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REPUBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELAUNIVERSIDAD DEL ZULIAFACULTAD DE MEDICINAInteracción GABAérgica-opioidérgica en el desarrollo de tolerancia a la morfinainducida por estrés de nado forzado repetidoTesis Doctoral para optar al Grado de Doctora en Ciencias Médicas,Facultad de Medicina, Universidad del ZuliaAutor: MSc María Lidia De Freitas Barboza NobregaC.I. V-13.024.492Tutor académico: Dr. Heberto José Suárez RocaC.I. V-4.533.204Maracaibo, Diciembre, 2.011

ÍNDICE DE CONTENIDO3Pág.RESUMEN…………………………………………………………………………... 4ABSTRACT……………………………………………………………………….…. 5INTRODUCCIÓN………………………………………………………………….… 6MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………………………….… 15RESULTADOS…………………………………………………………………….… 21DISCUSIÓN……………………………………………………………………….…. 31CONCLUSIONES…………………………………………………………………… 40IMPLICACIONES CLINICAS..…………………………...……..…………………. 41REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS....…………………………………………… 42INDICE DE FIGURAS...…………………………………...……..………………… 50

De Freitas Barboza Nobrega, María Lidia: “Interacción GABAérgica-opioidérgicaen el desarrollo de tolerancia a la morfina inducida por estrés de nado forzadorepetido”. Tesis Doctoral para optar al Grado de Doctora en Ciencias Médicas,Facultad de Medicina, Universidad del Zulia, Maracaibo-Venezuela, Diciembre de2011. 1-50 p.4RESUMENLa exposición repetida a nado forzado (NF) en ratas produce hiperalgesia ydisminuye la eficacia de la morfina para producir analgesia por mecanismos que nohan sido dilucidados. El objetivo fue determinar la participación de la interacciónGABAérgica-opioidérgica en el desarrollo de tolerancia a la morfina inducida porestrés crónico de NF en ratas. Ratas machos fueron sometidas por 3 díasconsecutivos a una sesión diaria de 10-20min de NF o de simulacro de nado (SN);un grupo no fue condicionado (NC). Un antagonista selectivo del receptor opioide(naloxona) y un modulador alostérico positivo de GABA (diazepam) fueronadministrados i.p. previo cada sesión. Un agonista opioide (morfina) se administró24h posterior a la última sesión. La nocicepción fue determinada con la prueba deplato caliente en 3 ocasiones: antes y 24h después del condicionamiento, y 30minposterior a la administración de morfina. Se determinó la expresión de la proteína c-Fos y los niveles de GABA en el asta dorsal de la médula espinal lumbar. Ratastratadas con naloxona y diazepam antes de cada sesión de NF no desarrollaronhiperalgesia. La eficacia de la morfina para producir analgesia fue más baja en ratassometidas a NF, efecto que fue prevenido con la administración pre-estrés dediazepam e intensificado con la administración de naloxona. La liberación basal einducida por dolor de GABA en la médula espinal fue más baja en el grupo de NF.La expresión inducida por dolor de la proteína c-Fos en médula espinal fue más altaen ratas sometidas a NF, siendo inhibida dicha sobreexpresión con el uso dediazepam. En conclusión, cambios en la transmisión GABAérgica y opioidérgicaestán implicados, al menos en parte, en el desarrollo de tolerancia al efectoanalgésico de la morfina en ratas sometidas a NF.Palabras claves: estrés, morfina, tolerancia, naloxona, diazepamCorreo electrónico: mldefreitas@hotmail.com

De Freitas Barboza Nobrega, María Lidia: “Interacción GABAérgica-opioidérgicaen el desarrollo de tolerancia a la morfina inducida por estrés de nado forzadorepetido”. Tesis Doctoral para optar al Grado de Doctora en Ciencias Médicas,Facultad de Medicina, Universidad del Zulia, Maracaibo-Venezuela, Diciembre de2011. 1-50 p.5ABSTRACTRepeated exposure to forced swimming (FS) induces hiperalgesia and decreases theefficacy of morphine to produce analgesia in rats by mechanisms to be elucidated.The objective was to determine the involvement of the GABAergic-opioidergicinteraction in the development of forced swimming stress-induced morphinetolerance. Male rats were daily submitted to 10-20 min of either forced swimming(FS) or sham swimming (SS) for 3 consecutive days; one group was not conditioned(control group). Selective opioid receptor antagonists (naloxone) and positiveallosteric modulator of GABAA receptors (diazepam) were administered i.p. beforeeach conditioning session. Opiod agonist (morphine) was administered i.p. 24h lastsession. Nociception was estimated thrice, before each behavioral conditioning and24h after the last, and 30min after morphine administration, using hot plate test. Theexpression of c-Fos protein and spinal GABA release in the dorsal horn of the lumbarspinal cord were estimated. Rats treated with naloxone and diazepam before eachFS session did not develop hiperalgesia. The efficacy of morphine to produceanalgesia in FS rats was lower than in SS and control group rats, prevented by prestressadministration of diazepam and intensified by pre-stress administration ofnaloxone. Basal and pain-evoked release of GABA in the spinal cord was lower in FSrats than in SS rats. Pain-induced c-Fos expression in spinal cord were significantlyhigher in FS rats than in SS rats. In FS rats, diazepam reduced the overexpression ofc-Fos. In conclusion, changes in GABAergic and opioidergic transmission areinvolved, at least in part, in the development of forced swimming stress-inducedmorphine tolerance.Key words: stress, morphine, tolerance, naloxone, diazepam.e-mail: mldefreitas@hotmail.com

INTRODUCCION6Fisiología del estrés.Hans Selye en 1936 introdujo y popularizó el término “estrés” en el ámbito médicoy científico, definiendo el estrés como una respuesta no específica del organismo ainfecciones bacterianas, toxinas, radiaciones y estímulos físicos, como cirugías,ejercicio, entre otros, con participación del eje hipotalámico-hipofisiario-adrenal(HHA) como mecanismo efector clave de esta respuesta (Selye, 1936).Cannon popularizó el concepto de homeostasis como el estado en el cual lasmedidas fisiológicas están en un nivel óptimo único para el funcionamiento delorganismo. Eventos potencialmente nocivos, o estresores, producen perturbación enla homeostasis. Ante esto, se desencadena una respuesta de estrés compensatoriapara tratar de mantener la homeostasis (Cannon, 1915).Los “estresores” pueden más específicamente definirse como cualquier estímulo,interno o externo, que percibido como una amenaza, directa o indirectamenteproduce una desestabilización en el organismo (Gómez, 2000). Se agrupan en trescategorías: 1) Estresores psicológicos, basados en una respuesta aprendida contrala amenaza (ansiedad, miedo, frustración, entre otros); 2) Estresores físicos queconsisten en estímulos físicos, como calor, frío, radiaciones, ruido, vibraciones,ejercicio, dolor, inmovilización, entre otros, y 3) Estresores orgánicos endógenos nopsicológicos, como la hipoglicemia, hemorragia, entre otros (Carrasco, 2003). Entérminos de duración, los estresores pueden ser divididos en dos principalescategorías: agudos o de exposición breve (minutos – horas) y única, y crónicos o deexposición prolongada (días – meses – años) y/o repetida (Pacak, 2001).La respuesta al estrés o síndrome general de adaptación es una reacciónneuroendocrina que ocurre en tres etapas (Selye, 1936): 1) primera etapa: ocurreentre 6-48 horas del estímulo inicial, es un estado de alarma general del organismocuando se confronta a una situación crítica, activando sus mecanismos de defensacontra el agente nocivo; 2) segunda etapa: luego de las 48 horas del estímulo, es unestado de resistencia, de adaptación del organismo, sin embargo el organismo nopuede mantenerse por si solo indefinidamente en este estado, de tal manera que siel estímulo persiste pasa a la siguiente etapa; 3) tercera etapa: fase de desgasteenergético (Selye, 1950). Entre las hormonas que participan en esta respuesta se

7incluyen: la hormona adrenocorticotrópica (ACTH) y cortisol/corticosterona del ejehipotálamo-hipófisis-adrenal (HHA), catecolaminas adrenales (adrenalina,noradrenalina), oxitocina, prolactina, renina, entre otras (Carrasco, 2003).La respuesta rápida y reversible ante el estrés es esencial para la adaptación ysupervivencia, pero la falta de control sobre el estresor, sobretodo en casos deexposición prolongada, conocida como estrés crónico, puede causar efectosadversos (García y col, 2008), ocasionando cambios funcionales principalmente enlos sistemas neuroendocrino, cardiovascular, inmune y gastrointestinal (Carrasco,2003), que terminan por descompensar el organismo y llevan a: un aumento en lasusceptibilidad a infecciones respiratorias (Cohen y col, 2001), alteraciones en elcurso de enfermedades inflamatorias (Miller y col, 2002), complicaciones deprocesos inflamatorios dérmicos (Arck y col, 2006), desordenes de la conducta comola depresión (Anisman, 2009; Gold y col, 2002), exacerbación de desordenesautoinmunes, desencadenando y/o intensificando el dolor en enfermedades crónicascomo fibromialgia y artritis reumatoide (Khasar, 2008).Fisiología del dolor.El dolor puede ser definido como una sensación desagradable que es percibidacomo una función integral modulada por condiciones psicológicas. La percepción deldolor o nocicepción resulta de la activación específica de una sub-población deneuronas periféricas ganglionares por estímulos nocivos. Dicha neuronas transmitenimpulsos nerviosos del sitio de lesión periférica (piel, músculo, vísceras, etc.) adiversas áreas del cerebro mediante un proceso dinámico. Estímulos dolorosos(químicos, térmicos, de presión, entre otros) excitan en la periferia estructurassensibles llamadas nociceptores, los cuales son terminaciones nerviosas libres (sincobertura de mielina) que actúan como transductores de esa información a impulsoselectroquímicos que se propagan en forma centrípeta (conducción ortodrómica)hacia el sistema nervioso central (SNC) a través de fibras nerviosas rápidas tipo Aδ(ligeramente mielinizadas) y lentas tipo C (sin mielina) (Julius y col, 2002). Diferentesmediadores inflamatorios pueden sensibilizar dichos nociceptores periféricos paraproducir un estado de dolor exagerado o hiperalgesia (Verri y col, 2006). Una vezestimulados, generan cambios en la carga eléctrica de la membrana neuronal de losnociceptores, lo que resulta en la propagación del estímulo nervioso hasta el astadorsal de la médula espinal, donde se liberan neurotransmisores, tales como, los

