REZUMAT - Read Only - USAMV Cluj-Napoca

Capitolul V. - InvestigaȘii necropsice Și histopatologicepentru stabilirea incidenȘei infestaȘiilor naturalla gazdele intermediare ……………………………… 26V.1. Introducere Și obiective ……………………………… 26V.2. Material Și metode ....................................................... 26V.3. Rezultate Și discuȘii .................................................... 28V.3.1. Dinamica spaială i ecologică al capturilor ……. 28V.3.2. Prevalena echinococozei alveolare …………….. 29V.3.3. Descrierea histologică a leziunilor ………………. 30V.4. Concluzii ……………………………………………. 32Capitolul VI. - Reproducerea experimentală a echinococozeialveolare cu E.multilocularis la Șoareci albi de laborator..33VI.1. Introducere Și obiective ……………………………… 33VI.2. Material Și metode ...................................................... 34VI.3. Rezultate Și discuȘii ...................................................... 35VI.4. Concluzii …………………………………………….. 37Capitolul VII.- Propuneri de măsuri privind controlulechinococozei cu E.multilocularis în România ………… 38VII.1. Evaluarea riscului Și a evoluȘiei spaȘio-temporale….. 38VII.2. Etapele principale ale managementului riscului …….. 40VII.3. ÎmbunătăȘirea măsurilor de diagnostic ………………. 41VII.4. Măsuri de prevenire a extinderii Și de control ………. 42VII.5. Recomandări ………………………………………… 45Capitolul VIII. - Concluzii generale ………………………… 46VIII.1. Recomandări ……………………………………….. 48Notă ………………………………………………………….. 49Bibliografie ………………………………………………….. 98ii

ABSTRACTPART I. – REFERENTIAL STUDYChapter I.I.1. General epidemiological aspects of infection withE.multilocularis ………………………………………… 50PART II. – OWN RESEARCHChapter II. - Helminth fauna of the small intestine in theeuropean red fox (Vulpes vulpes L.) and themorphological identification of E.multilocularis .............. 52II.1. Introduction and purpose ................................................ 52II.2. Material and methods ..................................................... 53II.3. Results and discussions ………………………………... 54II.4. Conclusions ……………………………………………. 65Chapter III. - Coproantigen-ELISA investigations for theeuropean red fox (Vulpes vulpes L.) populationscreening on the E.multilocularis infection estimate …….. 67III.1. Introduction and purpose ............................................... 67III.2. Material and methods .................................................... 67III.3. Results and discussions ………………………………. 68III.4. Conclusions …………………………………………... 70Chapter IV.- Taxonomical confirmation ofEchinococcus multilocularis by PCR …………………... 71IV.1. Introduction and purpose .............................................. 71IV.2. Material and methods ................................................... 72IV.3. Results and discussions ………………………………. 73IV.4. Conclusions …………………………………………... 73Chapter V.-Necroptic and histopathologically investigationsiii

about alveolar echinococcosis incidence in wild rodents... 73V.1. Introduction and purpose ............................................... 73V.2. Material and methods ..................................................... 74V.3. Results and discussions ……………………………….. 75V.3.1. Spatial and ecological dynamics of catches ………. 75V.3.2. Prevalence of alveolar echinococcosis ……………. 77V.3.3. Histological description of lesions ………………… 78V.4. Conclusions …………………………………………… 81Chapter VI.- Experimental reproduction of alveolarechinococcosis with E.multilocularis on whitelaboratory mice ................................................................. 82VI.1. Introduction and purpose .............................................. 82VI.2. Material and methods ................................................... 82VI.3. Results and discussions ………………………………. 84VI.4. Conclusions ………………………………………….. 86Chapter VII. - Proposals of measures control forechinococcosis with E.multilocularis in Romania........... 87VII.1. Risk assessment and spatial-temporal evolution ......... 87VII.2. The main steps of risk management ............................ 89VII.3. Improvement of diagnostic measures .......................... 90VII.4. Measures to prevent and control expansion ................ 91VII.5. Conclusions …………………………………………. 94Chapter VIII. General conclusions and recomandations ......... 95Note .......................................................................................... 97References ................................................................................ 98iv

PARTEA I. – STUDIU BIBLIOGRAFICCapitolul I.I.1. Aspecte epidemiologice generale privind infestaia cuE. multilocularisPrimul caz de echinococoză alveolară a fost descris la omîncă în 1852 în sudul Germaniei, ca fiind o tumoră hepatică. Apoi,în 1855 Virchow o descrie ca “o leziune multiloculară şi tumorăechinococică ulcerativă”. În 1901 Posselt este primul care găseşteîn intestinul câinelui un cestod foarte asemănător cu Echinococcusgranulosus, şi totuşi diferit, pe care îl descrie sub numele de Taeniaechinococcus alveolaris.Peste 50 de ani a ţinut disputa despre concepţia unichistică alui Dévé şi ceea polichistică descrisă de cei amintiţi, până cînd în1954 Rausch în Alaska şi în 1957 Vogel în Germania demonstreazăindependent unul de celălalt şi fără echivoc existenţa a două speciidiferite de echinococ: E. granulosus şi E. multilocularis.În Europa de până 1980 au fost cunoscute doar patru ţări(Austria, Franţa, Germania şi Elveţia) în care E. multilocularis a fostdescrisă. În 1996 numărul acestor ţări a ajuns la 9. Prezenţaparazitului se raportează tot mai frecvent din Europa de Est(Slovacia, Ungaria, Ukraina, Bulgaria), din Turcia, Asia (Rusia,Kazakhstan şi China), Amedica de Nord (Dakota) şi din Japonia.În majoritatea ţărilor echinococoza alveolară a căpătat dejaun caracter endemic şi este în curs de extindere continuă cu orapiditate alarmantă, devenind o boală emergentă (Sikó Barabási ȘiCozma, 2008).Dacă în 1982 extinderea se limita la Franţa şi o mică partedin Europa Centrală, în 2003 ea se extinde pe toată Europa Centralăşi de Est. Astfel de exemplu, dacă în Polonia în 1999 prevalenţa luiE. multilocularis din vulpile examinate a fost de 2,6 % , în 2003 eaa ajuns la 29,4 %. De asemenea, în 1999 în Slovacia se descrieprimul caz de E. multilocularis la vulpe, pentru ca apoi în 20001

prevalenţa la vulpile examinate ajunge la 24,8 %, iar în 2001 la33,9 % .Deşi în Ungaria primul caz de echinococoză alveolară la oma fost descrisă încă în 1988 parazitul responsabil nu a fost identificatpe teritoriul ţării până în 2003, când prevalenţa parazitului s-a stabilita fi deja de 29 % la vulpile examinate. Vulpile proveneau dinteritoriile învecinate cu Republica Slovacă.În România primele cazuri au fost descrise detaliat în 1991 labovine (0,01 %) şi la rozătoarele sălbatice – Microtus Chionomisnivalis ulpius Brehm (0,4 %). Apoi, în 1992-1993 sunt descriseprimele aspectele morfologice detaliate ale echinococozei alveolare,fiind semnalate şi la alte specii de Microtidae ca Arvicola terrestris,Microtus arvalis şi Myodes [sin.Clethrionomys] glareolus cu oprevalenţă de 0,57 % la animalele examinate.În 1996 sunt prezentate primele investigaţii privind ecologiaparazitului în Romania. În 1998 se descrie primul caz deechinococoză alveolară hepatică la o oaie provenită din judeţul Ilfov.Primul caz de echinococoză alveolară cu localizare hepartică la omse descrie în 1999. Cazul a fost confirmat serologic în InstitutulCantacuzino din Bucureşti şi reconfirmat serologic în Franţa şiElveţia prin ELISA ca fiind intens pozitiv. Apoi, în 2000 se descriecel de al doilea caz, o formaţiune chistică multiloculară pe splinaunei paciente de 49 ani.Un caz de gazdă intermediară aberantă a fost semnalată înjudeȘul Teleorman, unde se descrie în 2004 primul caz deechinococoză alveolară cu localizare exclusiv hepatică la cabalină.Parazitul adult însă nu a fost depistat în România până înprezent la nici o gazdă definitivă.Sursa de infestaţie şi ciclul biologic în Europa centrală estepreponderent de natură silvatică incluzând în principal vulpea roşieeuropeană (Vulpes vulpes) şi o serie de specii de rozătoare gazdeintermediare - şoarecele de apă (Arvicola terrestris), şoarecele decâmp (Microtus arvalis), şoarecele de pădure (Clethrionomisglareolus), etc. Vulpile infestate pot dispersa oncosferele de tenie peun teritoriu de peste 18 hectare şi la distanţe de peste 15-16 km. De2

asemeni, de la un singur excrement ce conţine oncosfere, aceştia în10 zile se pot dispersa la distanţe de 80m de la excrementul în cauză.Creşterea populaţiilor de vulpi şi extinderea ariei lor de viaţă cătreteritoriile urbane constituie un factor de risc mărit pentru om, şiaceasta cu atât mai mult cu cât aceste animalele, gazde definitive, nuprezintă nici un semn clinic la o infestaţie masivă de peste 100.000tenii. Oncosferele de E.multilocularis sunt viabile în mediulexterior 3-8 luni în timpul verii şi al toamnei, iar la temperaturile recide - 18 Cº din iarnă până 8 luni.Echinococoza alveolară este produsă de stadiul larvar alteniei E. multilocularis. Ea se caracterizează prin apariţia uneitumori cu caracter extensiv primordial în ficatul gazdelorintermediare inclusiv al omului. Tumora are un caracter pronunţatmalign, poate induce metastaze, diagnosticul este greoi, tratamentulexclusiv chirurgical prin extirpare. Pacienţii diagnosticaţi târziu saunediagnosticate şi netratate au un procent de letalitate de 94-100 %.Deşi cazurile umane sunt relativ de rare, perioada deincubaţie lungă (10-15 ani), costurile de spitalizare considerabile(17.800 USD/pacient/an), rata scăzută de supravieţuire, caracterulexpansiv al ariei de răspândire, creşterea numărului de cazuri umanede la an la an şi persistenţa parazitului în natură sunt suficienteargumente pentru ca echinococoza alveolară produsă de formalarvară a cestodului E. multilocularis să fie considerată ca o boalăparazitară de primă urgenţă în Europa.PARTEA II. – CERCETĂRI PROPRIICapitolul II. - Helmintofauna intestinului subire la vulpearoie europeană (Vulpes vulpes Linnae) iidentificarea morfologică a lui EchinococcusmultilocularisII.1. Obiective3

Helmintofauna intestinului subȘire la vulpea roȘieeuropeană (Vulpes vulpes Linnae) a fost studiată în România doar decâȘiva autori Și pe un număr redus de probe. Scopul acestui capitoleste acela ca, pe baza unui număr considerabil de probe să seanalizeze infestaȘia helmintică a intestinului subȘire la vulpi,evaluarea prevalenȘei lui E. multilocularis Și descriereamorfologică a acestui cestod.II.2. Material i metodeÎn perioada august 2oo7 - martie 2o1o au fost examinate unnumăr de 561 probe de intestin subȘire de vulpe. Probele auprovenit din 15 judeȘe din centrul Și nord-vestul României.Din cadavrele de vulpi s-a izolat prin ligaturare (de la nivelulpilorusului Și respectiv la nivelul valvulei ileo-coecale) intestinulsubȘire. Fiecare probă a fost împachetat Și etichetat cu dateindividuale necesare identificării ulterioare. Probele au fost păstratela temperatura de -2o C°, apoi cu 48 ore înainte de prelucrare au fostintroduse în freezer la -80 C° conform normelor internaȘionale deprotecȘie a muncii.La prelucrare s-a examinat atât conȘinutul intestinal, cât Șiraclatul mucoasei intestinate pe toată lungimea ei.HelminȘii izolaȘi au fost spălaȘi de trei ori în apă distilatăsterilă Și după o prealabilă clasificare taxonomică Și numărare alor, ele au fost stocate în recipiente etichetate, pe categorii, în formol10% sau etanol 70% pentru examene morfologice ulterioare.Pentru stabilirea intensităȘii infestaȘiei s-a numărat înfiecare probă numărul helminȘilor pe specii Și s-a utilizat un sistemde monitorizare.La identificarea morfologică a helminȘilor s-au luat înconsiderare următoarele criterii : forma, dimensiunile, structurascolexului cu formaȘiunile caracteristice (rostru nearmat saunumărul-, structura- Și dimensiunile croȘetelor rostelare),caracteristicile morfologice la diferite sexe, prezenȘa-, forma- ȘiconȘinutul proglotelor gravide, forma- Și aȘezarea ventuzelor latrematode etc.4

Între intensitatea infestaȘiei parazitare, dimensiunileparaziȘi-lor (între limite intraspecifice), relaȘia faȘă de ceilalȘiparaziȘi ai segnemtelor intestinale, există corelaȘii microecologiceȘi competitive. In diferite ecosisteme sau micro-ecosistemehelminȘii pot manifesta o biodiversitate diferită. În lupta decompetenȘă pe un substrat nutritiv domină helminȘii care seadaptează mai bine la condiȘiile microecologice din segmentulintestinal ocupat. Aceste specii se numesc specii dominante sauemergente într-o niȘă ecologică. În definirea niȘelor ecologicecaracteristice speciilor de helminȘi identificaȘi s-au avut în vedereparticularităȘile microecologice Și intensitatea infestaȘiilor pesegmentele intestinale parazitate Și anume duoden, jejun – cu celetrei porȘiuni: treimea anterioară, mediană Și ceea posterioară - Șirespectiv ileon.II.3. Rezultate i discuiiÎn urma examinării celor 561 probe au fost identificateca fiind parazitate 522 probe (93 %), iar într-un număr de 39 (7,0 %)de intestine nu a fost identificat nici un parazit prin metodelefolosite. Ponderea probelor negative se regăsesc la cele provenite dela vulpi masculi (59 %) Și la cele cu vârsta de 3 ani (41 %) Șirespectiv de 2 ani (29 %).InfestaȘia parazitară a intestinului subȘire a vulpilorexaminate a arătat un poliparazitism accentuat. Faptul că vulpearoȘie este mare consumatoare de rozătoare sălbatice în special dinfamilia Microtidae prezenȘa cestodelor în care intervin Și aceȘtiaca gazde intermediare este elocventă.În ce priveȘte prevalenȘa paraziȘilor Și intensitateainfestaȘiilor în probele examinate s-a constatat dominanȘanematodelor cu o prevalenȘă generală de 91,4 %, urmată de ceea acestodelor (90,7 %), respectiv de aceea a trematodelor (15 %).Intensitatea ceea mai ridicată a infestaȘiei s-a constatat în cazulcestodelor (Tabel 1.).Din cele 561 de probe au fost depistate trematode , respectivAlaria alata, numite Și trematode ale carnasierelor, în 84 cazuri,5

eprezentând o prevalenȘă de 15 %. DeȘi intensivitateaparazitismului a fost relativ redusă la 70 probe (sub 1.000), la 13probe aceasta a depăȘit valoarea de 1.000 Și respectiv în cazul uneisingure probe chiar valoarea de 10.000 mesocercari pe probă deintestin. Dimensiunile trematodului nu au prezentat diferenȘesemnificative de la caz la caz ele fiind cuprinse între 2-3 x 0,6-0,7mm. Cele mai infestate au fost probele provenite din judeȘele SatuMare (27 %), Bihor- (24 %) Și MaramureȘ- (19%).Segmentul intestinal parazitat a fost la 23 probe ultimaporȘiune a duodenului (27,4%), iar la 61 (72,6 %) probe treimeaanterioară a jejunului.În ambele cazuri mesocercarii erau competitoriprincipali ai substratului. Vulpile în vârsta de 4 ani au fost cele maiinfestate (45 %). Vulpile femele prezentau o prevalenȘă mai ridicată(54 %) faȘă de cele mascule (46 %).PrevalenȘa ridicată a trematodului A.alata reprezintă unrisc zoonotic, cunoscut fiind faptul că ele se închistează în Șesutulconjunctiv intermuscular la porc Și/sau mistreȘ (potenȘialconsumator de amfibieni, reptile, peȘti – gazde intermediare II.).Omul, chiar dacă este gazdă paratenică, prin consumul decarne cu mesocercari insuficient preparat termic, se poate infestachiar cu forme grave.Milesevic Și colab.(2004) au depistat în CroaȘia A.alata la 59%din mistreȘii examinaȘi.PrezenȘa trematodului a fost semnalat lavulpea roȘie europeană în numeroase Șări din europa centrală Și deest. Astfel, ea a fost descrisă în Germania (28,3-29,7%), Ausztria(18,4 %), Polonia (76,5-88,o %), Șările fostei Yugoslavii (64,8 %),precum Și în Bulgaria (2,1 %) (Möhl Și colab.,2009).Dintre cestode Mesocestoides lineatus pare să fie speciadominantă (28,7 %), urmat apoi de Dipylidium caninum (14,7 %) Șide Taenia pisiformis (12 %), celelalte specii având o prevalenȘă desub 10 %. InvestigaȘii asemănătoare a efectuat Și Reperant (2005)care după examinarea a 267 vulpi roȘii din ElveȘia a constatatdominanȘa lui E. multilocularis (45,7%), urmat apoi de Taenia spp.(4o,8 %), Mesocestoides spp. (6,4 %) Și Dipylidium spp. (1,9 %).Ultimile două au fost prezente doar ca cestode satelite înhelmintofauna intestinului subȘire.6

Prevalena speciilor identificate i gradul de intensitate a infeciilor (n=561)Tabel. 1.Speciile identificateNumărul probelor pozitivePrevalenaIntensitatea infestaiei(%)+ ++ +++ ++++ +++++Trematoda 84 15,0 39 31 13 0 1Alaria alata (Goeze,1782) 84 15,0 39 31 13 0 1Cestoda 509 90,7 290 114 68 16 21Dipyllidium caninum (Linnaeus, 1758) 83 14,7 50 20 12 0 1Echinococcus spp. 27 4,8 19 8 0 0 0Mesocestoides lineatus (Goeze, 1782) 161 28,7 38 48 40 15 20Taenia polyacantha (Linnaeus, 1758) 30 5,3 24 3 3 0 0Taenia hydatigena (Pallas, 1766) 46 8,2 32 8 5 1 0Taenia multiceps (Leske, 1780) 26 4,6 23 2 1 0 0Taenia pisiformis (Bloch, 1780) 67 12,0 45 16 6 0 0Taenia serialis (Gervais, 1847) 5 0,9 5 0 0 0 0Taenia taeniaeformis (Batsch, 1786) 15 2,6 15 0 0 0 0Taenia crassiceps (Zeder,1800) 28 5,0 23 5 0 0 0Taenia ovis (Cobbold, 1869) 21 3,7 16 4 1 0 0Nematoda 513 91,4 356 116 38 3 0Ancylostoma caninum (Ercolani,1859) 101 18,2 65 31 5 0 0Uncinaria stenocephala (Railliet,1854) 82 15,0 55 24 3 0 0Toxascaris leonina (von Linstow, 1902) 12 4,6 9 1 2 0 0Toxocara canis (Werner, 1782) 165 29,4 98 37 27 3 0Trichuris vulpis (Froelich, 1789) 153 27,2 129 23 1 0 07

Dipyllidium caninum a fost identificat în 83 probe (14,7%).Intensitatea infestaȘiei a fost între 1-100 cestode pe probă (60 %),într-un singur caz numărul acestora a depăȘit 10.000 de exemplare(1 %). Cele mai infestate au fost probele provenite din judeȘeleSibiu (39%), BraȘov (33%), Covasna (23%) Și Harghita (22 %).D. caninum format din proglote numite Și ”sâmbure decastravete” au fost uȘor de diferenȘiat după rostrul alungit în formăde con, după croȘetele aȘezate în mai multe rânduri, precum Șidupă aparatul genital cu o structură caracteristică din proglotelemature.88,50 % din exemplare au fost izolate din ultima treime ajejunului, aveau dimensiunile cuprinse între 28-42 cm Și eraucompetitori secundari. Vulpile cele mai infestate au avut vârsta de 4ani (43 %). Vulpile femele erau mai infestate (55 %) decât masculii(45 %).Echinococcus multilocularis a fost izolat din 27 probereprezentând o prevalenȘă de 4,8%. Intensitatea infestaȘiei în 70%avea valori de până la 100 cestode per probă, iar în 8 cazuri (30%)numărul lor era între 114 Și 312 (Tabel 2.). Teysseyre (2005)menȘionează că infestaȘia medie a vulpilor roȘii europene cuE.multilocularis variază între 50 Și 2.000 exemplare/probă.În urma examinării celor 561 de probe s-au izolat 2012exemplare de E. multilocularis. Aceasta reprezintă biomasa deE.multilocularis din cele 27 probe pozitive. Din acestea un număr de1482 au fost conservate în formol, iar 530 de exemplare în etanol70% pentru examene Și analize ulterioare inclusiv pentru PCR.Rezultate asemănătoare descrie Knapp Și colab.(2008), caredupă examinarea a 571 cadavre de vulpe roȘie provenite din europacentrală constată o prevalenȘă de 53 %. În privinȘa gradului deinfestare 91 % din probe erau infestate cu până la 10.000E.multilocularis / probă, iar în 9 % din probe numărul acestui cestoddepăȘea chiar 10.000 / probă examinată. Acest număr mare deE.multilocularis recalculat în valoare de biomasă reprezenta un totalde 175.897 cestode.8

Tabel 2.Prevalena E. multilocularis în vulpile necropsiateNr.crt.JudeȘulProbeexaminateProbepozitivePrevalenȘa(%)95% CI1. AB 23 0 0 [0.0, 0.0]2. AR 19 2 10,5 [3.3, 20.3]3. BH 41 6 14,6 [3.7, 25.4]4. BN 53 3 5,7 [0.57, 11.8]5. BV 24 0 0 [0.0, 0.0]6. CJ 36 1 2,8 [2.6, 8.1]7. CV 118 2 1,7 [0.6, 4.0]8. HR 41 1 2,4 [2.2, 7.1]9. HD 15 0 0 [0.0, 0.0]10. MM 37 4 10,8 [0.7, 20.8]11. MS 36 0 0 [0.0, 0.0]12. SM 63 8 12,7 [4.4, 20.9]13. SJ 18 0 0 [0.0, 0.0]14. SB 18 0 0 [0.0, 0.0]15. TM 19 0 0 [0.0, 0.0]TOTAL 561 27 4,8 [3.0, 6.5]Valori ridicate ale infestaȘiei, de 45,7 % a raportat ȘiReperant (2005) în cazul a 267 vulpi roȘii din ElveȘia. ValoareainfestaȘiei varia de la 1 la 120 020 exemplare pe probă examinată.La 88 % din probe se găseau sub 100 de E.multilocularis, la 9,7 %din probe între 1.000 Și 55.000 exemplare, iar la 1,9 % din probeerau peste 55.000 exemplare/probă examinată. Această ultimăcategorie a dat 76 % din biomasa totală de E.multilocularis.În ce priveȘte dispersia parazitului pe teritoriul luat în studiutrebuie remarcat faptul că din cele 15 judeȘe din centrul Și nordvestulRomâniei, în 8 judeȘe (53,3 %) ea a fost depistată în 26locaȘii. Cele mai infestate au fost probele provenite din judeȘele9

