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研 究 報 告OsMAPK3 與 轉 基 因 水 稻 及 巴 拉 刈 抗 性 185離 層 酸 誘 導 之 OsMAPK3 水 稻 轉 殖 株 可 提 升 巴 拉 刈之 抗 性趙 雲 洋 、 劉 麗 飛 、 張 孟 基 *國 立 臺 灣 大 學 農 藝 系摘 要作 物 對 除 草 劑 巴 拉 刈 之 抗 性 與 其 調 控 活化 氧 族 之 解 毒 能 力 有 關 。 先 前 研 究 顯 示 抑 制OsMAPK3 (Mitogen activated proteinkinase 3) 基 因 之 表 現 會 降 低 抗 氧 化 酵 素 的活 性 , 降 低 水 稻 對 非 生 物 逆 境 之 耐 受 性 。 因此 本 試 驗 將 ABA 誘 導 OsMAPK3 表 現 之 農桿 菌 質 體 , 轉 殖 於 臺 農 67 號 水 稻 中 , 探 討 水稻 轉 殖 株 之 抗 氧 化 酵 素 活 性 是 否 增 加 , 進 而得 以 提 升 水 稻 對 巴 拉 刈 之 抗 性 。 由 RT-PCR得 知 , 內 生 OsMAPK3 基 因 可 受 H 2 O 2 、ABA誘 導 ; 巴 拉 刈 則 無 影 響 。 同 時 OsMAPK3 轉殖 水 稻 經 ABA 處 理 後 可 有 效 誘 導 該 基 因 之表 現 。 比 較 非 轉 殖 株 與 OsMAPK3 轉 殖 水 稻間 抗 氧 化 酵 素 活 性 之 差 別 , 發 現 轉 殖 水 稻Catalase (CAT) 和 Ascorbate peroxidase(APX) 的 活 性 均 較 非 轉 殖 株 高 , 而 H 2 O 2 含量 則 較 低 。 以 巴 拉 刈 處 理 非 轉 殖 與OsMAPK3 過 量 表 現 之 稻 株 , 結 果 顯 示 轉 殖水 稻 的 Fv/Fm 比 值 與 葉 綠 素 含 量 都 比 非 轉殖 水 稻 高 , 生 長 外 觀 相 對 較 佳 。 顯 示 大 量 表現 OsMAPK3 可 提 升 水 稻 抗 氧 化 酵 素 活 性進 因 增 加 水 稻 對 巴 拉 刈 之 抗 性 。 綜 合 而 言 ,本 試 驗 結 果 指 出 調 控 水 稻 MAPK 之 訊 息 路徑 , 改 變 其 抗 氧 化 能 力 可 作 為 未 來 有 效 提 升作 物 除 草 劑 抗 性 之 可 能 途 徑 。* 通 信 作 者 , menchi@ntu.edu.tw投 稿 日 期 :2007 年 4 月 1 日接 受 日 期 :2007 年 4 月 9 日作 物 、 環 境 與 生 物 資 訊 4:185-200 (2007)Crop, Environment & Bioinformatics 4:185-200 (2007)189 Chung-Cheng Rd., Wufeng, Taichung Hsien41301, Taiwan ROC關 鍵 詞 ..MAPK, 巴 拉 刈 , 氧 化 逆 境 , 抗 氧化 酵 素 。Expression of an ABA-InducedOsMAPK3 in Transgenic Rice (Oryzasativa. L) Increases Paraquat ResistanceYun-Yang Chao, Li-Fei Liu and Men-Chi Chang*Department of Agronomy, National TaiwanUniversity, Taipei 10617, Taiwan ROCABSTRACTIn crops, the detoxification capabilityespecially in eliminating the accumulation ofreactive oxygen species, is highly linked to theherbicide tolerance of paraquat. Previous datashowed that by inhibition of OsMAPK3expression in rice resulted in decrease ofantioxidant enzymatic activities and reducedabiotic stress tolerance. Hence, in this study wetested whether by ABA-induced OsMAPK3expression in rice can lead to increase ofantioxidant enzymatic activities and furtherenhance paraquat resistance. RT-PCR analysisindicated that the endogenous OsMAPK3expression was induced by H 2 O 2 and ABA butnot paraquat. Meanwhile, after ABA treatmentthe OsMAPK3 expression was effectively inducedin transgenic rice. Antioxidant enzymaticactivities analysis showed that catalase (CAT) andascrobate peroxidase (APX) activities were bothincreased and the H 2 O 2 content was reduced intransformant. Also, OsMAPK3 transformant displayedhigher PSII electron transfer efficiency(Fv/Fm) and chlorophyll content after paraquattreatment and grew better than control. Theseresults suggest that up-regulation of OsMAPK3

186Crop, Environment & Bioinformatics, Vol. 4, September 2007not only increased the oxidative-inducedantioxidant defense but also improved riceparaquat tolerance. Taken together, bymanipulation the expression of MAPK gene andchanging the antioxidant capacity may provide analternative for producing transgenic herbicidetolerance crops in future.Key words: Mitogen-activated Protein kinase(MAPK), Paraquat, Oxidative stress,Antioxidant.前 言作 物 產 量 及 品 質 的 提 升 有 賴 田 間 雜 草 的防 除 。 為 了 防 止 除 草 劑 的 濫 用 提 高 田 間 之 管理 效 率 , 增 進 土 壤 再 利 用 能 力 , 抗 除 草 劑 轉基 因 作 物 之 研 發 有 其 必 要 性 更 成 為 農 業 生 技公 司 近 年 來 主 要 之 研 發 項 目 。 如 Monsanto、AgrEo、 AMYC、 Rhone Poluenc 等 公 司皆 已 發 展 出 抗 不 同 除 草 劑 (glyphosphate、glufosinate、 imidazole、phosphinothricin及 buctril) 之 轉 基 因 作 物 , 包 括 玉 米 、 大豆 、 油 菜 、 棉 花 、 菸 草 、 馬 鈴 薯 、 小 麥 及 水稻 等 。 目 前 抗 除 草 劑 轉 基 因 作 物 之 發 展 , 在促 進 除 草 劑 之 選 擇 性 使 用 、 改 善 栽 培 技 術 如直 播 水 稻 及 雜 交 水 稻 種 子 製 種 、 減 少 除 草 劑之 施 用 等 皆 有 重 要 的 商 業 價 值 。 