8aminoácidos glutamato y aspartato, y los neuropéptidos substancia P y el péptidorelacionado genéticamente con la calcitonina (conocido por sus siglas del ingléscomo, CGRP), entre otros. Estos neurotransmisores excitan, activando receptoresespecíficos, neuronas espinales post-sinápticas que transmiten la información quellega de la periferia a centros superiores, especialmente, al tálamo y la cortezacerebral (Goicoechea y col, 2006).Como todo mecanismo neurofisiológico, la función nociceptora está regulada pordiversas estructuras centrales y mecanismos de neurotransmisión. Desde estoscentros supraespinales del dolor se ponen en marcha vías descendentes que lleganal asta dorsal de la médula y liberan sustancias endógenas inhibitorias que modulanla transmisión del estímulo doloroso y disminuyen la liberación de neurotransmisoresexcitatorios desde los terminales centrales de los nervios sensoriales mediantehiperpolarización de la membrana de la neurona postsináptica (Goicoechea y col,2006). Además, a este mismo nivel espinal, entran en juego interneuronasinhibitorias que, liberando neurotransmisores inhibitorios como opioides y GABA,imitan y potencian el efecto inhibidor de las vías descendentes (Goicoechea y col,2006; Yaksh y col, 1999).El estrés crónico puede afectar la modulación supraespinal y espinal de lanocicepción, como parte de los mecanismos adaptativos del organismo,conduciendo a cambios, de larga duración, en la percepción del dolor. Esto se hademostrado en numerosos estudios en modelos animales que relacionan laexposición a estrés crónico con el desarrollo de hiperalgesia (Quintero y col, 2000;2003), es decir, percepción exagerada de dolor ante estímulos nocivos.Estrés como modulador de la función nociceptiva. Hiperalgesia inducida por estrés.El estrés puede desencadenar analgesia o hiperalgesia, según la duración eintensidad del estímulo estresor. Tradicionalmente, el estrés agudo ha sido asociadocon el desarrollo de analgesia (Lewis y col, 1980), mientras que el estrés crónico estárelacionado con el desarrollo de hiperalgesia (Da Silva y col, 2003). En efecto,previamente se ha reportado que el estrés de nado forzado repetido en ratas (unmodelo animal de estrés crónico) produce un incremento a largo plazo en larespuesta sensorial a la estimulación nociva, demostrándose que existe percepciónaumentada del dolor fásico (térmico) y tónico (inflamatorio), es decir, hiperalgesia, enratas sometidas a dicho modelo. Esta hiperalgesia es tardía, ya que ocurre 24 horas

después de la última sesión de estrés, y de larga duración, puesto que se observaincluso una semana después (Quintero y col, 2003).9El mecanismo responsable del desarrollo de la hiperalgesia en el estrés crónicono se conoce bien. Sin embargo, varios mecanismos han sido implicados en eldesarrollo de hiperalgesia inducida por estrés de nado forzado repetido en ratas. Sepiensa que podrían participar una cascada de eventos neuronales dentro de lasastas dorsales de la médula espinal que sensibilizan la transmisión sensorial, ya quese ha descrito un aumento en la expresión del proto-oncogen c-Fos (un marcadorde actividad neuronal) en neuronas localizadas en áreas nociceptivas de la médulaespinal (Quintero y col; 2003). Asimismo, algunos neurotransmisores han sidoimplicados. Existen fibras serotoninérgicas descendentes que inhiben la transmisióndel dolor a nivel espinal. El estrés repetido y prolongado por nado forzado en rataspuede reducir la liberación de serotonina a nivel del sistema nervioso central (Quinteroy col, 2000), por lo que se ha propuesto que el estado hiperalgésico post-estrés podríaestar asociado a una disminución de la liberación de serotonina o de la actividad delos receptores serotoninérgicos y/o de sus mecanismos de transducción intracelular.En este mismo sentido se ha reportado prevención del desarrollo de hiperalgesia enanimales pre-tratados con antidepresivos que bloquean la recaptación de serotonina,como clomipramina o fluoxetina, o con triptófano, un aminoácido precursor de lasíntesis del neurotransmisor (Quintero y col, 2000). Por otra parte, se ha reportadoreducción en la liberación de ácido gamma-amino butírico (GABA, por sus siglas eninglés γ-aminobutyric acid, principal neurotransmisor inhibitorio cerebral), basal einducida por dolor, a nivel del las láminas superficiales de las astas dorsales de lamédula espinal (Suárez-Roca y col, 2008).Papel de los opioides en la modulación del dolor inducida por estrés.El sistema opioide endógeno está formado por una familia de péptidos opioidesendógenos que se pueden agrupar en, al menos, tres familias: las endorfinas, lasencefalinas y las dinorfinas. Más recientemente se han identificado otros opioidesendógenos: la nociceptina y las endomorfinas, cuya relevancia y papel en elfuncionamiento del sistema opioide endógeno están aun siendo evaluados. Estospéptidos, una vez sintetizados, se almacenan en vesículas neuronales y sonliberados al espacio intersináptico en respuesta a un estímulo nervioso (Goicochea ycol, 2009).

10Los opioides son potentes analgésicos que ejercen sus efectos farmacológicos através de la activación de receptores específicos en el sistema nervioso. Se handescrito tres diferentes subtipos de receptores opioides unidos a la membrana, condiferentes características: mu (μ), delta (δ) y kappa (κ), los cuales estánampliamente distribuidos en el sistema nervioso central (SNC). Además de losreceptores opioides en el SNC, las neuronas periféricas, células neuroendocrinas(hipófisis, suprarrenales), inmunes, y ectodérmicas, expresan dichos receptores.Estos receptores periféricos juegan un rol importante en la modulación del dolor.(Hernández y col, 2005; Sehgal y col, 2011). La unión de opioides a sus respectivosreceptores provoca una hiperpolarización de las neuronas, lo que supone una menorfrecuencia de disparo, una menor conducción nerviosa y, por lo tanto, una menoractivación de las neuronas que transmiten la información dolorosa (Goicochea y col,2009).La respuesta nociceptiva al estrés es mediada y modulada por la liberación deopioides endógenos, los cuales son moduladores inhibitorios de las víasnociceptivas (Izumi y col, 1983; Lewis y col, 1980; Terman y col, 1986). Muchosestudios han demostrado que péptidos opioides son liberados durante el estrésagudo en diferentes regiones del cerebro (Wang y col, 2000; Wigger y col, 2002), loque puede estar en relación con la analgesia descrita en casos de estrés agudo.Asimismo, y reforzando esta teoría, se ha reportado reducción de la analgesia,inducida por estrés agudo, con el uso de naloxona (antagonista no selectivo delreceptor de opioides) en un modelo animal de estrés agudo por nado forzado, y enratones knockout con deficiencia de los receptores de opioides: μ, δ y κ. (Contet ycol, 2006).Cabría de esperarse que la exposición repetida a estrés conlleve a unasobreactivación de los receptores de opioides, lo que pudiera producirdesensibilización de los mismos, resultando en tolerancia al efecto analgésico deopioides endógenos, lo que podría estar implicado en la hiperalgesia observadacomo consecuencia de la exposición repetida a estrés de nado forzado. En estesentido, y reforzando esta teoría, se ha reportado que el uso de naloxona pre-estréspreviene el desarrollo de hiperalgesia en ratas sometidas a nado forzado repetido(Suárez-Roca y col, 2006).

11Además del posible desarrollo de tolerancia al efecto analgésico de los opioidesendógenos en casos de exposición a estresores en forma repetida, es de esperarseque se produzca tolerancia al efecto analgésico de opioides exógenos, como porejemplo morfina, en forma análoga a lo que ocurre como consecuencia de laadministración crónica exógena de los mismos. En el desarrollo de tolerancia alefecto analgésico de los opioides se han implicado varios mecanismos:desensibilización o internalización del receptor y alteración en las vías deseñalización post-receptor a nivel intracelular (Zuo, 2005). En este sentido, estudiosprevios han reportado el desarrollo de tolerancia al efecto antinociceptivo de lamorfina en ratas sometidas a estrés crónico de nado forzado, en concordancia con lahipótesis según la cual durante el estrés crónico los receptores opioides sonactivados en forma repetida (Suárez-Roca y col, 2006). Asimismo se ha reportadoprevención del desarrollo de tolerancia al efecto analgésico opioide, por laadministración repetida de opioides exógenos, con el uso de naloxona (Johnson ycol, 1989).Por otra parte, varios estudios independientes sugieren una relación inhibitoriarecíproca entre opioides y GABA, al menos en algunas estructuras del SNC. Dehecho, ha sido propuesto que uno de los mecanismos que explica el efectoanalgésico de los opioides es la supresión de la influencia inhibitoria del GABA enneuronas que forman parte de la vía antinociceptiva descendente. Los opioidesinhiben así la transmisión sináptica mediada por GABA en varias regiones delcerebro, por reducción de su liberación presináptica (Vaughan y col, 1997). Por otrolado, el bloqueo de los receptores GABA-A por microinyección de bicuculina(antagonista selectivo del GABA) en la sustancia gris periacueductal ventrolateral,incrementa in vivo la liberación de meta-encefalina en una manera dosisdependiente(Williams y col, 1995).Papel del GABA en la modulación del dolor inducida por estrés.El ácido gamma-aminobutírico (GABA) es el principal neurotransmisor inhibitoriocerebral. Deriva del ácido glutámico, mediante la descarboxilación realizada por laglutamato-descarboxilasa. Tras la interacción con los receptores específicos, GABAes recaptado activamente por la terminación y metabolizado (Watanabe y col, 2002).Actúa a través de tres tipos de receptores. Unos de acción rápida, receptoresionotrópicos: GABA A y GABA C ; y otros de acción lenta, los receptores metabotrópicos:

