受精後第二有糸分裂時の核膜孔複合体偏在が繊毛虫テトラヒメナの 核 ...

82 原 生 動 物 学 雑 誌 第 42 巻 第 1 号 2009 年配 → 複 製 → 分 配 」サイクルで, 複 製 が1 回 重 複 して「 複 製 → 複 製 → 分 配 → 複 製 → 分 配 ・・」となると2 倍体 の 無 性 生 殖 サイクルになる。 一 方 2 倍 体 の 無 性 生 殖サイクルで 分 配 が1 回 重 複 して「 複 製 → 分 配 → 複 製 →分 配 → 分 配 」となると2 倍 体 が1 倍 体 化 する。1 倍 体 と2 倍 体 の 無 性 生 殖 過 程 が 交 替 する 生 活 史 をもつ 生 物 (コケ,シダ, 褐 藻 類 , 紅 藻 類 , 有 孔 虫 類など)では,1 倍 体 が2 倍 体 化 するときが 受 精 であり,2 倍 体 が1 倍 体 化 するときが 減 数 分 裂 である。すなわち「1 倍 体 の2 倍 体 化 と2 倍 体 の1 倍 体 化 」は, 最も 原 始 的 な 形 の「 受 精 と 減 数 分 裂 」というパターンの 原 型 を 内 包 している 2) 。 言 い 換 えれば「 受 精 と 減 数分 裂 」が 有 性 生 殖 の 本 質 であり, 有 性 生 殖 には 元 来ゲノムの 多 様 性 をもたらすような 過 程 は 含 まれていなかったと 考 える。安 全 対 策 としての2 倍 体 化 が, 異 性 1 倍 体 細 胞 の 融合 ( 受 精 )の 形 をとるようになり,2 倍 体 の1 倍 体 化( 減 数 分 裂 ) 過 程 で 組 み 換 えが 起 こるようになったことで, 初 めて 有 性 生 殖 がゲノムの 多 様 化 を 保 証 するようになった。2 倍 体 化 機 構 として「1 倍 体 細 胞 同士 の 細 胞 融 合 」が「ゲノム 複 製 」よりも 後 の 出 来 事であるとみなす 理 由 は, 前 者 は 細 胞 融 合 のための 分子 的 仕 組 みだけでなく, 自 家 不 和 合 性 を 克 服 するための 仕 掛 けなど,ゲノムの 複 製 という 太 古 からの 様式 に 比 べてはるかに 複 雑 な 過 程 が 含 まれるからである。2 倍 体 中 心 の 生 活 史 に1 倍 体 が 短 く 介 在 する 後 生動 物 や 種 子 植 物 での 有 性 生 殖 は「( 性 分 化 と 組 み 換えを 伴 う) 減 数 分 裂 と 受 精 」であり,1 倍 体 化 は 性 成熟 を 意 味 し, 性 成 熟 までのタイミングを 計 ること( 性 的 未 熟 期 をもつこと)が2 倍 体 生 物 にとっての 生活 戦 略 になったとき, 寿 命 と 有 性 生 殖 のトレードオフが 確 立 したと 考 える。 繊 毛 虫 類 も 基 本 的 にはこの部 類 に 入 るが,ゲノムの 多 様 化 を 保 証 しない 有 性 生殖 を 保 持 している 点 で 特 異 な 位 置 を 占 める。[ 文 献 ]1) Maynard Smith, J. (1998) Evolutionary Genetics, 2ndEdn. Oxford Univ. Press, Oxford.2) Takagi, Y. (1999) Clonal life cycle of Paramecium inthe context of evolutionally acquired mortality. In:Cell Immortalization (ed. Macieira-Coelho, A.) pp.81-101. Springer, Berlin.( 1受 精 後 第 二 有 糸 分 裂 時 の 核 膜 孔 複 合 体 偏 在 が 繊 毛 虫 テトラヒメナの核 分 化 を 決 定 する武 内 史 英 1 , 岩 本 政 明 1 , 平 岡 泰 1,2 1,3, 原 口 徳 子情 報 通 信 研 究 機 構 神 戸 研 究 所 未 来 ICT 研 究 センターバイオICTグループ, 2 大 阪 大 学 大 学 院生 命 機 能 研 究 科 , 3 大 阪 大 学 大 学 院 理 学 研 究 科 )Biased distribution of the nuclear pore complex after second postzygotic nucleardivision determine nuclear differentiation in Teterahymena thermophilaFumihide BUNAI 1 , Masaaki IWAMOTO 1 , Yasushi HIRAOKA 1, 2 and Tokuko HARAGUCHI 1, 3( 1 Kobe Advanced ICT Research Center, National Institute of Information and Communications Technology,2 Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka University, 3 Graduate School of Science,Osaka University)SUMMARYThe ciliated protozoan, Tetrahymena thermophila, has two functionally