Satu Mare (31 %), MaramureȘ (23 %) Și Bihor (23 %).Localizările exacte ale provenienȘei probelor pozitive au fostrealizate prin utilizarea sistemului GPS.Analizând condiȘiile ecologice din zonele infestate, s-aconstatat faptul că altitudinea acestor teritorii era cuprinsă între 116m (CăuaȘ, judeȘul Satu Mare) Și 586 m (AleȘd, judeȘul Bihor).În zonele infestate temperatura medie anuală a fost cuprinsă între 9-11C°, iar cantitatea medie anuală de precipitaȘii era de 700-900 mm.Analizând cantitatea de biomasă de E.multilocularis pejudeȘe, s-a constatat că deȘi cantitatea ceea mai mare de biomasă afost în cazul judeȘului Bihor (764 E.multilocularis în cele 6 probepozitive), urmat de judeȘul Satu Mare (628 E.multilocularis în cele8 probe pozitive) Și apoi de judeȘul Arad (358 E.multilocularis încele 2 probe pozitive), totuȘi recalculat pe probă pozitivă numărulmediu cel mai mare de E.multilocularis a fost găsită în probelepozitive din judeȘul Arad (179), apoi în cele din judeȘul Bihor(127,3) Și în cele din judeȘul Satu Mare (78,5). Acest lucru este pedeplin justificabil prin faptul că în judeȘele limitrofe din UngariaprevalenȘa E.multilocularis este ridicată, iar prin deplasarea vulpilorîn aceste zone vehicularea parazitului poate fi realizată în condiȘiioptime.E. multilocularis a fost izolată în treimea distală a jejunului,unde în 59,2 % din cazuri era competitor principal, în 18,6 % dincazuri a fost competitor secundar, iar în 22,2 % competitor satelit pesubstratul nutritiv. Vulpile femele (59 %) au fost mai infestate decâtmasculii (41 %). Vârsta ceea mai infestată a fost cel de 4 ani (52%).Morfologic exemplarele de E. multilocularis au prezentat îngeneral 4-5 segmente mici, cu deschiderea porului genital în primaterime a proglotelor mature la partea anterioară a marginii proglotei.Uterul nu are ramificaţii laterale ci este mai mult saciform.Oncosferele din ultima proglotă gravidă erau tipice pentru Taeniaspp., cu perete gros Și brăzdat diagonal, cu dimensiuni cuprinse între30-50 Ș x 44 Ș, iar în interior în unele oncosfere s-au putut distingeembrionii hexacanȘi. Numărul oncosferelor din proglotele matureera în medie de 160-210. Majoritatea exemplarelor de E.multilocularis au fost gravide.10

Ponderea net majoritară în infestaȘiile cu cestode a probelors-a constatat cu Mesocestoides lineatus (28,7 %). Adultulparazitează în intestinul subȘire al vulpilor, iar forma detertathyridium în rozătoare Microtidae, dar mai ales în Microtusarvalis cu o incidenȘă ce poate ajunge până la 1,4 %.Intensitatea infestaȘiei (până la 5.000 cestode/probă) eraechilibrată: 24% din probele analizate aveau între 1-100 exemplare,30% între 101-1.000 Și 25% între 1.001-5.000. În cazul a 20 deprobe (12%) numărul cestodelor a depăȘit chiar 10.000 exemplare/probă. Cele mai infestate au fost probele provenite din judeȘele Cluj(47%), Covasna (43%) Și BraȘov (42%).Lungimea paraziȘilor în infestaȘiile slabe a fost de 15-28cm izolându-se în general forme adulte bine dezvoltate. Acesteexemplare au prezentat un scolex rotund, bine dezvoltat, nearmat,fără rostru Și respectiv cârlige. La exemplarele adulte porul genitals-a observat la nivelul treimii mijlocii al proglotei mature. Înproglotele gravide oncosferele au fost recunoscute în interiorulorganului paruterin înconjurat de un perete gros. În infestaȘiilemedii Și puternice cestodele aveau lungimea de 8-15 cm Și erau deobicei forme tinere.NiȘa ecologică favorabilă dezvoltării lui M.lineatus a fost cuprecădere treimea mediană (67,9%) Și ceea posterioară (32,1%) ajejunului, în competiȘia de substrat ocupând poziȘia principală.Vulpile femele (56 %) în vârstă de 4 ani (39 %) au fost cele maiinfestate.Taenia polycantha parazitează în intestinul subȘire alvulpilor, iar metacestodele în rozătoare Microtidae, dar mai ales înArvicola terrestris Și Clethrionomys glareolus. Ea a fost depistatăîn 30 de probe (5,3 %). Gradul de infestaȘie în 80 % din probe eraredusă (1-100). Probele pozitive au provenit din judeȘeleMaramureȘ (24 %), Satu Mare (21 %), Cluj (17 %) Și Bihor (5 %).Din punct de vedere al niȘei ecologice T.polycantha apopulat într- o proporȘie de 77 % treimea mijlocie a jejunului, iar în23 % treimea anterioară a acestuia. Preponderent ea a fost competitorsatelit. Cele mai infestate au fost vulpii masculi (60 %) în jurulvârstei de 4 ani (33 %).11

Într-un număr de 46 probe (8,2 %) s-a depistat Taeniahydatigena. Fiind un parazit cosmopolit se regăseȘte în intestinulsubȘire al câinilor, vulpilor, în cel al lupilor Și alȘi carnasierisălbatici, gazdele intermediare fiind rumegătoarele domestice Și celesălbatice. Faptul că ea a fost identificată în intestinul vulpilorconfirmă consumarea de către aceȘtia a cadavrelor de căpriori sauhoituri de ovine în regiunile geografice afectate.La 67 % din probe infestaȘia a fost slabă de până la 100cestode pe probă, iar în 31 % ea a fost cuprinsă între 100 Și 5000exemplare, într-un singur caz fiind chiar mai mult de 5.000. Nu s-auconstatat diferenȘe semnificative între dimensiunea cestodelor Șiintensitatea infestaȘiei. Cele mai infestate au fost probele provenitedin judeȘele BraȘov (21 %), Sibiu (17 %) Și Harghita (17 %).NiȘa ecologică favorabilă dezvoltării lui T.hydatigena a fosttreimea anterioară (în 78,2 % din cazuri) Și ceea mediană (21,8 %) ajejunului. În ambele cazuri în competiȘia de substrat se situa încategoria secundară. Vulpile femele (57 %) în vârstă de 4 ani (48 %)au fost cele mai infestate.Taenia multiceps a fost prezentă în 26 probe (4,6 %).Intensitatea infestaȘiei a fost sub 100 exemplare/probă la 88 % dincazuri.Cele mai infestate au fost probele din judeȘele Sibiu (17%),TimiȘ (11%) Și Harghita (10%).NiȘa ecologică favorabilă dezvoltării lui T.multiceps în79,2% din cazuri s-a dovedit a fi treimea mijlocie a jejunului Șinumai în 20,8% ceea posterioară. În ambele cazuri în competiȘia desubstrat se situa preponderent în categoria secundară. Vulpile femele(58 %) în vârstă de 4 ani (42 %) au fost cele mai infestate.Taenia pisiformis a fost depistat la 67 probe (12%).Intensitatea infestaȘiei a fost predominant slabă sub 100 de cestodeper probă (67%). Cele mai infestate au fost probele provenite dinjudeȘele Harghita (24%), Cluj (19%) Și Sibiu (17%).NiȘa ecologică caracteristică a fost în toate cazurile lanivelul treimii mediane a jejunului, unde în competenȘă T.pisiformisa fost de rol secundar. Vulpile femele (63 %) în vârstă de 4 ani aufost cele mai infestate (49 %).12

Cestodul Taenia serialis a fost identificat doar în 5 (0,9%)dintre probe.Acestea au provenit din judeȘele Covasna (2), BistriȘa(1), Harghita (1) Și TimiȘ (1).Intensitatea infestaȘiei a fost redusă în toate cazurile cu multsub 100 de exemplare/probă.T.serialis a fost prezent uniform întreimea anterioară Și ceea mijlocie a jejunului, ca competitor satelit.Vulpile femele (80 %) Și în jurul vârstei de 4 ani (60 %) aufost cele mai infestate.Taenia taeniaeformis parazitează în intestinul subȘire alvulpilor, iar metacestodele în rozătoare Arvicolidae, mai ales înArvicola terrestris. Ea a fost identificată în 15 probe (2,6 %).Intensitatea infestaȘiei nu a ajuns în nici un caz să depăȘească 100de cestode/probă. Cele mai infestate au fost probele provenite dinjudeȘele Alba (9%), BistriȘa (9%), Sălaj (6%) Și Sibiu (6%).NiȘa ecologică favorabilă dezvoltării teniei a fost treimeaanterioară (68,3%) Și respectiv ceea mediană (31,7%) a jejunuluiunde a fost competitor satelit. Vulpile femele (73%) Și în jurulvârstei de 3 ani (53 %) au fost cele mai infestate.Taenia crassiceps parazitează în intestinul subȘire alvulpilor, iar metacestodele în rozătoare Microtidae, dar mai ales înMicrotus arvalis, provocând cisticercoza la nivelul creierului, cusemne de perturbare a coordonării miȘcărilor.Cestodul a fost identificat în 28 probe (5%). IntensitateainfestaȘiei în 82% din cazuri a fost redusă (sub 100 exemplare/probă). Cele mai infestate au fost probele din judeȘele Satu Mare(14%), MaramureȘ (14%), Cluj (11%) Și Sălaj (11%).NiȘa ecologică favorabilă dezvoltării T.crassiceps oreprezenta treimea mijlocie a jejunului (68%) Și respectiv treimeaanterioară (32%), unde de obicei erau competitori satelit. Vulpilefemele (61%) Și cele în vârstă de 3-4 ani (32-32%) au fost cele maiintens parazitate.Taenia ovis a fost depistat în 21 probe (3,75 %), ceea cedemonstrează faptul că vulpile din zonele infestate pot consumacadavre de oaie.13

Intensitatea infestaȘiei în 76% din cazuri era de sub 100cestode/probă. Cele mai infestate au fost probele provenite dinjudeȘele Sibiu (28%) Și BraȘov (17%).NiȘa ecologică favorabilă dezvoltării T.ovis a fost treimeadistală a jejunului unde era competitor satelit. Vulpile femele (52%)Și în jurul vârstei de 4-5 ani (43-43%) erau cele mai infestate.Dintre nematodele identificate prevalenȘa ceea mai mare aavut Toxocara canis (29,4%) urmat de Trichuris vulpis (27,2%), iarapoi de celelalte nematode. În literatura de specialitate prevalenȘadiferitelor specii de nematode la vulpea roȘie variază în funcȘie dezona geografică. Astfel Reperant (2005) de exemplu subliniazădominanȘa lui Uncinaria stenocephala (79,0%), urmat apoi deToxocara canis respectiv Toxascaris leonina (ambele în total 73,8%),mai rar fiind identificate nematodele din specia Trichuris vulpis(8,6%).Ancylostoma caninum a fost depistată în 101 probe (18%),cu o intensitate a infestaȘiei de 1-100 nematode/probă (64 %).Cele mai infestate au fost probele provenite din judeȘele Hunedoara(60 %), Alba (39 %) Și MureȘ (39 %).Lungimea parazitului a fost de 0,8-2,0 cm, dar în 34,6 % dincazurile izolate s-au depistat forme tinere de 0,6-1,2 cm. La nivelulcapului s-a observat forma caracteristică a capsulei bucale cuformaȘiuni dentiforme. La masculi se distinge bursa copulatrix, iarla femele forma ascuȘită a părȘii caudale.NiȘa ecologică favorabilă dezvoltării parazitului a fostpreponderent în treimea mediană a jejunului, fiind competitorsecundar în competiȘia pe substrat. Vulpile femele (66%) în vârstăde 4 ani (39%) au fost cele mai infestate.InfestaȘia probelor cu Uncinaria stenocephala a fost de15%, fiind depistat la un număr de 82 probe. IntensitateainfestaȘiilor era în general slabă, nedeplăȘind 100 de nematode perprobă (67%). Cele mai infestate au fost probele provenite dinjudeȘele MureȘ (33%), Hunedoara (33%) Și Alba (30%).NiȘa ecologică favorabilă dezvoltării nematodului a fostreprezentată de partea distală a duodenului Și respectiv prima treimea jejunului unde pe lângă ceilalȘi helminȘi avea rol de competitor14

secundar. Femelele (56 %) de 4 ani (48 %) au fost cele maiparazitate.Toxascaris leonina Și Toxocara canis reprezintă cele maiimportante infestaȘii cu nematode ale vulpilor.Toxascaris leonina a fost identificată în 12 probe (4,6%).Intensitatea infestaȘiei a fost preponderent scăzută (în 75% dinprobe). Cele mai infestate au fost probele provenite din judeȘeleBraȘov (8%), MureȘ (6%) Și Sibiu (6%).Exemplarele adulte au atins chiar 10 cm, iar în partea loranterioară s-au observat aripi cervicale scurte Și perfect lamelate.NiȘa ecologică favorabilă pentru dezvoltarea lui T.leonina afost treimea distală a jejunului unde în competiȘia pe substrat eracompetitor secundar sau satelit. Cele mai infestate au fost vulpilefemele (58 %) de sub un an (59 %).În cazul celor 561 probe analizate Toxocara canis a fostdepistat la 165 de probe reprezentând procentual 29,4 % deprevalenȘă. Intensitatea infestaȘiilor a fost în general slabă de pânăla 100 paraziȘi / probă (59%), iar în 64 cazuri numărul acestora adepăȘit 100 de exemplare (38,8%) Și chiar 5.000 exemplare (2%).Cele mai infestate probe au fost cele provenite din judeȘele Hargita(56%), Hunedoara (53%) Și TimiȘ (47%).La deschiderea fragmentelor intestinale cu o intensitateridicată a infesȘiei, s-au observat ghemuri de Toxocara spp. tinerede 1,8-2,6 cm Și adulte cu dimensiuni de până la 18,6 cm.În niȘele ecologice reprezentate prin prima (38%) Șirespectiv ultima treime (62%) a jejunului T. canis a avut ocompetiȘie de substrat pe poziȘie de competitor principal împreunăcu A.alata (8:2) Și respectiv cu M.lineatus (7:3). Cea mai infestatăcategorie a fost aceea a femelelor (54 %) de 4 (36%) Și respectiv 3(34 %) ani.Trichuris vulpis a fost prezent la 27,2% (n = 153) dinprobele analizate. Intensitatea infestaȘiilor a fost în general slabă,sub 100 nematode per probă (84 %). Cele mai infestate au fostprobele provenite din judeȘele MureȘ (44%), BistriȘa (43%) ȘiBihor (41%).15

În niȘa ecologică favorabilă dezvoltării parazituluireprezentat prin ultima treime a jejunului Și respectiv în ileon unde aparticipat ca competitor satelit alături de Toxocara spp. Vulpilefemele (54 %) în vârstă de 4 (35 %) Și respectiv 3 (34 %) ani aufost în general mai frecvent infestate.PrevalenȘa, intensitatea infestaȘiei Și dispersia paraziȘilorla nivel intestinal este într-o strânsă corelaȘie. Calderini Și colab.(2009) arată că la vulpile din zona centrală a Italiei speciileDipylidium spp. Și Mesocestoides spp. au fost codominante. Eira Șicolab. (2006) atrage atenȘia asupra unor asociaȘii helmintice lanivelul intestinului subȘire ca de exemplu U.stenocephala cu T.canissau Mesocestoides spp. cu A.alata. Astfel, Caswell (1978) Și Hanski(1982,1991) grupează paraziȘii în competitori principali-, secundari-Și sateliȘi. Competitorii principali sunt de obicei în număr redus caspecie (în medie 2-5) dar cu intensitate mare a infestaȘiei (peste1.000 exemplare/probă). În cazul competitorilor secundari poate fivorba de mai multe specii de paraziȘi (în medie 4-8) care selocalizează preponderent în aceleaȘi segmente intestinale, având ointensitate medie a infestaȘiei (între 100 Și 500 exemplare/probă).Competitorii sateliȘi sunt de obicei specii (în medie 2-12), cu ointensitate redusă a infestaȘiei pe segment intestinal (1-50exemplare/probă).La clasificarea niȘelor ecologice Și incadrarea helminȘilorîn funcȘie de competiȘia de substrat s-a observat o netădiferenȘiere a speciilor pe niȘe ecologice aceasta fiind în corelaȘiecu dispersia helminȘilor Și cu intensivitatea infecȘiilor constatate.Astfel, s-a constatat că deȘi în primul Și ultimul segment intestinal(duoden Și respectiv ileon) nu există o competiȘie de substrat, lanivelul celor trei segmente ale jejunului se regăsesc atât speciile dingrupa competitorilor principali, cât Și cele din grupa competitorilorsecundari Și sateliȘi.II.4. ConcluziiCercetările privind helmintofauna intestinului subȘire lavulpea roȘie europeană (Vulpes vulpes Linnae) efectuate în 1516

judeȘe din centrul Și nord-vestul României, în perioada 2007-2010,pe 561 probe de intestin subȘire, au relevat următoarele :1.- Parazitofauna intestinului subȘire a fost polispecifică cuprevalenȘa dominantă a nematodelor (91,4 %), urmată imediat deceea a cestodelor (90,7 %) , respectiv a trematodelor (15 %).2.- Intensitatea ceea mai ridicată a infestaȘiei s-a constatat încazul cestodelor unde în 3,7% din probe numărul exemplarelor adepăȘit 10.000 / probă.3.- HelminȘii izolaȘi Și identificaȘi au aparȘinut speciilor: Alaria alata, Dipylidium caninum, Echinococcus multilocularis,Mesocestoides lineatus, T.polycantha, T.hydatigena, T.multiceps,T.pisiformis, T.serialis, T.taeniaeformis, T.crassiceps, T.ovis,Ancylostoma caninum, Uncinaria stenocephala, Toxascaris leonina,Toxocara canis Și Trichuris vulpis.4.- Lungimea cestodelor din genurile Taenia Și respectivMesocestoides a fost sub 20-25 cm Și chiar mai scurte, în special încazurile de infestaȘii masive de peste 1.000-5.000 exemplare. Taliaredusă a cestodelor în cazul infestaȘiilor masive se explică prinefectul de supraaglomerare – crowding effect.5.- NiȘa ecologică favorabilă dezvoltării trematodelor a fostduodenul, a infestaȘiilor cu cestode Și Toxocara spp.toată lungimeaa jejunului, cu localizări în funȘie de specie, ancilostomidele au fostdepistate în treimea mijlocie a jejunului, iar Trichuris spp. s-a izolatdin ileon – demonstrându-se astfel niȘele ecologice caracteristicepentru paraziȘii diagnosticaȘi.6.- În competiȘia de substrat s-au observat trei categorii decompetitori : principali, secundari Și sateliȘi. ProbabilitateaexistenȘei unui fenomen de competiȘie de substrat s-a observat înspecial în cazul infestaȘiilor masive cu M.lineatus, care s-a asociatcu un număr mic de alȘi paraziȘi din segmentul digestiv parazitat.7.- RepartiȘia infestaȘiilor pe judeȘe, sexul sau vârstavulpilor ca gazde parazitare nu pare să fie semnificativ diferită.TotuȘi categoria de vârstă ceea mai afectată a fost ceea de 4 ani(40,4%), femelele fiind mai infestate (56,6 %).8.- Pentru depistarea infestaȘiilor cu E. multilocularismetoda examinării raclatului mucoasei intestinale are o valoare17

completă Și reală numai dacă se examinează atât conȘinutul cât Șiraclatul mucoasei ultimei treimi a jejunului, pe toată lungimea sa.- În 27 probe (4,8 %) a fost depistată infestaȘia cu E.multilocularis, cu o biomasă totală de 2.012 cestode.- Probele pozitive pentru E. multilocularis au provenit din 8judeȘe din centrul Și nord-vestul României (53,3 % din număruljudeȘelor luate în studiu).- Cele mai infestate cu E. multilocularis au fost vulpilefemele (59,3 %), în jurul vârstei de 4 ani (51,9 %).- Au fost descrise caracterele morfo-structurale caracteristicespeciei E. multilocularis :strobila are 3-5 segmente, de 1,2-2,7 mm; scolexul cu patru ventuze,este armat cu 2 rânduri de croȘete rostrale; proglota ovigeră arelungimea de 0,7-1,2 mm; porul genital este situat pe margineaanterioară a primei treimi din proglotele gravide; uterul estesaciform, iar numărul testicolelor s-a situat între 12-24; proglotaovigeră conȘine 160-210 oncosfere, de 30-50 x 44 µm.Exemplarele de E. multilocularis izolate prin randomizare aufost conservate în alcool 90% pentru examinare ulterioară din metodaPCR.Capitolul III. - Investigaii copro-ELISA pentru screening-ulinfestaiilor cu E.multilocularis la vulpea roieeuropeană (Vulpes vulpes L.)III.1. ObiectiveDetectarea coproantigenelor metabolice prin tehnicacoproantigen-ELISA este o metodă imunologică care se bazează pedetecȘia antigenelor specifice de Echinococcus spp. prezente înmateriile fecale.Examenul raclatului de mucoasă intestinală pentru decelareainfestaȘiilor cu E.multilocularis are mai multe dezavantaje, printrecare durata lungă, costurile mari prin personalul implicat Șicertitudinea scăzută a rezultatelor în caz de infestaȘie slabă, sunt18

numai cele mai semnificative. În plus, metodele necropsicesubestimează prevalenȘa reală a infestaȘiei cu E.multilocularis.Testul coproantigen-ELISA (CpAgELISA) are Și avantajulcă el poate fi efectuat Și la animalele în viaȘă putându-se obȘinerezultate pozitive chiar în perioada de prepatenȘă a parazitului.Eckert Și colab.(2002) arată că E.multilocularis poate fi detectat la5-10 zile post infecȘie prin tehnica CpAgELISA.Testul CpAgELISA se utilizează ca test pre-screening înzonele în care nu se cunoaȘte statusul populaȘiei de vulpi cu privirela infestaȘia acestora cu E. multilocularis (Popa,2010).Specificitatea testului de detectare a coproantigenelor pentrugenul Echinococcus este în jur de 99 %, iar sensibilitatea este de84%. Testul CpAgELISA având o valoare predictivă negativă foarteridicată (99,9%), îl face potrivit pentru screeningul populaȘiilor devulpi cu o prevalenȘă redusă de E.multilocularis (Popa-2010).Tehnica CpAgELISA se aplică pentru diagnosticulinfestaȘiilor cu Echinococcus spp. atât pe probe proaspete, cât Și peprobe care au fost în prealabil congelate (-20 C°).În procedura de detectare a coproantigenelor metabolice deEchinococcus spp. prin tehnica CpAgELISA din probele de fecalesau probe proaspete de conȘinut rectal provenite de la vulpi s-autilizat metodologia descrisă de Deplazes Și colab.(1999) Și deManualul OIE (2008), având în vedere în primul rând instrucȘiunileproducătorilui de chituri.Obiectivul principal : Realizarea testului CpAgELISA la unnumăr reprezentativ de probe de fecale provenite de la vulpi dinjudeȘele luate în studiu.III.2. Materiale i metodeAu fost recoltate probe coprologice din jurul vizuinilor activeprecum Și din conȘinutul rectal în cazul cadavrelor proaspete devulpi.Probele de fecale au fost examinate folosind kitul comercialCHEKIT ECHINOTEST (produs de IDEXX Switzerland AG).19