12GABA B . La mayoría de los efectos inhibitorios rápidos del GABA son mediados por elreceptor ionotrópico GABA A , un canal iónico activado por ligando. El complejocanal/receptor traduce la señalización por GABA iniciando un flujo de cloro hacia elinterior de la célula, el cual hiperpolariza la membrana neuronal postsináptica. Dichoreceptor es una proteína pentamérica transmembrana, compuesta por cincosubunidades las cuales forman el canal iónico. Un gran número de drogaspsicoactivas ejercen sus efectos por medio de este receptor, por ejemplo, losansiolíticos (Moscote, 2005).Recordemos, como se mencionó anteriormente, que la función nociceptora estáregulada por diversas estructuras y mecanismos de neurotransmisión. Entre ellos, anivel espinal, entran en juego interneuronas inhibitorias que liberan GABA(Goicoechea y col, 2006). Existe evidencia que apoya el rol del GABA en laregulación de la nocicepción. El diazepam, fármaco modulador alostérico positivo delreceptor GABA-A, inhibe la activación de neuronas sensoriales en el asta dorsal dela médula espinal en ratas (DeFeudis, 1983; Hu y col, 2006). Agentesfarmacológicos, como la morfina, analgésico opioide (Chen y col, 2005), y elmidazolam, ansiolítico tipo benzodiacepina (Kohno y col, 2006), producen analgesia,al menos en parte, por estimulación del receptor GABA-A.Esta modulación espinal de la nocicepción es claramente afectada por el estréscrónico, como parte de los mecanismos adaptativos del organismo, y conducen acambios, de larga duración, en la percepción del dolor, afectándose, entre otras, latransmisión GABAérgica. El estrés disminuye la función del complejo receptorGABA-A, un efecto mimetizado por la administración in vivo de diferentes inhibidoresde la transmisión GABAérgica y antagonizado por ansiolíticos tipo benzodiacepinas(Biggio y col, 1990). Por otro lado en ratas con hiperalgesia inducida por estrés denado forzado repetido se ha reportado reducción en la liberación de GABA a nivelespinal, y prevención del desarrollo de la misma con el uso de diazepam (Suárez-Roca y col, 2008).No es conocido los mecanismos por los cuales el tratamiento pre-estrés condiazepam impide el desarrollo de la hiperalgesia inducida por estrés de nadoforzado repetido en ratas. Dado que el tratamiento con diazepam no altera laliberación de GABA a nivel medular (Suárez-Roca y col, 2008), esta benzodiazepinaprobablemente compensa la reducción en la liberación de GABA endógeno durante

el estrés de nado forzado, mediante el aumento de la afinidad de los receptorespost-sinápticos GABA-A, manteniendo así el tono GABAérgico.13Asimismo, la reducción de GABA podría estar relacionada con cambios a largoplazo de otros neurotransmisores fuertemente activados durante el estrés, quetambién afectan la modulación del dolor, como los péptidos opioides endógenos. Eneste sentido, se propuso anteriormente que la hiperalgesia inducida por el estrés denado forzado se asocia a una reducción en la función antinociceptiva de losreceptores μ opiáceos debido a la sobre-estimulación de estos receptores poropioides endógenos liberados durante el estrés, entonces la hiperalgesia puede serbloqueada por la administración pre-estrés de antagonistas selectivos de receptoresμ-opioides.Como se mencionó anteriormente, uno de los mecanismos implicados en eldesarrollo de hiperalgesia inducida por estrés de nado forzado repetido en ratas, esla reducción en la liberación de GABA, basal e inducida por dolor, a nivel del lasláminas superficiales de las astas dorsales de la médula espinal, siendo prevenida,la hiperalgesia, con el uso de diazepam, un modulador alostérico positivo delreceptor GABA-A (Suárez-Roca y col, 2008). Por lo tanto, es posible que unareducción en la actividad del receptor de GABA-A durante el estrés de nado forzadopueda aumentar la liberación de los opioides endógenos, asociado a una reducciónen la función antinociceptiva de los receptores opioides debido a una sobreestimulaciónde estos, lo que conllevaría al desarrollo de hiperalgesia y tolerancia aopioides exógenos, como se explico anteriormente. Así, la administración dediazepam durante el estrés de nado forzado evita el desarrollo de la hiperalgesia,manteniendo un tono GABAérgico suficiente, incluso en presencia de una reducciónde GABA endógeno y, en consecuencia, una adecuada liberación de opioidesendógenos y sensibilidad de los receptores opiáceos.Propósito del estudio.Es evidente que muchos factores están implicados en el desarrollo de toleranciaal efecto analgésico de los opioides en ratas sometidas a estrés de nado forzadorepetido, bien sea endógenos, lo que explicaría la aparición de hiperalgesia, oexógenos, con la falta de respuesta al uso de morfina. Algunos de los sistemasimplicados en ello son los sistemas opioidérgico y GABAérgico, íntimamenterelacionados, de allí que el presente trabajo se propuso determinar si, evitando la

14sobre-estimulación de los receptores opioidérgicos µ por opioides endógenosdurante el estrés de nado forzado (con el bloqueo dichos receptores mediante pretratamientocon bajas dosis de naloxona) y, compensando la reducción de losniveles intraespinales de GABA en ratas estresadas mediante la potenciación de laactividad del receptor GABA-A (con la administración de diazepam durante el estrésde nado forzado), se previene el desarrollo de tolerancia al efecto analgésico de lamorfina observada en ratas sometidas a estrés de nado forzado repetido.

MATERIALES Y METODOS151. Animales:Se utilizaron ratas machos Sprague Dawley con pesos entre 150 y 300 gr(Bioterio de la Facultad de Veterinaria, LUZ, Maracaibo). No se utilizaron ratashembras para evitar los cambios en la nocicepción provocados por el cicloestrogénico. Todas las ratas fueron individualmente enjauladas en el mismo cuartode laboratorio en donde se realizó el experimento conductual, en idénticascondiciones de temperatura (24-26ºC), iluminación, alimentación (alimento pararatas: Ratarina®, Protinal, Valencia, Venezuela) y agua, disponible “ad libitum”.2. Diseño experimental:Se utilizó el modelo de estrés por nado forzado crónico, el cual ha demostradoque produce cambios en la percepción del dolor (Quintero y col, 2000, 2003; Suárez-Roca y col, 2006, 2008).Las ratas fueron divididas en 3 grupos: En el primer grupo, las ratas fueronsometidas a tres sesiones de nado forzado inescapable e incontrolable: 10 minutosel primer día y 20 minutos el segundo y tercer día. Para ello cada rata fue colocadaen un recipiente, en un cilindro de plástico, de 30 cm de diámetro y 50 cm de alto, elcual se lleno de agua hasta aproximadamente 30 cm de profundidad y a unatemperatura de 24-26ºC. En el segundo grupo, las ratas fueron sometidas a unsimulacro de nado, el cual consistió en colocarlas en recipientes de igualescaracterísticas a las mencionadas arriba pero con una cantidad menor de agua (2cm de profundidad aproximadamente), con la finalidad de simular las condiciones dehumedad y temperatura de las ratas que si nadaron. Similarmente, fueron sometidasa tres sesiones: 10 minutos el primer día, 20 minutos el segundo día y 20 minutos eltercer día. En el tercer grupo, las ratas permanecieron en sus jaulas durante todo elprotocolo, no participaron en las sesiones de estrés de nado forzado ni simulacro denado.El primer día, todos los animales fueron pesados, se realizó la primera estimacióndel dolor térmico basal, obtenido por el tiempo de latencia (en segundos) de larespuesta de retirada de las patas traseras, usando el procedimiento del platocaliente descrito por Carter. Los animales fueron colocados sobre un plato caliente a52.5º C, y se midió el tiempo que tardaban en lamer sus patas traseras o el tiempo

16de salto desde la aplicación del estimulo térmico en las patas. Se determinó untiempo límite para la prueba de 45 segundos para disminuir la posibilidad dequemadura. Posteriormente se realizó la primera sesión de nado y simulacro (10minutos), al primer y segundo grupo de ratas respectivamente. Los días 2 y 3 serealizaron las sesiones de nado y simulacro (20 minutos) a los gruposcorrespondientes.En el día 4 (es decir, 24 horas posterior a la última sesión de condicionamiento)se midió nuevamente la reacción al dolor térmico en la prueba del plato caliente entodas las ratas incluido el grupo control de animales no manipulados.Tratamiento con naloxona:Para bloquear los receptores opioides durante el estrés de nado forzado, y asievitar una probable sobreestimulación de los mismos, a un grupo experimental se leadministró el antagonista no selectivo de receptores de opioides naloxona (disueltaen solución salina - vehículo) a una dosis de 0.1mg/kg o solo un volumenequivalente de solución salina (controles), por vía intraperitoneal (i.p.)., 30 minutosantes de cada sesión de nado forzado o simulacro de nado; igualmente se leadministró a los animales del grupo no condicionado.Tratamiento con diazepam:Para facilitar la activación de los receptores GABA-A durante el estrés de nadoforzado, a otro grupo experimental se administró el modulador positivo del receptorGABA-A diazepam (2 mg/kg) o solo un volumen equivalente de solución salina(como vehículo control) por vía i.p. una hora antes de cada sesión de nado forzado ysimulacro de nado; igualmente se le administró a los animales del grupo nocondicionado.Evaluación de la analgesia inducida por la morfina:Para determinar si los condicionamientos conductuales indujeron cambios en laactividad de los receptores opioides, se comparó el efecto analgésico producido porel agonista selectivo de los receptores opioides morfina en los grupos de animalesno manipulados (controles) y aquellos expuestos a nado forzado y simulacro denado repetido, pre-tratados (previo al condicionamiento conductual) con naloxona,diazepam o vehiculo (solución salina). La morfina se administró por vía i.p. a una

