高效液相色谱法(HPLC) 测定牛乳中β-乳球蛋白

高 效 液 相 色 谱 法 (HPLC) 测 定 牛 乳 中 α- 乳 白 蛋 白Determination of α-lactalbumin in milk products by highperformance liquid chromatography ( HPLC)关 荣 发 1 , 黄 光 荣 1 , 贾 振 宝 1 , 戴 贤 君 1 2, 叶 兴 乾GUAN Rong-fa 1 , HUANG Guang-rongn 1 , JIA Zhen-bao 1 , DAI Xian-jun 1 , YE Xing-qian 2(1. 中 国 计 量 学 院 生 命 科 学 学 院 , 杭 州 310018; 2. 浙 江 大 学 食 品 科 学 与 营 养 系 , 杭 州 310029)(1. College of Life Sciences, China Jiliang University,Hang Zhou 310018; 2. Department ofFood Science and Nutrition, Zhejiang University, Hangzhou 310029)摘 要 : 建 立 了 利 用 常 规 的 C18 色 谱 柱 的 高 效 液 相 色 谱 测 定 牛 乳 中 主 要 过 敏 蛋 白 α- 乳 白 蛋 白含 量 的 方 法 。 色 谱 条 件 : 色 谱 柱 Alltima-C18( 4.6 mm×200 mm, 5μm) , 柱 温 为 45℃, UV 检 测波 长 2l5 nm, 流 动 相 A 为 含 0.1% 三 氟 乙 酸 的 超 纯 水 , 流 动 相 B 为 乙 腈 ∶ 超 纯 水 ∶ 三 氟 乙 酸 =400∶100∶0.5, 采 用 梯 度 洗 脱 方 法 , 流 速 0.8mL/min。 结 果 表 明 : α- 乳 白 蛋 白 的 线 性 范 围 分 别 为 50μg/mL-1000μg/mL( r=0.9909); α- 乳 白 蛋 白 平 均 回 收 率 为 97.27 %, RSD=0.76%(n=5); 该 方 法 简便 、 准 确 , 适 合 于 乳 制 品 中 α- 乳 白 蛋 白 含 量 的 测 定 。关 键 词 : 高 效 液 相 色 谱 法 ; α- 乳 白 蛋 白 ; 乳 制 品 ; 测 定Abstract: A method for the determination ofα-lactalbumin in milk products by high performanceliquid chromatography has been established. The chromatography conditions as follow: Alltima-C18conlum (4.6 mm×200 mm, 5 μm), UV detection wavelengts 215 nm. This method consisted of alinear gradient of the two mobile phases of 0.1% trifluoroacetic acid in water and 0.5% trifluoroaceticacid and 80% acetonitrile in water at a flow rate of 0.5 mL/min, The conlum temperature was 25℃.The result showed that for α-lactalbumin the calibration curve was linear in the range of 50μg/mL ~1000μg/mL( r=0.9909). The average recovery percent was 97.27, the RSD was0.76%( n=5).The methods is suitable for contents analysis of α-lactalbumin in milk products.Key words: high performance liquid chromatography; α-lactalbumin; milk products; determination随 着 人 们 生 活 水 平 的 提 高 , 奶 制 品 在 国 内 的 消 费 量 迅 速 增 加 ,2005 年 我 国 城 镇 居 民 奶 类人 均 消 费 量 ( 折 鲜 奶 ) 已 达 25 公 斤 以 上 , 饮 用 UHT 奶 、 巴 氏 杀 菌 奶 等 液 态 奶 已 在 我 国 渐 成 习惯 , 液 态 乳 已 经 成 为 我 国 的 主 要 乳 制 品 。 