Plăcile de microtitrare sunt pre-căptuȘite cu anticorpi antiantigene de E.granulosus Și E.multilocularis. Probele în diluȘie seincubează în placa de microtitrare în duplicat – în godeurile test (+)Și în godeurile de control (-) – pentru a oferi rezultate valide. Oriceantigen specific Echinococcus spp. se leagă la anticorpii dingodeurile căptuȘite cu anticorpi Și formează un complex antigenanticorppe suprafaȘa plăcii. Materialul nelegat este eliminat prinspălare. Se adaugă un conjugat imunoenzimatic CHEKIT EchinotestIgG anti-Echinococcus spp. cu peroxidaza, care se leagă la antigenulde Echinococcus spp. legat la placa căptuȘită cu anticorpi.Conjugatul nelegat este eliminat prin spălare după care se adaugăsubstratul Și cromogenul în godeuri.Intensitatea culorii dezvoltate (densitate optică măsurată la450 nm) este direct proporȘională cu cantitatea de antigen specificspeciei Echinococcus spp. prezentă în probă.ExtincȘia netă (NE) reprezintă cantitatea de anticorpiîntâlniȘi. NE se calculează scăzând densitatea optică (OD)dezvoltată în godeurile cu anticorpi de control (-) din densitateaoptică (OD) dezvoltată în godeurile căptuȘite cu anticorpi antiEchinococcus (+) pentru acelaȘi ser. RelevanȘa pentru diagnostic arezultatului se obȘine comparând densitatea optică netă (NE) aprobelor cu cea a controlului pozitiv.III.3. Rezultate i discuiiS-a constatat că din cele 15 judeȘe luate în studiu, într-unnumăr de 9 judeȘe (60%) s-au depistat probe coprologice cureactivitate la testul CpAgELISA Echinococcus spp.După parcurgerea protocolului de lucru indicat deproducătorul de kituri din cele 176 probe coprologice examinate prinCpAgELISA CHEKIT-Echinotest au fost pozitive 20 de probe (11,4%) [CI 95 % : 6.6, 16.0], dubioase 18 probe (10,2 %) [CI 95 % : 5.7,14.7] Și negative 138 probe (78,4 %).Valorile densităȘii optice (OD) ale probelor pozitive au fostcuprinse între 40,585 Și 98,716. Probele cu rezultate dubioase aveau20

valorile OD cuprinse între 30 Și 40, iar probele negative valori OD

E.multilocularis în toate probele în care cestodul a fost depistat Șiprin examenul conȘinutului Și respectiv raclatului intestinal.Nu acelaȘi lucru putem afirma despre specificitate care a fostvariabilă de la 27,7% la 95 %. Se pare că sensibilitatea dar înspecial specificitatea metodei sunt influenȘate de etapa de patenȘăîn care se află animalul postinfecȘios, de presiunea parazitară Și denumărul de oncosferelor din fecale.Tabel 3.Rezultatele finale ale testului privind prevalenȘacoproantigenelor CpAgELISA Echinococcus spp.Nr.crt.JudeȘulCpAgTotal probepozitiveELISAPrevalenȘa finală(%)CI(95 %)1 AB 0 0 [0.0, 0.0]2 AR 3 18,7 [0.4, 37.9]3 BH 5 20,8 [4.5, 37.1]4 BN 2 25,0 [5.1, 55.1]5 BV 0 0 [0.0, 0.0]6 CJ 1 12,5 [10.4, 15.4]7 CV 3 18,7 [0.4, 37.9]8 HR 3 18,7 [0.4, 37.9]9 HD 0 0 [0.0, 0.0]10 MM 6 27,3 [8.6, 49.1]11 MS 0 0 [0.0, 0.0]12 SM 6 24,0 [7.2, 40.7]13 SJ 0 0 [0.0, 0.0]14 SB 0 0 [0.0, 0.0]15 TM 1 12,5 [10.4, 15.4]Total 176 30 17,0 [11.4, 22.6]III.4. Concluzii22

În urma examinării prin testul CpAgELISA a unui număr de176 probe coprologice provenite din judeȘele din zona centrală Șinord-vestică a României, s-au constatat :1.- PrevalenȘa medie la testul CpAgELISA Echinococcusspp. a fost de 17,0 %, fiind depistată în 9 (60 %) din judeȘele luateîn studiu. Ceea mai ridicată prevalenȘă s-a constatat în cazuljudeȘului MaramureȘ (27,3 %), fiind urmată de judeȘele BistriȘaNăsăud (25,0 %), Satu Mare (24 %) Și Bihor (20,8 %).2.- Metoda CpAgELISA utilizată a avut o sensibilitate de100% confirmând prezenȘa Echinococcus spp. Specificitatea a fostvariabilă de la 27,7 % la 95 %.3.- InvestigaȘiile realizate arată că metoda CpAgELISA esteo metodă foarte bună pentru screenengul populaȘiilor de vulpi faȘăde infestaȘia cu Echinococcus spp.III.5.- Recomandări1.- Având în vedere influenȘa incontestabilă a presiuniiparazitare asupra rezultatelor testului CpAgELISA esterecomandabilă completarea acestuia cu examinarea conȘinutului Șia raclatului intestinal, iar în cazul probelor pozitive este necesarăconfirmarea prin metoda PCR.2.- Screening-ul efectivelor de vulpi trebuie extinsă la nivelultuturor Laboratoarelor Sanitare Veterinare JudeȘene din România,dar în special din zonele nord-vestice Și centrale ale Șării, dincadavrele care se examinează în vederea rabiei, având în vedereextinderea accelerată a infestaȘiei.Capitolul IV. - Incadrarea taxonomică prin metoda PCRa speciei Echinococcus multilocularis.IV.1. Obiective23

Pentru confirmarea statusului taxonomic al cestoduluiidentificat morfologic ca E. multilocularis, s-a utilizat metodaMultiplex PCR (Polymerase Chain Reaction).ReacȘia de polimerizare în lanȘ, are la bază o tehnologie invitro care imită capacitatea naturală de replicare al ADN-lui Și careconstă în generarea rapidă a unor copii multiple a unei secvenȘenucleotidice Șintă (ADN sau ARN) dintr-o genă de interes. Produsulamplificat PCR este apoi detectat prin diverse metode.Având în vedere faptul că oncosferele diferitelor specii deTaeniidae spp. Și respectiv de Echinococcus spp. care parazitează înintestinul carnivorelor, din punct de vedere morfologic sunt imposibilde diferenȘiat, Deplazes Și colab.(2003) au dezvoltat un sistemMultiplex PCR capabil de diferenȘierea E.multilocularis deE.granulosus Și respectiv de oncosferele de tip Taenia spp. în bazadiferenȘei mărimii ampliconilor. Metoda se poate utiliza pentruidentificarea speciilor cât Și pentru stabilirea genotipului acestorcestode. Ea are valoare deosebită în diagnosticul individual lagazdele definitive, la evaluarea contaminării mediului Și la analizariscurilor de infestaȘie umană, iar în final în monitorizarea efectelorprogramelor de control al bolii.IV.2. Materiale i metodeDin totalul de 2.012 de cestodele identificate morfologic caE.multilocularis un număr de 530 exemplare au fost spălate de treiori în apă distilată sterilă Și stocate în etanol de 70 % în vedereaexaminătii ulterioare prin metoda PCR. Pentru examinare prinmetoda Multiplex PCR au fost alese aleatoriu 3 cestode adulte cuproglota finală gravidă Și intactă (cu oncosfere bine vizibile), dinprobele recoltate în perioada ianuarie-februarie 2009 Și provenitedin judeȘele cele mai infestate (Satu Mare Și Bihor).Pentru examinarea Și confirmarea prin tehnică de biologiemolecular a speciei E.multilocularis s-a utilizat metoda MultiplexPCR descris de Trachsel Și colab.(2007).24

Testul Multiplex PCR a fost realizat în cadrul Institutului deParazitologie al UniversităȘii din Zürich (ElveȘia), sub coordonareaDomnului Profesor Universitar Dr.Peter Deplazes.Pentru confirmarea cestodului E.multilocularis s-au folositprimerii care corespund genei mitocondrale 12S-ARN, cu mărimeaamplicon-ului de 395 pb, pentru E.granulosus primeri cu ampliconde 117 pb, iar pentru Taenia spp. primeri cu amplicon de 267 pb :UnivSr :TaeSf :EgS2f :EmN2f :EmNr :5’-GCGGTGTGTACMTGAGCTAAAC-3’5’-YGAYTCTTTTTAGGGGAAGGTGTG-3’5’-GTTTTTGTGTGTTACATTAATAAGGGTG-3’5’-TGCTGATTTGTTAAAGTTAGTGATC-3’5’-CATAAATCAATGGAAACAACAACAAG-3’IV.3. Rezultate i discuiiDupă respectarea protocolului de lucru Și a etapelor :prepararea mixului PCR, amplificarea Și electroforeza realizate întrunsistem integrat de aparatură PCR, la migrarea în gel de agaroză, s-a obȘinut un amplicon de 395 pb la toate cele trei probe,confirmând astfel apartenenȘa taxonomică a cestodului izolat laspecia E. multilocularis.InvestigaȘiile efectuate în Ungaria au relevant existenȘa apatru genotipuri: H (55,5%), G (18,5%), E (13,6%) Și D (12,4%),ceea ce sugerează faptul că această Șară poate fi graniȘa deextindere către est al unui focar European. TotuȘi, având în vederefaptul că judeȘele limitrofe cu Ungaria prezintă o infestaȘiesemnificativă a efectivelor de vulpi cu E.multilocularis se puneîntrebarea dacă această graniȘă nu este mai mare, inclusiv o partedin România. Pentru elucidarea acestor aspect se impune stabilireaexactă a genotipurilor de E.multilocularis din România.IV.4. ConcluziiAplicarea metodei Multiplex PCR (Polymerase ChainReaction), pe 3 exemplare de Echinococcus spp. recoltate în anul25

2009, de la vulpea roȘie europeană (Vulpes vulpes Linnae),provenite din judeȘele Satu Mare Și Bihor, alese aleatoriu dintr-obiomasă de 2.012 exemplare, a relevat următoarele :1.- Metoda multiplex PCR confirmă apartenenȘa taxonomicăa cestodelor examinate la specia Echinococcus multilocularis.2.- Prin extrapolare, având în vedere faptul că cele treiexemplare de cestode izolate Și examinate în mod aleatoriuprovenite din judeȘele din nord-vestul României, s-au dovedit a fiaparȘinătoare speciei Echinococcus multilocularis, afirmăm că toatecelelalte cestode cu morfo-structură identică izolate, reprezentând obiomasă totală de 2.012 de exemplare, aparȘin aceleeaȘi specii.IV.5. RecomandareInvestigaȘiile trebuiesc continuate pentru stabilireagenotipurilor care se găsesc pe teritoriul României.CapitolulV. - Investigaii necropsice i histopatologicepentru stabilirea incidenei infestaiilornaturale la gazdele intermediare.V.1. ObiectiveHidatidoza alveolară, produsă de E.multilocularis, larozătoarele sălbatice (din familia Cricetidae Și respectiv familiaMuridae), principalele gazde intermediare, a fost descris în literaturade specialitate din FranȘa, ElveȘia Și Austria cu o incidenȘăridicată (9-39 % la Arvicola terrestris Și respectiv 10-21 % laMicrotus arvalis) (Hofer Și colab.,2000; Gottstein Și colab.,2001;Pétavy Și colab.,2003).Ecoregiunile din centrul Și nord-vestul României populate cuaceste rozătoare sunt identice din punct de vedere meteo-pedoclimaticcu cele existente în vestul europei. Drept urmare,investigaȘiile pentru examinarea Și depistarea formei larvare a luiE.multilocularis, ori a altor modificări chistice hepatice la26

populaȘiile de rozătoare sălbatice sunt mai mult ca necesare Șijustificate.V.2. Materiale i metodeÎn perioada august 2007 – iulie 2010 s-a urmărit dinamicaspaȘială Și temporală a populaȘiilor de rozătoare din familiileCricetidae Murray,1866 Și respectiv Muridae Illiger,1815 caprincipalele gazde intermediare potenȘiale în infestaȘiile cuE.multilocularis, în 15 judeȘe din centrul Și nord-vestul României.Capturarea animalelor s-a făcut cu ajutorul a 120 de capcane -tip cutie (box – traps) artizanale Și tip plasă, de diferite dimensiuni.Au fost utilizate concomitent câte 20 de capcane astfel, ca în celepatru perioade ale anului (primăvara, vara, toamna Și iarna) să fieamplasate capcanele Și respectiv capturate gazde intermediare dinfiecare judeȘ. Ele au fost aȘezate fie în linie sau aleator, distanȘadintre ele fiind în medie de 10 m Și au fost lăsate la loculamplasărilor în medie 36-48, uneori chiar 72 ore. Astfel, în perioadainvestigată au fost amplasate în total 3.600 capcane. La amplasare s-au avut în vedere biotopurile preferate ale rozătoarelor sălbatice,precum : zone de podiȘuri împădurite, tufiȘurile din dealuricâmpii,de-a lungul apelor curgătoare Și stătătoare, terenuri cultivatepentru cereale ori rădăcinoase – locuri în care literatura despecialitate indica o mai mare diversitate de specii Și în special alspeciilor cu potenȘial mai mare de infestaȘie. Multe dintre capcaneau fost amplasate în zone cunoscute cu vizuini de vulpe.La capturarea Și uciderea rozătoarelor s-au respectatprevederile legislative privind protecȘia animalelor.Exemplarele astfel obȘinute au fost identificate prinnumerotare, congelate Și păstrate până la incadrarea lor taxonomică.Un număr de 87 exemplare au fost predate FacultăȘii de BiologeCluj Napoca pentru identificarea speciilor Și incadrare taxonomică.Ficatul tuturor rozătoarelor prinse a fost examinat în stareproaspătă - macroscopic - pentru depistarea metacestodelor deE.multilocularis sau alte forme larvare ale cestodelor. Cele cu27

modificări macroscopice au fost introduse în lichid fixator, formolneutru 10%.În vederea examenului histopatologic a fost aplicată metodahistologică de includere la parafină. În total au fost realizate 268 delame pentru examen histopatologic. Deparafinarea, clarificarea,hidratarea şi colorarea secţiunilor obţinute au fost efectuate dupătehnici acreditate şi/sau omologate. Coloraţiile histologice şihistochimice aplicate au fost: Hematoxilină-Eozină (HE), TricromicMasson, PAS-albastru Alcian, Van Giesson, Pappenheim, Kossa,Lillie-Pasternack, Albastru toluidină indicate de literatura despecialitate (Satoh Și colab.,2005,Marosfői,2007,Yamasaki Șicolab.,2008). Examenele histologice clasice au vizat structuramodificărilor constatate macroscopic; diferenȘierea faȘă de altemodificări chistice la nivel hepatic; structura-, starea evolutivă- Șiprezenţa cârligelor în cazul echinococozei alveolare.V.3. Rezultate i discuiiV.3.1. Dinamica spaială i ecologică al capturilorDin totalul de 3.600 capcane depuse 16,3 % au avut capturi.În medie capturile cele mai numerice au fost în perioada toamnei(lunile august, septembrie Și octombrie), urmând apoi perioada verii(lunile mai, junie Și iulie), iar cele mai slabe capturi s-au realizat înperioada iernii (lunile noiembrie, decembrie, ianuarie) Și respectiv înperioada primăverii (lunile februarie, martie, aprilie).În ce priveȘte dinamica distribuȘiei spaȘiale a rozătoarelorcapturate s-a constatat că atât ca diversitate a speciilor cât ȘiabundenȘa capturilor a fost mai mare în zonele cu altitudini maimici, zona terenurilor agricole Și în luncile râurilor, faȘă de zonelemuntoase Și deluroase. De asemenea, am constatat că, creȘtereasemnificativă a ponderilor speciilor dominante s-a făcut îndetrimentul celorlalte specii.Habitatele cu influenȘa puternică a zonelor împădurite audeterminat frecvenȘa ridicată a speciei Apodemus flavicollis(Melchior,1834), identificat aproape în jumătate dintre habitatele28

investigate (44,6 %). El manifestă o preferinȘă pentru zonele cuvegetaȘie lemnoasă : păduri, tufăriȘuri, liziere.De asemenea, s-a remarcat faptul că, pe terenurile deschiseponderea capturilor a fost în general la Microtus arvalis(Pallas,1778) – 32,4 %. DeȘi numărul capcanelor amplasate a fostaproximativ egală în diferite ecoregiuni -, zone geografice-, orihabitate, diferenȘa de peste 10 % dintre ponderea speciilormajoritare se explică de către Benedek (2008a,b) prin tiparelecomportamentale diferite dintre speciile predominant forestiere.Astfel, speciile forestiere, care sunt obiȘnuite cu schimbări bruȘteintervenite în mediul lor Și intră în capcane aproape imediat dupăinstalarea lor, speciile din zonele deschise sunt mai suspicioase, maireticiente faȘă de obiectele noi apărute în habitatul lor, evitându-le.Între cele două categorii se situează specia Clethrionomysglareolus (Schreber,1780) care este larg răspândit în zoneleîmpădurite de la altitudini mari Și medii (19,86 %), dar nu dezvoltăpopulaȘii cu densităȘi mari.În sfârȘit a patra categorie de habitat o reprezintă cele dealtitudine joasă, cu umiditate ridicată pe parcursul întregului an.Specia reprezentativă a acestui habitat a fost Apodemus agrarius(Pallas, 1771), care în aceste zone a ajuns la 74,5 % din numărul totalal capturilor. La munte ea se urcă de- alungul râurilor numai însectorul inferior.V.3.2. Prevalena echinococozei alveolareÎn urma examenelor morfopatologice efectuate imediat dupăcapturare, din totalul de 552 rozătoare prinse au fost depistatemacroscopic modificări chistice la nivelul ficatului la un număr de17 (3,1%) exemplare.PrevalenȘa ceea mai mare a modificărilor chistice hepatice s-a constatat la capturile din judeȘul Satu Mare (10,5%), urmat dejudeȘul TimiȘ (8 %).Numărul formaȘiunilor chistice sau pauciloculare depistateîn ficatul rozătoarelor sălbatice, dimensiunile Și forma acestora,structura Și dispoziȘia lor în parenchimul hepatic a fost variabil dela o specie la alta.29

La două probe de Arvicola terrestris Și o probă provenită dela Microtus arvalis macroscopic s-au constatat pe suprafaȘaficatului imediat sub capsula Glisson formaȘiuni glomerulare, ca unconglomerat de chiȘti, asemănătoare conopidei, bine reliefate pesuprafaȘă, de culoare alb murdar-gălbui, cu diametrul veziculelorcuprinse între 1-6 mm.Formele primare extrahepatice sunt foarte rare (1%). Profilulmorfologic cel mai frecvent întâlnit a fost echinococoza alveolarăintrahepatică heterogenă, infiltrativă, cu o masă destructivă, cu ostructură neregulată Și nevascularizată, cu necroză centrală.Pe secȘiune apare ca o structură spongioasă sau chiarasemănătoare miezului de pâine sau caȘ, cu cavităȘi goale sau cu unconȘinut cenuȘiu, vâscos. Majoritatea cavităȘilor apar fără unconȘinut bine definit.La celelalte 14 probe formaȘiunea a avut macroscopic maimult caracter de chist, neexteriorizându-se caracterul ei septatmultivezicular.Examenul morfo-structural al chisturilor pe secȘiune arelevat prezenȘa unor chisturi uniloculare (în cazul larvelor tinere),circulare sau neregulat ovoidale. FormaȘiunile mici au avutdimensiuni cuprinse între 100-200 x 250-350 Șm. Chisturile dedimensiuni mai mari (1200 – 1500 Șm) conȘineau pe secȘiuneconcreȘiuni uneori calcificaȘi Și un depozit gelatinos, chiar păstosneidentificabil. Chisturile monoveziculare erau în general rarîntâlnite. Predominau cele cu o structură complexă prin împărȘireacavităȘii de către cuticulă într-o masă cavernoasă pluriveziculară.Echinococoza alveolară se prezintă întodeauna invadant,aproape identică ca morfostructură cu cancerul hepatic, care pe calehematogenă este diseminat în celelalte organe ducând la apariȘia demetastaze parazitare. Modificările apar cel mai frecvent la nivelullobului drept în zona portală, sau în cazuri mai rare poate afecta maimulȘi lobi. IniȘial leziunile apar în ficat sub formă de focare dedimensiuni mici, dar cu timpul pot ajunge la dimensiuniconsiderabile (15–20 mm în diametru) cu zone infiltrate.V.3.3. Descrierea histologică a leziunilor30

Histopatologic formaȘiunile larvare ale cestoduluiE.multilocularis se dezvoltă în ficatul rozătoarelor sub forma unortumori granulomatoase infiltrative cu reacȘie periferică puternică,care duc până la urmă la distrugerea organului.În sens centripet, stratul adventiȘial este constituit dintr-oreacȘie fibro-conjunctivă, cu prezenȘa celulelor inflamatorii. Astfel,spre periferie predomină limfocitele Și monocitele, apoi urmează obogată infiltraȘie cu celule gigante, atenuându-se treptat reacȘialocală inflamatorie. Acesteia îi ia locul reacȘia fibroconjunctivă.Cuticula, uni- sau pealocuri pluristratificată, este formată dinlame concentrice de Șesut conjunctiv, care penetrează în cavitateachistică stabilind multiple anastomoze cu proprile ei lame, ducând laformarea aspectului plurivezicular. În spaȘiile dintre aceste lame sepot decela formaȘiuni celulare asemănătoare celulelor gigante, rareeuzinofile Și histiocite.Membrana proligeră (stratul germinativ) care căptuȘeȘtecavităȘile neoformate pare de structură plasmatică, în care doar rarse poate defini conturul unor celule. Acest strat prezintă atât zone decelule foarte tinere, cât Și zone în care multiplicarea exhaustivă acelulelor – sub forma unor rizoizi – îmbracă un caracter specificȘesuturilor maligne. Datorită multitudinii de anastomoze este ostructură cu caracter invadant.Aspecte histologice identice au fost descrise Și de KodamaȘi colab.(2003), care arată că, chisturile alveolare produse deE.multilocularis (cu dimensiuni de 1-10 mm diametru) au uncaracter alveolar Și prin proliferarea exogenă a chistului – originarădin membrana laminară - invadează Și distruge progresiv Șesuturilehepatice ale gazdei. Zona de proliferare este întodeauna separată deparenchimul hepatic de către un strat de celule inflamatorii.Leziunile multiloculare, dimensiunile Și localizareachisturilor se aseamănă cu leziunile din cisticercoza rozătoarelorsălbatice produsă de Taenia taeniaeformis. Literatura de specialitateindică posibilitatea ca în ficatul unor rozătoare sălbatice, în special laArvicola terrestris să fie depistate metacestode aparȘinând specieiTaenia taeniaeformis simultan cu metacestode aparȘinândE.multilocularis (Deblock Și Pétavy-1983; Hofer Și colab.,2000).31

Din aceste considerente din probele diagnosticate ca pozitivemacroscopic, în urma examenelor histopatologice s-a pusdiagnosticul diferenȘial în baza caracretelor morfo-structurale Și aformaȘiunilor parazitare depistate. FaȘă de caracterele morfologiceale echinococozei alveolare descrise anterior, cisticercoza cuT.taeniaeformis (numită strobilocercus) prezintă chisturi bine vizibilemacroscopic, cu o culoare alb-gălbui, fără conȘinut lichid. În aceȘtichiȘti se vede întodeauna scolexul Și strobila larvară de 4,5 x 0,5cm (Karimi Și colab.,2010). Scolexul prezintă o dublă coroană decârlige. Numărul cârligelor este de 36 cu dimensiuni cuprinse între0,36-0,44 mm pentru coroana anterioară Și 0,25-0,27 mm pentruceea posterioară. Forma acestora este tipică pentru T. taeniaeformis.Rezultatele finale privind infestaȘia naturală a rozătoarelorsălbatice (n=552) Și respectiv confirmarea prezenȘei metacestoduluide E.multilocularis arată o prevalenȘă de 2,4 % (n=13),fertilitatea chisturilor fiind de 53,8 % (Tabel 4.).Tabel 4.Rezultatele finale privind infestaȘia naturală a rozătoarelor sălbaticecu metacestodul de E.multilocularisSpeciile de rozătoaresălbaticeNr.capturatePozitive(nr.)Prevalena(%)FertilitateachisturilorArvicola terrestris 103 9 8,7 6Clethrionomys glareolus 34 1 2,9 -Microtus arvalis 132 2 1,5 1Apodemus agrarius 95 1 1,0 -Total 364 13 3,6 7 (53,8 %)Probele pozitive provin din zone geografice în care au fostdepistate Și infestaȘii cu E.multilocularis ale efectivelor de vulpi,32

aceste zone putând fi considerate areale cu risc ridicat pentruexpunerea omului la infestaȘiile cu oncosfere ale acestui cestod.V.4. ConcluziiInvestigaȘiile necropsice Și histopatologice efectuate înperioada 1991-1995 Și respectiv 2007-2010, în vederea evaluăriiincidenȘei infestaȘiilor naturale cu larve de E.multilocularis la 3003rozătoare sălbatice, din 15 judeȘe situate în centrul Și nord-vestulRomâniei, au arătat următoarele :1.- Arvicola terresris alături de Clethrionomys glareolus,Microtus arvalis Și Apodemus agrarius sunt gazde inermediarepentru infestaȘia cu E. multilocularis în centrul Și nord-vestulRomâniei.2.- Modificările necropsice depistate la nivelul ficatului suntcu aspect excrescent conopidiform, asemănătoare granuloamelortumorale, fiind depistate la 0,5 % din rozătoare (1991-1995) Șirespectiv 3,1 % (2007-2010).3.- Histologic s-a confirmat caracterul neolpazic, invadant aleformaȘiunii de matacestod, cu tendinȘă de distrugere a Șesutuluihepatic adiacent.4.- Fertilitatea chisturilor hepatice în Arvicola terresris, darȘi în Microtus arvalis demonstrează capacitatea infestantă aformaȘiunii cu rol în dispersarea infestaȘiei la gazda definitivă.5.- Diagnosticul diferenȘial al echinococozei alveolare larozătoarele gazde intermediare se face faȘă de strobilocercoza cu T.taeniaeformis.Capitolul VI. - Reproducerea experimentală a echinococozeialveolare cu E.multilocularis la oareci albi delaboratorVI.1. Obiective33

