全長cDNAライブラリを用いたアピコンプレクサ原虫の発現遺伝子の解析 ...

Jpn. J. Protozool. Vol. 40, No. 1. (2007)57全 長 cDNAライブラリを 用 いたアピコンプレクサ 原 虫 の 発 現 遺 伝 子 の 解 析渡 辺 純 一 1 , 鈴 木 穣 2 , 若 栗 浩 幸2 ( 東 京 大 学 1 医 科 学 研 究 所 , 2 新 領 域 )Analysis of expressed genes of apicomplexan parasitesusing full-length cDNA librariesJunichi WATANABE 1 , Yutaka SUZUKI 2 , Hiroyuki WAKAGURI 2( 1 Institute of Medical Science, 2 Graduate School of Frontier Sciences, The University of Tokyo)SUMMARYApicomplexan protozoa are obligatory parasites that cause various diseases including malaria. Recent studies revealedthat they belong to the superkingdom Alveolata which also contains Ciliata and Dinoflagellata. Using oligo-cappingmethods, we have produced full-length cDNA libraries from various apicomplexa, including Plasmodium falciparum, P.vivax, P. yoelii, P. berghei, Toxoplasma gondii and Cryptosporidium parvum. Large scale determination of 5'-end onepasssequences and comparisons with the genome sequences revealed that 80–90% contain the entire ORF (open readingframe) and these were considered to represent full length clones. The database, Full-malaria, was produced and publishedon the internet (http://fullmal.ims.u-tokyo.ac.jp). Determination of the entire sequences of these clones should elucidatethe exact gene structures and transcriptional start sites. The latter defines the regions that control gene expression upstream.Comparative analysis of these libraries will help elucidate the process of evolution of apicomplexan parasites.Similar studies involving Ciliata and Dinoflagellata are expected to unravel the mechanisms behind the parasitism. Theclones will also be used for various experiments.[ 目 的 ] アピコンプレクサ 原 虫 は, 偏 性 寄 生 性 の 原 虫で,マラリアやトキソプラズマなどの 疾 病 の 原 因 となるため, 医 学 ・ 獣 医 学 領 域 で 研 究 が 行 われてきた。 早 くからゲノム 解 読 の 対 象 となり,2002 年の 熱 帯 熱 マラリア 原 虫 (Plasmodium falciparum)の 全 ゲノム23Mbが 解 読 を 嚆 矢 として,つぎつぎにゲノムが 公 開 されている。また, 最 近 の 分 子 生 物 学 的 研 究 ・ 微 細 形 態 学 的 解析 から, 本 原 虫 が, 繊 毛 虫 や, 渦 鞭 毛 虫 と 近 縁 のアルベオラータ 超 門 を 形 成 することが 明 らかになり,原 虫 の 進 化 , 寄 生 進 化 の 観 点 から 興 味 がもたれている。我 々は, 独 自 に 開 発 したoligo-cap 法 を 用 いてこれらの 原 虫 から 全 長 cDNAライブラリを 作 成 し, 発 現 遺伝 子 の 解 析 を 行 った。oligo-cap 法 は, 真 核 生 物 のmRNAの5’ 端 に 存 在 するcap 構 造 を 利 用 してmRNAの 全 長 をクローニングするもので, 発 現 遺 伝 子 を 効率 よく 解 析 する 技 術 である。これまでに, 複 数 の 原虫 種 からライブラリを 作 成 し 解 析 した( 表 1)。[ 材 料 と 方 法 ] 原 虫 の 調 整 は, 標 準 的 方 法 で 行 った。