17dosis de 3 o 7 mg/kg 24 horas después de la última sesión de nado forzado ysimulacro de nado (4to día). La analgesia se estimó por la medición de los cambiosen el tiempo de latencia para la respuesta de retirada de las patas traseras del platocaliente, 30 minutos posteriores a la inyección de la droga. La respuesta de latenciaen el plato caliente con respecto a la basal fue obtenida 24 horas después de laúltima sesión de condicionamiento y previa a la inyección de morfina.Medición de la liberación de GABA después del estrés repetido.Para determinar como el condicionamiento conductual y el diazepam afectan laliberación del neurotransmisor inhibitorio GABA de la médula espinal lumbar, serealizó el monitoreo de los niveles de GABA in vivo mediante microdiálisis del astadorsal lumbar de la médula espinal de la rata. Para ello, un grupo experimental deratas sometidas a nado forzado y simulacro de nado repetido, y pre-tratadas (antesdel condicionamiento conductual) con diazepam, fueron anestesiadas con ketamina(100 mg/Kg. i.p.) y xylazina (10 mg/Kg. i.p.), luego la porción dorsal de la médulaespinal, a nivel del segmento lumbar L4-L5, fue expuesta utilizando un procedimientoquirúrgico descrito por Storkson (Storkson y col, 1996), para implantarles cánulasintratecales para microdiálisis. Para este procedimiento se utilizó un aparatoestereotáxico espinal para rata. El instrumental quirúrgico y los catéteres paraimplantación intratecal crónica fueron esterilizados por autoclave (Autoclave ThomasAll-American modelo 25X). Las cánulas intratecales fueron introducidas hasta 1mma nivel del asta posterior de los segmentos lumbares L4-L5 de la médula espinallumbar hasta alcanzar las láminas superficiales I y II (comprobado post-mortem portinción histológica). Luego se inició la perfusión del líquido cefalorraquídeo artificial auna velocidad de 1 μl/min usando una bomba de infusión. Después de 60 min deperfusión de lavado, el microdializado, se colectó una muestra basal durante 9 minantes de la inyección de formalina al 1% en la región ventral de la pata derechatrasera del animal. Posteriormente, se tomaron cinco muestras: a los 0–6 min, 7–15min, 16–30 min, 60–75 min, y 90–105 min luego de la inyección de formalina. En losmicrodializados se determinó el contenido de GABA. Todos los estándares y lasmuestras (dializados) fueron derivatizadas con 1 mg. de FITC en 1 ml de acetona,esto en buffer carbonato (1:1) durante 15 a 18 horas. La electroforesis capilar fueanalizada con un equipo de detección, mediante fluorescencia inducida por lásermodelo R2D2 (Meridiálisis, Mérida). La separación de la muestra se realizó a travésde un capilar de silica-fundida 70 cm de longitud y de 350 μ diámetro externo,

18aplicando un voltaje de 20 kV e inyectando 5 nl por muestra y estándar, por mediode un sistema de inyección de alta presión. Para la separación de los componentesde la muestra durante la corrida electroforética, se utilizó buffer borato para losaminoácidos neutros; el tiempo de corrida total fue de 15 minutos. El capilar fuelavado con 0.1 M de NaOH (3 min), H 2 O 18 Ω (3 min), y buffer carbonato (3 min) enel intervalo entre cada muestra. La determinación del pico de GABA se llevó a cabomediante “spiking” del electroferograma del microdializado, adicionando unacantidad estándar de GABA a las corridas electroforéticas para medir GABAendógeno, respectivamente.Inmunohistoquímica para el marcador neuronal c-Fos:El proto-oncogén c-fos se activa rápidamente después de estímulos nocivos,expresándose la proteína Fos en neuronas del asta dorsal de la médula espinal, detal manera que la expresión de c-Fos es un marcador neuronal en respuestaa estímulos nociceptivos (Coggeshall, 2005). En el presente estudio se utilizó comoun marcador de la actividad sensorial, permitiendo estudiar el efecto del diazepam,sobre la actividad de las neuronas sensoriales del asta dorsal de la médula espinal.Para ello a un grupo de ratas sometidas a nado forzado y simulacro de nado pretratadascon diazepam, se le inyectó 0.1cc de formalina al 1% vía subcutánea, en laplanta de la pata trasera derecha. Dos horas posterior a la inyección de formalina, seprocedió al sacrificio de los animales, anestesiándolos con CO 2 y luegoperfundiéndolos intracardiacamente con buffer PBS, seguido de una prefijación conparaformaldehído al 4%. El segmento lumbar de la médula espinal fue disecado ypost-fijado durante 2 horas con paraformaldehído al 4%, para luego ser críoprotegidodurante toda la noche con sucrosa al 30% y posteriormente guardado a 4 °C hastasu procesamiento.Al momento del procesamiento el trozo de tejido se colocó sobre una placametálica, con previa adición de Histo-prep TM , y se colocó en la zona decongelamiento del micrótomo (Modelo HM505N). Una vez congelados los bloques,se procedió a realizar cortes de 40 μm de grosor, cuidando la integridad del tejidomedular. Luego se tomaron los cortes con un pincel fino y se colectaron en bufferPBS/TX (buffer fosfato salino 0,1 M con 4% Triton X-100). Se seleccionaronmorfológicamente los cortes correspondientes a los segmentos lumbares L4 y L5.

19Posteriormente los cortes fueron transferidos a un recipiente con malla quecontiene PBS/TX. Se realizaron dos lavados de 10 minutos y dos lavados de 5minutos. Una vez culminado este lapso, se procedió a reducir la actividad de laperoxidasa endógena exponiendo los cortes a H 2 O 2 al 0.3 % por 30 minutos. Luegose repetieron los lavados en PBS/TX, igual que en el caso anterior, y se procedió abloquear con suero normal de cabra al 4 % en PBS/TX por 1 hora. Por último seincubaron los cortes en placas serológicas con anticuerpo primario de clase IgG deconejo para anti-proteína c-Fos de rata en una dilución de 1:2000, por 36 horas a4°C. (Vector Laboratories, Burlingame, C.A, U.S.A). Un grupo de cortes no seincubaron en anticuerpo primario con el fin de determinar la especificidad dereacción cromática.Al día siguiente, se lavaron los cortes con PBS/TX dos veces por 10 minutos ydos veces por 5 minutos, seguidamente se bloquearon con suero normal al 4% enPBS/TX por 30 minutos, y se incubaron con anticuerpo secundario de clase IgG derata para anti-IgG de conejo por 90 minutos en una concentración de 1:2000. Luegose procedió a lavar nuevamente con PBS/TX con los mismos tiempos estipulados.Aproximadamente 1 hora antes de comenzar el lavado se procedió a la preparacióndel complejo reactivo ABC (Estreptavidina - Biotina- HRP) según instrucciones delfabricante (Vector Laboratories, Burlingame, C.A, U.S.A). Terminados los lavados seincubaron los cortes con ABC por 90 minutos, para luego lavarlos con PBS/TX, porel mismo tiempo anterior. Finalmente se incubaron con diaminobencidina (DAB) pararevelar las proteínas marcadas, con una reacción que produce un color negromarrón.Los cortes se lavaron con TBS/TX, por el mismo periodo de tiempo y setransferieron a portaobjetos precubiertos con gelatina, y se dejaron secar toda lanoche.Al día siguiente, los cortes se lavaron sumergiéndolos en agua de grifo por 20segundos y se procedió a la deshidratación de los mismos sumergiéndolos en formaprogresiva en etanol al 50 %, 70%, 95 %, 100 % por 1 minuto cada uno, y en xilenopor 4 minutos. Luego, los cortes se montaron de forma permanente cubiertos conPermount® y cubreobjetos, para la observación bajo microscopio de luz.

203. Cálculos y análisis estadístico:Los resultados obtenidos fueron expresados como promedio ± error estándardel promedio. El análisis estadístico se hizo aplicando análisis de varianza (ANOVA)de una o dos vías, seguido de la prueba de rangos múltiples de Bonferroni. Se aplicóla prueba t de Student para determinar las diferencias entre las latencias en laprueba de plato caliente de cada grupo. Un valor de p igual o menor de 0,05 fueconsiderado significativo.

RESULTADOS21a) Evaluación de la respuesta nociceptiva durante el estrés.En el grupo sometido a nado forzado se observó una disminución significativa deltiempo de latencia para la respuesta nociceptiva (tiempo que tardó la rata en lamersus patas traseras o el tiempo que tardó en saltar desde la aplicación del estímulotérmico), medida 24 horas después de la tercera y ultima sesión de nado forzado,con respecto a los tiempos de latencia basales obtenidos antes de la primera sesión(PC1: 13,21 ± 1,52 seg; PC2: 8,86 ± 0,96 seg; p

22Tiempo de latencia(segundos)2015105a) No condicionadoTiempo de latencia(segundos)2015105b) Simulacro de nadoTiempo de latencia(segundos)2015105c) Nado forzado*PC1PC20SALNALPlato caliente0SALNALPlato caliente0SALNALPlato calienteFigura 2. Respuesta nociceptiva con el uso pre-estrés de naloxona. En el eje de la ordenada,período de latencia en plato caliente (segundos), en el eje de la abscisa, momento de medición delPC (PC1: plato caliente 1 o basal, PC2: plato caliente 2, 24 horas post condicionamiento), previotratamiento con solución salina (SAL) o naloxona (NAL). a) Grupo no condicionado: No hubodiferencia significativa entre PC1 y PC2 en ninguno de los dos grupos; b) Grupo simulacro de nado:No hubo diferencia significativa entre PC1 y PC2 en ninguno de los dos grupos; c) Grupo nadoforzado: * diferencia estadísticamente significativa respecto al PC1-SAL (t de student; t=4,830, gl=17,p=0,0002).Cuando se administró diazepam, un modulador alostérico positivo del GABA,previo cada sesión de condicionamiento, se previno la disminución del tiempo delatencia para la respuesta nociceptiva en el plato caliente observada en el grupo deratas sometidas a nado forzado (PC1: 10,170 ± 0,634 seg; PC2: 11,00 ± 1,192 seg)(Figura 3c). En el grupo no condicionado, el tratamiento con diazepam conllevó a unaumento significativo del tiempo de latencia para la respuesta nociceptiva conrespecto al tiempo de latencia basal (PC1: 8,764 ± 0,741 seg; PC2: 11,990 ± 1,680seg; p