Pentru a-Și încheia ciclul biologic, oncosferele deE.multilocularis trebuie să ajungă în tractusul digestiv al unei gazdeintermediare. Aici, din oncosferele ingerate, embrionii trec princirculaţie în toate organele gazdei. Dezvoltarea formei de metacestodare loc la rozătoare în medie între 150-170 zile, dezvoltare ce are loc,în primul rând în ficat.Având în vedere confirmarea prezenȘei de E.multilocularisla efectivele de vulpi în România (4,8%), precum Și depistareaformei larvare, la rozătoarele sălbatice (3,6%) am dorit să realizămreproducerea experimentală a infestaȘiei la Șoareci albi delaborator.VI.2. Materiale i metodeUltimul proglot al cestodului E.multilocularis matur este celoviger, care conţine un uter hipertrofiat în care se găsesc circa 400-800 ouă embrionate, proglota fiind un adevărat „sac” cu oncosfere.Acesta din urmă se desprinde de corpul cestodului la fiecare 7-14zile Numărul mediu zilnic de proglote care se desprind de pe corpulunei tenii este de 0,071.Pentru reproducerea experimentală a infestaȘiei s-au folositdouă probe de intestin de vulpe proaspete, recoltate în data de 24ianuarie 2010 în zona AleȘd, judeȘul Bihor Și respectiv în data de25 ianuarie 2010 în zona Sălsig, judeȘul MaramureȘ. Din cele douăprobe de intestin s-au izolat formele mature de E.multilocularis înnumăr de 312 Și respectiv 79 exemplare. Sub stereomicroscop a fostrecoltat de la fiecare cestod ultimul proglot cu oncosferele mature.SecȘionând peretele proglotei s-au pus în libertate oncosferele.Acestea au fost strânse într-un recipient cu ser fiziologic la + 4 C°.Astfel au fost obȘinute 31.680 de oncosfere (numărate cucamera McMaster). Din aceasta s-a preparat o suspensie de oncosfere(în 150 ml ser fiziologic păstrat la +4 C°), astfel ca 1 ml de suspensieconȘinea în medie 210 oncosfere.Din suspensia preparată s-a administrat la un număr de 48Șoareci albi de laborator per os câte 1 ml în ziua 0-2-4, însemnând oadministrare totală de 630 oncosfere pe Șoarece.34

Un număr de 2 Șoareci au murit în ziua a 2-a post infestarecu diagnosticul morfo-histopatologic de bronhopneumonie abingestis,alte 3 Șoareci au murit în ziua a 14-a cu diagnosticul morfohistopatologicde gastrită Și respectiv indigestie spumoasă.Cele 43 de Șoareci rămase au fost eutanasiate pe loturi astfel: 7 Șoareci la 90 de zile postinfestare, 12 Șoareci la 120 zile, 12Șoareci la 150 zile Și respectiv 12 Șoareci la 180 zile de la datainfestării experimentale.Examenul morfo-histopatologic a fost efectuat după metodeleconsacrate pe un număr de 1.075 de lame.VI.3. Rezultate i discuiiLa examenul macroscopic al ficatului 46,5 % din Șoareciprezentau modificări macroscopice chistice.S-a observat că, cu cât perioada parcursă de la infestaȘiaexperimentală era mai lungă, cu atât leziunile macroscopice auapărut în mai mulȘi Șoareci ca urmare a timpului necesar pentrudezvoltarea metacestodului.În cazul primului lot, eutanasiat la 90 zile nu au fostconstatate modificări macroscopice chistice.În cazul celui de al doilea lot au fost depistate la doi Șoareci(16,7 %) câte un chist pe suprafaȘa ficatului. AceȘtia erau foartemici, uniloculari, situate imediat sub capsula Glisson.La lotul III. formaȘiunile chistice au fost unice la 2 probe(16,7 %), câte două chisturi au fost la 3 probe (25 %), iar în cazulunei probe (8,3 %) s-au depistat chiar trei formaȘiuni chisticedispersate pe suprafaȘa ficatului, preponderent în zona hilului.La probele din lotul IV. toate cele 12 de Șoareci au prezentatmodificări chistice macroscopice pe suprafaȘa ficatului. În 4 (33,3%) dintre aceste cazuri au fost formaȘiuni unice, la 5 (41,7 %) probeau fost câte 2 chisturi pe suprafaȘa ficatului, iar la 3 (25 %) probechisturile erau multiloculare bine dezvoltaȘe sub forma unorciorchine, cu perete subȘire. Acestea din urmă au fost în zonahilului hepatic, grupate imediat sub capsula Glisson.35

În cazul a 23 probe nu am constatat modificări macroscopice,dar Și aceste probe au fost examinate histopatologic.Histologic, granulomul periparazitar caracteristic prezentainfiltraȘii fibroase în cazul tuturor probelor de ficat, infiltraȘie careincludea marginal celule epitelioide, vezicule Și granuloame cuinfiltraȘii macrofage Și fibroblastice înconjurate de limfocite.DiferenȘe majore se pot observa între două necropsii realizate înintervale diferite de la infestaȘia experimentală, în special la 120 Șirespectiv la 180 de zile, când se pot remarca diferenȘe semnificativeevolutive în ce priveȘte frecvenȘa Și extinderea zonelornecrotice, precum Și intensitatea fibrinogenezei.În cazul chistului simplu peretele este bine conturat. Lamodificările polichistice multiple spaţiul interchistic este îngust, înschimb peretele chistic bine reprezentat.În câteva chisturi au fost observate puncte de înmugurire lanivelul membranei proligere, precum şi vezicule proligere în diferitefaze evolutive, unele dintre ele fiind fixate de membrana proligerăprintr-un „pedicul” celular, iar altele nefixate, libere în cavitateaalveolară.Una din caracteristicile echinococozei alveolare produse deE.multilocularis o reprezintă producȘia exuberantă de celule princreȘterea exogenă a membranei germinale împreună cu peretelechistic. ProtoscolecȘii iau naȘtere din membrana germinală. Înmulte cazuri pe faȘa internă a membranei germinale prindesprinderea chisturilor deja formate se pot produce procese demetastază în diferite Șesuturi ale organismului gazdă. CreȘtereaexhaustivă a formaȘiunii alveolare pate duce la formarea de noifocare alveolare.În cazul tuturor celor 20 de probe cu modificări macroscopicechistice, histopatologic s-a confirmat echinococoza alveolară. Dincele 23 probe fără modificări macroscopice la examenulhistopatologic au fost depistate formaȘiuni alveolare în cazul a 8probe.Astfel, rezultatul final al infestaȘiei experimentale cuoncosfere de E.multilocularis la Șoareci albi de laborator se prezintăastfel : la lotul I. probe confirmate pozitive = 0, la lotul II.prevalenȘa36

era de 41,7 %, la lotul III.modificările de natură alveolară au fostconfirmate în 91,7 %, iar la lotul IV.toate modificările alveolarehepatice au fost confirmate a fi metacestode deE.multilocularis.PrevalenȘa totală a fost de 65,1%.13 (46,4%) chisturi din cele 28 de probe pozitivehistopatologic au fost fertile. Ele proveneau din lotul III.- 4 probe Șilotul IV.- 9 probe. Toate cele 3 chisturi multiloculare din probeleprovenite din lotul IV. au fost fertile (Tabel 5.).La 15 Șoareci nu au fost găsite chisturi alveolare, în schimbau fost observate numeroase zone intra şi extra lobulare cu infiltraţiicu celule inflamatorii ca răspuns la acȘiunea parazitului, in unelecazuri modificările având chiar aspect de adenom. Totodată au fostremarcate mai multe celule gigante multinucleate, solitare, izolateuna câte una, uneori însoţie de câteva limfocite. A mai fost observatăcongestie şi degenerescenţa granulară a hepatocitelor.Rezultatul final al infecȘiei experimentaleTabel 5.Lot nr.Nr.oarecieutanasiaiNr.pozitivehistopatologicPrevalena(%)Nr.chisturifertileI. 7 0 0 0 0II. 12 5 41,7 0 0III. 12 11 91,7 4 6,4IV. 12 12 100 9 55,0Total 43 28 65,1 13 46,4%VI.4. ConcluziiEchinococoza alveolară cu E. multilocularis la 48 Șoareci delaborator a fost reprodusă prin infestaȘii experimantale37

administrând per os un număr total de 630 oncosfere / Șoarece, înzilele 0-2-4 a experimentului :1.- Modificările morfo-histopatologice apar după 120-180 dezile de la administrarea per os a suspensiei de oncosfere.2.- Modificările morfo-histopatologice reproduse experimentalla Șorecii de laborator sunt identice cu cele constatate cuocazia infestaȘiilor naturale, respectiv : macroscopic chisturi simpleȘi multiloculare, sub forma unor ciorchine, cu perete subȘire,frecvent în zona hilului hepatic, situate sub capsula Glisson;histopatologic, s-au relevant chisturi subcapsulare, în diferite faze deevoluȘie, cu puncte de înmugurire la nivelul membranei proligere,ce determină apariȘia veziculelor proligere, unele libere în cavitateachistului, precum Și a protoscolecȘilor.3.- Procentul de fertilitate a chisturilor nu este semnificativdiferit în cazul infestaȘiilor experimentale (46,4 %) faȘă de cele dininfestaȘiile naturale (53,8 %).Capitolul VII.- Propuneri de măsuri privind controlulechinococozei cu E.multilocularis în România.Scopul final al investigaȘiilor epidemiologice constă înelaborarea Și aplicarea unor strategii imediate Și de perspectivă desupraveghere Și control împotriva apariȘiei Și extinderiiinfestaȘiilor cu E. multilocularis. Elaborarea unor programe deprofilaxie Și combatere eficiente sunt posibile numai în cunoȘtinȘăde cauză privind epidemiologia Și evaluarea riscului prin analizaextinderii Și evoluȘia spaȘio-temporală a bolii.VII.1. Evaluarea riscului i a evoluiei spaio-temporaleAnaliza de risc este un instrument destinat să furnizeze unobiectiv Și un instrument destinat celor care iau decizii. În fond,procesul de analiză de risc Și actul de a realiza evaluarea riscului nusunt fenomene noi. Analiza de risc, în ceea ce priveȘte infestaȘiile38

parazitare de exemplu, seamănă foarte mult cu o prelucrare statisticăa cunoȘtinȘelor epidemiologice.Etapele care trebuiesc respectate în analiza de risc sunt :- Identificarea pericolului;- Evaluarea riscului;- Gestiunea riscului;- Comunicarea relativă a riscului.Identificarea cestdului E. multilocularis pe teritoriulRomâniei necesită luarea unor decizii Și elaborarea de strategii faȘăde o situaȘie necunoscută până în prezent cu atât mai mult, cu câtaceasta în mod evident poate afecta un număr important de oameniȘi animale prin implicaȘiile pe care le are.Un al doilea pas necesar în analiza de risc este evaluareaextinderii Și a tendinȘei de propagare a infestaȘiei pe teritoriulȘării. În acest sens este imperios necesar continuarea investigaȘiilorde amploare pentru evaluarea prevalenȘei parazitului Și a formeisale larvare la gazdele definitive Și respectiv la cele intermediare,din mediu silvatic, rural Și chiar urban pe o perioadă de cel puȘin 3-5 ani. În baza rezultatelor obȘinute prin evaluarea evoluȘiei anualeale infestaȘiilor se poate realiza un studiu de evoluȘie spaȘiotemporalăa transmiterii de E.multilocularis. Folosirea unor sistemeȘi imagini din satelit ca : CORINE Land Cver (Co-ORdinatin ofInformation on the Environment), Landsat TM sau ArcView, permiturmărirea evoluȘiei spaȘio temporale, dar Și a modificărilor meteogeograficecare o pot influenȘa (Staubach Și colab.,2001).Efectivele de vulpi arată o tendinȘă accelerată de creȘtere înEuropa, habitatul Și arealul lor trofic pătrunzând de foarte multe oriîn zonele locuite, în mediu rural Și chiar urban. Studiile ecologice Șiepidemiologice au arătat că în periferia zonelor urbane existăcondiȘii optime pentru o densitate mare de gazde definitive (vulpea)Și de gazde intermediare (rozătoare), ceea ce a avut drept rezultat opoluare masivă a acestor zone cu oncosfere de E. multilocularis.(Hegglin Și Deplazes-2008; Reperant Și colab.,2009; Casulli Șicolab.,2010).Se pare că, câinii Și pisicile pot contribui la evoluȘia Șidispersia cestodului E. multilocularis atât ca gazde definitive, cât Și39

ca gazde intermediare. Pericolul este cu atât mai mare cu câtprevalenȘa lui E. multilocularis în câini Și pisici vagabonzi poateajunge până la 7% Și respectiv la 3% (Goodfellow Și colab.,2006).Drept urmare, riscul real al apariȘiei infestaȘiei la om cuE.multilocularis a crescut dramatic în general în zonele afectate,ajungând în Șările Europei centrale la 0,02-1,4 cazuri la 100.000 delocuitori. Statisticile din domeniu arată că 70 % din persoaneleinfestate cu E. multilocularis lucrează în domeniu agricol sau silvic,respectiv sunt deȘinători de câini sau pisici. Boala la om în multeȘări europene este considerat ca boală declarabilă (Decizia ComisieiCE nr.2008/426/CE). Rata mortalităȘii în cazurile de echinococozăalveolară diagnosticate la om, fără un tratament adecvat, esteextreme de mare. Tratamentele sunt foarte scumpe Și durează toatăviaȘa pacientului. Se estimează că, pentru tratamentul unui singurpacient se cheltuieȘte între 108.762-250.000 Euro (Torgerson Șicolab.,2008).VII.2. Etapele principale ale managementului risculuiEtapele principale ale managementului riscului infestaȘiilorcu E. multilocularis, precum Și a măsurilor de control ale acestuiasunt :- Analiza riscului;- Modelarea matematică pentru optimizarea metodelor deprevenire Și control;- Studiul fezabilităȘii prin metode de calcul/măsurare acosturilor Și beneficiilor; Și- Planificarea managementului riscului.După Kamiya (2007), pentru succesul unei strategii decontrol asupra echinococozei alveolare sunt necesare :- Informarea Și educarea corectă a populaȘiei care devenindconȘtient de pericolul unei zoonoze parazitare poate săiniȘieze Și chiar să participe activ la controlul acestuia;- IniȘiativa naȘională guvernamentală;- Participarea laboratoarelor de cercetare;40

- Proiect corect Și eficient de preparare Și de amplasare amomelilor cu medicamente antiparazitare.Într-un proiect elaborat de ISS/WHO/FAO (1990 Și 1992)privind “Controlul i reducerea infestaiei cu E.multilocularisprin deparazitarea efectivelor de vulpi” Și completat de cercetărileulterioare din domeniu, luând în considerare criteriul cost-eficienȘătrebuie să fie dezvoltate următoarele etape :- O monitorizare exactă a zonelor cu prevalenȘă ridicată ainfestaȘiilor cu E.multilocularis la toate gazdele definitive posibileȘi urmărirea permanentă a infestaȘiilor acestora prin diagnosticintravitam (inclusiv la câini, pisici etc. !), prin utilizarea hărȘilorbazate pe GIS, tehnologie indispensabilă;- Un model optim Și testat de dispersie în timp Și spaȘiu amomelilor urmărit prin sistemul hărȘilor GIS;- Un tip de momeală cu caracteristici mărite de palatibilitate, cuspecificitate cât mai mare de consum de către vulpi;- Elaborarea unei metodologii practice de monitorizare aconsumului de momeli.VII.3. Îmbunătăirea măsurilor de diagnosticÎmpunătăȘirea permanentă a măsurilor de diagnostic,extinderea aplicării acestora cu scop de screening Și apoi dediagnostic de certitudine constituie una dintre principalele etape alemanagementului riscului.Până de curând, detectarea paraziţilor la necropsie a fostsingura metodă de încredere pentru diagnosticarea infestaţiei cu E.multilocularis la gazde definitive (vulpi, câini, pisici etc.) În aceastăindicaţie, tehnica raclării mucoasei intestinale (intestinal scrapingtechnique = IST) a fost în principala tehnică utilizată în anchetelepopulaȘiilor mari de vulpi. IST are o sensibilitate de 100%, cuinterval de confidenȘă cuprinsă între 76,8 % Și 92,6 %.Metoda de sedimentare şi de numărare (sedimentation andcounting technique = SCT), este de asemenea o tehnică precisă (cu osensibilitate ~ 100%) şi poate fi considerată metoda standard de41

"aur". Ambele, IST şi SCT au o valoare predictivă de specificitatepentru identificarea parazitului Și care se bazează pe criterii distinctemorfologice de 100 %.Detectarea anticorpilor serici prin teste foarte specifice nueste adecvat pentru estimarea prevalenţei reale a E.multilocularis lagazdele definitive din cauza corelaţiei insuficiente dintre prevalenţaanticorpilor serici şi a prezenȘei cestodului adult la nivel intestinal.Testele CpAg-ELISA pot detecta antigenele de E.multilocularis înmateriile fecale deja în timpul perioadei de prepatenȘă (2-29 zilepostinfecȘie), fiind cel mai sensibil (până la 63 %) în perioada depatenȘă (30-70 zile postinfecȘios). Excreţia coproantigenelor estestrâns corelat cu prezenţa intestinală a etapelor imature şi mature aleparazitului şi numărul acestora. Diverse laboratoare descriu diferitetipuri de sensibilităţi cuprinse între 84 şi 95% şi o specificitate de96%. Având totuȘi o marjă de nesiguranȘă (până la 100 %) aspecificităȘii, aceasta indică influenȘa cestodelor non-Echinococcus(Taenia spp, Mesocestoides spp... etc.) şi nematozi, descris Și încapitolul 3 al acestei lucrări. De asemenea, în testele CpAg-ELISApot apare reacȘii încruciȘate cu E. granulosus.Detectarea de ADN în materiile fecale prin PCR este deasemenea specific (100%) şi sensibil (89-100%) în diagnosticulsarcinii intestinale de E. multilocularis. TotuȘi Davidson Șicolab.(2008) arată că rezultatele obȘinute în urma examinăriimateriilor fecale prin metoda Multiplex PCR trebuie tratată cuprudenȘă având în vedere faptul că ea poate detecta prezenȘaintestinală de E.multilocularis doar în perioada patentă, care este 2/3din ciclul evolutiv al parazitului.În urma investigaȘiilor efectuate putem recomanda testulCpAg-ELISA ca test de screening pentru o evaluare primară astatusului de sănătate a populaiilor de vulpi, ea având osensibilitate de 100 % în cazul analizelor efectuate şi PCR ca test deconfirmare. Examenul raclatului de mucoasă intestinală estedeosebit de labrioasă dar nu trebuie exclusă din procedura dediagnostic.VII.4. Măsuri de prevenire a extinderii i de control42

În funcȘie de rezultatele evaluării riscului într-o anumităzonă geografică programele de control în privinȘa infestaȘiilor cuE.multilcularis la gazdele definitive Și respectiv al echinococozeialveolare la gazdele intermediare pot fi :a.- decizia de a nu lua nici o măsură specifică – în cazurile derisc minim;b.- promovarea de materiale educative Și informaȘionale –cu rezultate foarte târzii;c.- tratarea antiparazitară efectivelor de vulpi în teritoriilecunoscute a fi infestate cu E.multilcularis – cu rezultate după 3-4 ani,Și cu pericolul reminiscenȘei în caz de întrerupere;d.- reducerea numărului de rozătoare gazde intermediare,menȘinerea la un nivel optim a numărului de vulpi Și tratareaantiparazitară susȘinută a acestora – cu cele mai mari perspective Șidupă un timp realtiv scurt.EvoluȘia dinamicii populaȘiei de E.multilocularis într-unteritoriu depinde în primul rând de distribuȘia Și longevitateapersistenȘei cestodului în gazdele definitive Și mai puȘin depindede situaȘia epidemiologică a gazdelor intermediare.Cu certitudine însă există o strânsă corelaȘie întrecomponenȘa faunei de rozătoare sălbatice Și prevalenȘa deE.multilcularis la gazdele definitive. Astfel, în zonele în care speciiledin genul Arvicola Și Microtus predomină în stomacul vulpilor,prevalenȘa cestodului este semnificativ mai mare faȘă de zoneleunde în dieta gazdei definitive domină speciile din genurileClethrionomys Și Apodemus.TotuȘi, în cazul aplicării procedurii de reducere a număruluide rozătoare, gazde intermediare, trebuie avut în vedere faptul căunele substanȘe ca de exemplu bromadiolonul, utilizate încombaterea acestor rozătoare, au efect cumulativ, astfel ca la 135 ziledupă aplicare 99,6 % din Arvicola terrestris Și 41 % din Microtusarvalis prezentau o remanenȘă detectabilă (cu nivelul maxim la 3,3Și respectiv 6,5 zile de la aplicare), ceea ce ar putea duce laintoxicarea vulpilor consumatoare (Sage Și colab.,2008, 2010).43

Neexistând la ora actuală posibilitatea vaccinării efectivelorde gazde definitive împotriva infestaȘiilor cu E.multilcularis,singura măsură de prevenire a extinderii Și de control al bolii estedehelmintizarea acestora cu atât mai mult cu cât ele produc an de ano biomasă impresionantă de agenȘi zoonotici.În cazul aplicării unor protocoale de tratamente adecvateinfestaȘia efectivelor de vulpi poate fi mult scăzută Și chiar redusăla minim. TotuȘi având în vedere costurile deosebit de ridicate aleunui tratament susȘinut este recomandabil să se facă o analiză costbeneficiuîn special în zonele cu ciclul silvatic susȘinut.În încercările de a crea un model eficient de tratament Șicontrol al infestaȘiilor cu E.multilocularis în FranȘa au fostfolosite modele matematice de urmărire a prevalenȘei cestodului lavulpe Și respectiv al infestaȘiilor cu forma de metacestod laMicrotus arvalis ca principală gazdă intermediară în această Șară. Înbaza acestor modele s-au calculat necesarul de momeli cupraziquantel distribuit din elicoptere odată cu momelile vaccinalecontra rabiei. Rezultatele au arătat că pentru reuȘita acȘiunii estenecesar:- un control al prevalenȘei infestaȘiei la populaȘiile de vulpiînainte de utilizarea momelilor medicamentate;- un calcul sau modelare matematică pentru evaluareanecesarului de momeli medicamentate, în funcȘie dedensitatea populaȘiei de vulpi a zonei în cauză, în funcȘiede alte specii din zonă care ar putea consuma momelile,precum Și în funcȘie de modelul geografic al teritoriului;- un tratament de lungă durată, de cel puȘin trei ani, cuadministrarea trimestrială a momelilor;- un control al prevalenȘei infestaȘiei la populaȘiile de vulpidupă un interval de trei ani pentru stabilirea eficienȘeitratamentului efectuat.În Germania s-au testat utilizarea a 50 mg de praziquantel/momeală. Momelile au fost plasate pe un teritoriu de 3.000 km² însudul Germaniei, cu o densitate de 20 momeli/km². Repetareadispersării momelilor la interval de 6-12 săptămâni, cu repetare la 1844