但 牛 乳 过 敏 是 儿 童 中 一 种 常 见 的 食 物 过 敏 , 严 重 地 影基 金 项 目 : 浙 江 省 分 析 测 试 科 技 计 划 项 目 ( 编 号 :2007F70027)作 者 简 介 : 王 关 荣 发 (1975 - ) 男 , 中 国 计 量 学 院 生 物 安 全 与 食 品 科 学 研 究 所讲 师 , 博 士 研 究 生 。E-mail:rfguan@163. com

[ ]响 儿 童 的 身 体 健 康1 [ ]。 在 成 年 人 中 牛 乳 过 敏 也 时 有 发 生 , 已 引 起 了 全 球 的 广 泛 关 注 2 。 牛 乳 中的 主 要 过 敏 成 分 有 α- 乳 白 蛋 白 、 酪 蛋 白 和 β- 乳 球 蛋 白 等 。2002 年 国 际 食 品 规 范 委 员 会 提 议 对 欧[ ]洲 的 食 品 标 签 法 规 进 行 修 改 , 提 议 对 所 有 的 食 物 中 的 过 敏 成 分 进 行 标 识3 。 这 一 提 议 对 保 护 食物 过 敏 人 群 非 常 有 利 , 但 同 时 也 要 求 更 可 靠 有 效 的 食 物 过 敏 原 检 测 方 法 来 确 保 它 的 实 施 。用 于 检 测 牛 乳 过 敏 原 的 方 法 主 要 有 : 免 疫 吸 附 实 验 、SDS-PAGE 电 泳 、 酶 联 免 疫 吸 附 实 验 、聚 丙 烯 凝 胶 电 泳 结 合 激 光 扫 描 、 电 泳 和 毛 细 管 电 泳 等 方 法 。 但 以 上 各 种 方 法 在 测 定 α- 乳 白 蛋 白时 都 有 一 定 的 难 度 , 难 以 在 实 践 中 应 用 。 反 相 高 效 液 相 色 谱 法 是 分 析 乳 清 蛋 白 成 分 的 有 效 方 法之 一 , 与 其 他 色 谱 方 法 相 比 具 有 分 辨 率 和 回 收 率 高 、 重 复 性 好 、 操 作 简 便 等 优 势 , 国 内 外 相 关 的α- 乳 白 蛋 白 液 相 测 定 方 法 需 要 专 门 的 C4 色 谱 柱 , 而 C4 色 谱 柱 用 途 不 及 C18 色 谱 柱 广 泛 。 本文 采 用 C18 色 谱 柱 , 优 化 了 α- 乳 白 蛋 白 的 分 析 条 件 , 与 现 有 的 方 法 相 比 , 可 以 利 用 常 规 的 C18色 谱 柱 , 缩 短 了 分 析 时 间 , 建 立 的 定 量 测 定 α- 乳 白 蛋 白 的 方 法 为 监 测 目 前 市 场 中 各 类 乳 制 品 中的 α- 乳 白 蛋 白 及 低 过 敏 乳 制 品 的 研 究 和 质 量 提 供 了 有 效 的 方 法 。1 材 料 与 方 法1.1 试 验 材 料生 乳 : 浙 江 省 杭 州 二 牧 奶 牛 场 , 浙 江 省 杭 州 普 利 奶 牛 场 , 浙 江 省 杭 州 乔 司 奶 牛 场α- 乳 白 蛋 白 标 准 品 (Sigma 公 司 )乙 腈 : 色 谱 纯 , 天 津 市 四 友 生 物 医 学 技 术 有 限 公 司甲 醇 : 色 谱 纯 , 天 津 市 四 友 生 物 医 学 技 术 有 限 公 司三 氟 乙 酸 (TFA): 色 谱 纯 , 美 国 TEDIA 公 司氯 化 钠 : 分 析 纯 , 上 海 光 铧 科 技 有 限 公 司叠 氮 化 钠 (Sodium Azide), 分 析 纯 , 浙 江 东 阳 利 得 医 药 化 学 有 限 公 司1.2 仪 器BioSafe Avanti J-10 型 高 速 冷 冻 离 心 机 : 美 国 贝 克 曼 有 限 公 司C5 型 