迄 今 為 止 ,在 植 物 基 因 工 程 上 如 何 獲 得 更 有 效 、 抗 多 重除 草 劑 之 轉 基 因 作 物 依 然 是 研 究 重 點 。一 般 除 草 劑 依 其 化 學 結 構 及 作 用 模 式 ,可 分 為 抑 制 光 合 作 用 型 ( 如 : 巴 拉 刈 )、auxin型 ( 如 :2,4-D )、 抑 制 脂 質 合 成 型 、 抑 制 胺基 酸 合 成 型 ( 如 glycophosate ) 等 。 由 植 物對 除 草 劑 抗 性 生 理 機 制 之 研 究 可 知 除 草 劑 在施 用 後 , 植 株 可 於 不 同 階 段 包 括 吸 收 、 轉 運 、代 謝 、 解 毒 ( 抗 氧 化 ) 及 改 變 目 標 酵 素 之 活 性等 過 程 產 生 抗 性 。 目 前 抗 除 草 劑 轉 基 因 作 物主 要 經 由 (1) 修 飾 除 草 劑 作 用 的 標 的 蛋 白 ,使 植 物 對 除 草 劑 不 敏 感 , 或 過 量 表 現 標 的 蛋白 酶 , 有 效 解 除 除 草 劑 對 植 物 的 傷 害 , 如 :Subramanian (1990) 等 人 發 現 菸 草 與 棉 花acetolactate synthase (ALS) 基 因 的 突 變體 , 可 以 抵 抗 除 草 劑 Triazolopyrimidinesulfanilides 的 危 害 。 而 Harrison (1996) 等人 則 藉 由 農 桿 菌 轉 殖 法 將 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS)基 因 轉 殖 於 大 豆 中 , 發 現 此 轉 殖 大 豆 能 耐 除草 劑 glyphosate 的 傷 害 。(2) 藉 由 轉 殖 特 定酵 素 直 接 去 除 除 草 劑 的 毒 害 , 如 :Cao et al.(1992) 從 Streptomyces hygroscopicus 菌 中選 殖 出 phosphinothricin N-acetyltransferase(PAT) 基 因 , 藉 由 微 注 射 技 術 將PAT 基 因 ( 又 稱 bar 基 因 ) 轉 殖 於 水 稻 中 , 轉殖 水 稻 經 廣 效 性 除 草 劑 Basta 處 理 後 ,PAT酵 素 可 將 acetyl-coenzyme A 上 的 乙 醯 基 轉移 至 固 殺 草 (phosphinothricin, PTT) 之 胺 基上 , 使 固 殺 草 失 去 毒 性 。(3) 增 強 植 株 對 除 草劑 之 代 謝 , 如 Kawahigashi et al. (2005) 將人 類 細 胞 色 素 P450 基 因 (CYP1A1、CYP2B6和 CYP2C1P) 構 建 於 同 一 表 現 載 體p1KBASH 轉 入 日 本 晴 水 稻 中 , 發 現 該 轉 殖株 可 對 多 種 除 草 劑 呈 現 抗 性 。在 廣 效 性 除 草 劑 中 以 巴 拉 刈 對 植 物 的 傷害 與 影 響 最 大 , 因 為 巴 拉 刈 (1,1'-dimethyl-4,4'-bipyridium, 分 子 式 為 C 12 H 14 N 2 ) 極 易 溶 於水 且 具 有 很 強 的 還 原 能 力 , 屬 於 聯 砒 啶 類(pyridine) 非 選 擇 性 萌 後 接 觸 型 的 除 草 劑 。 防除 之 雜 草 包 括 : 水 稗 、 鴨 舌 草 、 滿 天 星 及 其他 禾 本 科 、 莎 草 科 、 菊 科 、 莧 科 、 豆 科 等 植物 。 作 用 機 制 是 當 植 物 進 行 光 合 作 用 時 , 在光 反 應 系 統 I 接 受 電 子 後 , 依 序 將 電 子 傳 給鐵 氧 化 還 原 蛋 白 (Fd;Ferredoxin) 與 黃 素 蛋 白(Fp;Flavoprotein)。 在 此 電 子 傳 遞 過 程 中 巴拉 刈 很 容 易 奪 取 鐵 氧 化 還 原 蛋 白 與 黃 素 蛋 白應 接 收 的 電 子 轉 移 給 氧 分 子 而 形 成 活 化 氧 族物 質 ( 如 O- 2 )。 進 而 引 起 細 胞 膜 系 的 脂 肪 酸 氧化 , 破 壞 膜 系 並 使 膜 系 崩 解 最 後 造 成 植 物 枯萎 死 亡 (Chia et al. 1981 )。 當 植 物 吸 收 巴 拉 刈產 生 活 化 氧 族 後 , 若 能 調 控 抗 氧 化 酵 素 活 性減 低 氧 化 逆 境 危 害 , 即 可 避 免 巴 拉 刈 的 毒 害 。植 物 在 生 長 發 育 過 程 處 於 不 同 之 生 物 或非 生 物 逆 境 , 如 : 乾 旱 、 鹽 害 、 高 、 低 温 、重 金 屬 、 強 光 、 除 草 劑 與 病 害 (Allen 1995,

OsMAPK3 與 轉 基 因 水 稻 及 巴 拉 刈 抗 性 187Desikan et al. 2001) 下 皆 會 引 起 氧 化 逆 境 而受 到 傷 害 。 目 前 已 知 在 真 核 生 物 中 ,Mitogen-activated protein kinase (MAPK)可 參 與 氧 化 逆 境 下 活 化 氧 族 的 訊 息 傳 遞(Gustin et al. 1998)。MAPK 訊 息 傳 遞 是 經 由一 連 串 磷 酸 化 與 去 磷 酸 化 的 過 程 , 此 途 徑 主要 是 由 MAPKKK 開 始 活 化 下 游 的MAPKKs, 當 MAPKKs 被 活 化 後 即 接 續 活化 下 游 的 MAPKs 進 而 啟 動 下 游 相 應 對 的基 因 , 增 強 植 物 對 氧 化 逆 境 之 防 禦 能 力 而 可耐 受 不 同 之 逆 境 (Mizoguchi et al. 1997)。 在阿 拉 伯 芥 中 已 知 有 80 個 MAPKKKs、10個 MAPKKs 與 23 個 MAPKs 等 基 因(Ichimura et al. 2002)。 Reyna and Yang(2006) 比 對 水 稻 基 因 庫 發 現 有 17 個OsMAPKs 基 因 , 因 此 分 成 A ~ F 六 群 , 其中 A、B、C 三 群 和 生 物 性 與 非 生 物 性 逆 境的 調 控 有 關 , 而 D、E、F 三 群 的 功 能 仍 未知 。 本 試 驗 探 討 的 OsMAPK3 基 因 屬 於 C群 。 此 基 因 位 於 第 二 條 染 色 體 上 , 另 外 一 個 C群 的 OsMPK4 基 因 是 位 於 第 六 條 染 色 體上 , 兩 者 在 氨 基 酸 序 列 上 有 91% 相 似 。 根據 Agrawal et al. (2003) 及 Fu et al. (2002)之 研 究 , 已 知 OsMPK4 參 與 不 同 非 生 物 性逆 境 的 調 控 。目 前 對 於 氧 化 逆 境 下 MAPK 與 活 化 氧 族及 抗 氧 化 酵 素 含 量 及 活 性 的 變 化 與 調 控 已 有諸 多 報 導 。Yuasa et al. (2001) 將 阿 拉 伯 芥T87 懸 浮 細 胞 處 理 巴 拉 刈 或 3-amino -1,2,4-triazole (catalase 抑 制 劑 ) 後 , 會 增 加 活化 氧 族 的 含 量 , 提 高 細 胞 內 H 2 O 2 濃 度 並 使ATMPK6 的 活 性 增 強 。 另 外 Rentel et al.(2004) 發 現 OXI1 (Oxidative signalinducible1) 蛋 白 具 絲 胺 酸 (Serine)/ 酥 胺 酸(Threonine) 蛋 白 酶 的 功 能 , 可 受 H 2 O 2 的 誘導 而 表 現 。 同 時 OXI1 蛋 白 也 能 活 化 受H 2 O 2 誘 導 的 AtMPK3 與 AtMPK6 的 活性 (Kovtun et al. 2000), 顯 示 活 化 氧 族 與MAPK 這 兩 個 路 徑 的 訊 息 是 藉 由 OXI1 連接 後 , 接 續 將 訊 息 傳 遞 至 下 游 的 基 因 。 此 外Capone et al. (2004) 直 接 將 阿 拉 伯 芥 根 部 處理 H 2 O 2 15 分 鐘 後 即 有 50~60 kDa 的 蛋白 激 酶 開 始 表 現 。 