Și respectiv 36 luni au dat rezultate considerabile în scădereahelmintozelor în general la vulpi, dar în special în cel al infestaȘiilorcu E. multilocularis.Aplicarea de momeli preparate din făină de peȘte, cu o dozăde 50 mg praziquantel în jurul vizuinilor dar mai cu seamă prindispersare din elicoptere au dat rezultate în Șările vest-Europene Șiîn cele din Europa centrală. Este foarte important ca numărulmomelilor dispersate să fie în corelaȘie cu efectivele de vulpi Și cudensitatea acestora. În medie ea variază de la 20 la 50 momeli / km 2 .Totodată, având în vedere faptul că ciclul evolutiv al E.multilcularisîn vulpe este în medie de 35 zile, aplicarea momelilor esterecomandabil să se facă la interval de 3-4 săptămâni. O serie destudii Și încercări din Europa centrală arată că într-o populaȘie devulpi cu o prevalenȘă a infestaȘiei de 60 %, după un an detratament aceasta a scăzut la 40 %, iar după 2 ani aceasta s-a redus la10 % (Pufe,2009). Costurile cuprinzând producerea- Și, dispersiamomelilor, colectarea - Și, transportul probelor, precum Șianalizele de labrator efectuate pe o suprafaȘă de 3000 km 2 teritoriuîn care au fost 7 aplicaȘii de momeli s-au ridicat la 689.000 Euro(Pufe,2009).Având în vedere importanȘa deosebită a bolii din punct devedere al sănătăȘii umane, Comisia Europeană subvenȘionează”optimizarea” cu praziquantel a prevalenȘei infestaȘiilor în Șărileunde aceasta este foarte ridicată.Având în vedere posibilitatea prevalenȘei parazitului lacâinii Și pisicile vagaboande, este recomandabil extindereamăsurilor de tratament Și în rândul acestora administrându-le cuocazia capturării lor o doză de 5 mg praziquantel / kg greutatecorporal.Una dintre principalele metode de prevenȘie Și control alinfestaȘiilor cu E.multilocularis îl constituie informarea proactivă apopulaiei Și creȘterea nivelului conoȘtinȘelor acestora. Astfel,investigaȘii recente arată că la un public de 2041 persoaneintervievat din Șările Republica Cehă, FranȘa, Germania ȘiElveȘia numărul celor care aveau informaȘii despre aceastăinfestaȘie era mică procentual în Republica Cehă (14 %) Și în45

FranȘa (18 %), comparativ cu procentul celor informaȘi dinGermania (63 %) sau ElveȘia (70 %). FaȘă de FranȘa unde numai17 % din populaȘie s-a mai informat Și din iniȘiativă proprie, înGermania Și ElveȘia procentul acestora era mult mai mare, 54 %respectiv 60 %. Beneficiile unui program proactiv de informare apopulaȘiei ar fi în principal : percepȘia reală a riscului, informaȘiiprivind posibilităȘile de minimalizare a riscurilor Și prevenireareacȘiilor exagerate de anxietate faȘă de infestaȘie.VII.5. RecomandăriPentru prevenirea Și controlul infestaȘiilor cu E.multilocularisse recomandă:1.- Evaluarea exactă a efectivelor de vulpi Și de rozătoarepotenȘiale gazde intermediare pe întregul teritoriu al Șării, precumȘi cunoaȘterea Și monitorizarea densităȘii acestora;2.- Evaluarea prevalenȘei cestodului E. multilocularis latoate speciile de gazde definitive (vulpi, câini, pisici, râs etc.) precumȘi prevalenȘa formei larvare la toate speciile de gazde intermediare,accidentale sau aberante;3.- Introducerea ca analiză obligatorie în Programul strategical acȘiunilor sanitare veterinare suportate din buget a supravegheriiinfestaȘiei, la probele de cadavre de vulpi prelevate Și înaintatelaboratoarelor sanitare veterinare judeȘene, prin metodele de raclaj-Și sedimentarea mucoasei jejunului, precum Și prin CpAgELISA;4.- ÎnfiinȘarea de laboratoare regionale dotate corespunzătorpentru realizarea testului Multiplex PCR Și a genotipizării;5.- Tratamentul antiparazitar susȘinut Și consecvent pe operioadă de cel puȘin 3 ani al efectivelor de vulpi concomitent cuvaccinarea antirabică, cu ajutorul momelilor (5o mg praziquantel/momeală) dispersate câte 20 momeli/km 2 , precum Și în jurulvizuinilor locuite.6.- Tratamentul antiparazitar trebuie început în primul an înzonele endemice sau în zonele cu prevalenȘă ridicată din mediileurban Și rural, fiind extins obligatoriu în al doilea an pe teritoriulîntregii Șări;46

7.- Concomitent cu tratamentele antiparazitare începute,trebuie realizată o acȘiune susȘinută Și consecventă în direcȘiareducerii efectivelor de vulpi la un optim stabilit de specialiȘtiibiologi Și silvici, precum Și o reducere substanȘială a populaȘiilorde rozătoare gazde intermediare;8.- Informarea proactivă a populaȘiei Și creȘterea niveluluiconoȘtinȘelor acestora prin mijloace mass-media, în sistemeleeducaȘionale, prin afiȘe Și pliante, care trebuie să întregeascămăsurile de prevenire Și control a bolii.Capitolul VIII. - Concluzii generaleEchincocoza alveolară cauzată de larvele teniei E.multilocularis, dispersată în natură de vulpea roȘie europeană(Vulpes vulpes L.) Și întreȘinută de gazde intermediare rozătoaresălbatice din familiile Cricetidae Și Microtidae este o zoonozăpotenȘial fatală.InvestigaȘiile efectuate în perioada 2007-2010 pe teritoriul a15 judeȘe din centrul Și nord-vestul României au relevaturmătoarele aspecte :1.- Parazitofauna intestinului subȘire la vulpea roȘieeuropeană (n=561) a fost polispecifică cu prevalenȘa dominantă anematodelor (91,4 %), urmată de aceea a cestodelor (90,7 %) ,respectiv a trematodelor (15 %).2.- HelminȘii izolaȘi Și identificaȘi au aparȘinut speciilor: Alaria alata, Dipylidium caninum, Echinococcus multilocularis,Mesocestoides lineatus, T.polycantha, T.hydatigena, T.multiceps,T.pisiformis, T.serialis, T.taeniaeformis, T.crassiceps, T.ovis,Ancylostoma caninum, Uncinaria stenocephala, Toxascaris leonina,Toxocara canis Și Trichuris vulpis.3.- Din totalul de 561 de probe în 27 (4,8 %) a fost depistatăspecia E. multilocularis, cu o biomasă totală de 2.012 cestode.Probele pozitive au provenit din 8 judeȘe (53,3%) : Bihor(14,6 %), Satu Mare (12,7%) Și MaramureȘ (10,8%), Arad47

(10,5%), BistriȘa-Năsăud (5,7%), Cluj (2,8%), Harghita (2,4%) ȘiCovasna (1,7%).4.- PrevalenȘa medie la testul CpAgELISA Echinococcusspp. a fost de 17,0 %, fiind depistată în 9 (60 %) din judeȘele luateîn studiu. Ceea mai ridicată prevalenȘă s-a constatat în cazuljudeȘului MaramureȘ (27,3%), fiind urmată de judeȘele BistriȘaNăsăud (25,0%), Satu Mare (24%) Și Bihor (20,8%).Metoda CpAgELISA utilizată a avut o sensibilitate de 100%confirmând prezenȘa Echinococcus spp. Specificitatea a fostvariabilă de la 27,7 % la 95 %.5.- Metoda Multiplex PCR confirmă apartenenȘa taxonomicăa cestodelor examinate din genul Echinococcus, la speciaEchinococcus multilocularis, fiind prima confirmare în România.6.- InvestigaȘiile morfopatologice efectuate pe probele derozătoare sălbatice capturate arată că Arvicola terresris alături deClethrionomys glareolus, Microtus arvalis Și Apodemus agrariussunt gazde inermediare pentru echinococoza alvelară în cazulinfestaȘiilor cu E.multilocularis, pe teritoriul României.7.- Modificările necropsice depistate la nivelul ficatuluigazdelor intermediare sunt cu aspect excrescent conopidiform,asemănătoare granuloamelor tumorale, confirmând caracterulparaneolpazic, invadant al formaȘiunii de matacestod, cu tendinȘăde distrugere a Șesutului hepatic adiacent.8.- Fertilitatea chisturilor din Arvicola terrestris Și Microtusarvalis demonstrează capacitatea infestantă a larvelor deE.multilocularis pentru gazdele definitive.9.- Echinococoza alveolară la Șoareci de laborator a fostreprodus, prioritar în România, prin infestaȘii experimentaleadministrând per os un număr mediu de 630 oncosfere, modificărilemorfo-histopatologice apărând după 120-180 de zile. Fertilitateachisturilor a fost de 46,5 %.Modificările morfo-histopatologice reproduse experimental laȘorecii de laborator sunt identice cu cele constatate cu ocaziainfestaȘiilor naturale.48

Procentul de fertilitate a chisturilor nu este semnificativdiferit în cazul infestaȘiilor experimentale (46,4 %) faȘă de cele dininfestaȘiile naturale (53,8 %).VIII.1.RecomandăriPentru prevenirea extinderii Și controlul bolii este nevoie deo serie de măsuri susȘinute Și consecvente ca :- Evaluarea exactă a efectivelor de vulpi, gazde definitive, Și derozătoare, potenȘiale gazde intermediare;- Evaluarea prevalenȘei cestodului E.multilocularis la toatespeciile de gazde definitive;- Extinderea investigaȘiilor de laborator în sistemulProgramului strategic prin metoda examinării mucoaseijejunale, prin testele CpAgELISA Și Multiplex PCR;Se va elabora un program de dehelmintizare a efectivelor devulpi, concomitent cu reducerea numerică a populaȘiilor derozătoare, gazde intermediare.NOTĂ :Valoarea tiinifică deosebită a acestei teze rezultă dinfaptul că pentru prima dată în România:- a fost depistat Și descris morfologic prezenȘa cestoduluiEchinococcus multilocularis la efectivele de vulpi;- a fost realizat incadrarea taxonomică a cestodului prin teste debiologie moleculară - Multiplex PCR;- s-a realizat un screening la populaȘia de vulpi de pe teritoriul a15 judeȘe din centrul Și nord-vestul României prin testulCpAgELISA;- s-a urmărit întregul ciclu de evoluȘie al acestui cestod,prezenȘa ei fiind diagnosticată Și la gazdele intermediare;- s-a realizat întrega gamă de investigaȘii ȘtiinȘifice privitoarela cestodul Echinococcus multilocularis, de la depistarea lui îngazdele definitive, descrierea morfologică a cestodului,49

screeningul populaȘiei afectate, depistarea Și descrierea morfohistopatologicăa formei larvare la gazdele intermediare, Șireproducerea experimentală a infestaȘiei parazitare în condiȘiide laborator;- s-a lucrat printr-o colaborare internaȘională a AsociaȘiei”Echino-News” România Și a USAMV Cluj-Napoca Facultateade Medicină Veterinară-disciplina de Parazitologie Și boliparazitare, cu Universitatea de Medicină Veterinară dinBudapesta (Ungaria) Și cu Institutul de Parazitologie alUniversităȘii din Zürich (ElveȘia).În urma investigaȘiilor efectuate Și publicate, laSimpozionul european privind epidemiologia echinococozeialveolare de la Malzéville (FranȘa) din decembrie 2010, România afost pusă, pentru prima dată pe harta sistemului European demonitorizare a bolii.PART I. – REFERENTIAL STUDYChapter I.I.1. General epidemiological aspects of infection withE.multilocularisThe first case of alveolar echinococcosis in humans wasdescribed in 1852 in southern Germany,as a liver tumor.Then, in1855 Virchow described it as "a multilocular tumoral and hydatidulcerative lesion”. In 1901 Posselt is the first who founds in theintestine of a dog an Echinococcus granulosus like cestoda, yetdifferent, which he describes as the Taenia Echinococcus alveolaris.Over 50 years has kept the dispute about the monocystic design,described by Dévé and polycystic described by the mentioned autors,till in 1954 Rausch in Alaska and in 1957 Vogel in Germany50

independently from each other demonstrate unequivocally theexistence of two different species of echinococcus: E.granulosusand E.multilocularis.In Europe in 1980 it was known in only four countries(Austria, France, Germany and Switzerland) where it was describedthe E.multilocularis. In 1996 the number of these countries hasreached 9. The presence of the parasite is reported more frequently inEastern Europe (Slovakia, Hungary, Ukraine, Bulgaria), Turkey,Asia (Russia, Kazakhstan and China), Amedia North (Dakota) andJapan.In most European countries alveolar echinococcosis hasalready an endemic character and is still expanding with alarmingrapidity and becomt an emergent disease (Sikó Barabási andCozma,2008).If in 1982 the extension was limited to a small part of Franceand Central Europe, in 2003 it is expanding throughout Central andEastern Europe. So for example if in Poland in 1999 the prevalenceof E.multilocularis in examined foxes was 2.6%, in 2003 it reached29.4%.Also, in 1999 in Slovakia the first case of E.multilocularis infox was described, and then in 2000 the prevalence in the examinedfoxes reached 24.8% and 33.9% in 2001.While in Hungary the first case of alveolar echinococcosis inhumans was described in 1988 still the parasite responsible was notidentified in the country until 2003, when parasite prevalence wasalready set to be 29% in examined foxes. Foxes came from borderterritories of the Slovak Republic.In Romania, the first cases were described in detail in 1991 incattle (0,01 %) and in wild rodents – Microtus Chionomis nivalisulpius Brehm (0,4 %). Then, in 1992-1993 were described the firstdetailed morphological aspects of alveolar echinococcosis, beingreported in other microtidae species like Arvicola terrestris,Microtus arvalis and Myodes [sin.Clethrionomys] glareolus with aprevalence of 0.57% in examined animals. In 1996 are the firstinvestigations presented on parasite ecology in Romania. In 1998was the first case of hepatic alveolar echinococcosis in a sheep51

described (in Ilfov county). The first case of hepatic localizedalveolar echinococcosis in humans was described in 1999. The casewas confirmed serologically in the Cantacuzino Institute in Bucharestand in France and Switzerland serologically confirmed by ELISA ashighly positive. In 2000 the second case of multilocular cystic wasdescribed on the spleen of a patient of 49 years. A case of an aberrantintermediate host has been reported in Teleorman county, where in2004 a first case of alveolar echinococcosis was described, localizedexclusively in the liver of a horse.The adult parasite has not been detected in Romania so farfrom any definitive host.Source of infection and life cycle in central Europe is mainlyforestry including mainly the European red fox (Vulpes vulpes) andseveral species of rodents as intermediate hosts : water mouse(Arvicola terrestris), field mouse (Microtus arvalis), forest mouse(Clethrionomis glareolus), etc. Foxes can spread oncospheres oftapeworm in an area over 18 hectares and at distances over 15-16km. Also, from a single stool containing oncospheres, in 10 daysthey can disperse distances of over 80 m from the excrement inquestion. Increasing fox populations and extending their life by urbanterritories is an increased risk factor for humans, and this is all themore so as these animals, the definitive hosts, show no clinical signsto a massive 100,000 tapeworm infection. The E.multilocularisoncospheres are viable outdoors 3-8 months during summer andautumn, and in cold temperatures - 18 C in winter and up to 8months.Alveolar echinococcosis is caused by the larval stage oftapeworm E.multilocularis. It is characterized by the appearance of atumor with extensive character, primary in the liver of intermediatehosts including humans. The tumor has a pronounced malignantcharacter, can induce metastasis, the diagnosis is difficult andtreatment exists by surgical removal. Mortality rate is 94-100% inpatients diagnosed late or undiagnosed and untreated. Althoughhuman cases are relatively rare, long incubation period (10-15 years),considerable hospital costs (17.800 USD/pacient/year), low survival52

ate, expansive character of the area of distribution, increase inhuman cases from year to year and persistence of the parasite innature are sufficient arguments for alveolar echinococcosis causedby the larvae form of E.multilocularis to be considered as a firstemergency parasitic disease in Europe.PART II. – OWN RESEARCHChapter II. - Helminth fauna of the small intestine in theeuropean red fox (Vulpes vulpes L.) and themorphological identification of E.multilocularisII.1. PurposeThe helminth fauna of the small intestine in the european redfox (Vulpes vulpes L.) was studied in Romania only by a few authorsand only on a few samples. The purpose of this paper is to analize thesmall intestinal infestation with parasites on a large number ofsamples from foxes and particular the morphological description ofcestode E.multilocularis.II.2. Material and methodsBetween August 2oo7 - March 2o1o were examined anumber of 561 samples of small intestine. Samples came from 15counties from central and north-vest part of România.From the bodies of foxes the small intestine was isolated byligation (from the pylorus and from the ileocecal valve), which wasindividually packaged and identified with the data described above.Samples were kept in temperature-2o C °, then 48 hours beforeopening were placed in freezer at -80 C ° in accordance withinternational labor protection.For the intestinal content it was used the complemented”golden method” . Thus it was examined the intestinal content, the53

scraped mucosa of the intestine throughout its length and also thefoam resulting from repeated decantation.The isolated parasites were cleaned three times with steriledistillated water, and after a taxonomical classification and counting,they were deposited categorized in labeled recipients in formalin10%, or ethanol 70% for further morphological examinations.For determination of the intensity of infestation, in eachsample/animal the parasites were counted by species and amonitoring system was used.At the morphological identification of parasites the fallowingcriterias were considered: form, dimension, structure of the scolexwith the tipical formations (number, forme and structure of therostellar hooks), morphological characteristics by the sexes, thepresence-, form- and contents of the gravid proglote, form- andorientation of the suckers etc.Between intensity of parasitic infestation, parasite size(between intraspecific limits), relationship to other intestinalparasites there are microecological and competitive correlations. Indifferent ecosystems and micro-ecosystems helminths mayexperience a different biodiversity. In the power struggle on anutritive substrate dominates helminths that adapt better to themicroecological conditions of the occupied intestinal segment. Thesespecies are known as emerging or dominant species in an ecologicalniche.II.3. Results and discussionsFollowing examination of 561 samples were identified asbeing infested 522 samples (93.0%) and in a number of 39 (7.0%) ofintestines were no parasites identified by any method. Negativesamples came from male foxes (59%) and those being 3 years old(41%) respectively 2 years old (29%).Regarding the prevalence of parasites and intensity ofinfestation in the examined dominance of the nematodes has beenfound with a prevalence of 91.4%, fallowed by cestodes (90.7%),54

espectively trematodes (15%). The highest intensity of infestationwas established in the case of cestodes (Table 1.).From the 561 samples were detected trematodes ,respectively Alaria alata, called also the trematodes of carnivores, in84 cases, representing a prevalence of 15%. Although the intensityof parasitism was relatively low in 70 samples (less than 1,000), in13 samples this exceeded 1,000 and in one single case it were over10,000 mesocercares in the intestinal sample. Trematodesdimensions showed no significant differences in case they arebetween 2-3 x 0.6-0.7 mm.The most infested samples were collected from Satu Mare(27%), Bihor- (24%) and MaramureȘ- (19%) countys.In 23 samples the last part of the duodenum (27.4 %) and in61 samples (72.6 %) the first part of the jejunum were infested. Inbouth cases the mesocercares were main substrate competitors. 4year old foxes were most infested (45%). The prevalence ofinfestation was higher in female foxes (54%) as in male foxes(46%).55

The prevalence of the identificated parasits and the intensity of infections (n=561)Table. 1.Identificated species No.of positive samples Prevalence (%)The intensity of the infestations+ ++ +++ ++++ +++++Trematoda 84 15,0 39 31 13 0 1Alaria alata (Goeze,1782) 84 15,0 39 31 13 0 1Cestoda 509 90,7 290 114 68 16 21Dipyllidium caninum (Linnaeus, 1758) 83 14,7 50 20 12 0 1Echinococcus spp. 27 4,8 19 8 0 0 0Mesocestoides lineatus (Goeze, 1782) 161 28,7 38 48 40 15 20Taenia polyacantha (Linnaeus, 1758) 30 5,3 24 3 3 0 0Taenia hydatigena (Pallas, 1766) 46 8,2 32 8 5 1 0Taenia multiceps (Leske, 1780) 26 4,6 23 2 1 0 0Taenia pisiformis (Bloch, 1780) 67 12,0 45 16 6 0 0Taenia serialis (Gervais, 1847) 5 0,9 5 0 0 0 0Taenia taeniaeformis (Batsch, 1786) 15 2,6 15 0 0 0 0Taenia crassiceps (Zeder,1800) 28 5,0 23 5 0 0 0Taenia ovis (Cobbold, 1869) 21 3,7 16 4 1 0 0Nematoda 513 91,4 356 116 38 3 0Ancylostoma caninum (Ercolani,1859) 101 18,2 65 31 5 0 0Uncinaria stenocephala (Railliet,1854) 82 15,0 55 24 3 0 0Toxascaris leonina (von Linstow, 1902) 12 4,6 9 1 2 0 0Toxocara canis (Werner, 1782) 165 29,4 98 37 27 3 0Trichuris vulpis (Froelich, 1789) 153 27,2 129 23 1 0 056

The high prevalence ot the trematod A.alata reprezents azoonotic risk, knowing that they form some cysts in conjonctivaltissue in the pig and/or wildpig (potential consumer ofamphibians, reptiles, fish - intermediate hosts II.). Man, even if heis paratenic host, by eating insufficiently cooked meat withmesocercares, can be infested even with severe formes .Milesevic et al. (2004) discovered in CroaȘia A.alata in59% of the examined wild pigs. The presence of this parasite wasnotified in the european red fox in many central and easterneuropean countries. Thus it was described in Germany (28.3-29.7 %), Austria (18.4%), Poland (76.5-88.0%), countries of theformer Yugoslavia (64,8%) and Bulgaria (2.1%) (Möhl et al.-2009).From the cestodes Mesocestoides lineatus seems to be thedominating species (28.7 %), fallowed by Dipylidium caninum(14.7 %) and Taenia pisiformis (12 %), others species having aprevalence of less than 10 %. Similar investigations were made byReperant (2005) who after examination of 267 red foxes fromSwitzerland has found domination of E. multilocularis (45.7 %),fallowed by Taenia spp. (4o.8 %), Mesocestoides spp. (6.4 %)and Dipylidium spp. (1.9 %). The last two were present only likesatelit cestodes in the small intestines helmintofauna.Dipyllidium caninum was identified in 83 samples(14.7%). The intensity of infestation was between 1-100 cestodesper sample (60 %), in a single case there number exceeded 10,000specimen (1 %).The most infested samples were from Sibiu - (39 %),BraȘov - (33 %), Covasna - (23 %) and Harghita counties (22 %).88.50 % of the D. caninum were isolated from the lastpart of the jejunum, sizes were between 28-42 cm and weresecondary competitors. 4 year old foxes were most infested(43%). The prevalence of infection was higher in female foxes(55 %) as in male foxes (45 %).Echinococcus multilocularis was isolated from 27showing a 4.8 % prevalente. The intensivity of infestation was a57