and structurally distinct nucleiin a single cell. Although understanding such “nuclear dimorphism” is a central issue, unique to ciliatebiology, the molecular bases of nuclear differentiation have remained largely unknown. because ofthe technical difficulties of monitoring a temporal sequence of highly-dynamic, complex nuclear events ina rapidly moving organism. Here we report a method of live-cell fluorescence imaging to monitor dynamicbehavior of specific molecules in living Tetrahymena cells undergoing nuclear differentiation. Wehave also developed a technique of correlative light and electron microscopy by which molecule-specificfluorescence images can be correlated with ultrastructural electron microscopy images. Using these imagingtechnologies, we examined dynamic behavior of the nuclear pore complex (NPC) and nuclear membranesduring sexual reproduction, including nuclear differentiation. We found that the NPCs moved towardthe anterior side of the nuclear envelope during the second postzygotic mitosis, generating distinguishablenuclei; one is NPC-rich, and the other is NPC-poor. Live-cell imaging further showed that the

Jpn. J. Protozool. Vol. 42, No. 1. (2009)83NPC-rich and NPC-poor nuclei were destined to become the new macronucleus and micronucleus, respectively.These results suggest that the NPCs, or components of the NPC, may contribute to nucleardifferentiation through regulation of selective nuclear transport.[ 目 的 ] 繊 毛 虫 テトラヒメナは 大 核 と 小 核 という 機 能と 構 造 の 異 なる2 種 類 の 核 をもつ。これらの 核 は 接合 で 形 成 される 一 つの 受 精 核 より 分 化 する。 受 精 核は2 回 の 有 糸 分 裂 を 経 て4つの 核 に 分 裂 し, 細 胞 前端 に 位 置 した2 核 は 大 核 に, 後 端 に 位 置 した2 核 は 小核 に 分 化 する。この 核 分 化 は 同 一 の 細 胞 質 中 で 行 われるにも 関 わらず,TWI1 蛋 白 質 やPDD 蛋 白 質 などが大 核 になる 予 定 の 核 ( 大 核 原 基 )へ 選 択 的 に 輸 送 されることによって 大 核 分 化 を 象 徴 するDNA 再 編 成 がおこなわれる(1)。このことから 核 分 化 では 核 内輸 送 機 構 が 重 要 な 働 きがあると 考 えられるが, 大 核分 化 を 決 定 づける 分 子 やそのメカニズムは 分 かっていない。そこでまず 我 々はテトラヒメナの 核 分 化 を決 定 する 分 子 とそのメカニズムを 研 究 するために 接合 ・ 核 分 化 過 程 での 細 胞 核 の 挙 動 を 生 きた 細 胞 で 追跡 できる 蛍 光 ライブセルイメージング 技 術 を 開 発 した。この 方 法 を 用 いることにより 核 分 裂 および 核 分化 過 程 での 核 構 造 の 変 化 を,GFP 融 合 蛋 白 質 や 蛍 光染 色 したDNAの 局 在 を 指 標 にして 調 べることができる。さらにこの 分 子 特 異 的 イメージングに 加 えてliveCLEM 法 を 開 発 した。この 方 法 は, 上 述 した 蛍 光 ライブセルイメージング 法 を 用 いて 観 察 した 同 一 細 胞を 電 子 顕 微 鏡 で 観 察 するものであり,これによって分 子 特 異 的 な 局 在 とその 経 時 変 化 に 加 え, 核 膜 などの 膜 構 造 , 核 膜 孔 複 合 体 , 微 小 管 などの 細 胞 超 微 細構 造 を 観 察 することができる。 