) Efecto del estrés de nado forzado repetido en la liberación de GABA en el astadorsal de la médula espinal lumbar, basal e inducida por dolor.23En condiciones basales, y en presencia de un estímulo doloroso, después de lainyección subcutánea de formalina en la pata trasera derecha (en las fases: 1, inter,2 y 3 del test de formalina), la liberación de GABA a nivel de la médula espinallumbar fue significativamente más baja en ratas sometidas a nado forzado que enlas ratas sometidas a simulacro de nado y no condicionadas (Figura 4). Por otraparte, se observó un aumento general significativo en los niveles de GABA en ratassometidas a simulacro de nado en comparación a las no condicionadas, cuando serealizó un ANOVA de dos vías solo entre estos dos grupos (Protocolo conductual,F(1)=15,58, p

24el período correspondiente a la fase 2 del test de formalina, fueron significativamentemás altos en ratas sometidas a nado forzado pretratadas con diazepam que enaquellas pretratadas con salina (Figura 5).Concentración de GABA(μM en muestras microdializadas)3210**Basal 1 Inter 2 3 4Fases del test de formalinaNF + salinaNF + diazepamFigura 5: Influencia del diazepam en la liberación basal e inducida por dolor de GABA enmédula espinal en ratas sometidas a estrés de nado forzado repetido. Diazepam (2mg/kg, i.p.)fue administrado una hora antes de cada sesión de nado forzado (NF). En la ordenada, concentraciónde GABA en las muestras microdializadas. En la abscisa, período de recolección durante el test deformalina; muestra basal microdializada fue recolectada 9 minutos antes de la inyección de formalinaen la pata trasera; 1, inter, 2, 3, y 4 para muestras recolectadas entre 0 – 6 min, 7 – 15 min, 16 – 30min, 60 – 75 min y 90 – 105 min después de la inyección de formalina, respectivamente. Cada puntorepresenta la media ± error estándar de 5 ratas. * diferencia significativa con respecto a las rataspretratadas con salina (ANOVA de dos vías seguido del test de Bonferroni: tratamiento, F(1)=15,64,p=0,0006; fases del test de formalina, F(5)=8,763, p=0,001; interacción, F(5)=4,856, p=0,0033.c) Efecto del estrés de nado forzado repetido en la expresión de c-Fos en médulaespinal lumbar.La inyección de formalina en la pata trasera de las ratas indujo la expresión denúcleos inmunoreactivos de c-Fos en el asta dorsal ipsilateral de la médula espinallumbar en todos los grupos experimentales. La mayor densidad de expresión de c-fos se observó en núcleos localizados en la cara medial de la lámina superficial (I yII) y en el cuello del asta dorsal (lámina V y VI) ipsilateral al sitio de inyección deformalina, lo cual es consistente con la proyección topográfica de las vías aferentesde la pata trasera al asta dorsal de la médula espinal lumbar (Figuras 6 y 7). Elnúmero de núcleos inmunoreactivos en el asta dorsal ipsilateral fuesignificativamente más alto en las ratas sometidas a nado forzado que en las ratassometidas a simulacro de nado y las no condicionadas (Figuras 6A vs 6C, 7);asimismo, el número de núcleos inmunoreactivos fue mayor en las ratas sometidas asimulacro de nado que en las no condicionadas (Figuras: 6A vs 6B, 7). De talmanera que el estrés de nado forzado repetido en ratas produce una sobreexpresión

25de c-Fos en las astas dorsales de la médula espinal, específicamente en las láminasinvolucradas en el procesamiento de los estímulos nociceptivos que provienen de laperiferia.Figura 6. Microfotografías (100X) mostrando la expresión de la proteína c-Fos inducida por formalinaen el asta dorsal ipsilateral al sitio de inyección, en ratas no condicionadas (A), sometidas a simulacrode nado (B) y nado forzado (C). La expresión de c-Fos fue más alta en ratas sometidas a nadoforzado que en aquellas sometidas a simulacro de nado y en las no condicionadas; mientras que enel grupo de simulacro de nado la expresión fue mayor que en el grupo no condicionado. I-II = láminasuperficial I - II, III-IV = lámina del núcleo propio III-IV, y V-VI = lámina del cuello del asta dorsal V-VI.Núcleos reactivos para c-Fos50 NC403020100*** *** **I-II III-IV V-VI VII-VIII IX-XLáminas de la médula espinalFigura 7. Efecto del estrés de nado forzado repetido en la expresión de c-Fos en médulaespinal lumbar. La activación de neuronas nociceptivas espinales (determinada por la expresión dec-Fos) inducida por la inyección intraplantar de formalina está incrementada en láminas del astadorsal de la médula espinal lumbar de ratas sometidas a estrés de nado forzado y simulacro de nado.En la ordenada número medio de núcleos inmunoreactivos a c-Fos (calculados en base a 10 – 20cortes de médula espinal lumbar por rata). En la abscisa la localización en las láminas: I-II = láminasuperficial I - II, III-IV = láminas del núcleo propio III-IV, V-VI = láminas del cuello del asta dorsal V-VI,y VII-VIII y IX-X = láminas ventrales VII, VIII, IX, y lámina central X, respectivamente. Cada valor es lamedia ± error estándar. NC: no condicionadas, SN: simulacro de nado, NF: nado forzado. * diferenciasignificativa con respecto al grupo no condicionado, ** respecto a ambos grupos, simulacro de nado yno condicionado (ANOVA de dos vías seguido del test de Bonferroni): protocolo conductual,F(2)=201,7, p

26Cuando se administró diazepam previo cada sesión de nado forzado se observóuna reducción significativa en el número de núcleos inmunoreactivos a c-Fos conrespecto al grupo tratado con salina (Figura 8). Esta disminución significativa en laexpresión de c-Fos en ratas sometidas a nado forzado tratadas con diazepam,estuvo localizada en las láminas I-II, III-IV y V-VI cuando se comparó con lastratadas con salina (Figura 9).ABCFigura 8. Microfotografías (100X) mostrando la expresión de la proteína c-Fos inducida por formalinaen el asta dorsal ipsilateral al sitio de inyección en ratas no condicionadas (A) y sometidas a nadoforzado (B). El aumento en la expresión de c-Fos observada en ratas sometidas a nado forzado (B)fue antagonizada con el uso de diazepam (2mg/kg, i.p.) previo cada sesión de nado (C). I-II = láminasuperficial I - II, III-IV = lámina del núcleo propio III-IV, y V-VI = lámina del cuello del asta dorsal V-VI.Núcleos reactivos para c-Fos50403020100***I-II III-IV V-VI VII-VIII IX-XLáminas de la médula espinalSalinaDiazepamFigura 9. Efecto del diazepam en la expresión de la proteína c-Fos en la médula espinal luegode la inyección intraplantar de formalina en ratas sometidas a estrés de nado forzado repetido.Diazepam (2 mg/kg) o solución salina (como vehículo control) fueron inyectadas i.p. una hora antesde cada sesión de nado. En la ordenada número medio de núcleos inmunoreactivos a c-Fos(calculados en base a 10 – 20 cortes de médula espinal lumbar por rata). En la abscisa la localizaciónen las láminas: I-II = lámina superficial I - II, III-IV = láminas del núcleo propio III-IV, V-VI = láminas delcuello del asta dorsal V-VI, y VII-VIII y IX-X = láminas ventrales VII, VIII, IX, y lámina central X,respectivamente. La activación de neuronas nociceptivas espinales (determinada por la expresiónde c-Fos) inducida por la inyección intraplantar de formalina está incrementada en láminas del astadorsal de la médula espinal lumbar de ratas sometidas a estrés de nado forzado. Esta sobreexpresiónde c-Fos en médula espinal es antagonizada con la administración de diazepam (2mg/kg, i.p.) previo

cada sesión de nado. * diferencia significativa respecto al grupo tratado con salina (ANOVA de dosvías seguido del test de Bonferroni): tratamiento, F(2)=185,0, p

28analgésica de la morfina observada en el grupo de ratas sometidas a nado forzadopre-tratadas con naloxona (PC3: NC: 34,14 ± 4,84; SN: 30,57 ± 4,50; NF: 14,95 ±2,20) (Figura 11).Pre-tratamiento: Naloxona40Tiempo de latencia(segundos)302010inyección ipde morfina*NCSNNF0PC1 PC2 PC3Plato calienteFigura 11. Efecto del tratamiento pre-condicionamiento con naloxona en la tolerancia al efectoanalgésico de la morfina inducida por el estrés de nado forzado repetido. En el eje de laordenada, período de latencia en plato caliente (segundos), en el eje de la abscisa, momento demedición del PC (PC1: plato caliente 1 o basal, PC2: plato caliente 2 o post condicionamiento; PC3:plato caliente 3 (30 minutos post administración de morfina). NC: no condicionadas, SN: simulacro denado, NF: nado forzado. * Diferencia significativa con respecto al grupo no condicionado y simulacrode nado (p