100 cestodes per sample in 70% , and in 8 cases (30%) therenumber was between 114 and 312 (Table 2.). Teysseyre (2005)states that avarage infestation in the european red foxes withE.multilocularis varies between 50 and 2,000 specimen/sample.During the examination of the 561 samples 2,012 specimen ofE.multilocularis were isolated. This represents theE.multilocularis biomass of the 27 positive samples. From these1,482 were preserved in formalin and 530 specimen in ethanol70% for further examenes and analises, including PCR.No.Table 2.The E.multilocularis prevalence in examinated foxesCounty ExaminatedsamplesPozitivsamplesPrevalence(%)Confidenceinterval95% CI1. AB 23 0 0 [0.0, 0.0]2. AR 19 2 10,5 [3.3, 20.3]3. BH 41 6 14,6 [3.7, 25.4]4. BN 53 3 5,7 [0.57, 11.8]5. BV 24 0 0 [0.0, 0.0]6. CJ 36 1 2,8 [2.6, 8.1]7. CV 118 2 1,7 [0.6, 4.0]8. HR 41 1 2,4 [2.2, 7.1]9. HD 15 0 0 [0.0, 0.0]10. MM 37 4 10,8 [0.7, 20.8]11. MS 36 0 0 [0.0, 0.0]12. SM 63 8 12,7 [4.4, 20.9]13. SJ 18 0 0 [0.0, 0.0]14. SB 18 0 0 [0.0, 0.0]15. TM 19 0 0 [0.0, 0.0]TOTAL 561 27 4,8 [3.0, 6.5]Same results are described by Knapp et al. (2008), whofinds a prevalence of 53 % after examening 571 red fox bodies58

from central europe. Concerning the intensity of infestation, 91 %from the samples had till 10,000 E.multilocularis / sample, and in9 % of the bodies the number of the cestode exceded 10,000 /examined sample. This number of E.multilocularis recalculated inbiomass values represented a total of 175,897 cestodes.Also high values of infestation 45.7 % reported Reperant(2005) after the examination of 267 red foxes in Switzerland. Thevalue of infestation varies from 1 to 120,020 specimen perexamined. In 88 % of the samples they have found less than 100E.multilocularis, in 9.7 % of the samples between 1,000 and55,000 specimen, and in 1.9 % had over 55,000 specimen perexamined sample. This last category gave 76% of total biomassof E.multilocularis.Regarding the parasitic dispersal on the studied area,has to be noted that from the 15 counties in central and north-vestpart of România, the parasite was found 8 counties (53.3 %), in 26locations. The most infested samples were from Satu Mare (31%), MaramureȘ (23 %) and Bihor counties (23 %). Exactlocation of the origin of positive samples were made using GPS.Analyzing environmental conditions from infested areas, it wasfound that elevation of these areas ranged between 116 m(CăuaȘ, Satu Mare county) and 586 m (AleȘd,Bihor county). Ininfested areas average annual temperature was between 9-11 C°,and average annual rainfall was 700-900 mm.Analyzing the amount of biomass of E.multilocularis incounties, found that although the greater quantity of biomass wasin case of Bihor county (764 E.multilocularis in the 6 positivesamples), fallowed by Satu Mare county (628 E.multilocularis inthe 8 positive samples) and after Arad county (358 E.multilocularis in 2 positive samples), however, recalculated thepositive sample highest average number of E.multilocularis wasfound in the positive samples from Arad county (179), fallowedby the samples from Bihor county (127.3) and samples from SatuMare county (78.5). In counties situated near the border withHungary, the prevalence of E.multilocularis is high and this could59

ostrum and hooks. In adult specimens the genital pore wasobserved in the middle third of the mature proglottids. In thepregnant proglottids , the oncospheres were recognized in theinterior of the parauterin organ, surrounded with a thick wall. Inmedium and high infestations the cestodes had length of 8-15 cmand were commonly young forms.Favorable ecological niche for the development ofM.lineatus was mostly the middle third (67.9 %) and posteriorthird (32.1 %) a jejunului, în competiȘia de substrat ocupândpoziȘia principală. 4 year old (39 %) female foxes (56 %), weremost infected.Taenia polycantha lives in the small intestine of foxes,the methacestodes in microtidae rodents, mostly in Arvicolaterrestris and Clethrionomys glareolus. This parasite was foundin 30 samples (5.3%). The infestation rate in 80% of the sampleswas low (1-100).Positive samples were from MaramureȘ (24%), Satu Mare (21 %), Cluj (17 %) and Bihor counties (5 %).From point of wiew of the ecological nischeT.polycantha populated in a proportion of 77% middle third ofthe jejunum, and in 23 % the anterior third of this. Mostly it wassatellite competitor. Mostly infested were male foxes (60%) about4 years old (33%).In 46 samples (8.2 %) was Taenia hydatigena found.Being a cosmopolitan parasite it is found in the small intestine ofdogs, foxes, wolves and that of other wild carnivores,intermediate host being domestic and wild ruminants. The fact,that it has been identified in the intestine of foxes confirmed, thatthey are eating deers or sheeps in the affected regions.In 67% from samples infestation was low till 100 cestodesper sample, in 31% infestation was between 100 and 5,000specimenes, in a single case was over 5,000. There were nosemnificative differences betwen the cestodes size and intensityof infestation.Most infested samples were from BraȘov (21%), Sibiu(17%) and Harghita counties (17%).61

Favorable ecological niche for the development ofT.hydatigena was the anterior third (in 78.2% of the cases) andthe middle part (21.8%) of the jejunum. In both cases in substratecompetition was on secondary category. 4 years old (48%) femalefoxes (57%) were most infected.Taenia multiceps was present in 26 samples (4.6%).Intensity of infestation was under 100 specimenes/sample in88% of the cases. Most infested samples were from Sibiu (17%),TimiȘ- (11%) and Harghita (10%) counties.Favorable ecological niche for the development ofT.multiceps in 79.2 % of the cases proved to be the middle thirdof the jejunum and only in 20.8% the posterior third. In bothcases in substrate competition was on secondary category.4 yearsold (58 %) female foxes (42 %) were most infected.Taenia pisiformis was found in 67 samples (12 %).Intensity of infestation was mostly low, under 100 de cestodes persample (67 %). The intensity of infestation did not influence themorphology and develope of the cestode.Most infested samples were from Harghita- (24%), Cluj-(19%) and Sibiu counties (17%). The characteristic ecologicalniche in all cases was the middle third of the jejunum, where inthe substrate competition T.pisiformis had a secundary role. 4years old (63 %) female foxes (49 %) were most infested.The cestode Taenia serialis was identified in only 5(0.9%) samples collected from Covasna- (2), BistriȘa- (1),Harghita (1) and TimiȘ counties (1). Intensity of infestation waswery low, in all cases under 100 specimen/sample.T.serialis was uniformly present in the anterior third andmiddle third of the jejunum, like competitor satellite.Aproximatly 4 years old (80 %) female foxes (60 %) weremost infected.Taenia taeniaeformis parazite of the small intestine offoxes and the metacestodes in Microtidae and Arvicolidaerodents, mostly Arvicola terrestris. It was identified in 15samples (2.6 %). Intensity of infestation never reached 10062

cestodes per sample Most infested samples were from Alba (9 %),BistriȘa (9 %), Sălaj (6 %) and Sibiu counties (6 %).Favorable ecological niche for the development of theteniae was the anterior third (68.3%) and the middle third (31.7%)of the jejunuum, where it was a competitor satellite. Femalefoxes (73%) and aproximatly 3 years old (53%) were mostlyinfested.Taenia crassiceps parazite of the small intestine of foxesand the metacestodes in Microtidae rodents, mostly Microtusarvalis, producing cisticercosis of the brain, with signs ofincoordonated movements.The cestodul was identified in 28 samples (5 %). Intensityof infestation in 82% was low (under 100 specimenes/sample).Most infested samples were found in Satu Mare- (14 %),MaramureȘ- (14 %), Cluj- (11 %) and Sălaj counties (11 %).Favorable ecological niche for the development ofT.crassiceps is the middle third of the jejunum (68 %) andrespectively the anterior third (32 %), where commonly they weresatellite competitor.Female foxes (61%) and betwen 3-4 years of age (32-32%) are most intensly parazited.Taenia ovis was found in 21 samples (3.75 %), whatdemonstrates that foxes from infested areas can consume deadsheep. The intensity of infestation in 76% cases was lower than100 cestodes/sample.Mostly infested samples were collected fromSibiu- (28 %) and BraȘov counties (17 %). Favorable ecologicalniche for the development of T.ovis was the fost distal third ofthe jejunum, where it was a satellite competitor. Female foxes(52 %) around 4-5 years of age (43-43 %) were mostly infested.From the identified nematodes Toxocara canis (29.4 %)had the highest prevalence, fallowed by Trichuris vulpis (27.2 %),and other nematodes. In the literature the prevalence of differentspecies of nematodes in the red fox varies by geographical area.So Reperant (2005) for exemple highlights the dominance ofUncinaria stenocephala (79.o %), fallowed by Toxocara canis63

espectively Toxocara leonina (both in total 73.8 %), rarely beenidentified nematodes from Trichuris vulpis species (8.6 %).Ancylostoma caninum was found in 101 samples (18 %),with an intensity of infestation 1-100 nematodes/sample (64 %).Mostly infested samples were from Hunedoara (60 %), Alba(39%) and MureȘ counties (39 %).Lenght of parasite was 0.8-2.0 cm, but in 34.6 % of theisolated cases there were younger formes with 0.6-1.2 cm.Favorable ecological niche for the development of theparasite was mostly in the middle third of the jejunum, having asecundary role in the substrate competition 4 year old (39 %)female foxes (66 %) were mostly infested.Infestation of the samples with Uncinaria stenocephalawas 15 %, parasites were found in 82 samples. The intensity ofinfestations was usually low, not exceeding 100 nematodes persample (67 %). Most infested samples were collected fromMureȘ- (33 %), Hunedoara- (33 %) and Alba counties (30 %).Favorable ecological niche for the development of thenematode was mostly the posterior third of the duodenm and theanterior third of the jejunum, where with other helmints had asecundary competitor role. 4 year old (48 %) femeleles (56 %)were mostly infested.Toxascaris leonina and Toxocara canis represents themost important nematodes in foxes.Toxascaris leonina was identificated in 12 samples(4.6%). Intensity of infestation was predominantly low (in 75 %of the samples). Most infested samples were from BraȘov- (8 %),MureȘ- (6 %) and Sibiu counties (6 %).Adult specimens have reached even 10 cm, and on thereanterior part were observed perfect lamelated short cervicalwings.Favorable ecological niche for the development of theT.leonina was the distal part of the jejunum, where in thesubstrate competition was a secundary or satellite competitor.64

Mostly infested were femele (58 %) and less than 1 year old foxes(59 %).In the case of the 561 examened samples Toxocara caniswas found in 165, whitch represents a 29.4 % procente ofprevalence. The intensity of infestations was generally low till100 parasites / sample (59%), and in 64 cases there numberexceded 100 specimenes (38.8%) and even 5,000 specimenes(2%). Mostly infested samples were collected in Harghita (56 %),Hunedoara- (53 %) and TimiȘ counties (47 %).At the opening of intestinal fragments with a highintensity of infestation, where observed knots of Toxocara spp.young with 1.8-2.6 cm and adults with sizes up to 18.6 cm.In the ecological niches represented by the first (38 %)and last third (62 %) of the jejunum T. canis in the substratecompetition was competing with A.alata (8:2) and (7:3) for themain position. Mostly infested category were 4 (36%) and 3(34%) years old females (54 %).Trichuris vulpis was present in 27.2 % (n = 153) of theanalized samples. intensity of infestations was generally low till100 nematodes/sample (84%). Mostly infested samples werecollected in MureȘ (44%), BistriȘa (43%) and Bihor counties(41%).Characteristic form like a ”whip” of the species, with thethin first two thirdes of the body, and the last third much thickermade it easy to identificate. Also his long esophagus is easy todetect.Favorable ecological niche for the development of theparasite is the posterior third of jejunum and in the ileum where itwas like satellite competitor satelit together with Toxocara spp.Female foxes (54 %) of 4 (35 %) and respectively 3 (34 %) yearsold were most frecvent infested.Prevalence, intensity of infestation and spread of parasitesin the intestin is in a close correlation. Calderini et al. (2009)shows that in central Italy Dipylidium spp. and Mesocestoidesspp. were codominante in foxes. Eira et al. (2006) drawes65

attention over the association of helmints in the small intestine,like U.stenocephala with T.canis or Mesocestoides spp. withA.alata. So,Caswell (1978) and Hanski (1982,1991) groupsparasites in main-, secondary- and satellites competitioncategories. Main competitors are usually in small number as aspecies (in avarage 2-5) but with high intensity of infestation(over 1,000 specimenes/sample). In case of secundary competitorsit may be more species of parasites (avarage 4-8) which islocalized mainly in the same intestinal segments, having anaverage intensity of infestation (between 100 and 500specimenes/sample). Competitor satellites are usually species(avarage 2-12), with a reduced intensity of infestation in theintestinal segment (1-50 specimenes/sample).In the classification of ecological niches and the helmintsregarding the substrate competition, observed a clear differentiationof species in ecological niches these being correlated with thedispersion of helmints, and with the intensivity of the statedinfestations. So it was observed, that although in the anterior andposterior intestinal segment (duodenum and ileum) was nosubstrate competition, in all the three thirds of the jejunum therewere species found from the main competitors, secondarycompetitors and satelites.II.4. Conclusions1.- The small intestines parasito fauna was polispecificwith the predominance of nematodes (91.4 %), fallowed bycestodes (90.7 %) and trematodes (15 %).2.- The highest intensity of infestation was found in thecase of cestodes, where in 3.7 % of the samples the number ofparasitic specimanes was over 10,000 / sample.3.- Isolated and identified helmints were from fallowedspecies: A.alata, D.caninum, E.multilocularis, M.lineatus,T.polycantha, T.hydatigena, T.multiceps, T. pisiformis, T.serialis,66

T.taeniaeformis, T.crassiceps, T.ovis, A.caninum, U.stenocephala,Toxascaris leonina, Toxocara canis and Trichuris vulpis.4.- The lenght of cestodes from the genus Taenia andrespectivly Mesocestoides was under 20-25 cm even shorter,especially in the case of massive infestations with over 1,000-5,000 specimanes.This reduce size of cestodes in case of massiveinfestations could be explaned with overcrouding,crowding effect.5.- Favorable ecological niche for the development ofrematodes was the duodenum, in case of infestations withcestodes and Toxocara spp. the whole lenght of the jejunum withlocalizations depending on species, Ancylostoma was found inmiddle third of the jejunum and Trichuris spp. was isolated fromthe ileum – demonstrating the characteristic ecological niches ofthe diagnosted parasites.6.- In the competing substrate were observed threecategories of competitors: primary, secondary and satellites. Theprobability of existence of a phenomenon for the substratecompetition it was observed, mainly in case of massiveinfestations with Mesocestoides lineatus, which was associatedwith a small number of other parasites of the parasited digestivesegment.7.- The distribution of infestations by counties, sex or ageof the foxes like parasitic hosts does not appear to be signifycantlydifferent. However the most affected age group was that 4year old (40.3 %), more infested appered to be femeles (55.2 %).8.- In 27 samples (4.8 %) was E.multilocularis found, witho total biomass of 2,012 cestodes.9.- Positive samples for E.multilocularis were found in 8counties (53.3 % from the analized counties).10.- Mostly infested with E.multilocularis were femalefoxes (59.3 %) around 4 years of age (51.9 %).11.-The morphological and structural characteristics ofE.multilocularis species were described: form- and dimensions ofthe body, and of the hooks, the structure of the last gravidproglotes with oncosphere.67

Chapter III. - Coproantigen-ELISA investigations for theeuropean red fox (Vulpes vulpes L.) populationscreening on the E.multilocularis infection estimateIII.1. PurposeDetection of metabolic coproantigen of Echinococcusspp. with the coproantigen-ELISA technique (CpAgELISA), animmunologic test, which is based on the detection of specificantigenes of Echinococcus present in faeces.The examination of the intestinal scraping for reveling theinfection with E.multilocularis has many disadvantages includingthe length, high costs by personnel involved and low certainty ofresults in case of poor infection are only the most significant. Inaddition, autopsy methods underestimate the true prevalence ofinfection with E.multilocularis.The CpAgELISA test has the advantages that it can beperformed on alive animals, being able to achieve positive resultseven during the prepatent period of the parasite. E.multiloculariscould be detected 5-10 days after infection with CpAgELISAtechnique.The test has a very high negative predictive value(99.9%), makes it suitable for screening the fox populations withlow prevalence of E. multilocularis, or in areas , where the statusof infestation of fox population is not known.The main objective: Achievement of the CpAgELISA testby a representative number of faces samples taken from foxesfrom the studied counties.III.2. Materials and methodsThere were a total of 176 coprologic samples collectedaround active burrows and rectal contents in case of fresh bodies.The CpAgELISA technique was applied for the diagnostic of68

E.multilocularis infection from both fresh samples and sampleswhich were previously frozen (-20 C°).For the detection of metabolic coproantigen ofEchinococcus spp., faces samples were examined by enzymeimmunoassay technique ELISA, using commercial kit CHEKITECHINOTEST (product of IDEXX Switzerland AG).III.3. Results and discutionsIt was found that in the studied 15 counties, in 9 counties(60 %) coprologic samples were reactive to the CpAgELISAEchinococcus spp. test.After completing the protocol, from the total of 176examined coprologic samples with CpAgELISA CHEKIT-Echinotest, 20 samples were found positive (11.36 %) [CI 95 % :6.6, 16.0], 18 samples suspicious (10.22 %) [CI 95 % : 5.7, 14.7]and 138 samples were found negative (78.4 %).Optical density values (OD) of the pozitive samples werebetween 40,585 and 98,716. Suspicious samples had there ODvalues between 30 and 40, and negative samples had there ODvalues < 29.It was noted, that from the examined 20 positive cases, in19 samples the presence of E.multilocularis was confirmed, but inone case (sample nr.18 from Arad county) the necropsy hadconfirmed only a weak infestation with U.stenocephala. Thisshows the possibility that the CpAgELISA test could give falsepositive reactions, in this case representing 5 %.In the case of the 18 suspicious samples, in 13 cases thenecropsic examination did not reveal the presence ofE.multilocularis, and in the remaining 5 samples the cestode wasidentified in a reduced number: 3, 8 and respectively 6 specimenin samples nr.45, 49 and 50 from BistriȘa counties; 12 specimenin sample nr.18 from Cluj county; 2 specimen in sample nr. 21from Satu Mare county.69

From the consideration, that the CpAgELISA test did notconfirm the presence of E.multilocularis in case of these weakinfections, all the 18 dubious samples after the first CpAgELISAtest were retested. Given that from the 18 suspicious samples tothe first test, during the second test a number of 10 (55.5 %) wereconsidered positive, notes that in some cases the CpAgELISA testcan give false negative reactions.Final test results on the prevalence of coproantigenCpAgELISA Echinococcus spp., with 20 positive samples duringthe first test and 10 positive samples after the second test shows,that avarage prevalence with CpAgELISA test Echinococcus spp.was 17.0% [CI 95% : 11.4, 22.6] in (60 %) from the studiedcounties. Highest prevalence was observed in MaramureȘ county(27.3%) [CI 95% : 8.6, 49.1], fallowed by BistriȘa Năsăudcounty (25.0%) [CI 95% : 5.1, 55.1], Satu Mare (24%) [CI 95% :7.2, 40.7] and Bihor (20.8%) [CI 95 % : 4.5, 37.1]. TheCpAgELISA test rezultats confirm the findings at necropsy, thecontent and mucosa of the intestine (Table 3.).Investigations show that the CpAgELISA method had100% sensitivity confirming the presence of E.multilocularis inall the samples, where the cestode was discovered by theexamination of the intestinal contant and the intestinal scraping.Not the same can be said about the specificity that wasvariable from 27.7 % (in case of repeting the dubious cases) to95% (positive samples after the first tests with the CpAgELISAmethod). It seems that the sensitivity but in particular the specificmethod are influenced by the patent stage of in which the animalis after the infection, the parasitic pressure and the number ofoncospheres from the faces.70

Tabel 3.Final results about the presence of the coproantigens byCpAgELISA Echinococcus spp. testCpAg ELISACINo. County Total pozitiv Final prevalence(95 %)samples(%)1 AB 0 0 [0.0, 0.0]2 AR 3 18,7 [0.4, 37.9]3 BH 5 20,8 [4.5, 37.1]4 BN 2 25,0 [5.1, 55.1]5 BV 0 0 [0.0, 0.0]6 CJ 1 12,5 [10.4, 15.4]7 CV 3 18,7 [0.4, 37.9]8 HR 3 18,7 [0.4, 37.9]9 HD 0 0 [0.0, 0.0]10 MM 6 27,3 [8.6, 49.1]11 MS 0 0 [0.0, 0.0]12 SM 6 24,0 [7.2, 40.7]13 SJ 0 0 [0.0, 0.0]14 SB 0 0 [0.0, 0.0]15 TM 1 12,5 [10.4, 15.4]Total 176 30 17,0 [11.4, 22.6]III.4. Conclusions1.- Investigations suggest that the CpAgELISA method isa great way for the screening of fox populations for theEchinococcus spp. infestations.71

2.- Given the undeniable influence of parasite pressure ontest results, it is recommended supplementing the CpAgELISAtest with examining the content and the scraping of the intestine,and in positive cases it is necessary to confirm by PCR method.3.- The screening of fox populations must be extend to allSanitary Veterinary Laboratories in all countys from Romaniabut especially in central and north-western areas of the country,the bodies for rabies must be examined, having regard to theaccelerated expansion of the infestation.Chapter IV.- Taxonomical confirmation ofEchinococcus multilocularis by PCRIV.1. PurposeTo confirm the taxonomic status of the morphologicallyidentified cestode like E. multilocularis, the Multiplex PCR(Polymerase Chain Reaction) method was used. PolymeraseChain Reaction - PCR, is based on in vitro technology thatimitates the natural ability of DNA replication and is rapidlygenerating multiple copies of a target nucleotide sequence (DNAor RNA) from a gene of interest. PCR amplified product is thendetected by various methods.Given that oncospheres of different species of Taeniidaeand respectively of Echinococcus spp., parasite in the intestine ofcarnivores, morphologically are indistinguishable. There havedeveloped a Multiplex PCR system capable of differentiating theoncospheres of E.multilocularis from E.granulosus andrespectively from Taenia spp., based on the size of the ampliconsize. The method can be used to identify species and to determinethe genotype of these cestodes. It has particular value in theindividually diagnosis of definitive hosts, the evaluation ofenvironmental contamination and analysis of human infection72

isk, and finally monitoring the effects of disease controlprograms.IV.2. Materials and methodsFrom the total of 2012 morphologically identified likeE.multilocularis cestodes, a number of 530 specimens werestored in 70% ethanol for subsequent examination by PCR. Forthe examination with Multiplex PCR method 3 adult cestodeswere randomly selected with a final intact pregnant proglot (withclearly visible oncospheres), from samples collected duringJanuary-February 2009 and from the most infected counties (SatuMare and Bihor).For examination and confirmation by molecular biologytechniques the morphological species like E.multilocularis theMultiplex PCR methode was used. The test was conducted at theInstitute of Parasitology, University of Zurich (Switzerland) underthe coordination of Professor Dr.Peter Deplazes.After extraction of the parasite's DNA, it was passed on tothe next stage of work: Polymerase Chain Reaction (PCR) for theconfirmation of the E. multilocularis species.For the confirmation of the E.multilocularis cestode,primers were used which were corresponding the 12S-ARNmitochondrial gene, with the amplicon size 395 pb, forE.granulosus primers with amplicon size 117 pb, and for Taeniaspp. primers with amplicon size 267 pb :UnivSr :TaeSf :EgS2f :EmN2f :EmNr :5’-GCGGTGTGTACMTGAGCTAAAC-3’5’-YGAYTCTTTTTAGGGGAAGGTGTG-3’5’-GTTTTTGTGTGTTACATTAATAAGGGTG-3’5’-TGCTGATTTGTTAAAGTTAGTGATC-3’5’-CATAAATCAATGGAAACAACAACAAG-3’73