另 亦 可 偵 測 到 38 kDa 與42 kDa 的 MAPK 蛋 白 。 表 示 當 阿 伯 芥 根 圈(rhizosphere ) 受 到 活 化 氧 族 刺 激 後 , 可 快 速將 訊 息 傳 遞 給 地 上 部 而 活 化 MAPK 蛋 白 開啟 防 禦 機 制 而 提 高 植 物 對 逆 境 的 耐 受 力 。 此外 Zhang et al. (2006) 對 玉 米 葉 片 進 行 ABA與 H 2 O 2 處 理 經 兩 小 時 後 , 可 觀 測 到 46 kD的 MAPK 的 蛋 白 被 活 化 , 且 促 進 下 游 抗 氧化 基 因 之 表 現 並 提 高 其 活 性 , 例 如 :CAT1、cAPX、GR1 與 SOD。 由 上 可 知 植 物 清 除 活化 氧 族 的 防 禦 機 制 可 能 主 要 藉 由 MAPK 將訊 息 傳 遞 至 下 游 的 轉 錄 因 子 , 啟 動 清 除 自 由基 酵 素 的 基 因 並 活 化 其 蛋 白 質 的 活 性 , 如 :Superoxide dismutase (SOD) 、 Ascorbateperoxidase (APX) 、 Catalase (CAT) 和Glutathione reductase (GR)。 進 而 減 少 活 化氧 族 之 產 生 與 累 積 (Mittler et al. 2004)。 之 前我 們 已 證 實 抑 制 OsMAPK3 基 因 表 現 會 降低 抗 氧 化 酵 素 的 活 性 , 進 而 減 弱 植 株 對 乾 旱與 鹽 害 的 耐 受 性 (Chao et al. 2007)。 因 此 本 試驗 藉 由 離 層 酸 誘 導 OsMAPK3 表 現 之 水 稻 轉殖 株 , 探 討 是 否 可 以 因 調 控 MAPK 路 徑 中OsMAPK3 之 表 現 增 加 抗 氧 化 酵 素 的 活 性 ,進 而 提 高 水 稻 對 除 草 劑 巴 拉 刈 的 抗 性 。 試 驗結 果 顯 示 以 離 層 酸 誘 導 OsMAPK3 可 增 加水 稻 抗 氧 化 酵 素 活 性 及 對 巴 拉 刈 之 抗 性 , 表示 調 控 水 稻 OsMAPKs 基 因 之 表 現 可 作 為提 升 作 物 除 草 劑 抗 性 之 可 能 途 徑 。材 料 和 與 方 法一 、 基 因 來 源 與 質 體 構 築本 試 驗 所 用 的 OsMAPK3 基 因(Accession No. AF241166) 是 國 立 嘉 義 大 學農 藝 學 系 侯 新 龍 助 理 教 授 , 從 水 稻 懸 浮 細 胞在 糖 缺 乏 下 , 以 差 異 性 篩 選 所 選 殖 而 得 之 。本 研 究 室 獲 贈 該 基 因 後 , 進 行 質 體 構 築 。 首先 將 載 體 pET 32a (Novagen) 與 含OsMAPK3 基 因 的 質 體 pBS MAPK 各 別 進 行

188Crop, Environment & Bioinformatics, Vol. 4, September 2007Sal I 與 Not I 酶 切 反 應 。 將 酶 切 後 兩 DNA片 段 黏 接 得 到 含 OsMAPK3 基 因 的 質 體 pETMAPK。 再 以 Nco I 與 Xho I 酶 切 質 體pQS122Z( 中 研 院 植 物 所 賀 端 華 教 授 提 供 ), 可將 約 2.8 Kb TPS (Trehalose-6-PhosphateSynthase) 基 因 切 除 後 當 成 載 體 。 然 後 再 與 從質 體 pET MAPK 經 Nco I 和 Xho I 酶 切 後分 離 得 到 的 MAPK 片 段 黏 接 即 可 得 到 以ABRC 為 啟 動 子 及 Nos 為 終 結 子 誘 導OsMAPK3 之 基 因 表 現 質 體 pQS MAPK。 最後 將 經 Sac I 酶 切 後 並 補 成 平 端 的 pQSMAPK 質 體 , 與 經 Sina I 酶 切 後 之 農 桿 菌 載體 pCAMBIA 1302 黏 接 即 得 到 最 後 轉 殖 所 用的 質 體 p1302 ARMK (Fig. 1)。二 、 水 稻 基 因 轉 殖 、 植 株 再 生 與 繁 殖本 試 驗 以 水 稻 臺 農 67 號 (Oryza sativa L.cv. TNG 67) 為 材 料 , 取 開 花 後 約 10~15 天的 未 成 熟 胚 , 滅 菌 後 接 種 在 誘 導 癒 合 組 織CIM 培 養 基 (2N6 基 礎 培 養 基 ;3.98 g L -1 N6salt,30 g L -1 Sucrose, 0.5 mg L -1 Nicotinicacid,1.0 mg L -1 Thiamine HCl,0.5 mg L -1Pyridoxin HCl) 中 並 添 加 10 μM 2-4dichlorophenoxyacetic acid, 置 於 28℃ 全 日照 培 養 室 中 , 培 養 至 少 3 週 。 當 癒 合 組 織 形成 後 , 經 繼 代 培 養 3~4 週 , 做 為 農 稈 菌 轉 殖材 料 。 利 用 MicroPulser (Bio-RadLaboratories, UK) 電 穿 孔 儀 , 將 已 構 築 好 的p1302ARMK 質 體 轉 入 LBA4404 菌 系 , 並 培養 於 含 100 mg L -1 Kanamycin 的 3 mL YEP(1% Bacto-tryptone , 0.5% Bacto-yeastextract,0.5% NaCl) 液 態 培 養 基 中 , 在 28℃振 盪 培 養 過 夜 。 將 含 質 體 的 農 桿 菌 液 與 癒 合組 織 混 合 後 , 置 於 2N6-AS 培 養 基 (2N6 基礎 培 養 基 中 加 100 μM Acetosyrigone (AS)、30 g L -1 Glucose) 中 共 同 培 養 3 天 , 然 後 以無 菌 水 洗 去 大 部 分 農 桿 菌 之 菌 體 , 再 用 含 有250 mg L -1 Cefotaxime (Sigma) 的 MS 培 養 基洗 滌 癒 合 組 織 , 隨 後 移 至 CIM-CH 篩 選 培 養基 (CIM 培 養 基 中 加 250 mg L -1 Cefotaxime與 50 mg L -1 Hygromycin) 上 , 於 28℃ 全 日照 培 養 室 中 培 養 3~4 週 , 可 得 到 具Hygromycin 抗 性 的 癒 合 組 織 。 接 著 將 此 癒合 組 織 移 置 RM 分 化 培 養 基 (2N6 基 礎 培 養 基再 添 加 250 mg L -1 Cefotaxime、50 mg L -1Hygromycin、300 mg L -1 Casein、 0.5 mgL -1 Proline、100 mg L -1 Kinetin、250 mg L -1Myo-Inositol) 上 , 於 28℃ 全 日 照 培 養 室 中培 養 4 週 , 得 到 再 生 水 稻 。 隨 後 將 再 生 苗 移至 不 含 抗 生 素 之 MS 固 態 培 養 基 (MS 基 礎 培養 基 中 添 加 3 g L -1 Phytagel), 培 養 2-3 週後 , 將 再 生 苗 移 至 人 工 氣 候 室 種 植 ( 日 25℃/Fig. 1. Schematic diagram of the ABA-induced expression plasmid p1302 ARMK. RB, right border; LB,left border; ABRC, ABA responsive complex of ABA inducible promoter; MA, amplifiedfull-length cDNA fragment of OsMAPK3 gene; NOS, nopaline synthase terminator; 35S,cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter; Hygromycin R, hygromycin Bphosphotransferase. Bold underlined bar represents probe used for Southern blot analysis.