本 研 究 は,これらの解 析 方 法 を 用 いてテトラヒメナの 核 分 化 過 程 でおこる 細 胞 ( 核 ) 構 造 の 変 化 を 解 析 し, 核 分 化 に 関 与 する 分 子 ・ 構 造 ・ 仕 組 みを 解 明 することを 目 的 とするものである。[ 材 料 と 方 法 ] 繊 毛 虫 Tetrahymena thermophila 細 胞 から, 核 膜 孔 複 合 体 蛋 白 質 の 一 つであるseh1のcDNAをRT-PCR 法 で 増 幅 ・ 分 取 し,カドミウムでGFPの 発 現を 誘 導 できるベクターpIGF-1へクローニングした。これを 接 合 細 胞 (CU427×CU428)へエレクトロポレーションで 導 入 し,GFP-Seh1 発 現 株 をパロモマイシンと 蛍 光 顕 微 鏡 観 察 により 選 別 した。このGFPseh1発 現 株 と 野 生 型 CU428 株 を 掛 け 合 わせて 接 合 を誘 導 しライブセルイメージングを 行 った: 細 胞 はガラスボトムディッシュにアガロースで 包 埋 し 蛍 光 顕微 鏡 で 観 察 した。Live CLEM 法 を 行 う 場 合 は,ライブセルイメージングした 後 4%グルタルアルデヒドで固 定 ,エタノールによる 脱 水 , 樹 脂 (Epon812) 置 換により 電 子 顕 微 鏡 用 試 料 を 作 製 し, 超 薄 切 片 を 電 子顕 微 鏡 で 観 察 した。 得 られた 蛍 光 顕 微 鏡 画 像 と 電 子顕 微 鏡 画 像 の 相 関 を 検 討 した。[ 結 果 ] 蛍 光 顕 微 鏡 観 察 の 結 果 , 栄 養 増 殖 過 程 では,GFP-seh1は 大 核 と 小 核 の 核 膜 に 局 在 することがわかった。 接 合 過 程 では,GFP-seh1は, 減 数 分 裂 前 期( 三 日 月 期 )から 減 数 分 裂 期 に 存 在 する4つの 小 核全 ての 核 膜 に 局 在 するが, 核 交 換 期 になると,4つの 小 核 のうち 選 択 された1つがさらに 分 裂 してできた2つの 核 ( 移 動 核 と 静 止 核 )にのみ 局 在 し, 選 択されず 退 化 する 運 命 の 小 核 ではその 蛍 光 が 消 失 していくことがわかった。 核 交 換 後 の 受 精 によってできた 受 精 核 では, 受 精 後 の 第 一 有 糸 分 裂 までは,2つの 細 胞 核 に 均 等 にGFP-seh1が 分 配 された。また 減 数分 裂 中 や 受 精 後 の 有 糸 分 裂 中 では,GFP-seh1は 伸 長する 小 核 の 両 端 に 強 く 局 在 した。しかし, 受 精 後 の第 二 有 糸 分 裂 途 中 からGFP-seh1は 新 大 核 側 で 強 く,新 小 核 側 で 弱 い 局 在 を 示 した。これらの 核 の 核 膜 を電 子 顕 微 鏡 で 観 察 し, 新 大 核 と 新 小 核 に 局 在 する 核膜 孔 複 合 体 の 数 を 定 量 した 結 果 , 新 大 核 側 に80% 以上 が 偏 在 することが 分 かった。[ 考 察 ] 蛍 光 と 電 子 顕 微 鏡 観 察 から, 受 精 後 の 第 二 分裂 は,2つの 核 に 核 膜 孔 複 合 体 が 不 均 等 に 分 配 されることが 明 らかとなった。この 第 二 分 裂 直 後 に 起 こる 核 分 化 では, 新 大 核 になる 核 では,ゲノムDNAの再 編 成 (DNA elimination)が 起 こることが 知 られている(1)。このゲノムDNA 再 編 成 は, 厳 密 に 新 大核 でのみ 起 こり,この 時 期 に 新 大 核 特 異 的 に 局 在 するTWI1 蛋 白 質 やPDD 蛋 白 質 が 関 与 することが 知 られている(1)。 従 って,これらの 蛋 白 質 は, 厳 密 に新 大 核 にのみ 核 移 行 されるものと 予 想 される。 今回 , 我 々が 発 見 した 第 二 分 裂 での 核 膜 孔 複 合 体 の 極端 な 不 均 等 分 裂 は, 直 後 に 起 こる 核 分 化 に 必 要 な 蛋白 質 などの 分 子 を 選 択 的 に 新 大 核 に 輸 送 するための構 造 基 盤 であると 思 われる。 面 白 いことに, 別 の 繊毛 虫 であるゾウリムシでは 受 精 後 の 第 三 分 裂 直 後に, 核 分 化 がおこることが 示 されている(2,3)。この 違 いは, 核 膜 孔 複 合 体 の 不 等 分 配 の 起 こる 時 期 が,この2つの 生 物 で 異 なっていることを 示しているかもしれない。もしそうならば, 核 膜 孔 複合 体 は, 繊 毛 虫 の 核 分 化 に 決 定 的 な 役 割 を 果 たすことを 示 唆 するものである。[ 文 献 ]1) Chalker D.L. (2008) Biochim Biophys Acta. PMID:18706458.2) Mikami, K. (1980) Develop. Boil. 80, 46-55.3) Grandchamp, S., Beisson, J. (1981) Develop. Boil. 81,336-341.