IV.3. Results and discussionsAfter working protocol compliance and sequencing: PCRmix preparation, amplification and electrophoresis performed inan integrated PCR equipment, by migration in agarose gel, anamplicon size 395 pb was obtained in all the 3 samples,confirming the taxonomic affiliation of isolate E. multiloculariscestoda species.Investigations carried out in Hungary revealed theexistence of four genotypes: H (55.5 %), G (18.5 %), E (13.6 %)and D (12.4 %), suggesting that this country may be the boundaryto the east of a European outbreak. However, given that thecounties bordering with Hungary presents a significant infectionwith E.multilocularis of the fox populations the question iswhether this boundary is not larger, including a part of Romania.To elucidate this aspect is required to accurately determine thegenotypes of E.multilocularis in Romania.IV.4. Conclusions1.- Investigations should be continued and completed with theestablishment of genotypes found in Romania.Chapter V.-Necroptic and histopathologically investigationsabout alveolar echinococcosis incidence in wildrodentsV.1. PurposesAlveolar hydatidosis produced by the larval form of theE.multilocularis in wild rodents as main intermediate hosts, wasdescribed in France, Switzerland and Austria with a highincidence (9-39% in Arvicola terrestris, respectively 10-21% inMicrotus arvalis).74

Ecoregions of central and north-west regions of Româniainhabited by these rodents are identical in terms of weather andpedoclimatic conditions to those in Western Europe.The presence of E. multilocularis was confirmed also inred foxes from Romania in 2010.In this paper, we systematically investigated wild rodentpopulations from different ecoregions of 15 counties from thecentral and north-west part of România, for cystic parasitic lesionsin the liver with emphasis on alveolar echinococcosis.V.2. Materials and methodsBetween August 2007 and July 2010 we followed thespatial and temporal dynamics of rodent populations fromCricetidae and Muridae families as the main potentialintermediate hosts in the infestations with E. multilocularis. Thestudy was conducted in 15 counties from central and north-westpart of România. To follow the parasites spatial and ecologicaldynamics, the 15 counties were divided into ecoregions.To ensure the conditions for catching, pathologicalexamination, identification and preservation of samples wereperformed in the field. A total number of 120 traps of two types(wooden box and wire) were used. Preferred biotopes of wildrodents such as wooded areas of plateaus and hills, plain bushes,along the rivers or lakes, farmlands etc. were chosen as locationsfor placing the traps.Captured individuals identified to species level andeuthanized with intraperitoneal T61.The liver of all rodents was examined for the detection oflarval E.multilocularis or other larval forms of cestodes. Thosewith macroscopic changes were fixed in 10% neutral formalin.For the histopathological examination all samples wereincluded in paraffin. Embedded tissue fragments were sectionedusing a microtome at 4-5 µm, making serial sections of allanatomical structures of the liver to reflect the existing alveolar75

cysts and other associated histological lesions. A total of 268slides were made for histopathological examination. De-waxing,clarifying, hydrating and staining of sections were carried out byregular techniques. Histological and histochemical stains appliedwere: hematoxylin-eosin (HE), Masson Trichromic (MT), AlcianbluePAS, Van Gieson Stain (VG), Pappenheim, Koss, Lillie-Pasternack and Toluidine blue (TB) (Satoh et al.-2005, Marosfői-2007, Yamasaki et al.-2008). Histological examinations focusedon the differentiation from other cystic structures in the liver.V.3. Results and discussionV.3.1. Spatial and ecological dynamics of catchesOf the total of 3600 traps, 16.3% had made catches.In the ecoregion of SomeȘului and CriȘurilor plains(partially Bihor, Satu Mare and MaramureȘ counties) themajority of caught rodents (62.6%) were from Cricetidae familywith the dominating species M. arvalis (74.6%), followed by A.terrestris (20.7%), Microtus agrestis (3%) and Pitymyssubterraneus (1.7%). The second rodent family was representedby Muridae (26.8%): Apodemus spp. (48.8%), Micromys minutus(30.8%), Mus musculus (14.4%), Rattus norvegicus (4%) and R.rattus (2%). Family Gliridae corresponded to 2.0% of the totalcatch. The rest of the catch belonged to the non-rodent familySoricidae (8.6%). The richest catches were recorded in arableland regions segmented with forests and orchards.In the ecoregion of Apuseni Mountains and CriȘana Hills(partially Sălaj, Cluj, Alba, Arad and Bihor counties) the maincatch was Apodemus flavicollis (58.6%) followed by A.terrestris(21.2%), M. arvalis (18.3%) and C.glareolus (1.9%). The relativeabundance of A.flavicollis is due to relatively low altitudes andproper environment .In the ecoregion of the Transylvanian Plateau (partiallyCluj,MureȘ, Harghita, Alba, Hunedoara, BistriȘa-Năsăudcounties) the variety of habitats (both natural and anthropogenic)76

was reflected in the diversity of the catch : A. terrestris (35.8%),A. flavicollis (29.6%), A. agrarius (14.3%), A. sylvaticus (16.5%)and C. glareolus (3.8%). In intensively cultivated agriculturalareas the catch was represented by M. arvalis (72.4%), A.sylvaticus (12.2%), A. agrarius (5.6%) and A. terrestris (9.8%).The variety of habitats (both naturaland anthropogenic) of thisecoregion is also reflected in the structure of small rodentcommunities. Specific diversity is high and the share of thespecies is relatively balanced.In the ecoregion of Eastern Carpathian Mountains(partially BistriȘa-Năsăud,Harghita,Covasna and BraȘovcounties), as a result of relatively high annual humidity the mostabundant species was A. agrarius (74.5%), followed by A.flavicollis (18.2%) and A.sylvaticus (3.2%). The frequency ofM.arvalis was 4.1%.In the ecoregion area of Banatului Hills (partially TimiȘand Hunedoara counties) most species have been found at lowaltitudes, in forested areas: C. glareolus (45%), A. flavicollis(34%), A. terrestris (Linnaeus,1758) – 8.6%, Microtus agrestis(Linnaeus,1761) – 6.8% and C. nivalis (5.6%).Ecoregion of Southern Carpathians (partially Hunedoara,Sibiu and BraȘov counties) is characterized by a high proportionof forest habitat. The dominating species was A.flavicollis(44.2%), followed by A. agrarius (18.7%), M. arvalis (28.6%)and A. terrestris (7.5%). The rest of the species from theCricetidae and Muridae families were under 1%.The dynamics of spatial distribution of rodents as regardsdiversity of species and abundance of catch was higher on loweraltitudes, agricultural lands and along rivers compared tomountainous and hilly areas.In woodland habitats the rodents identified with highfrequency was A. flavicollis. This species shows a preference forhabitats with woody vegetation: forest, scrub, selvedges.Conversely, A. sylvaticus mainly occupies the wooded habitat inwhich they can reach high densities during winter.77

On open lands the most abundant species was M. arvalis(32.4%). Although the number of traps placed in differentecoregions was equal, the difference of over 10% of the share ofthe majority of species might be explained by different behavioralpatterns. Forest species, which are used to fast changes occurringin their environment, fall into traps almost immediately afterinstallation. Species in open areas are more suspicious, morereluctant to new objects in their habitat, avoiding them. In order tobe caught the traps should be left for longer time in the sameplace.Particular interest is raised by the influence of theintensive and traditional farming practices on the ecology of M.agrestis. The few number of captured field vole could beexplained by their life as an unspecialized opportunist in a varietyof habitat types.Between the two categories lies the bank vole C. glareoluswhich is widespread in forested areas and areas at high altitudes(19.86%), but they do not develop high density populations. Theforest destruction generated the local extinction of the bank vole.Finally the fourth category of habitat is the low altitudeand high humidity during the whole year. The most representativespecies of this habitat was A. agrarius which in these areasreached 74.5% of the total catch. They climb the mountains alongthe river but just on the lower part.V.3.2. Prevalence of alveolar echinococcosisFollowing morphological examinations performedimmediately after the capture of a total number of 552 rodents(potential intermediate hosts) macroscopic changes were detectedin the liver of 17 (3.1%) animals.Greater prevalence of cystic changes in the liver wasfound in catches from Satu Mare (10.5%) and TimiȘ counties(8.0%). In the infected rodent species dominance of four specieswas found with a prevalence between 1.1% and 8.7% . In two A.terrestris samples and one M. arvalis sample macroscopically78

glomerular formations were found just below the liver surfaceunder the Glisson’s capsule, like a conglomerate of cysts, similarto a cauliflower, with well highlighted area, dirty yellowishwhitecolor, with vesicle diameter ranging from 1-6 mm.Extrahepatic disease was very rare (1%). The mostfrequent morphological profile of alveolar echinococcosis wasrepresented by an intrahepatic heterogeneous, infiltrative anddestructive mass, with irregular outlines and a non-vascular andnecrotic center. The cyst appears as a spongy structure,resembling a crumb or cheese, with empty cavities or with a greyand jelly content. Most of the cavities do not have a well-definedcontent. In other samples, the formation had mainly a cysticstructure, without a divided multivesicular character.The gross lesions consisted of unilocular cysts (in the caseof young cysts), circular or irregular oval forms. The small cystshad dimensions between 100-200 x 250-350 µm. The biggestcysts (1200-1500 µm) usually contained a calcareous deposit, or ajelly substance, moreover an unidentifiable content. Themonovesicular cysts were rare. The greatest number of them hada complex structure divided by the cuticula in a multivesicular,cavernous or spongy formation.V.3.3. Histological description of lesionsThe larval cestodes of E. multilocularis from the liver ofvoles produce a typical infiltration and induce destruction of theorgan. The intermediate hosts respond with a granulomatousinflammatory reaction and peripheral formation of granulationtissue. In centripetal direction, the adventitial layer’s componentswere formed by the fibroconjunctive reaction; the inflammatorycells were present. In the peripheral areas the lymphocytes andmonocytes were dominating. They were followed by a richinfiltration of the giant cells and a decrease of the inflammatorylocal reaction. These structures were gradually changed by thefibroconjunctive reaction.79

The cuticular layer was mono- or multistratified, formedby concentric conjunctival tissue layers, which penetrated in thecystic cavity and developed many anastomoses conferring it amulti-vesicular aspect. In the spaces between these blade cellsimilar to giant cells we could also notice rare histiocytes andeosinophils. Due to the multitude of anastomoses, the cyst is astructure with an invasive character . In most cases there werecollapsed cysts characterized by a fragmented or folded laminarlayer and massive necrosis.The germinative layer which lines the new formed cavitieshas a plasmatic structure with rarely multinucleate cells. Thislayer had many young cells and gave a rhizoid aspectcharacteristic for the malignant tissues. Some cysts containedremnants of a single germinative layer.Studies aiming the histological aspects have suggested thatE. multilocularis produces multilocular alveolar cysts (1–10 mmin diameter) that resemble alveoli (Kodama et al.2003).They growby means of exogenous proliferation with cysts that progressivelyinvade the host tissue by means of peripheral extension of theprocesses originating in the germinal layer. The larvae causeinvasive and destructive changes in the tissue. This area isseparated from the hepatic parenchyma by inflammatory cells.The lesion are characterized by many alveoli withdifferent sizes and shapes. Observation of alveolus wall showedthat the thick, non-cellular laminated outer layer looked bank-like,sometimes folding within the alveolar cavity. The thin, germinalinner membrane lined by a single layer cell was usually deficientdue to detachment. Brood capsule or protoscolices wereoccasionally seen. The lesion may be complicated by centralnecrosis, producing a cavity or pseudocyst after liquefaction. Inthe periphery of alveoli group there was hyperplasia offibroconnective tissue and cellular infiltration of eosinocytes,lymphocytes, plasma cells and giant cells, forming a typicalalveococcus nodule. The alveolar echinococcosis lesions in theliver behave like a slow growing liver cancer. Although the liver80

is the most frequently involved organ, blood dissemination toother organs can also occur. The right lobe is involved mostfrequently, with involvement of the porta hepatis. Parasitic lesionsin the liver can vary from small foci (few mm) to large (15–20cm) areas of infiltration.The found cystic structure, their size and location lookalike the wild rodents cysticercosis produced by Taeniataeniaeformis. Many studies have reported the presence ofT.taeniaeformis cysts in wild Rodents. Moreover,in the literature,E. multilocularis and T. taeniaeformis were simultaneously foundin the liver of A. terrestris. The differential diagnosis is based onthe gross and histological characteristics. In opposite to thealveolar echincoccosis morphology, the T.taeniaeformis cysticformes – the strobilocercus - showed macroscopically visiblecysts of whitish to yellow colour. The cyst containedapproximately 4.5 x 0.5 cm long larvae without any fluid. Twocrowns of hooks were observed on the scolex. The total numberof hoks were 36 and their size was 0.36-0.44 mm on the anteriorcrown and 0.25-0.27 mm on the posterior one. Their shape weretypical of T. taeniaeformis.The final results of natural infected wild rodents (n=552)respectively the confirmation of the E.multilocularis metacestodepresence show the 3,6 % (n=13) prevalence and the 53.8 %fertility of the cysts (Table 4.)In seven cases (53.8%) a few invaginated protoscolices(60-100 µm diameter) were present.The confirmed E.multilocularis metacestode samples wereoriginating from the same geographic area where the adult stageof the parasit was found in foxes.81

Table 4.The final results of natural infected wild rodents byE.multilocularis metacestodeWild rodent speciesCapturatedno.Pozitiveno.Prevalence(%)Fertility of thecystsArvicola terrestris 103 9 8,7 6Clethrionomys glareolus 34 1 2,9 -Microtus arvalis 132 2 1,5 1Apodemus agrarius 95 1 1,0 -Total 364 13 3,6 7 (53,8 %)V.4. Conclusions1.- Hilly and mountainous areas of most counties in thecentral and north-west regions of România, where the prevalenceof the E.multilocularis cestode and it’s metacestod form wasreported, areas that may be considered high-risk areas for humanexposure to infestation.2.- A. terrestris, C.glareolus, M.arvalis and A.agrarius aresuitable intermediate hosts of primary importance for thetransmission of E. multilocularis in Romania.3.- The morpho-histopathological examination confirmedthe presence of the E.multilocularis metacestode in 2.4 % ofsamples (n=13).4.- The lesions in all cases were characterized byprominent proliferation of granulation tissue and neoplasm likefibrosis.5.- A 53.8 % of the alveolar cysts were fertile. Arvicolaterresris, Clethrionomys glareolus, Microtus arvalis and82

Apodemus agrarius can be an intermediate host of primaryimportance for the transmission of E.multilocularis in Romania.6.- The diagnosis of alveolar echinococcosis in rodents asintermediate hosts, should place special emphasis on differentialdiagnosis to cysticercosis with Taenia taeniaeformis.Chapter VI.- Experimental reproduction of alveolarechinococcosis with E.multilocularis on whitelaboratory miceVI.1. PurposesTo complete the life cycle of E.multilocularis, theoncospheres must reach the digestive tract of an intermediatehost. Here, from the ingested oncospheres, the embryos passthrough the circulation in all organs of the host.The development of the metacestode form in the rodentsoccures in avarage between 150-170 days, development whattakes place first in the liver.Given the confirmation of E.multilocularis in foxeslivestock in Romania (with a prevalence of 4.8 %), and thedetection of larval form, the metacestod, in wild rodents (2.4 %)we wanted to experimentally reproduce the infection in laboratorywhite mice.VI.2. Material and methodsThe last proglot of the adult E.multilocularis tapeworm isthe oviger ( 0.5 – 1.1 mm lenght), containing a hypertrophieduterus where there are somting like 400-800 embryonated eggs,the proglot being a true "bag" with oncospheres. This latterseparates from the body of the cestoda in every 7-14 days. Theaverage daily number of proglotes what is removed from the bodyof a tapeworm is approximately 0,071.83

For the experimental reproduction of alveolarechinococcosis with E.multilocularis on white laboratory mice,from two samples of fresh fox intestine (collected from January24 -th 2010 in Aleşd, Bihor county respectively on January 25 -th2010 in Salsig, MaramureȘ county), mature forms ofE.multilocularis were isolated. Under the stereomicroscope weseparated the last proglot with the mature oncospheres.Slicing the wall of the proglot, the oncospheres werereleased. They were collected in a container with saline water at+4 C °.From a total of 124 adult E.multilocularis, over 31,680oncospheres were obtained (counted with the camera McMaster).A suspension of oncospheres were prepared (in 150 ml normalsaline water, stored at +4 C°), such as 1 ml of suspensioncontained 210 oncospheres.From this suspension was administered to a total of 48laboratory white mice. 1 ml per os on day 0-2-4, meaning a totalof 630 onco-spheres per os administration.A total of 2 mice died on day 2 of post-infective withmorpho-histopathologically diagnosis of bronchopneumonia abingestis,other 3 mice died on day 14 with the morphohistologicallydiagnosis of gastritis and respectively foamyindigestion.The survived 43 mice was euthanasied in the followingmanner : 7 mice from the I.group on the 90 -th day post infection, anumber of 12 mice from the II.group on the 120 -th day postinfection, 12 mice from the III.group on the 150 -th day postinfection, and 12 mice from the IV.group on the 150 -th day postinfection.Morphological and histological examination wereperformed by the usually methods, on over a number of 1,075histological slides.84

VI.3. Results and discussionsMacroscopical examination of the liver revealed the in46,5 % cystic modifications.It was noticed that as the period covered by theexperimental infection was longer, the macroscopic lesions werepresent by more mice due to the time required to for thedevelopment of the metacestod.In the first group, euthanized at 90 days, no macroscopiccystic changes were observed.In the second group, these changes were detected by 2mice (16.7 %) one cyst on each of the liver surface. They werevery small, uniloculari, located just below the Glisson capsule.In group III. cystic formations were unique in 2 samples(16.7 %), two cysts were in 3 samples (25 %), and in a singlecase (8.3 %) were found three cyst formation on the surface ofliver, mainly in the hilum .In samples from group IV. all 12 mice showed gross cysticchanges on the surface of the liver. In 4 (33.3 %) of these caseswere unique formations, in 5 (41.7 %) of the samples, there were2 chysts on the liver surface, and in 3 (25 %) samples the chistswere multiloculare, well developed in the form of clusters, with athin wall. They have been in the hepatic hilum, groupedimmediately below the Glisson capsule.In the remaining 23 samples we did not find anymacroscopic changes, these samples were also examinedhistopathologically.Histopathologically revealed that most cysts had acapsular- subcapsular location. The characteristic periparasiticgranulomatous, fibrous infiltrates were observed in all infectedlivers included epithelioid cells bordering the vesicles and agranulomatous infiltrate composed of macrophages and fibroblasts,surrounded by lymphocytes, as previously describedelsewere. The main differences that could be observed betweenthe two autopsy times, but especially at 120 days and 180 days,85

were the frequency of necrotic areas in liver and the intensity offibrogenesis.In the case of the simple cyst the wall is well defined.Because of the multiple polycystic changes, the interchistic spaceis narrow, well-represented instead is the cyst wall.In a few cysts germinative points were observed in theproliger membrane level, and germinative vesicles in differentevolutionary phases, some of them were fixed to the proligermembrane through a cellular "pedicle", others loose, free in thehydatid fluid.As one characteristic of alveolar echinococcosis producedby larval form of E.multilocularis were the capsules, produced bythe exogenous budding of germinal cell layer together with cystwall; the protoscolexes grow from germinal cells on germinal celllayer; the peduncles of early protoscolexes are attached to thegerminal cell layer on the inner surface of capsule wall. Thesuperficial surface of livers of experimental mice never showedany hyperemic phenomenon.Many germinal cells grew on the inner surface of earlycysts, most of which metastasized into host tissue to form broodvesicles or from the germinal cell layer on the inner surface of thevesicle wall. Cells also had an appearance of proliferating bymeans of alveolar buds from alveolar tissue that developedoutward to form new alveolar foci.For all 20 samples with macroscopic cystic changes,histopathologically the alveolar echinococcosis was confirmed.From the 23 samples without macroscopic changes, byhistopathological examination alveolare formations were detectedin 8 samples.Thus, the outcome of experimental infection withE.multilocularis oncospheres in white laboratory mice is asfallowing: in group I. positive confirmed samples were 0, ingroup II. the prevalence was 41.7 %, in group III. alveolarmodifications were confirmed in 91.7 %, and in group IV. all the86

hepatic alveolar changes were confirmed as metacestodes ofE.multilocularis. Total prevalecne was 65.1 %.13 (46.4 %) chists out of 28 positive sampleshistopatologically were fertile. They came from group III.- 4samples and group IV.- 9 samples. All the 3 multiloculare cystswere from group IV. and they were fertile (Table 5.)..In 15 mice we did not find any alveolar hidatic cysts, butthere have been observed numerous intra-and extra-lobular areaswith infiltration of inflamatory cells, like a response to theparasites action, in some cases these modifications having justlook like an adenoma. Also noted were multiple multinucleatedgiant cells, solitary, isolated one by one, sometimes with a fewlymphocytes. It was observed congestion and granulardegeneration of hepatocytes .The final result of the experimental infectionTable 5.No. ofgroupEuthanasiatedmiceHistologicalpositivePrevalence(%)No.offertile cysts%I. 7 0 0 0 0II. 12 5 41,7 0 0III. 12 11 91,7 4 6,4IV. 12 12 100 9 55,0Total 43 28 65,1 13 46,4VI.4. Conclusions1.- Alveolar echinococcosis with E.multilocularis inLaboratory mice can be reproduced by experimental infection,orally administrating an average of 630 oncospheres.2.- Morphological and histological changes occurre after120-180 days after the oral administration of oncospheres.87

3.- Morphological and histological changes reproducedexperimentally in mice by laboratory studies are identical tothose found during natural infection.4.- Percentage of fertility of the cysts was lower inexperimental infections (46.4%) than in natural infections(53.8%).Chapter VII. - Proposals of measures for echinococcosis withE.multilocularis control in Romania.The ultimate goal of epidemiological investigations is todevelop and implement immediate strategies and futuresurveillance and control against the presence and extent ofinfestation with E. multilocularis . Development of effectiveprevention and control programs are possible only with fullknowledge on the epidemiology and risk assessment by analyzingthe extent and spatial-temporal evolution of the disease.VII.1. Risk assessment and spatial-temporal evolutionRisk analysis is a tool designed to provide an objectiveand a tool for decision makers. After all, the risk analysis and theact of risk evaluation are not new phenomena. Risk analysis interms of parasitic infestations, are much like a statisticalprocessing of epidemiological knowledge.Steps to follow in the risk analysis are:- Identify the hazard;- Risk assessment;- Risk management;- Relative communication of the risk.Identification of E. multilocularis in Romania requiresmaking decisions and developing strategies to a hitherto unknownsituation more so, since it clearly can affect a large number ofpeople and animals with his implications. A second necessary step88

in the risk analysis is to assess the extent and trend of the spreadof infestation in the country.In this regard it is imperative important for extensivefurther investigations to assess the prevalence of definitive hostsand those of intermediate hosts from the forestery enviroment,rural and even urban areas for at least 3-5 years. Based on theresults obtained by evaluating the annual progress of theinfestation a study of spatial-temporal evolution ofE.multilocularis transmission can be made. Using the systemsand satellite imagery like: CORINE Land Cver (Co-ordinatin ofInformation on the Environment), Landsat TM or ArcView, theseallow the fallowing of spatio temporal evoluation and meteogeographicalchanges what can influence.The numbers of foxes show rapid growth trend in Europe,their habitat and feeding area entering many times in inhabitedareas, in rural and even urban areas.Ecological and epidemiologicalstudies have shown that the periphery of urban areas areoptimal for a high density of definitive hosts (foxes) andintermediate hosts (rodents), which resulted in heavy pollution ofthese areas with oncospheres of E. multilocularis. It seems thatdogs and cats may contribute to the evolution of E. multilocularisboth as definitive host and as intermediate hosts.The danger is even greater as the prevalence ofE.multilocularis in stray dogs and cats can get up to 7% respectively3%.Therefore the actual risk of infestations in humans withE.multilocularis increased dramatically generally in affectedareas, in central European countries reaching 0.02-1.4 cases per100,000 inhabitants. Statistics show that 70% of people infectedwith E. multilocularis are working in agriculture or forestry field,or that they are owners of dogs or cats. As a human disease inmany European countries it is considered a declarable disease.Mortality rate in alveolar echinococcosis without appropriatetreatment is extremely high. Treatments are very expensive and89

lifelong. It is estimated that to treat a single patient it costsbetween 108.762 to 250.000 Euro.VII.2. The main steps of risk managementThe main steps of risk management in E.multilocularisinfection and its control measures are:- Risk analysis;- Mathematical modeling for optimization of prevention andcontrol methods;- Study of the feasibility with calculation methods /measurementof costs and benefits, and- Risk management planning.For the success of alveolar echinococcosis controlstrategies fallowing are needed:- Correct informing and educating the population to becomeproperly aware of the danger of parasitic zoonoses and to initiateand actively participate in its control (endogenous developmentcontrol);- National governmental initiative- Participation of research laboratories;- Correct and effective project preparation and placement ofbaits with anti-parasitic drugs.In a project developed by ISS/WHO/FAO of "Controlingand reducing the infection with E.multilocularis by dewormingthe fox populations”, and supplemented by further research in thisarea, taking into account cost-effectiveness criteria should bedeveloped following steps :- an exact monitoring of areas with prevalence of infestationwith E.multilocularis of all possible final hosts and permanentfallowing their infestation by intravitam diagnostic (includingdogs, cats, etc..!), using indispensable maps based on GIStechnology;90

