Amoeba proteusの収縮胞の水集積におけるアクアポリンの役割 Role of ...

54 原 生 動 物 学 雑 誌 第 40 巻 第 1 号 2007 年This study has been carried out under collaboration withDr. Koichi Ito (Department of Basic Medical Sciences,Institute of Medical Science, The University of Tokyo).[References]1) Ito, K., Frolova, L., Seit-Nebi, A., Karamyshev, A.,Kisselev, L., Nakamura, Y. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 99, 8494-8499.2) Kervestin, S., Frolova, L., Kisselev, L., Jean-Jean, O.(2001) EMBO Report, 2, 680-684.3) Kim, O. T. P., Yura, K., Go, N., Harumoto, T. (2005)Gene, 346, 277-286.4) Song, H., Mugnier, P., Das, A.K., Webb, H.M., Evans,D.R., Tuite, M.F., Hemmings, B.A., Barford, D. (2000)Cell 100, 311-321.Amoeba proteusの 収 縮 胞 の 水 集 積 におけるアクアポリンの 役 割西 原 絵 里 , 横 田 悦 雄 , 新 免 輝 男 , 園 部 誠 司( 兵 庫 県 立 大 学 大 学 院 ・ 生 命 理 学 研 究 科 )Role of aquaporin in the contractile vacuole of Amoeba proteusEri NISHIHARA, Etsuo YOKOTA, Teruo SHIMMEN, and Seiji SONOBE(Department of Life Science, Graduate School of Life Science, University of Hyogo)SUMMARYBased on the measurement of water permeability, we have hypothesized the presence of aquaporin in the membraneof the contractile vacuole (CV) of Amoeba proteus. In the present study, we cloned an aquaporin gene from A.proteus (ApAQP), which encodes a protein composed of 295 amino acids. The protein has six putative transmembranedomains and two NPA (Asn-Pro-Ala) motifs, which are conserved among aquaporins of other species. Expression analysisusing Xenopus oocytes demonstrated that the gene encodes an aquaporin that is functional as a water channel. Immunofluorescencemicroscopy with anti-ApAQP antibody showed the localization of ApAQP on the CV membrane andthe vesicles around CV. This is the first success in explaining the high water permeability of the CV membrane.[ 目 的 ] すべての 生 物 において 細 胞 の 浸 透 圧 調 節 は 大変 重 要 であり, 生 物 種 によってそれぞれの 浸 透 圧 調節 機 構 が 進 化 している。 淡 水 産 原 生 動 物 であるAmoeba proteusは 収 縮 胞 と 呼 ばれる 特 殊 な 細 胞 小 器 官によって 浸 透 圧 調 節 を 行 う。 収 縮 胞 は 細 胞 内 へ 流 入した 水 を 細 胞 外 へ 排 出 する 役 割 を 持 ち, 細 胞 の 体 積を 維 持 するために 必 要 不 可 欠 である。しかしながら, 収 縮 胞 への 水 の 集 積 機 構 は 全 く 解 明 されていない。 収 縮 胞 内 への 水 の 集 積 機 構 を 調 べるために,Amoeba proteusから 取 り 出 した 収 縮 胞 を 用 いて 解 析 した。さらに, 水 チャネルであるアクアポリンの 関 与が 示 唆 されたため,A. proteusからアクアポリン 遺 伝子 の 単 離 を 試 み, 収 縮 胞 との 関 連 を 調 べた。[ 材 料 と 方 法 ] 材 料 にはAmoeba proteus を 用 い,Tetrahymena pyriformisを 餌 として 与 えた。 実 験 には2日 以 上 飢 餓 状 態 にした 細 胞 を 用 いた。等 張 液 (1)で20 分 間 処 理 した 細 胞 をスライドガラスとカバーガラスの 間 に 挟 み, 押 しつぶして 収 縮 胞 を単 離 した(2)。この 収 縮 胞 周 辺 に 高 張 液 を 灌 流 し, 続