29Tiempo de latencia(segundos)40302010Pre-tratamiento: Diazepaminyección ipde morfinaNCSNNF0PC1 PC2 PC3Plato calienteFigura 12. Efecto del tratamiento pre-condicionamiento con diazepam en la tolerancia al efectoanalgésico a la morfina inducida por el estrés de nado forzado repetido. En el eje de laordenada, período de latencia en plato caliente (segundos), en el eje de la abscisa, momento demedición del PC (PC1: plato caliente 1 o basal, PC2: plato caliente 2 o post condicionamiento; PC3:plato caliente 3 (30 minutos post administración de morfina). NC: no condicionadas, SN: simulacro denado, NF: nado forzado. No se observó diferencia significativa entre los grupos (ANOVA de dos víasseguido del test de Bonferroni: condicionamiento conductual F(2)=2,792, p=0,0665; plato calienteF(2)=26,11, p

DISCUSION30a. Hiperalgesia térmica inducida por estrés de nado forzado repetido.Los resultados de este estudio confirman, como ha sido reportado en estudiosprevios (Quintero y col, 2000; Suárez-Roca y col, 2006), que el estrés crónico pornado forzado induce el desarrollo de hiperalgesia cutánea al estímulo térmiconocivo, la cual se manifiesta como una disminución significativa del tiempo delatencia para la respuesta nociceptiva en la prueba de plato caliente, observabledesde al menos 24 horas posteriores a la última sesión de nado forzado. Dichoefecto hiperalgésico no se observó en los animales sometidos a simulacro de nado,ni en los animales no condicionados, lo que sugiere que es necesaria la acción deun estresor intenso y mantenido a lo largo del tiempo, como el nado forzadorepetido, para inducir cambios funcionales que se manifiesten en cambiosconductuales asociados a hiperalgesia térmica cutánea, ya que las ratas sometidasa un estrés moderado, como el de simulacro de nado, mantuvieron tiempos delatencia similares en las dos mediciones realizadas. Por otro lado, cabe destacar quela hiperalgesia inducida por estrés no es exclusiva del modelo de nado forzadorepetido ya que ha sido igualmente reportada en otros modelos animales de estréscrónico: estrés social (Vidal y Jacob, 1982; Marcinkiewcz y col, 2009), estrés derestricción (da Silva y col, 2003; Gameiro y col, 2005, 2006), entre otros. Diversosmecanismos han sido implicados en la aparición de hiperalgesia en ratas sometidasa nado forzado: activación y sensibilización de neuronas sensoriales a nivel espinal(Quintero y col, 2003), disminución de la actividad serotoninérgica central (Quintero ycol, 2000), reducción de la liberación de GABA a nivel de las láminas superficialesde las astas dorsales de la médula espinal (Suárez-Roca y col, 2008), estimulaciónrepetida de receptores µ-opioides y NMDA (Suárez-Roca y col, 2006), entre otros;sin embargo los mecanismos exactos no han sido por completo dilucidados.El estrés afecta la actividad cerebral y promueve cambios en múltiples sistemasneuronales. La disfunción del eje hipotálamo-hipófisis-adrenal y en múltiplessistemas de neurotransmisores en el SNC, incluyendo serotoninérgico,noradrenérgico y opioidérgico, han sido reportados (Imbe y col, 2006).Los péptidos opioides (principalmente endorfinas y encefalinas) son liberados enestados de estimulación intensa, como por ejemplo durante el estrés, modificando

31de diferentes maneras los mecanismos homeostáticos circulatorios y cumpliendo asídiferentes roles en la regulación de la respuesta al estrés (McCubbin, 1993). Dehecho diferentes estudios han demostrado que el estrés agudo induce la apariciónde analgesia, la cual es bloqueada o atenuada con la administración previa denaloxona, antagonista del receptor opioide, (Bodnar y col, 1978; Coderre y Rollman,1983; Vaswani y col, 1988), lo que sugiere que el sistema opioide endógeno estáinvolucrado en la analgesia inducida por estrés. De allí que se piense quealteraciones o disregulaciones en el sistema opioide, como el que se piensa ocurredurante el estrés crónico, puedan participar al menos en parte, en la fisiopatologíade la hiperalgesia inducida por estrés crónico. Se plantea así, que la liberaciónfrecuente de opioides como consecuencia de la exposición repetida a un estresorpodría conllevar a una sobreactivación y consecuente desensibilización de losreceptores opioides, resultando en una disminución del efecto analgésico de losopioides endógenos, fenómeno que pudiera estar implicado en el desarrollo dehiperalgesia.En el presente estudio, cuando el antagonista del receptor opioide naloxona fueadministrado previo a cada sesión de condicionamiento, se previno el desarrollo dehiperalgesia (expresada como una disminución en el tiempo de latencia para larespuesta nociceptiva) en el grupo de ratas sometidas a nado forzado pre-tratadascon solución salina, lo cual es congruente con lo anteriormente expuesto, y sugiereque el sistema de opioides endógenos, paradójicamente, juega un papel importanteen el desarrollo de hiperalgesia por estrés de nado forzado repetido. Por otra parte,el pre-tratamiento con naloxona no modificó los períodos de latencia en el platocaliente ni en el grupo de ratas sometidas a simulacro de nado ni en el nocondicionado, lo que sugiere que la naloxona a las dosis utilizadas no tiene efectoper se significativo en la nocicepción. Estos hallazgos corroboran un estudiopreviamente reportado por Suárez-Roca y col (2006).Como se mencionó anteriormente, uno de los mecanismos implicados en eldesarrollo de hiperalgesia inducida por estrés de nado forzado repetido en ratas, esla reducción en la liberación de GABA constitutiva (basal) e inducida por dolor a nivelde las láminas superficiales de las astas dorsales de la médula espinal (Suárez-Roca y col, 2008). Asimismo en otros modelos de estrés crónico, también ha sidoreportada una disminución en los niveles de GABA en diferentes regiones del SNC

32(Acosta y col, 1993; Gronli y col, 2007). En el presente estudio, cuando se administródiazepam, un modulador alostérico positivo del receptor GABA-A, previo a cadasesión de condicionamiento, se previno la aparición hiperalgesia, observada en elgrupo de ratas sometidas a nado forzado, lo que apoya la idea de que la disminuciónen la actividad GABAérgica está implicada en el desarrollo de hiperalgesia en estemodelo de estrés crónico, ya que el diazepam incrementa el tono GABAérgico(Suárez-Roca y col, 2008; Quintero y col, 2011). Asimismo, este efectoantihiperalgésico del diazepam ha sido descrito en otros modelos animales de estréscrónico que conllevan al desarrollo de hiperalgesia (frío, vibración, estrés social)(Vidal, 1982; Jorum, 1988; Omiya y col, 2000). Dado que el diazepam es unmodulador alostérico positivo del receptor GABA-A, esta benzodiazepinaprobablemente compensa la reducción en la liberación de GABA endógeno duranteel estrés de nado forzado mediante el aumento de la afinidad de los receptores postsinápticosGABA-A, manteniendo así el tono GABAérgico y así evitando el desarrollode hiperalgesia.Con respecto a los otros grupos de estudio, el pre-tratamiento con diazepam nomodificó el período de latencia para la respuesta nociceptiva en el plato caliente enel grupo de ratas sometidas a simulacro de nado, pero si en el grupo nocondicionado, donde se observó aumento del mismo, es decir, en este último grupode estudio diazepam mostró un efecto analgésico. De tal manera que el tratamientocon diazepam produjo un efecto antihiperalgésico en el grupo de nado forzado y unefecto analgésico en el grupo no condicionado. Reportes en cuanto al efecto deldiazepam en la nocicepción son controversiales. Se ha planteado que los efectossedativos y ansiolíticos del diazepam pueden influenciar en los resultados de los testnociceptivos en animales, pero que probablemente la droga no tiene efectoantinociceptivo por si misma (Rosland y col, 1987). Congruente con nuestrohallazgo, Zambotti y col (1991) reportaron incremento en la latencia en la prueba deretirada de la cola (tail flick) en respuesta a un estímulo térmico en ratas con laadministración aguda de diazepam, efecto revertido con el uso de un antagonista debenzodiacepinas. Por otra parte otros estudios han reportado que diazepam noprodujo efecto antinociceptivo ni en la prueba de retirada de la cola en respuesta aun estímulo térmico, ni en la prueba del plato caliente (Rosland y col, 1987), pero sien el test de formalina en ratones (Rosland y col, 1987; Knabl y col, 2009); sinembargo los mecanismos por lo que esto ocurre no han sido dilucidados.

33Por lo anteriormente expuesto, es evidente que alteraciones en los sistemasopioidérgico y GABAérgico pudieran estar implicadas en el desarrollo dehiperalgesia en ratas sometidas a estrés de nado forzado repetido, ya que eltratamiento pre-condicionamiento con naloxona y diazepam previnieron el desarrollode la misma, es decir, mostraron un efecto antihiperalgésico en este modelo deestrés crónico.b. Efecto del estrés de nado forzado repetido en la liberación espinal de GABA y enla expresión inducida por dolor de la proteína c-Fos en el asta dorsal de la médulaespinal lumbar.En el presente estudio se encontró que los niveles de GABA en médula espinal,basales e inducidos por dolor, fue significativamente menor en las ratas sometidas anado forzado, en comparación a los niveles observados en las ratas sometidas asimulacro de nado y en las no condicionadas, siendo este efecto parcialmenteprevenido con el uso de diazepam previo cada sesión de nado. En congruencia coneste hallazgo, una disminución en las concentraciones de GABA en el hipocampo yen la región tálamo-hipotálamo 24 horas después del estrés de nado forzadorepetido ha sido reportada (Briones y col, 2005). Asimismo, en otros modelos deestrés crónico se han reportado niveles disminuidos de GABA a nivel de diferentesestructuras del SNC: hipocampo (Gronli y col, 2007), corteza cerebral frontal,hipotálamo y bulbo olfatorio (Acosta y col, 1993). Una reducción en el impulsoGABAérgico hacia las neuronas parvocelulares en el núcleo paraventricular delhipotálamo ha sido observada después del estrés crónico impredecible, debido auna disminución, tanto en el número de sinapsis GABAérgicas funcionales (Verkuyl ycol, 2004), como en la liberación de vesículas que contienen GABA (Verkuyl y col,2005). Esto sugiere que cambios en la neurotransmisión GABAérgica en la médulaespinal podría influenciar directa o indirectamente en la nocicepción.La reducción de GABA podría estar vinculada a cambios a largo plazo de otrosneurotransmisores activados durante el estrés, los cuales son igualmenteimportantes en la modulación del dolor, como por ejemplo, péptidos opioidesendógenos. Varios estudios sugieren una relación inhibitoria recíproca entre GABA yopioides endógenos, al menos en algunas estructuras del SNC. Por ejemplo el