OsMAPK3 與 轉 基 因 水 稻 及 巴 拉 刈 抗 性 189夜 20℃), 栽 培 約 4 個 月 , 得 到 T 1 代 種 子 ,並 於 人 工 氣 候 室 種 植 繁 殖 T 2 代 。三 、 轉 殖 水 稻 之 Hygromycin 篩 選取 T 2 代 種 子 以 1% 次 氯 酸 鈉 滅 菌 後 浸 於水 中 , 置 於 28℃ 暗 箱 催 芽 兩 天 , 再 培 養 於 含50 mg L -1 Hygromycin 的 木 村 氏 水 耕 溶 液中 。 然 後 於 人 工 氣 候 室 ( 日 25℃/ 夜 20℃) 生 長兩 星 期 , 計 算 耐 抗 生 素 Hygromycin 水 稻 植株 的 比 例 。 藉 由 轉 殖 株 耐 性 比 例 並 配 合 孟 德爾 定 律 , 決 定 轉 殖 水 稻 是 否 為 轉 基 因 單 一 拷貝 之 插 入 及 是 否 為 同 質 或 異 質 結 合 體 。四 、OsMAPK3 基 因 表 現 量 之 檢 測臺 農 67 號 水 稻 生 長 至 三 葉 齡 幼 苗 時 , 分別 於 水 耕 液 中 加 入 100 μM 巴 拉 刈 或 10 mMH 2 O 2 或 100 μM ABA 等 處 理 , 並 於 0、0.5、1、2 與 4 小 時 各 別 取 樣 。 而 OsMAPK3 轉 殖水 稻 則 以 100 μM 巴 拉 刈 處 理 並 於 0、0.5、1、2 與 4 小 時 各 別 取 樣 ;100 μM ABA 處 理 則 分制 於 0、15、30 分 鐘 後 取 樣 。 將 上 述 材 料 每處 理 取 約 0.5 克 之 5 株 地 上 部 組 織 , 用 0.7 mL萃 取 液 (TRIzol, Invitrogen) 提 取 TotalRNA。 經 DNase I (Turbo DNA-free Kit,Ambion, Austin, TX) 處 理 後 , 取 1 μg TotalRNA 進 行 RT-PCR 檢 測 (one Step RT-PCRKit, QIAGEN ® )。 以 OsMAPK3 基 因 3’ 端 UTR專 一 性 序 列 設 計 引 子 , 利 用 RT-PCR 技 術 偵測 OsMAPK3 基 因 表 現 。 其 序 列 為 Forwardprimer 5’TGCCCGATGATCTTCAACTG3’,Reverse primer 5’ GCACTTCTCATCATGAACTAGCC3’。PCR 的 設 定 : 起 始 變 性 溫 度 為94℃ 5 分 鐘 ; 變 性 溫 度 94℃ 1 分 鐘 , 煉 合溫 度 59℃ 1 分 鐘 , 延 展 溫 度 72℃ 1 分 鐘 ,循 環 30 週 期 ; 最 後 延 展 溫 度 為 72℃ 7 分鐘 。 試 驗 中 小 心 調 整 所 使 用 之 PCR 週 期 數 (26~35), 避 免 達 到 最 高 飽 和 點 以 期 反 應 基 因 之真 實 變 化 。 而 偵 測 OsRAB16a 基 因 表 現 的 引子 序 列 為 Forward primer 5’CGACACACCACCACACCATG 3’,Reverseprimer 5’ TGTGTACATATGCACGA TGA 3’。PCR 的 設 定 : 起 始 變 性 溫 度 為 94℃ 5 分鐘 ; 變 性 溫 度 94℃ 0.5 分 鐘 , 煉 合 溫 度 59℃ 0.5 分 鐘 , 延 展 溫 度 72℃ 0.5 分 鐘 , 循環 28 週 期 ; 最 後 延 展 溫 度 為 72℃ 7 分 鐘 。本 試 驗 以 GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 基 因 作 為 實 驗之 內 在 控 制 組 , 引 子 序 列 為 Forward primer5’ CGGTTGATGGACCGTCCAGC 3’, Reverseprimer 5’ GAGCCATTCCAGCCTTGGCG3’,PCR 檢 測 設 定 : 起 始 變 性 溫 度 為 94℃ 5分 鐘 ; 變 性 溫 度 94℃ 1 分 鐘 , 煉 合 溫 度 59℃ 1 分 鐘 , 延 展 溫 度 72℃ 1 分 鐘 , 循 環 24週 期 ; 最 後 延 展 溫 度 為 72℃ 7 分 鐘 。 PCR產 物 以 1.5% 洋 菜 膠 分 離 , 利 用 Gel-Pro ®Analyzer 軟 體 將 膠 體 中 DNA 條 帶 進 行 標 定後 , 將 其 濃 度 轉 成 數 值 , 再 將 OsMAPK3DNA 條 帶 反 應 之 數 值 除 以 GAPDH 數 值 進行 標 準 化 。 試 驗 結 果 之 分 析 是 將 非 轉 殖 水 稻的 標 準 化 數 值 當 成 1, 轉 殖 水 稻 所 得 之 數 值 則是 將 標 準 化 之 值 對 照 非 轉 殖 水 稻 而 量 化 , 依據 量 化 後 之 數 值 繪 製 成 圖 。五 、 水 稻 對 巴 拉 刈 之 抗 性 與 生 理 表 現 分 析將 臺 農 67 號 非 轉 殖 水 稻 與 OsMAPK3轉 殖 水 稻 , 在 人 工 氣 候 室 自 然 光 玻 璃 室 ( 日 25℃/ 夜 20℃) 以 木 村 氏 水 耕 液 栽 培 至 三 葉 齡 幼苗 , 移 置 溫 度 28℃、 全 日 光 照 130 ± 0.35 μmols -1 m -1 環 境 下 生 長 。 於 四 葉 齡 幼 苗 時 處 理 100μM 巴 拉 刈 一 天 , 每 次 試 驗 以 4 株 幼 苗 進 行 處理 。 之 後 在 相 同 環 境 下 恢 復 生 長 , 一 天 後 固定 取 第 四 片 葉 片 尖 端 三 公 分 在 葉 綠 素 螢 光 測定 儀 (Chlorophyll fluorometer, Joniorpam,Walz, Germany) 的 偵 測 器 上 , 測 量 Fv/Fm值 , 同 時 取 下 第 三 片 尖 端 三 公 分 葉 片 分 析 葉綠 素 含 量 , 並 記 錄 外 觀 生 長 情 形 。 實 驗 共 重複 三 次 。六 、 水 稻 H 2 O 2 含 量 變 化 及 抗 氧 化 酵 素 的測 定