Jpn. J. Protozool. Vol. 40, No. 1. (2007)55いて, 等 張 液 を 灌 流 した。その 際 の 収 縮 胞 の 体 積 変化 を 測 定 した。さらに,この 結 果 より, 収 縮 胞 膜 の水 透 過 係 数 を 求 めた。分 子 学 的 手 法 を 用 いてA. proteusからにアクアポリン 遺 伝 子 (ApAQP)のクローニングを 行 った。 続 いて,ApAQPをもとにアミノ 酸 配 列 を 決 定 し,C 末 側に 対 するポリクローナル 抗 体 を 作 製 した。A. proteusのtotalタンパク 質 を 用 いて 抗 ApAQP 抗 体 に 対 するウエスタンブロットを 行 った。さらに,この 抗 体 を 用いて 細 胞 染 色 を 行 い, 分 布 を 調 べた。[ 結 果 と 考 察 ] 収 縮 胞 内 への 水 集 積 機 構 を 調 べるために, 単 離 した 収 縮 胞 周 辺 の 外 液 の 浸 透 圧 を 変 化 させ,その 時 の 体 積 変 化 を 調 べた。 高 張 液 を 灌 流 すると,その 体 積 は 急 速 に 減 少 した。 続 いて, 等 張 液 を灌 流 すると, 膨 張 したが,もとの 体 積 には 戻 らず 破裂 した。このことから, 収 縮 胞 膜 が 半 透 性 であることがわかった。Parameciumにおいて 収 縮 胞 内 の 無 機イオン 活 性 が 高 いことが 報 告 されている(3)。これらのことより, 浸 透 圧 差 を 利 用 した 収 縮 胞 内 への 水 の集 積 が 示 唆 される。さらに, 前 述 した 結 果 より, 収縮 胞 膜 の 水 透 過 係 数 を 求 めると,1.06 (μm/sec・OsM)であった。これは 赤 血 球 やカエル 卵 における 細 胞 膜の 水 透 過 係 数 に 近 い 値 であった(4)。これらの 細 胞 膜には 水 チャネルであるアクアポリンが 存 在 することが 知 られており,A. proteusの 収 縮 胞 の 膜 にもアクアポリンが 存 在 する 可 能 性 が 示 唆 された。そこで, 分 子 学 的 手 法 を 用 いてA. proteusからアクアポリン 遺 伝 子 ( 以 下 ApAQP)の 単 離 を 試 みた。その 結 果 ,AQP 様 遺 伝 子 が 得 られ,それから 推 測 されるアミノ 酸 配 列 にはAQPに 特 異 的 に 存 在 するNPAモチーフを2ヶ 所 もち,6 回 膜 貫 通 型 タンパク 質 であることがわかった。さらに, 単 離 したApAQPのmRNAを 顕 微 注 射 したXenopus 卵 において, 水 輸 送 活 性 が 上昇 したことから, 今 回 単 離 した 遺 伝 子 は 水 チャネルとして 機 能 するAQPをコードしていることが 示 された。さらにこのApAQPのC 末 側 の 配 列 をもとに 抗 体を 作 製 し, 免 疫 学 的 解 析 を 行 った。 抗 ApAQP 抗 体 を用 いてイムノブロットを 行 った 結 果 ,32 kDa 付 近 にシングルバンドが 確 認 できた。これはApAQP 遺 伝 子から 推 定 される 分 子 量 と 一 致 した。さらに, 抗ApAQP 抗 体 を 用 いて 細 胞 染 色 を 行 った 結 果 , 収 縮 胞膜 のみに 蛍 光 が 確 認 できた。これらのことらか,ApAQPは 収 縮 胞 への 水 の 集 積 に 関 与 していることが考 えられた。[ 文 献 ]1. Shimmen, T. and MacRobbie, E. A. C. (1987) PlantCell Physiol., 28: 1023-10372. Nishihara, E., Shimmen, T., and Sonobe, S. (2004) CellStruct. Funct., 29: 85-903. Stock, C., Gronlien, H.K., Allen, R.D., and Naitoh, Y.(2002) J. Cell Sci., 115: 2339-23484. Tazawa, M., and Shimmen, T. (1981) Regulation ofwater and ions. Kumazawa, K. Asakusashoten, TokyoJapan. p.p. 18-77.太 陽 虫 Actinophrys solにおけるグルカン 結 合 タンパク 質 GP40のcDNAクローニング角 田 宗 一 郎 , 洲 崎 敏 伸 ( 神 戸 大 ・ 理 ・ 生 物 )cDNA cloning of a putative glucan binding protein GP40from the heliozoon Actinophrys solSoichiro KAKUTA and Toshinobu SUZAKI (Dept. Biol., Fac. Sci., Kobe Univ.)SUMMARY