34bloqueo de los receptores GABA-A por microinyección de bicuculina (antagonistaselectivo del GABA) en la sustancia gris periacueductal ventrolateral, incrementa invivo la liberación de meta-encefalina en una manera dosis-dependiente (Williams ycol, 1995). De tal manera que, la reducción en los niveles de GABA en este modelode estrés crónico pudiera estar relacionado con un aumento de la liberación deopioides endógenos por disminución del tono inhibitorio GABAérgico. Esto traeríacomo consecuencia: sobreestimulación y subsecuente desensibilización de losreceptores opioides, el desarrollo de hiperalgesia por disminución del tono inhibitorioopioide sobre la nocicepción y desarrollo de tolerancia al efecto analgésico deopioides exógenos como la morfina.Asimismo, en el presente estudio se evidenció un aumento en la expresión de c-Fos, inducida por la inyección de formalina en la pata trasera, en el asta dorsalipsilateral de la médula espinal lumbar en ratas sometidas a nado forzado. Las astasdorsales espinales contienen neuronas sensoriales de rango dinámico amplio quereciben impulsos sensoriales y nociceptivos estrechamente relacionados conconductas nociceptivas y de discriminación sensorial (Light, 1992). El protooncogénc-fos se activa rápidamente después de estímulos nocivos, expresándosela proteína Fos en neuronas del asta dorsal de la médula espinal, de tal manera quela expresión de c-Fos es un marcador neuronal en respuesta a estímulosnociceptivos (Coggeshall, 2005). De allí que este aumento en la expresión de c-Fosen el asta dorsal de la médula espinal observado en las ratas sometidas a estrés denado forzado repetido pudiera estar en relación con la hiperalgesia observada endicho grupo. Por otra parte, con el uso de diazepam pre-estrés, antes de cadasesión de nado, previamente relacionado con la prevención del desarrollo dehiperalgesia, se observó una disminución significativa en la expresión de la proteínac-Fos, en el asta dorsal de la médula espinal lumbar ipsilateral al sitio deestimulación, en ratas sometidas a nado forzado. Este hallazgo es congruente conotros estudios que han reportado que el uso de diazepam disminuye la expresión dec-Fos, inducida por estrés, en diferentes estructuras del SNC: corteza cerebral,hipocampo, hipotálamo, entre otras (Beck y col, 1997; Alves y col, 2005), e inhibe elincremento de los niveles del ARNm de c-Fos, inducido por estrés de nado forzado,en corteza cerebral e hipocampo (Bozas y col, 1997)

c. Efecto del estrés crónico de nado forzado repetido en el efecto analgésico de lamorfina.35La morfina, y sus derivados opioides, son los fármacos más comunes y efectivosen el tratamiento del dolor severo. Desafortunadamente su uso como terapia a largoplazo se ve limitado por el desarrollo de tolerancia, definida como un estado deadaptación en el cual la exposición repetida a la droga induce cambiosneuroquimicos que resultan en una disminución del efecto analgesico de la drogacon el tiempo (DuPen y col, 2007). Numerosos estudios en animales han reportadodesarrollo de tolerancia al efecto analgésico de la morfina posterior a suadministración crónica (Belozertseva y Bespalov, 1998; Tejwani y col, 1998; Ingramy col, 2008; Lin y col, 2010). Se ha planteado que la clave del mecanismo celularimplicado en el desarrollo de dicha tolerancia es la desensibilización de losreceptores opioides (Williams y col, 2001; Kieffer y Evans, 2002; DuPen y col, 2007).En el presente estudio, la administración de morfina, 24 horas después de laúltima sesión de condicionamiento, produjo una reducción en la nocicepción térmicaen todos los grupos de estudio, sin embargo la eficacia de la morfina para produciranalgesia fue significativamente más baja en ratas sometidas a nado forzado, esdecir, se observó desarrollo de tolerancia al efecto analgésico de la morfina en esteúltimo grupo. Como se planteó anteriormente, la liberación frecuente de opioidescomo consecuencia de la exposición repetida a un estresor intenso podría conllevara una sobreactivación y consecuente desensibilización de los receptores opioides(en forma análoga a lo que ocurre como consecuencia de la administración crónicade opioides exógenos), fenómeno que pudiera estar implicado en el desarrollo detolerancia al efecto analgésico de la morfina observada en las ratas que fueronsometidas a estrés de nado forzado repetido. Por otra parte, al igual que lo descritoen la hiperalgesia inducida por estrés crónico de nado forzado, el desarrollo detolerancia al efecto analgésico de la morfina no es exclusivo del modelo de nadoforzado repetido, sino que ha sido reportado en numerosos estudios animales,donde se han utilizado diferentes protocolos de estrés en forma repetida: nado enagua caliente (Christie y col, 1982), restricción (Benedek y Szikszay, 1985; da Silvay col, 2003; Gameiro y col, 2005, 2006), inmovilización (Puglisi-Allegra y col, 1986),confrontaciones sociales (Belozertseva y Bespalov, 1998), aislamiento social(Szikszay y Benedek, 1989).

d. Efecto de la naloxona en la tolerancia a la morfina inducida por estrés de nadoforzado repetido.36Se planteo anteriormente que uno de los fenómenos que pudiera estar implicadoen el desarrollo de tolerancia al efecto analgésico de la morfina en ratas sometidas aestrés de nado forzado repetido, era la sobreestimulación y consecuentedesensibilización de los receptores opioides. Si esto es cierto, la administracion delantagonista del receptor opioide naloxona durante el protocolo de estrés, deberiabloquear la activacion de dichos receptores por opioides endogenos liberadosdurante el estres y asi prevenir el desarrollo de tolerancia al efecto analgesico de lamorfina. Sin embargo, en contraste a lo esperado, en el presente estudio el uso denaloxona pre-condicionamiento no previno el desarrollo de tolerancia al efectoanalgésico de la morfina en las ratas sometidas a estrés de nado forzado repetido,por el contrario, aumentó dicha tolerancia. Este resultado, no obstante, esconsistente con los hallazgos de Ibuki y col (1997), quienes evaluaron la magnitudde la respuesta al efecto analgésico de la morfina en ratas, luego de la exposicióncrónica a una infusión espinal continua de la misma (20 nmol/h durante 7 días),reportando una mayor tolerancia en ratas co-tratadas con naloxona (0,6 mg/kg, s.c.)en comparación con aquellas tratadas solo con el agonista opioide (Ibuki y col,1997). A su vez, los hallazgos de Ibuki y col (1997) son consistentes con un estudioque muestran que la naloxona (2 mg/kg, i.p.) incrementa la liberación espinal deglutamato y que antagonistas del receptor NMDA aminoran la pérdida del efectoopioide en un modelo de infusión espinal con morfina, lo que explicaría el incrementode la tolerancia al efecto analgésico de la morfina en ratas co-tratadas con naloxonaen dicho modelo (Jhamandas y col, 1996).Por otra parte, cabe señalar, que los opioides producen analgesia por activacióndel receptor opioide μ ligado a proteína G inhibitoria (Gi/o) e interacciones concanales iónicos relacionados que disminuyen la transmisión sináptica y laexcitabilidad neuronal en neuronas espinales por hiperpolarización (Zöllner y Stein,2007). Paradójicamente, después de la exposición crónica a opioides exógenos,puede emerger un efecto excitatorio sobre los mecanismos modulatorios de lanocicepción que podrían contribuir al desarrollo de la tolerancia al efecto analgésico,e incluso, estar asociado al desarrollo de hiperalgesia. Dicho efecto excitatorio de losopioides y el desarrollo de tolerancia no se observa, en preparaciones de celularesin vitro, si la morfina se administra junto con dosis ultrabajas de naloxona (Wang y

37col, 2005). Otros estudios han reportado hallazgos similares, donde la administraciónconjunta de morfina con dosis ultrabajas de naloxona mejora significativamente laeficacia y potencia antinociceptiva de la morfina e inhibe la inducción de toleranciacrónica, e incluso revierten la ya establecida (Crain y Shen, 2000; Abul y col, 2007;Lin y col, 2010). Algunos mecanismos han sido implicados en este efecto:atenuación de la transmisión glutamatérgica y neuroinflamación, inhibición de lasobreexpresión de citocinas proinflamatorias causado por la administración intratecalcontinua de morfina, e incremento en la expresión de IL-10 (citocina antiinflamatoria)(Lin y col, 2010). El efecto de dosis ultrabajas de antagonistas opioides no se limitaexclusivamente a la tolerancia crónica, observándose también bloqueo del desarrollode tolerancia aguda, en ratas expuestas a tres dosis de morfina intratecal aintervalos de 90 minutos (McNaull y col, 2007). Este efecto de naloxona parece serdependiente de la dosis; a dosis muy bajas (3 μg/Kg) induce un efectoantinociceptivo y dosis mucho mas altas (1 mg/kg o más) un efecto hiperalgésico enmodelos experimentales de mononeuropatía (Attal y col, 1990) y de dolor crónico enratas (Kayser y col, 1996). En el presente estudio, el presente estudio se utilizo unadosis de naloxona de 0.1mg/kg, relativamente alta en comparación con la dosis de 3μg/Kg que induce analgesia, por lo que debería esperarse que la naloxonafavoreciera la aparición de un estado hiperalgésico que antagonizaríafuncionalmente la analgesia de la morfina, lo cual se observaría como un fenómenode tolerancia. De esta manera, ya que el uso de naloxona (al menos no a las dosisutilizadas) no previno el desarrollo de tolerancia al efecto analgésico de la morfina enratas sometidas a nado forzado, una disminución de la sensibilidad o la activación delos receptores opioides, asociada a una excesiva y repetida estimulación porliberación excesiva de opioides endógenos durante el estrés, no parece estarimplicada o suficiente.e. Efecto del diazepam en la tolerancia a la morfina inducida por estrés de nadoforzado repetido.En el presente estudio el uso de diazepam previo al condicionamiento estresanteprevino el desarrollo de la tolerancia al efecto analgésico de la morfina observada enlas ratas sometidas a nado forzado repetido, lo que sugiere que la disminución de laactividad GABAérgica pudiera estar implicada en el desarrollo de tolerancia a lamorfina. Congruente con nuestros hallazgos, la administración concomitante de