190Crop, Environment & Bioinformatics, Vol. 4, September 2007非 轉 殖 水 稻 與 OsMAPK3 轉 殖 水 稻 之 生長 與 巴 拉 刈 處 理 如 五 所 述 。 將 四 葉 齡 幼 苗 生長 於 含 100 μM 巴 拉 刈 (24% 草 蕪 松 、 興 農 公司 ) 的 水 耕 液 一 天 後 , 測 量 非 轉 殖 與 轉 殖 水 稻H 2 O 2 含 量 與 CAT、APX 和 GR 等 酵 素 活 性之 變 化 。 每 處 理 2 株 幼 苗 , 重 複 四 次 。H 2 O 2 之 含 量 測 定 係 參 考 Jana andChoudhuri (1981) 之 方 法 ,CAT 之 活 性 測 定係 參 考 Kato and Shimizu (1987) 之 方 法 ,APX 活 性 測 定 係 參 考 Nakano and Asada(1981) 之 方 法 ,GR 之 活 性 測 定 係 參 考 Fosterand Hess (1980) 之 方 法 。 蛋 白 質 測 定 法 則是 依 據 Bradford (1976) 進 行 。H 2 O 2 含 量 之 原 位 染 色 係 利 用Diaminobenzidine (DAB) 染 色 法 進 行(Thordal-Christensen et al. 1997)。 植 株 經100 μM 巴 拉 刈 處 理 一 天 , 立 即 取 第 四 葉 葉尖 下 三 公 分 的 葉 片 , 每 一 材 料 處 理 3 株 幼苗 , 並 重 複 三 次 。 將 這 些 葉 片 浸 於 0.01% 之DAB 溶 液 中 , 置 於 光 照 下 一 天 後 , 取 出 葉 片浸 於 含 80% 酒 精 的 試 管 中 , 以 隔 水 加 熱 法煮 20 分 鐘 去 除 葉 綠 素 , 記 錄 葉 片 上 紅 褐 色斑 點 分 佈 情 形 , 此 即 H 2 O 2 累 積 的 位 置 。七 、 統 計 分 析以 SAS ( Statistical Analysis System ) 8.2版 統 計 分 析 軟 體 進 行 統 計 分 析 。 並 利 用 LSD(least significant difference) 方 法 進 行 分 析 ( P

OsMAPK3 與 轉 基 因 水 稻 及 巴 拉 刈 抗 性 191Fig. 2. RT-PCR detection of OsMAPK3 gene expression in rice (Oryza sativa L.) seedling under H 2 O 2 ,ABA or paraquat treatments. TNG 67 rice seedlings were treated with 100 μM paraquat, 10 mMH 2 O 2 or 100 μM ABA for 0.5, 1, 2, and 4 hours, respectively. Then RT-PCR was conducted tomeasure OsMAPK3 gene expression profiling. Control indicates rice seedlings grow undernormal condition (30℃/25℃) without any treatment. Glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase(GAPDH) gene was used as an internal control (A). Time course analysis of relative RNAtranscription levels of OsMAPK3 gene under H 2 O 2 , ABA or paraquat treatments. DNA bandintensity was processed with Gel-Pro® Analyzer software, then the gene expression ofOsMAPK3 was normalized to GAPDH. The value obtained at 0 hr from control experiment wasarbitrary set up as 1 for comparison. The data represent means ± SE (standard error) of fiveindividual rice seedlings from three independent experiments.

192Crop, Environment & Bioinformatics, Vol. 4, September 2007Fig. 3. Determination of inserted gene numbers and expression of OsMAPK3 in wild-type and T 2generation transgenic rice seedlings, AR5E-7-1, AR7A-7-1 and AR14B-3-1. Southern blotanalysis (A). Genomic DNA extracted from 3-leaf staged rice seedlings was digested withHind III restriction enzyme, then gel separated and hybridized with 1.5 Kb OsMAPK3DNA probe. a: foreign introduced OsMAPK3 gene, b: endogenous rice OsMAPK3 gene.Time course analysis of OsMAPK3 and OsRAB16a expression under 100 μM ABA (B) or 100μM paraquat treatment (C).GAPDH gene was used as an internal control and ABA-inducedOsRAB16a was used for a positive control. Each data was obtained as mean ± SE from fiveindividuals and three times of independent experiments. Time course analysis of H 2 O 2content change in wild-type rice (TNG 67) under 100 μM paraquat treatment (D). Data werecalculated from three times of independent experiments.

OsMAPK3 與 轉 基 因 水 稻 及 巴 拉 刈 抗 性 193Fig. 4. Changes of H 2 O 2 content in ABA-induced OsMAPK3 transgenic rice plants under 100 μMparaquat treatment then recovery for one day. H 2 O 2 content (A) distribution of H 2 O 2 in riceleaves after DAB staining (B). The data represent means ± SE from three individual plantsand replicated for three times. Letters indicate significant differences (P< 0.05) as assessedby Duncan’s test with SAS software.