ヒト 赤 血 球 を 用 いて 培 養 (Pf), 患 者 から 採 血(Pv),マウスの 腹 腔 内 に 投 与 させ 感 染 増 殖 させたものを 全 血 として 回 収 (Py,Pb), 同 様 に 感 染 させ腹 腔 内 から 回 収 (Tg),SCIDマウスに 経 口 投 与 させ感 染 増 殖 , 糞 便 中 に 回 収 (Cp)。 原 虫 は 適 当 な 方 法で 精 製 したのち,TrizolでRNAを 抽 出 し,oligo-cap 法で 全 長 cDNAライブラリを 作 成 した。それぞれ,1 万個 のランダムクローンの5’ 端 ワンパスシークエンスを 決 定 した。ゲノム 塩 基 配 列 とBLATで 比 較 ,ゲノム 上 にマップした。 結 果 をデータベース 化 し,ゲノムビューワーを 作 成 して,インターネットで 公 開 した(Full-malaria, http://fullmal.ims.u-tokyo.ac.jp)。[ 結 果 ] 80〜90%のクローンでORF(open readingframe)の 全 長 を 含 むクローンが 得 られた。300

58 原 生 動 物 学 雑 誌 第 40 巻 第 1 号 2007 年0〜6000 個 と 想 像 される 原 虫 遺 伝 子 のうち1000〜2000 遺 伝 子 について 全 長 クローンが 得 られた。[ 考 察 ] ゲノム 解 読 時 代 において, 発 現 遺 伝 子 の 全 長を 解 析 できる 全 長 cDNAライブラリの 研 究 は 時 宜 を 得たものである。 共 通 の 祖 先 に 由 来 する 種 々の 原 虫が, 進 化 の 過 程 で,しだいに 感 染 する 宿 主 域 を 広げ, 多 様 な 生 活 環 を 有 するようになった 経 過 を,ゲノムサイズや,GC 含 量 の 変 化 と 関 係 づけて 解 析 することはきわめて 興 味 深 い。また,アピコンプレクサ原 虫 だけでなく, 近 縁 の 繊 毛 虫 (Tetrahymena)や 渦 鞭毛 虫 を 含 めた 比 較 解 析 は, 原 虫 の 進 化 分 化 , 寄 生 進化 の 解 明 に 貢 献 するものと 期 待 される。[ 文 献 ]Watanabe J, Suzuki Y, Sasaki M, Sugano S. Full-malaria2004: an enlarged database for comparative studies of fulllengthcDNAs of malaria parasites, Plasmodium species.Nucleic Acids Res. 2004 Jan 1;32(Database issue):D334-8.Suzuki et al. Construction and characterization of a fulllength-enriched and a 5'-end-enriched cDNA library. Gene1997 200: 149-156.表 1species 症 状 ゲノムサイズ GC 含 量 ステージPlasmodium falciparum 熱 帯 熱 マラリア 23Mb 19% 赤 内 型 ・ 生 殖 母 体Plamodium vivax 三 日 熱 マラリア 30Mb 30% 赤 内 型 ・ 生 殖 母 体Plasmodium yoelii ネズミマラリア 23Mb 23% 赤 内 型 ・ 生 殖 母 体Plasmodium berghei ネズミマラリア 23Mb 23% 赤 内 型 ・ 生 殖 母 体Toxoplasma gondii 水 頭 症 65Mb 65% タキゾイトCryptosporidium parvum 下 痢 症 9Mb 30% スポロゾイトマイクロインジェクションによるゾウリムシの 低 温 耐 性 細 胞 質 因 子 の 研 究佐 々 木 大 , 芳 賀 信 幸 ( 石 巻 専 修 大 学 ・ 理 工 )Microinjection studies on the cytoplasmic factors responsible for low-temperaturetolerance in Paramecium caudatumHajime Sasaki, Nobuyuki Haga (Dept. of Biol. Engin., Ishinomaki Senshu Univ.)SUMMARYIn previous studies we have found remarkable differences in the ability of wild stock of P. caudatum to surviveunder low-temperature conditions. To test the presence of cytoplasmic factors that are associated with low-temperaturetolerance, we performed cytoplasm transplantation experiments among stocks showing high survival rate at 5°C andstocks showing low survival rate. As a result, we have found an increase of survival rate in low survival stocks after