超 高 压 均 质 机 : 加 拿 大 AVESTIN 公 司Delta 320-S pH 计 : 瑞 士 梅 特 勒 公 司Millex-HA 型 滤 器 : 美 国 密 理 博 公 司Hitachi( 日 立 ) CR22G 高 速 冷 冻 离 心 机 : 日 本 日 立 公 司Waters2695 型 高 效 液 相 色 谱 仪 : 美 国 Waters 公 司Warters 2996 二 级 管 阵 列 检 测 器 : 美 国 Waters 公 司QL-901 型 旋 涡 混 合 器 : 东 莞 市 华 达 电 子 仪 器 有 限 公 司

Waters Oasis HLB Extracton Cratridge: 美 国 Waters 公 司Alltima-C18 色 谱 柱 (4.6mm x 250mm, 5μm, 美 国 奥 泰 科 技 ( 中 国 ) 有 限 公 司 )1.2 试 验 方 法1.2.1 色 谱 条 件流 动 相 : 流 动 相 (A): 超 纯 水 含 0.1% 三 氟 乙 酸 (TFA), 流 动 相 (B): 乙 腈 + 超 纯 水 + 三 氟 乙酸 (400/100/0.5), 流 速 0.8mL/min, 柱 温 45℃, 检 测 波 长 :215nm表 1 梯 度 洗 脱 条 件Table 1 Gradient elution condition时 间Time(min)流 速mL/min洗 脱 液 ASolvent A (%)洗 脱 液 BSolvent B (%)0 0.8 64 3620 0.8 44 5630 0.8 40 6035 0.8 64 3638 0.8 64 361.2.2 对 照 品 溶 液 的 制 备精 确 称 取 α- 乳 白 蛋 白 标 准 品 16mg, 用 超 纯 水 配 制 成 1.6mg/mL 的 原 液 ; 适 量 吸 取 原 液 , 配制 成 标 样 浓 度 为 0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mg/mL 的 系 列 标 准 液 。1.2.3 样 品 供 试 液 的 制 备将 牛 乳 于 20℃ 条 件 下 , 以 2000g 离 心 20min 后 , 把 上 层 脂 肪 去 掉 ; 取 上 清 液 于 10mL 离 心管 中 , 置 于 -20℃ 保 存 , 待 测 ; 分 别 取 5mL0.10mol/L,pH 4.6 醋 酸 缓 冲 液 和 1mL 上 清 液 于 10mL离 心 管 中 ; 用 漩 涡 振 荡 器 混 匀 牛 乳 样 品 后 , 于 室 温 下 以 4000g 离 心 10min; 取 上 清 液 , 用 0.45μm 水 性 滤 器 过 滤 到 1.5mL 离 心 管 中 , 滤 液 用 于 α- 乳 白 蛋 白 的 测 定 。2 结 果 与 分 析2.1 流 动 相 的 选 择采 用 反 相 高 效 液 相 色 谱 方 法 分 析 蛋 白 的 流 动 相 系 统 基 本 为 三 氟 乙 酸 的 水 溶 液 和 乙 腈 溶 液 ,采 用 梯 度 洗 脱 , 但 随 着 样 品 的 不 同 及 色 谱 柱 的 不 同 , 梯 度 洗 脱 条 件 也 随 之 改 变 。 在 蛋 白 质 的 反相 液 相 色 谱 分 离 中 , 初 始 洗 脱 条 件 下 流 动 相 中 有 机 溶 剂 的 浓 度 较 低 , 蛋 白 质 与 固 定 相 间 的 疏 水作 用 较 强 , 蛋 白 质 几 乎 完 全 被 固 定 相 吸 附 。 而 一 旦 流 动 相 中 的 有 机 溶 剂 达 到 特 定 的 浓 度 , 使 蛋白 质 与 固 定 相 的 作 用 小 于 与 流 动 相 的 作 用 时 , 蛋 白 质 就 会 完 全 从 固 定 相 上 洗 脱 下 来 , 几 乎 不 再与 固 定 相 发 生 作 用 。 本 试 验 尝 试 了 以 不 同 比 例 的 三 氟 乙 酸 的 水 溶 液 和 乙 腈 溶 液 作 流 动 相 。 当 以高 比 例 的 水 进 行 梯 度 洗 脱 时 , 蛋 白 质 的 出 峰 时 间 延 迟 ; 而 以 高 比 例 的 乙 腈 进 行 梯 度 洗 脱 时 , 多