194Crop, Environment & Bioinformatics, Vol. 4, September 2007此 外 比 較 轉 殖 與 非 轉 殖 水 稻 於 巴 拉 刈 處 理 下OsMAPK3 基 因 表 現 之 差 異 , 結 果 顯 示 , 在巴 拉 刈 處 理 前 、 後 轉 殖 水 稻 OsMAPK3 表 現量 都 比 非 轉 殖 水 稻 高 。 但 兩 者 的 OsMAPK3表 現 皆 不 會 因 巴 拉 刈 處 理 時 間 之 增 加 而 有 所改 變 (Fig. 3C)。 由 於 除 草 劑 巴 拉 刈 已 知 會 引起 植 物 之 氧 化 逆 境 提 升 H 2 O 2 含 量 , 而 H 2 O 2則 會 誘 導 OsMAPK3 基 因 之 表 現 (Fig.2A), 因 此 本 試 驗 亦 針 對 非 轉 殖 水 稻 於 巴 拉 刈處 理 後 六 小 時 內 之 H 2 O 2 含 量 變 化 進 行 測定 。 由 Fig. 3D 顯 示 H 2 O 2 含 量 並 未 因 巴 拉 刈之 處 理 而 有 明 顯 變 化 。 表 示 水 稻 經 巴 拉 刈 短期 處 理 並 不 會 快 速 累 積 H 2 O 2 含 量 進 而 誘 導OsMAPK3 之 表 現 。 試 驗 結 果 亦 發 現 不 論 非轉 殖 或 轉 殖 水 稻 經 巴 拉 刈 處 理 後 ,OsRab16A表 現 並 無 明 顯 差 異 (Fig. 3C), 表 示 巴 拉 刈 處理 可 能 並 不 會 改 變 水 稻 內 生 ABA 之 含 量 而與 ABA 之 調 控 途 徑 無 關 。四 、 轉 殖 與 非 轉 殖 水 稻 於 巴 拉 刈 處 理 之抗 氧 化 酵 素 活 性 分 析由 於 如 何 去 除 植 物 吸 收 巴 拉 刈 所 產 生 之活 化 氧 族 與 植 物 抗 巴 拉 刈 的 能 力 有 關 。 因 此本 試 驗 將 OsMAPK3 轉 殖 水 稻 處 理 100μM 巴 拉 刈 1 天 後 , 分 析 抗 氧 化 酵 素 活 性 之變 化 , 以 期 瞭 解 誘 導 OsMAPK3 基 因 表 現 是否 可 改 變 轉 殖 水 稻 之 抗 氧 化 能 力 。 結 果 顯 示非 轉 殖 水 稻 處 理 巴 拉 刈 後 H 2 O 2 的 含 量 明 顯比 轉 殖 OsMAPK3 水 稻 高 約 50%~60%(Fig. 4A), 但 處 理 前 兩 者 H 2 O 2 含 量 則 無 明顯 差 異 。 除 此 之 外 因 DAB 染 劑 會 與 H 2 O 2結 合 經 還 原 後 呈 現 紅 褐 色 沈 澱 , 可 以 此 顏 色之 變 化 來 觀 察 H 2 O 2 在 葉 片 組 織 上 的 分布 。 經 DAB 染 色 可 知 , 在 未 處 理 時 非 轉 殖水 稻 葉 片 的 褐 色 斑 點 顏 色 較 轉 殖 水 稻 深 , 表示 植 株 在 全 日 照 環 境 下 生 長 已 產 生 輕 微 的 氧化 逆 境 。 經 100 μM 巴 拉 刈 處 理 一 天 後 , 非轉 殖 水 稻 葉 片 已 幾 乎 完 全 呈 深 褐 色 , 而 轉 殖水 稻 僅 在 葉 的 尖 端 、 基 部 及 部 分 葉 身 可 看 到褐 色 斑 點 。 由 上 述 H 2 O 2 定 量 與 原 位 染 色 之結 果 顯 示 , 轉 殖 水 稻 葉 片 累 積 的 H 2 O 2 含 量明 顯 比 非 轉 殖 水 稻 低 (Fig. 4 B)。 為 進 一 步 闡明 轉 殖 株 H 2 O 2 含 量 之 降 低 , 是 否 歸 因 於 轉殖 株 抗 氧 化 酵 素 活 性 之 增 加 所 致 , 因 此 本 試驗 進 一 步 測 定 抗 氧 化 逆 境 防 禦 機 制ascotrbate-glutathione cycle 中 CAT 、APX 和 GR 等 抗 氧 化 酵 素 活 性 。 結 果 發現 , 經 100 μM 巴 拉 刈 處 理 後 , 轉 殖 水 稻 的CAT 與 APX 活 性 明 顯 比 非 轉 殖 水 稻 高 , 其中 CAT 高 約 40%~50%, 而 APX 高 約10%~25% (Fig. 5), 但 GR 活 性 與 非 轉 殖水 稻 則 無 明 顯 差 異 (Fig. 5)。五 、 轉 殖 OsMAPK3 水 稻 處 理 巴 拉 刈 後之 抗 性 生 理 分 析以 ABA 誘 導 OsMAPK3 轉 殖 水 稻 所 導 致抗 氧 化 能 力 之 提 升 可 否 增 加 水 稻 對 巴 拉 刈 之抗 性 ? 本 試 驗 因 此 針 對 轉 殖 與 非 轉 殖 水 稻 於巴 拉 刈 處 理 後 , 分 別 測 量 光 合 作 用 電 子 傳 遞效 率 並 紀 錄 植 株 的 生 長 情 形 。 在 逆 境 下 葉 綠素 螢 光 量 Fv/Fm 值 和 葉 綠 素 含 量 之 分 析 , 巳普 遍 被 視 為 植 物 葉 綠 囊 膜 之 損 傷 程 度 , 而 其所 反 應 光 合 作 用 效 率 之 下 降 值 則 可 作 為 巴 拉刈 抗 性 的 生 理 評 估 指 標 (Guidi et al. 1997)。本 試 驗 結 果 顯 示 轉 殖 水 稻 在 未 處 理 巴 拉 刈時 , 所 得 的 Fv/Fm 值 與 非 轉 殖 水 稻 皆 為 0.8 左右 (Fig. 6A)。 但 經 100 μM 巴 拉 刈 處 理 一 天 ,再 移 至 正 常 水 耕 全 日 照 環 境 恢 復 一 天 後 , 轉殖 水 稻 所 測 得 Fv/Fm 值 均 比 非 轉 殖 水 稻 高 出67%~78% 左 右 (Fig. 6A), 而 葉 綠 素 含 量 亦增 加 了 24%~31%。 從 植 株 外 觀 明 顯 發 現 ,巴 拉 刈 處 理 後 非 轉 殖 水 稻 第 四 葉 片 皆 已 捲曲 , 但 轉 殖 株 除 AR14B-3-1 轉 殖 系 少 部 分 植 株第 四 葉 捲 曲 外 , 其 他 兩 個 轉 殖 系 第 四 葉 均 展開 且 生 長 正 常 (Fig. 6B), 顯 示 轉 殖 水 稻 經 巴 拉刈 處 理 後 較 非 轉 殖 水 稻 呈 現 較 高 的 抗 性 。討 論一 、 H 2 O 2 與 ABA 而 非 巴 拉 刈 可 誘 導 水稻 內 生 OsMAPK3 基 因 之 表 現

OsMAPK3 與 轉 基 因 水 稻 及 巴 拉 刈 抗 性 195Fig. 5. Enzymatic activities assay of CAT, APX and GR in ABA-induced OsMAPK3 transgenic riceplants under 24 hours 100 μM paraquat treatment then recovery for one day. The datarepresent means ± SE of two individuals from four independent experiments. Significantdifferences (P< 0.05) with or without paraquat treatments were indicated with letters asassessed by Duncan’s test with SAS software.