38benzodiacepinas (moduladores alostéricos positivos del GABA) como diazepam(Tejwani y col, 1994; 1998) o midazolam (Asl y col, 2008) y morfina resulta eninhibición del desarrollo de tolerancia a esta última. Asimismo, los agonistasGABAérgicos que actúan directamente estimulando receptores GABA, mejoran elefecto analgésico de los opioides (Sivam y Ho, 1985). La administraciónconcomitante de muscinol (agonista GABA-A) y morfina potencia el efectoantinociceptivo, somático y visceral de esta última tanto en intensidad como enduración (Hara y col, 1999).Como se mencionó anteriormente no se saben los mecanismos por los cuales eltratamiento pre-estrés con diazepam previno el desarrollo de hiperalgesia y eldesarrollo de tolerancia al efecto analgésico de la morfina en ratas sometidas aestrés de nado forzado repetido. Quintero y col (2011) reportaron en ratas sometidasa nado forzado repetido una disminución en la liberación de GABA, asociada a unincremento en la liberación de glutamato, por encima del rango fisiológico normal, enla médula espinal; hallazgos asociados a la presencia de hiperalgesia cutáneainflamatoria y revertidos con el uso de diazepam. Glutamato es el principal mediadorexcitatorio del SNC, y está involucrado en muchos procesos fisiológicos ypatológicos, entre ellos en dolor crónico (Mayer y Westbrook, 1987). Igualmente,reducción de la actividad GABAérgica endógena ha sido observada en estados dedolor crónico (Ibuki y col, 1997; Moore y col, 2002). De tal manera que estedesbalance en los niveles de neurotransmisores inhibitorios y excitatorios a nivelespinal, GABA y glutamato respectivamente, inducido por el estrés de nado forzadorepetido, pudiera tener un impacto significativo en la transmisión nociceptiva, con elconsecuente desarrollo de hiperalgesia y tolerancia al efecto analgésico de opioidesexógenos observada en este modelo de estrés crónico. El aumento en la liberaciónde glutamato en la médula espinal de ratas sometidas a estrés de nado forzadopudiera conducir a la sobreactivación de los receptores AMPA/kainato, yposteriormente a la activación de los receptores NMDA. Numerosos estudiosplantean la participación de los receptores glutamatérgicos, de tipo NMDA, en latolerancia analgésica a la morfina (Hernández y Cruz, 2005); otros han reportadoque el uso de antagonistas del receptor NMDA inhiben el desarrollo de toleranciaanalgésica a opioides (Popik y Kozela, 1999; Trujillo KA, 2000; Fischer y col, 2010),y algunos incluso revierten gradualmente la tolerancia ya establecida. Por otra parte,hay evidencia de que en animales tolerantes se incrementa la afinidad de los

eceptores NMDA y hay una regulación en baja de los transportadores espinales deglutamato por lo que aumenta su actividad excitatoria (Chih-Shung y col, 2000).39Dado que, en el presente estudio, el tratamiento pre-estrés con diazepam evitó ladisminución de la liberación espinal de GABA en ratas estresadas con nado forzado,y se sabe que aumenta la afinidad de los receptores GABA-A postsinápticos,manteniendo así el tono GABAérgico aun en presencia de de bajos niveles de GABAespinal, los niveles de glutamato se mantendrían bajos (niveles fisiológicos) y no seproduciría la activación de los receptores glutamatérgicos subtipo NMDA; comoresultado, no se produciría ni hiperalgesia ni tolerancia al efecto analgésico de lamorfina, hallazgos observados en el presente estudio.

CONCLUSIONES401. El estrés de nado forzado repetido en ratas induce el desarrollo de hiperalgesiatérmica cutánea. La administración de naloxona y diazepam, previo cada sesiónde condicionamiento, previno el desarrollo de hiperalgesia; de tal manera quenaloxona y diazepam mostraron un efecto antihiperalgésico en este modelo deestrés crónico.2. La liberación basal e inducida por dolor de GABA en la médula espinal fue másbaja en ratas sometidas a nado forzado.3. La expresión inducida por dolor de la proteína c-Fos en médula espinal fue másalta en ratas sometidas a nado forzado, siendo inhibida dicha sobreexpresión conel uso pre-condicionamiento de diazepam.4. La eficacia de la morfina para producir analgesia fue más baja en ratassometidas a nado forzado (es decir, desarrollaron tolerancia a la misma), efectoque fue prevenido con la administración, previa cada sesión de condicionamientode diazepam e intensificado con la administración de naloxona.5. Cambios en la transmisión GABAérgica y opioidérgica están implicados, almenos en parte, en el desarrollo de hiperalgesia térmica cutánea y de toleranciaal efecto analgésico de la morfina en ratas sometidas a nado forzado.

IMPLICACIONES CLINICAS41El estrés constituye un problema de salud pública importante, ya que afectasignificativamente a un gran número de personas en la actualidad, con ampliasrepercusiones en su vida laboral y familiar, afectando tanto la salud física como lamental. El estrés está, en muchos casos, asociado a dolor crónico inexplicable,observándose, en patologías como la fibromialgia, síndrome de fatiga crónica ytrastornos psiquiátricos, como la ansiedad y la depresión mayor, exacerbación decuadros dolorosos luego de episodios repetidos de estrés (Khasar, 2008). Demanera que cambios en los niveles de ansiedad inducidos por estrés secorrelacionan con cambios en la nocicepción en humanos. Por ejemplo, la intensidaddel dolor es mayor en pacientes con ansiedad inducida por estrés (Van den Hout ycol, 2001), pudiendo ser aliviado por medidas que reduzcan la ansiedad (Suls y col,1989). Así, el diazepam (ansiolítico) reduce la dimensión afectiva del dolor(desagrado, ansiedad, miedo, etc) pero no la intensidad del dolor en los sereshumanos (Gracely y col, 1978), lo que sugiere que el diazepam al mismo tiempopodría reducir la hiperalgesia y la ansiedad, dos fenómenos no secuencialescoexistentes, actuando sobre un mecanismo común, es decir, mejorando laneurotransmisión de GABA. Si ese es el caso, la hiperalgesia inducida por estrés denado forzado repetido en ratas podría ser un modelo animal que permitiría ayudar ala comprensión de los estados de dolor exagerado asociado a altos niveles deansiedad, una situación ampliamente vista en la práctica médica y los trastornospsicosomáticos. En otro sentido, los analgésicos opioides constituyen unaherramienta fundamental en el manejo de estos cuadros de dolor crónico, por supotente efecto analgésico; sin embargo, a largo plazo dicha efectividad se velimitada por el desarrollo de tolerancia. Considerando la relación existente entreepisodios de estrés crónico y la aparición desarrollo de tolerancia al efectoanalgésico de los opioides, resulta de invaluable interés estudiar la modulaciónfarmacológica de los receptores opioides bajo condiciones de estrés. De tal manerade poder comprender más profundamente los mecanismos implicados en laaparición de los fenómenos de hiperalgesia y tolerancia analgésica inducida porestrés, y por ende, poder desarrollar estrategias terapéuticas orientadas a manejareficazmente el dolor crónico asociado a estrés. El estudio continuo del fenómenopermitirá definir protocolos diagnósticos y terapéuticos para los pacientes afectadoscon estos cuadros.

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INDICE DE FIGURAS50Pág.Figura 1. Respuesta nociceptiva………………………………………………….. 21Figura 2 Respuesta nociceptiva con el uso pre-estrés de naloxona……….... 22Figura 3 Respuesta nociceptiva con el uso pre-estrés de diazepam…………. 22Figura 4 Influencia del estrés de nado forzado repetido y test de formalinaen la liberación in vivo de GABA en la médula espinal lumbar enratas……………………………………………………............................ 23Figura 5 Influencia del diazepam en la liberación basal e inducida por dolorde GABA en médula espinal en ratas sometidas a estrés de nadoforzado repetido……………………………………………………….…. 24Figura 6 Figura 6. Microfotografías (100X) mostrando la expresión de laproteína c-Fos inducida por formalina en el asta dorsal ipsilateral alsitio de inyección, en ratas no condicionadas (A), sometidas asimulacro de nado (B) y nado forzado (C)……………………………. 25Figura 7 Efecto del estrés de nado forzado repetido en la expresión de c-Fosen médula espinal lumbar……………………………………………….. 25Figura 8 Figura 8. Microfotografías (100X) mostrando la expresión de laproteína c-Fos inducida por formalina en el asta dorsal ipsilateral alsitio de inyección en ratas no condicionadas (A) y sometidas a nadoforzado (B). Efecto del diazepam……………………………………….. 26Figura 9 Efecto del diazepam en la expresión de la proteína c-Fos en lamédula espinal luego de la inyección intraplantar de formalina enratas sometidas a estrés de nado forzado repetido…………………... 26Figura 10 Efecto de la exposición al estrés de NF en la respuesta analgésicaa la morfina………………………………………………………………... 27Figura 11 Efecto del tratamiento pre-condicionamiento con naloxona en latolerancia al efecto analgésico de la morfina inducida por el estrésde nado forzado repetido………………………………………………… 28Figura 12 Efecto del tratamiento pre-condicionamiento con diazepam en latolerancia al efecto analgésico a la morfina inducida por el estrés denado forzado repetido……………………………………………………. 29