肽 及 蛋 白 质 的 出 峰 时 间 缩 短 , 但 α- 乳 白 蛋 白 和 β- 乳 球 蛋 白 不 能 分 开 。 在 兼 顾 保 留 时 间 和 分 离度 的 前 提 下 , 最 终 选 择 用 于 测 定 α- 乳 白 蛋 白 的 流 动 相 及 梯 度 洗 脱 条 件 如 “1.2.1” 节 所 述 。 标 准品 和 样 品 的 分 离 结 果 分 别 见 图 1 和 图 2。a:α- 乳 白 蛋 白图 1 标 准 品 HPLC 图Fig.1 HPLC chromatogram of standard reference2.2 回 归 方 程 、 线 性 范 围 及 检 出 限精 确 称 取 α- 乳 白 蛋 白 标 准 品 6mg, 用 超 纯 水 配 制 成 0.6mg/mL 的 原 液 ; 适 量 吸 取 原 液 , 配 制成 标 样 浓 度 为 0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6mg/mL 的 系 列 标 准 液 , 按 1.2.1 所 述 色 谱 条 件 进 行 测 定 ,以 峰 面 积 为 纵 坐 标 , 浓 度 为 横 坐 标 做 标 准 曲 线 , 得 α- 乳 白 蛋 白 的 回 归 方 程 为Y=1406800X+1221.4(r=0.9909), 线 性 范 围 为 50μg/mL-1000μg/mL; 以 信 噪 比 S/N=3 计 算 α- 乳白 蛋 白 的 检 测 限 为 30ng 色 谱 图 ( 见 图 1)。2.3 加 样 回 收 率 实 验以 同 一 奶 粉 配 制 的 牛 奶 为 空 白 样 品 , 精 确 定 量 加 入 α- 乳 白 蛋 白 标 准 品 溶 液 , 按 样 品 处 理 方法 制 备 样 品 液 , 进 行 测 定 , 用 已 知 浓 度 的 样 品 溶 液 定 溶 , 按 1.2.1 所 述 色 谱 条 件 , 每 样 平 行 测 定5 次 , 每 次 进 样 50μL, 测 定 其 中 α- 乳 白 蛋 白 的 含 量 , 计 算 回 收 率 , 得 α- 乳 白 蛋 白 平 均 回 收 率为 97.27%,RSD=0.76%( 结 果 见 表 1)。

表 1 α- 乳 白 蛋 白 回 收 率 (n=5)Table 1 Recovery ofα-lactalbumin (n=5)本 底 含 量 (mg/mL)加 入 量 (mg/mL)测 出 量 (mg/mL )平 均 回 收 率 /%RSD/BackgroundAddedamount/Detectableamount/Average%amount/(mg/mL)(mg/mL)(mg/mL)recovery/%0.601 0.05 0.649 96.4 3.840.601 0.1 0.699 97.6 3.570.601 0.2 0.797 97.8 2.362.4 精 密 度 实 验取 同 一 对 照 品 溶 液 (α- 乳 白 蛋 白 0.2 mg/mL) , 按 1.2.1 所 述 色 谱 条 件 进 行 测 定 , 连 续 进 样 5次 , 每 次 50μL 记 录 色 谱 峰 面 积 , 计 算 相 对 标 准 偏 差 , 结 果 α- 乳 白 蛋 白 RSD=0.86 %。2.5 稳 定 性 实 验精 确 吸 取 新 配 制 的 供 试 品 溶 液 , 按 1.2.1 色 谱 条 件 每 隔 2 h 进 样 测 定 一 次 , 结 果 表 明 α- 乳 白蛋 白 在 12h 稳 定 。2.6 样 品 的 测 定 结 果取 一 定 量 原 料 奶 按 1.2.3 样 品 处 理 方 法 及 1.2.1 色 谱 条 件 进 行 测 定 , 结 果 见 表 2, 样 品 色 谱 图见 图 2。表 2 样 品 测 定 结 果Table 2 Determination results of sample样 品 Sample 1 2 3 4 5α- 乳 白 蛋 白 α-lactalbumin(mg/mL) 1.19 1.20 1.21 1.20 1.21

Additives and Contaminants,2004, 1(21):1-31