196Crop, Environment & Bioinformatics, Vol. 4, September 2007Fig. 6. Phenotypes and herbicide resistance of ABA-induced transgenic rice seedlings under 100μM paraquat stress. Phenotypes of wild-type and transgenic rice plants before or after oneday of 100 μM paraquat treatment then recovered for one day (A). Fv/Fm values weremeasured from the 4 th leaf and the chlorophyll content was determined from the 3 rd leaf ofwild-type and transgenic rice plants without or with one day of 100 μM paraquat treatmentthen recovered for one day (B). Data were obtained as means ± SE of four individualseedlings and experiments were repeated three times. Significant differences (P< 0.05) ofplants response to paraquat were indicated with letters as assessed by Duncan’s test withSAS software.雖 然 除 草 劑 巴 拉 刈 已 知 會 造 成 氧 化 逆 境增 加 H 2 O 2 含 量 , 但 由 於 短 時 間 之 處 理 並 無法 造 成 H 2 O 2 之 大 量 累 積 (Fig. 3D) 是 以 巴 拉刈 並 不 引 起 OsMAPK3 表 現 量 之 改 變 。 再 者由 Fig. 3C 顯 示 巴 拉 刈 之 處 理 並 不 會 顯 著 的造 成 OsRAB16a 表 現 之 變 化 , 因 此 巴 拉 刈 亦不 會 影 響 內 生 ABA 含 量 導 致 OsMAPK3 表現 之 變 異 。 至 於 H 2 O 2 是 否 會 影 響 內 生 ABA含 量 , 在 本 試 驗 中 因 未 對 ABA 進 行 定 量 分 析無 法 判 斷 。 但 Jiang and Zhang (2002) 對 玉

OsMAPK3 與 轉 基 因 水 稻 及 巴 拉 刈 抗 性 197米 切 離 葉 處 理 不 同 濃 度 的 H 2 O 2 和 巴 拉 刈 ,由 結 果 顯 示 ABA 含 量 在 處 理 0~12 小 時間 變 化 皆 不 明 顯 , 表 示 玉 米 切 離 葉 經 H 2 O 2和 巴 拉 刈 處 理 後 不 會 改 變 內 生 ABA 的 含量 , 此 結 果 大 致 與 本 試 驗 相 同 。 因 此 初 步 結論 可 認 為 巴 拉 刈 、H 2 O 2 與 ABA 可 被 視 為 獨立 的 三 個 因 子 , 而 可 各 別 探 討 巴 拉 刈 、H 2 O 2與 ABA 對 OsMAPK3 基 因 表 現 之 影 響 。 先前 分 析 OsMAPK3 基 因 之 起 動 子 序 列(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalup.html) 發 現 其 上 游 具 有 ABAresponsive element (ABRE) 及 antioxidantresponsive element (ARE) 等 cis-actingDNA elements, 推 測 OsMAPK3 基 因 很 可 能會 受 到 ABA 及 H 2 O 2 之 誘 導 。 研 究 結 果 亦 顯示 水 稻 內 生 之 OsMAPK3 在 H 2 O 2 或 ABA 處理 可 增 加 基 因 之 表 現 , 巴 拉 刈 則 無 影 響 (Fig.2)。 此 結 果 亦 强 化 了 過 去 認 為 當 植 物 體 中 活性 氧 族 增 加 時 會 藉 由 MAPK 傳 遞 訊 息 , 開啟 相 關 防 禦 機 制 以 提 升 耐 受 性 之 概 念 。 例 如Nakagami et al. (2004) 發 現 苜 蓿 經 H 2 O 2處 理 後 ,OMTK1 (oxidative stress-activatedMAP triple-kinase;MAPKKK) 活 性 提 高 ,進 而 活 化 下 游 的 MM3 (MAPK) 蛋 白 引 起 細胞 凋 亡 之 反 應 。Grant et al. (2000) 利 用 GST(glutathione S- transferase) 作 為 活 性 氧 族 存在 時 的 指 標 性 基 因 , 將 gst1::luc ( 其 中 gst1為 GST 基 因 的 啟 動 子 ) 之 構 築 轉 殖 於 阿 拉 伯芥 中 , 偵 測 MAPK 及 不 同 植 物 荷 爾 蒙 在 活 化氧 族 訊 息 傳 遞 中 扮 演 之 角 色 。 結 果 顯 示 施 加蕃 茄 细 菌 性 葉 斑 病 菌 (Pseudomonas syringaepv.) 的 萃 取 物 於 轉 殖 gst1::luc 阿 拉 伯 芥 時 , 可明 顯 提 高 報 導 基 因 luciferase 的 活 性 。 若 將gst1::luc 轉 殖 到 對 水 楊 酸 、 茉 莉 酸 和 乙 烯 不 敏感 且 可 大 量 表 現 活 性 氧 族 的 阿 拉 伯 芥 突 變 體nahG、coi1 和 etr1 中 , 則 可 發 現 除 了 報 導 基因 luciferase 活 性 明 顯 提 高 , 並 可 偵 測 到 一個 48 kDa 的 MAPK 活 化 蛋 白 。 表 示 GST1的 表 現 是 因 活 化 氧 族 誘 導 MAPK 而 非 病 原 菌本 身 所 引 起 。 推 測 本 篇 研 究 中 水 稻 之OsMAPK3 可 能 亦 可 在 活 化 氧 族 之 訊 息 傳 遞中 扮 演 重 要 之 角 色 。二 、 ABA 可 有 效 誘 導 轉 殖 水 稻OsMAPK3 之 表 現本 試 驗 轉 殖 水 稻 經 ABA 處 理 後 發 現OsMAPK3 及 OsRAB16a 之 表 現 皆 會 隨ABA 處 理 時 間 而 增 加 。 其 中 OsRAB16a 為ABA 調 控 之 正 向 表 達 基 因 。 表 示 ABA 之 處理 有 效 且 轉 殖 水 稻 中 OsMAPK3 之 表 現 亦 可被 ABRC (ABA Responsive Complex) 所 驅動 。 此 外 實 驗 還 發 現 在 未 處 理 巴 拉 刈 之 轉 殖水 稻 OsMAPK3 基 因 表 現 比 非 轉 殖 株 強(Fig. 3B), 主 要 可 能 因 為 ABRC 並 非 一 嚴 格調 控 (tightly controlled) 之 起 動 子 , 在 轉 殖 水稻 中 可 經 由 內 生 ABA 之 作 用 提 高OsMAPK3 表 現 量 。 而 在 巴 拉 刈 處 理 下 , 轉殖 水 稻 OsMAPK3 表 現 量 與 處 理 前 相 比 並 無變 化 , 但 整 體 而 言 皆 比 非 轉 殖 水 稻 高 (Fig.3C)。 表 示 轉 殖 株 OsMAPK3 之 增 加 表 現 量 可能 主 要 皆 來 自 內 生 ABA 之 影 響 。