- an optimal and tested model in time and space dispersion ofbaits pursued through GIS maps;- a type of bait with increased features of palatibility,specificity with high consumption by fox populations;- develop a practical methodology for monitoring bait consumption.VII.3. Improvement of diagnostic measuresConstant improvement of diagnostic measures, ofextending their application for screening and diagnostic purpose isone of the main stages of risk management.Until recently, detection of parasites at necropsy was theonly reliable method for diagnosing the infection withE.multilocularis by definitive hosts (foxes, dogs, cats, etc..) Inthis indication intestinal scraping technique (intestinal scrapingtechnique = IST) was the main technique used in surveys of largefox populations. IST has a 100% sensibility, with confidenceinterval between 76.8% and 92.6%.Sedimentation and counting technique (sedimentation andcounting technique = SCT), is also an accurate technique (with asensitivity ~ 100%) and can be considered the standard "gold "method. Both SCT and IST have a predictive value to identify thespecific parasite and is based on of 100% distinct morphologicalcriteria. Detection of serum antibodies with very specific tests isnot appropriate for estimating the actual prevalence ofE.multilocularis in definitive hosts because of insufficientcorrelation between the prevalence of serum antibodies and thepresence of adult tapeworms in the gut. The CpAg-ELISA testscan detect the E.multilocularis antigenes in the faeces alredy inthe prepatent period (2-29 days after infection), beeing mostsensitive (up to 63 %) in the patent period (30-70 days afterinfection). The excretion of coproantigenes is closely correlatedwith the presence of intestinal immature and mature stages of theparasite and their number. Different laboratories describe91

different types of sensitivities between 84 and 95% and aspecificity of 96%. However with a margin of uncertainty of thespecificity (up to 100%), this indicates the influence of cestodesnon Echinococcus (Taenia spp, Mesocestoides spp. etc.) andnematods, described in Chapter 2 of this paper. Also, in CpAg-ELISA tests cross-reactions may occur with E.granulosus.Detection of DNA in feces by PCR is also specific (100%)and sensitive (89-100%) in diagnosis of intestinal loading with E.multilocularis, but the results of faecal examination by MultiplexPCR method should be treated with caution given the fact that itcan detect the presence of intestinal E.multilocularis only duringthe patent period, which is two thirds of the evolutionary cycle ofthe parasite.After investigations we recommend the CpAg-ELISA testas a screening test for primary assessment of health status in foxpopulations, it has a sensitivity of 100% when performed, andPCR analysis as confirmatory test. The intestinal scrapingtechnique is very hard work but should not be excluded from thediagnostic procedure.VII.4. Measures to prevent and control expansionDepending on the results of risk assessment in a givengeographical area, programs of control in E.multilcularis infectionin definitive hosts respectively of alveolar echinococcosis inintermediate hosts can be :a.- decision not to take any specific action - in cases of lowrisk;b.- promotion of educational and informational materials - withvery late;c.- antiparasitic treatment fox herds in the territory known to beinfested with E.multilcularis – results after 3-4 years, andthe danger of falling back in case of interruption;d.- reducing the number of rodent intermediate hosts,maintaining an optimal level in the number of foxes and92

their sustained antiparasitic treatment – the mostpromising and after a relatively short time.Evolution of the E.multilocularis population dynamics inan area depends primarily on the distribution and longevity ofpersistence of the cestoda in the definitive hosts and lessdependent on the epidemiological situation of the intermediatehost. But certainly there is a close correlation between thecomposition of fauna of wild rodents and the prevalence ofE.multilcularis in definitive hosts. Thus, in areas where species ofthe genus Arvicola and Microtus predominate in the stomach offoxes, the prevalence of cestode is significantly higher than inareas where the in definitive hosts diet dominate theClethrionomys and Apodemus species.However, when applying the procedure to reduce thenumber of rodents, as intermediate hosts, should be consideredthat some substances like bromadiolon, used to control theserodents, have cumulative effect, such as 135 days after application99.6% of Arvicola terrestris and 41% of Microtus arvalis had adetectable remanence (with the maximum level at 3.3 respectively6.5 days after application), which could lead to poisoning offoxes.As there is currently no possibility of vaccination of thedefinitive hosts against E.multilcularis infections, the onlymeasure to prevent and control their expansion is deworming ofthese, especially because every year they produce an impressivebiomass of zoonotic agents. If the appropriate treatment protocolsar used, the number of infected fox population can be greatlyreduced or even minimized. However, given the particularly highcosts of sustained treatment it is advisable to make a cost-benefitanalysis in particular in supported forestry cycle areas.In their attempts to create an effective model of treatmentand infection control against E.multilocularis in France wereused mathematical models in tracking the prevalence of cestode infoxes, and respectively in infections with the metacestod form93

present in Microtus arvalis as the main intermediate host in thiscountry.Based on these models bait needs were calculated withpraziquantel distributed from helicopters in the same time withrabies vaccine baits. The results showed that for successful actionis necessary:- control of infection prevalence in populations of foxes beforeusing medicated baits;- a calculation or mathematical modeling to assess the need formedicated baits, depending on the density of foxes in the areaconcerned, depending on other species in the area that mayconsume baits, and depending on the geographic area;- a long-term treatment of at least three years, with quarterlyadministration of baits;- control of infection prevalence in fox populations after aperiod of three years to determine the effectiveness of treatmentperformed.In Germany tests were made by using 50 mgpraziquantel/bait. Baits were placed in an area of 3,000 km² insouthern Germany with a density of 20 baits / km². The placementof bait was repeated at intervals of 6-12 weeks then repeated at18 and respectively 36 months, gave significant results inlowering the helmintosis generally in foxes, but particularly thatof E. multilocularis.Application of baits prepared with fishmeal, with a dose of50 mg praziquantel around burrows and especially spreading fromhelicopters gave results in Western European countries and inCentral Europe. It is very important that the number of baitsdispersed to be correlated with the numbers of foxes and theirdensity. On average it ranges from 20 to 50 baits / km 2 .However, given that evolutionary cycle of E.multilcularisin the fox is on average 35 days, bait application is advisable to bemade in every 3-4 weeks. A number of studies and tests in centralEurope show that in a population of foxes with a 60% prevalence94

of infection, after one year of treatment this fell to 40%, and after2 years it has been reduced to 10%.Including production costs, bait spread, collecting - andtransport of samples, and laboratory tests carried out over an areaof 3,000 km 2 area where baits have been placed in sevenapplications, amounted to 689,000 Euro.Given the importance of disease in terms of human health,the European Commission subsidizes the "improvement" ofprevalence the infection with praziquantel in countries where it isvery high.Given the possibility of parasite prevalence in stray dogsand cats, expansion of treatment measures is recommended toadministre a dose of 5 mg praziquantel / kg body weight to theseanimals at capture. One of the main methods of prevention andcontrol of infections with E.multilocularis is to proactivelyinform the population and increase their knowledge.Thus, recent investigations show that an audience of 2041people were interviewed in the countries Czech Republic, France,Germany and Switzerland. The number of people who hadinformation about the infection was low on percentage: CzechRepublic (14%) and in France (18%), compared to the percentageof those from Germany (63%) and Switzerland (70%). Comparedto France, where only 17% of the population did informed on hisown initiative, in Germany and Switzerland their percentage wasmuch higher, 54% and 60%. The benefits of a proactive publicinformation program would be primarily actual perception of risk,information on opportunities to minimize risks and preventexaggerated reactions of anxiety about infection.VII.5. ConclusionsIt requires:- a national strategy very well set up for human and animalpopulation surveillance;- international collaboration and cross border in this regard;95

- a deeper investigation to better understand the epidemiologyand pathogenesis of the disease;- to make an epidemiological screening of all hunted foxes;- further investigations on a range of at least 5 years todetermine the spatial and temporal evolution of parasiteexpansion;- development of early diagnostic methods;- development of methods of vaccination or effective antiparasitic medication affordable for cost-benefit to all affectedcountries.Due to the continuing infestation of intermediate hosts, wheretreatment does not apply for three years, the infestation of the foxpopulation returns to baseline. From these considerations inparallel with the deworming of fox populations, a decrease in wildrodents populations must be achieved.Chapter VIII. General conclusions and recomandationsAlveolar echinococcosis in humans caused by E.multilocularis, dispersed in nature by the European red fox(Vulpes vulpes L.) and maintained by intermediate hosts from theorder of Microtide is a potentially fatal zoonosis.Investigations conducted during 2007-2010 on the territoryof 15 counties in Transylvania, revealed the following mainaspects:1.- The parasitic fauna of small intestine in the Europeanred fox was polispecific, with dominant prevalence of thenematodes (91,4 %), fallowed by the cestodes (90,7 %), respecttivelyby trematodes (15 %).2.- Highest intensity of infection was found with cestodes,where in 3,7 % of the samples there number excedeed 10.000 /sample.3.- Isolated and identified helminths belonged to species:Alaria alata, Dipylidium caninum, Echinococcus multilocularis,96

Mesocestoides lineatus, T.polycantha, T.hydatigena, T.multiceps,T.pisiformis, T.serialis, T.taeniaeformis, T.crassiceps, T.ovis,Ancylostoma caninum, Uncinaria stenocephala, Toxascarisleonina, Toxocara canis and Trichuris vulpis.4.- For the detection of E.multilocularis infections, theintestinal scraping technique has a complete and real value onlyif they examine both the content and the scraping of the lastthirds of the jejunum throughout its length.5.- From the total of 561 samples, in 27 (4,8 %)E.multilocularis was found, with a total of 2.012 cestodes.6.- Positive samples for E.multilocularis came from 8counties (53,3 % from the studied counties)7.- Investigations carried out to detect parasite antigens infaces samples shows, that the CpAgELISA method is a very goodway for the screening of the E.multilocularis infection in foxpopulations.8.- Given the undeniable influence of parasite pressure ontest results CpAgELISA it is advisable to complete with theexamination of the content and the scraping of the intestine, andin case of positive samples if it is necessary, to confirm by PCRmethod.9.- The Multiplex PCR method confirms the taxonomicaffiliation of the examined species of cestodes E.multilocularis.10.- Morphological investigations carried out on capturedwild rodent samples shows, that Arvicola terresris withClethrionomys glareolus, Microtus arvalis and Apodemusagrarius may be intermediate hosts for infection withE.multilocularis on Romanian territory.11.- Necropsy revealed changes in the liver ofintermediate hosts, which are looking like cauliflower, similar totumor granulomas, confirming the neolpazic nature, invadant ofthe matacestod form with tendency of liver tissue destruction.12.- The fertile cysts from Arvicola terresris, but alsoMicrotus arvalis demonstrates the ability of infestation of theparty involved, with infective dispersal role.97

13.- Alveolar echinococsis with E.multilocularis can bereproduced by experimental infection of the laboratory mice withan average of 630 oncospheres orally administrated.15.. Morphological and histopathological changes experimentallyreproduced on laboratory rats, are identical to thosefound during natural infection.16.- Percentage of fertility of the cysts is not significantlydifferent in experimental infections (46,4 %) to those of naturalinfections (53,8 %).17. – To prevent the expansion and disease control, thisrequires a sustained and consistent set of measures like:- Accurate assessment of the number of foxes and rodents aspotential intermediate hosts;- Estimate the prevalence of E.multilocularis cestod in anyspecies of definitive hosts;- Extension of laboratory investigations into the StrategicProgram with the jejunal mucosa examination method made pyCpAgELISA and Multiplex PCR tests18.- It has to be made a supported and consequent antiparasitetreatment program the number of fox populations, whilereducing the number of rodent populations as the intermediatehosts.NOTE :Special scientific value of this thesis stems from the factthat for the first time in Romania :- was discovered and morphologically described the presenceof cestode Echinococcus multilocularis in foxes heards;- was achieved the taxonomically classification of the cestodeby molecular biology tests - Multiplex PCR;- in 15 couties from center and north-west of Romaniascreenings of fox populations were made with CpAgELISAtest;98

- it was followed the whole development cycle of the cestode,its presence was diagnosed also in intermediate hosts; theentire range of scientific investigations was made concerningthe cestode Echinococcus multilocularis, his detection indefinitive hosts, morphological description of cestode,screening of the affected population, detection and morphohistologicaldescription of the larval form in intermediatehosts and experimental reproduction of parasitic infestationsin laboratory conditions;- Work by an international collaboration of the fallowing:Association ”Echino-News” Romania; with USAMV Cluj-Napoca Faculty of Veterinary Medicine - Parasitology andparasitic diseases section, with University of VeterinaryMedicine from Budapest (Hungary) and ParasitologicalInstitute of Zürich (Switzerland) University.As a result - after the publication of results, during theeuropean symposium on the epidemiology of alveolarechinococcosis in December 2010, Romania has been put for thefirst time on the map of the European disease surveillancesystem.BIBLIOGRAFIE - REFERENCES :1.- Benedek A.M. (2008-a.) - Small mammals (Ordo Insectivoraand Ordo Rodentia) from Agnita-Sighişoara area(Romania). Transylvanian Review of Systematical andEcological Research, 3;2.- Benedek A.M. (2008-b.) – Studii asupra mamiferelor mici(Ordinele Insectivora Și Rodentia) în Transilvania-România.Teză de doctorat.Universitatea dinBucureȘti, Facultatea de Biologie;99

3.- Calderini P., Magi M., Gabrielli S., Brozzi A., Kumlien S.,Grifoni G., Iori A., Cancrini G. (2009) - Investigationon the occurrence of Echinococcus multilocularis inCentral Itay. BMC Veterinary Research, 5, 44;4.- Casulli A., Széll Z., Pozio E., Sréter T. (2010) Spatialdistribution and genetic diversity of Echinococcusmultilocularis in Hungary. Vet. Parasitol., 174, 3-4,241-246;5.- Caswell H. (1978) –Predator mediated co-existence : a nonequilibriummodel. American Nature, 112, 127-154;6.- Davidson K.R., Øines Ø., Knut M., Mathis A. (2008) –Echinococcus multilocularis – adaptation of a wormegg isolation procedure coupled with multiplex PCRassay to carry out large-scale screening of red foxes(Vulpes vulpes) in Norway. Parasitology Research,104, 3, 509-514;7.- Deblock S. and Pétavy A.F. (1983) - Les larves hépatiquesde cestode parasites du grand campagnol (Arvicolaterrestris) en Auvergne, France.Ann.Parasit.Hum.Comp., 58, 5, 423-437;8.- Decizia Comisiei nr.2008/426/CE – din 28 aprilie 2008privind modificarea Deciziei 2002/253/CE de stabilirea definiȘiilor de caz pentru raportarea bolilortransmisibile reȘelei comunitare în conformitate cuDecizia nr.2119/98/CE a Parlamentului European Și alConsiliului. Jurnalul Oficial L., 159, 46-90;9.- Deplazes P., Alther P., Tanner I., Thompson R.C., Eckert J.(1999) - Echinococcus multilocularis coproantigendetection by enzime-linked immunosorbent assay infox, dog, and cat populations. J.Parasitol.,85,1,115-121;10.- Deplazes P., Dinkel A., Mathis A. (2003) – Molecular toolsfor studies on the transmission biology ofEchinococcus multilocularis.Parasitology,127S,53-61;100

11.- Eckert J., Gemmell M.A., Meslin F.X., Pawlowski Z.S.(2002) - WHO/OIE Manual on Echinococcosis inHumans and Animals: a Public Health Problem ofGlobal Concern; Ed. World Org. for Anim. Health,WHO/OIE, Paris, France;12.- Eira C., Vingada J., Torres J., Miquel J. (2006) – Thehelminth community of the red fox (Vulpes vulpes) inDumas de Mira (Portugal) and its effect on hostcondition. Wildl. Biol. Pract., 2, 1, 26-36;13.- Goodfellow M., Shaw S., Morgan E. (2006) – Importeddisease of dogs and cats exotic to Ireland:Echinococcus multilocularis.Irish Vet.J.,59,4,214-216;14.- Gottstein B. (2001) - Hydatid disease. http://www.harcourtinternational.com/e-books/pdf/813.pdf;15.- Hanski I. (1982)–Dynamics of regional distribution : the coreand satellite species hypotheses.Oikos,38,210-221;16.- Hanski I. (1991) – Core and satellite species. Theory andartifacts. Oikos, 62, 88-89;17.- Hegglin D. and Deplazes P. (2008) - Control strategy forEchinococcus multilocularis. Emerg.Infect.Dis., 14,10, 1626-1628;18.- Hofer S.,Gloor S.,Müller U.,Mathis A.,Hegglin D.,DeplazesP. (2000) - High prevalence of E. multilocularis inurban red foxes (Vulpes vulpes) and voles (Arvicolaterrestris) in the city of Zürich, Switzerland.Parasitology, 20, 135-142;19.- Kamiya M. (2007) – Collaborative control initiativestargeting zoonotic agents of alveolar echinococcosis inthe northern hemisphere. J.Vet.Sci., 8, 4, 313-321;20.-Karimi I., Chalechale A., Bahiraie A., Azadbakht M. (2010) -t : Larvae of Taenia taeniaeformis in the hepatobiliarysystem of Mus musculus. The Internet Journal ofParasitic Diseases, http://www.ispub. com/journal/101

the_internet/journal_of_parasitic_diseases/volume_3_number_2_55/ article/ larvae-of-aenia-taeniaeformisin-the-hepatobiliary-system-of-mus-musculus.html;21.- Knapp J., Guislain M.H., Bart J.M., Raoul F., Gottstein B.,Giraudoux P., Piarroux R. (2008) – Genetic diversityof Echinococcus multilocularis on local scale.Infection, Genetics and Evolution, 8, 367-373;22.- Kodama Y., Fujita N., Shimizu T. (2003) – Alveolarechinococcosis: MR findings in the liver. Radiology,228, 172-177;23.- Marosfői L. (2007) - Studiul histologic al organelor, incorelatie cu virsta si prezenta de leziuni macroscopicela distanta, la bovinele sacrificate pentru consum. PhDThesis, USAMV Cluj-Napoca;24.- Milesevic M., Ekert M., Mahnik M. (2004) - Incidence ofmesocercaria of Alaria alata in the meat of wild boarskilled in the hunting ground "Posavske šume" from 4September to 10 December 2003. VeterinarskaStanica, 35, 4, 215-219;25.- Möhl, K., Groβe K., Hamedy A., Wüste T., Kabelitz P.,Lücker E. (2009) – Biology of Alaria spp. and humanexposition risk to Alaria mesocercariae-a review.Parasitology Res., http://parasitology. informatik. uniwuerzburg.de/;26.- OIE Manual (2008)–Terrestrial manual.Cpt.2.1.4., www.oie.int.;27.- Pétavy A.F., Tenora F., Deblock S. (2003) - Co-occurrenceof metacestodes of Echinococcus multilocularis andTaenia Taeniaeformis (Cestoda) in Arvicola terrestris(Rodentia) in France.Folia Parasitologica,50,157-158;28.- Popa E. (2010) – Manual de diagnostic pentru echinococozala animale. Laboratorul NaȘional de ReferinȘă pentruEchinococoză – IDSA, BucureȘti;102

29.- Pufe M. (2009) – Az Echinococcus multilocularis prevalenciájánakcsökkentése németországi rókákban prazikvantelkezeléssel. Magyar Állatorvosok Lapja,Budapest, 8, 131, 503-507;30.- Reperant L.A. (2005) – Ecologie parasitaire d’Echinococcusmultilocularis et autres helminthes du systeme renardroux-rongeurs en milieu urban et peri-urbain:Implications zoonotiques dans le canton de Geneve,Suisse. Ecole Nationale Veterinaire de Lyon, Thèsen°52 pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire;31.- Reperant L.A., Hegglin D., Tanner I., Fischer C., Deplazes P.(2009) - Rodents as shared indicators for zoonoticparasites of carnivores in urban environments.Parasitology, 136, 329-337;32.- Sage M., Coeurdassier M., Defaut R., Gimbert F., Berny P.,Giraudoux P. (2008) - Kinetiks of bromadiolone inrodent populations and implications for predators afterfield control of the water vole, Arvicola terrestris.Sci.Total Environ., 407, 1, 211-22;32.- Sage M., Fourel I., Coeurdassier M., Barrat J., Berny P.,Giraudoux P. (2010) – Determination of bromadioloneresidues in fox faeces by LC/ESI-MS in relationshipwith toxicological data and clinical signs after repeatedexposure. Environ. Res., 110, 7, 664-674;33.- Satoh M., Nakaya K., Nakako M., Xiao N., Yamasaki H.,Sako Y., Naitoh Y., Kobayashi M., Ohtaishi N., Ito A.(2005) - Short report : Echinococcus multilocularisconfirmed on Kunashiri island. Am.J.Trop.Med.Hyg.,72, 3, 284-288;34.- Sikó Barabási S. Și Cozma V. (2008.) - Echinococozaalveolară. O posibilă zoonoză emergentă în România(Sinteză). Rev.Scientia Parasitologica. 9, 1, 48-60;35.- Staubach C., Thulke H.H., Tackmann K., Hugh-Jones M.,Conraths F.J. (2001) – Geographic information103

system-aided analysis of factors associated with thespatial distribution of Echinococcus multilocularisinfections of foxes.Am.J.Trop.Med.Hyg.,65,6,943-948;36.- Teysseyre A.J.F. (2005) – Contribution à l’étude duparasitisme intestinal du renard roux (Vulpes vulpes)en Midi-Pirénées: Recherche d’Echinococcusmultilocularis. These pour obtenir le grade de DocteurVétérinaire. École Nationale Veterinaire Toulouse;37.- Torgerson P.R., Schweiger A., Deplazes P., Pohar M.,Reichen J., Ammann R.W., Tarr P.E., Halkik N.,Müllhaupt B. (2008) – Alveolar echinococcosis : Froma deadly disease to a well-controlled infection.Relative survival and economic analysis inSwitzerland over the last 35 years. J.of Hepatol., 49,72-77;38.- Trachsel D., Deplazes P., Mathis P. (2007) – Identification oftaeniid eggs in the faeces of carnivores based onmultiplex PCR using targets in mithocondrial DNA.Parasitology, 134, 911-920;39.- Yamasaki H., Nakao M., Nakaya K., Schantz P.M., Ito A.(2008) - Genetic Analysis of E. multilocularisOriginating from a Patient with AlveolarEchinococcosis Occurring in Minnesota in 1977. Am.J.Trop.Med.Hyg., 79, 2, 245-247;40.- http://www.echino.eu/english/?p=21).104