三 、 轉 殖 OsMAPK3 水 稻 經 巴 拉 刈 處 理後 可 增 加 抗 氧 化 酵 素 之 活 性 , 提 升 對巴 拉 刈 之 抗 性轉 殖 OsMAPK3 水 稻 於 巴 拉 刈 處 理 下Fv/Fm 值 與 葉 綠 素 含 量 都 比 非 轉 殖 水 稻 較高 (Fig. 6B)。 H 2 O 2 含 量 與 DAB 染 色 結果 , 顯 示 轉 殖 水 稻 H 2 O 2 含 量 比 非 轉 殖 者 明顯 降 低 , 褐 色 斑 點 亦 較 非 轉 殖 水 稻 少 (Figs.4A 及 4B)。 轉 殖 水 稻 相 較 於 巴 拉 刈 處 理 下 的CAT 與 APX 活 性 皆 較 非 轉 殖 水 稻 高 。 綜 合此 些 證 據 皆 顯 示 OsMAPK3 經 內 生 ABA 誘導 表 現 可 提 升 抗 氧 化 酵 素 之 活 性 , 改 變 轉 殖株 抗 氧 化 逆 境 之 解 毒 能 力 , 增 加 對 巴 拉 刈 之抗 性 。 一 般 植 物 在 葉 綠 體 與 細 胞 質 中 進 行Ascorbate–Glutathione 循 環 , 平 時 藉 由APX 維 持 細 胞 內 H 2 O 2 的 穩 定 。 而 CAT則 多 存 在 於 細 胞 質 和 過 氧 化 體 中 , 其 酵 素 作用 之 Km 值 較 APX 高 。 當 植 物 遇 到 逆 境

198Crop, Environment & Bioinformatics, Vol. 4, September 2007時 , 短 期 由 CAT 負 責 迅 速 清 除 過 量 的H 2 O 2 ; 長 期 之 逆 境 馴 化 適 應 則 以 APX 較 重 要(Neill et al. 2002)。 本 試 驗 中 轉 殖 水 稻 不 論 在未 處 理 或 處 理 巴 拉 刈 時 , CAT 與 APX 含量 均 比 非 轉 殖 水 稻 高 (Fig. 5), 顯 示 轉 殖 水 稻具 有 較 高 清 除 H 2 O 2 之 能 力 , 使 H 2 O 2 之 累 積量 減 少 (Fig. 4 A)。 此 外 由 於 非 轉 殖 水 稻 經 巴拉 刈 處 理 後 仍 有 H 2 O 2 之 殘 留 , 使Ascorbate–Glutathione 循 環 反 應 中 GR 活性 明 顯 增 加 , 但 GR 活 性 之 表 現 在 轉 殖 水稻 間 變 化 則 不 明 顯 (Fig. 5)。 表 示 CAT、APX與 GR 等 酵 素 活 性 在 Ascorbate–Glutathione循 環 反 應 中 或 許 存 有 相 互 協 調 以 達 平 衡 之 關聯 性 。四 、 轉 殖 OsMAPK3 水 稻 是 否 透 過 ABA調 控 之 相 關 途 徑 提 升 抗 氧 化 酵 素 活性 ?Jiang and Zhang (2002) 之 研 究 顯 示 ,玉 米 切 離 葉 在 缺 水 處 理 下 內 生 ABA 含 量 會提 高 , 進 而 活 化 抗 氧 化 酵 素 活 性 , 以 解 除 活化 氧 族 對 細 胞 的 毒 害 。Yoshida et al. (2003)也 證 實 經 ABA 前 處 理 的 藍 綠 藻 , 再 處 理 巴 拉刈 或 H 2 O 2 時 可 減 輕 活 化 氧 族 所 造 成 之 逆境 。 主 要 是 藍 綠 藻 經 ABA 處 理 後 可 先 活 化CAT 與 APX 的 活 性 , 降 低 細 胞 內 H 2 O 2 含量 以 減 少 細 胞 傷 亡 。 由 此 可 知 植 物 可 透 過ABA 之 相 關 調 控 途 徑 提 高 抗 氧 化 酵 素 活 性 ,以 減 低 細 胞 傷 害 。 雖 然 本 試 驗 所 使 用OsMAPK3 基 因 之 起 動 子 DNA 序 列 經 分 析已 知 具 有 ABA responsive element (ABRE)之 cis-acting element ( 資 料 未 顯 示 ), 但 轉 殖OsMAPK3 水 稻 是 否 經 由 ABA 調 控 之 相 關或 非 相 關 途 徑 提 升 抗 氧 化 酵 素 活 性 , 而 增 強對 巴 拉 刈 之 抗 性 則 仍 不 甚 清 楚 。 在 本 試 驗 轉殖 OsMAPK3 水 稻 經 巴 拉 刈 處 理 後 可 提 高CAT 和 APX 等 抗 氧 化 酵 素 的 活 性 , 但 從 水稻 在 巴 拉 刈 處 理 前 、 後 , 檢 測 OsRab16A 基因 表 現 都 無 明 顯 差 異 (Fig. 3C), 顯 示 巴 拉 刈並 不 會 影 響 內 生 ABA 含 量 。 因 此 CAT 與APX 抗 氧 化 酵 素 活 性 之 提 升 可 能 是 受 上 游OsMAPK3 基 因 調 控 而 非 與 ABA 調 控 途 徑緊 密 相 關 。 是 否 再 由 OsMAPK3 啟 動 下 游 基因 作 用 於 CAT 及 APX 基 因 之 表 現 尚 待 進 一步 之 實 驗 與 研 究 。五 、 OsMAPK3 轉 殖 水 稻 於 抗 除 草 劑 之未 來 應 用目 前 耐 除 草 劑 的 轉 殖 作 物 多 以 轉 殖 特 定的 蛋 白 酶 , 解 除 除 草 劑 對 植 物 產 生 的 毒 害 獲致 抗 性 (Cao et al. 1992, Harrison et al. 1996,Subramanian et al. 1990 )。 但 本 篇 是 首 度 以調 控 MAPK 訊 息 傳 遞 中 的 因 子 增 加 下 游 的氧 化 酵 素 活 性 , 進 而 解 除 因 處 理 巴 拉 刈 所 形成 氧 化 逆 境 , 提 高 水 稻 對 除 草 劑 巴 拉 刈 的 抗性 。 在 目 前 全 球 生 技 市 場 對 如 何 獲 得 更 有效 、 抗 多 重 除 草 劑 轉 基 因 作 物 之 需 求 仍 有 其迫 切 性 , 抗 巴 拉 刈 之 OsMAPK3 轉 殖 水 稻 有其 意 義 。 末 來 之 應 用 上 我 們 希 望 進 一 步 瞭 解OsMAPK3 轉 殖 水 稻 對 其 它 不 同 作 用 方 式 除草 劑 是 否 依 然 呈 現 抗 性 ? 是 否 較 現 有 之 抗 巴拉 刈 轉 基 因 作 物 更 耐 受 巴 拉 刈 之 毒 性 ? 綜 合而 言 , 本 試 驗 證 明 藉 由 ABA 誘 導 OsMAPK3之 基 因 轉 殖 方 式 可 活 化 下 游 抗 氧 化 酵 素 活性 , 清 除 因 除 草 劑 產 生 之 氧 化 逆 境 進 而 提 高水 稻 對 巴 拉 刈 的 抗 性 。 此 項 研 究 在 未 來 有 效提 升 作 物 除 草 劑 抗 性 方 面 , 提 供 調 控 水 稻MAPK 之 訊 息 路 徑 改 變 其 抗 氧 化 能 力 之 可 能途 徑 。致 謝本 試 驗 承 蒙 嘉 義 大 學 農 藝 系 侯 新 龍 助 理教 授 提 供 水 稻 OsMAPK3 基 因 與 協 助 , 謹 此誌 謝 。引 用 文 獻Agrawal GK, SK Agrawal, J Shibato, H Iwahashi,R Rakwal (2003) Novel rice MAP kinasesOsMSRMK3 and OsWJUMK1 involved inencountering diverse environmental stressesand developmental regulation. Biochem.

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