テトラヒメナを用いたミトコンドリア活性化因子の探索とその生理効果 ...

24 原 生 動 物 学 雑 誌 第 40 巻 第 1 号 2007 年在 しない。もし 外 来 の CrK と PCr を 繊 毛 基 部 から 与えて 内 在 の PArg シャトルと 同 等 の 繊 毛 打 頻 度 上 昇 がみられれば,CrK が 繊 毛 基 部 から 流 入 し 人 工 の ATP再 生 系 として 機 能 しうることが 証 明 できる。そこで,ATP のみで 再 活 性 化 したインタクトシートの 繊毛 に ATP に 加 え PCr 及 びウサギ 筋 肉 由 来 の CrK(Roche 社 製 )を 含 む 再 活 性 化 溶 液 を 灌 流 して, 繊毛 打 頻 度 の 変 化 を 調 べたところ,0.6 mg/ml の CrK によって 内 在 の PArg シャトル 機 構 と 同 等 の ATP 再 生効 果 を 得 られることが 分 かった。これは,CrK の 分子 量 81 kDa から 計 算 すると 約 7.4 μM であり,このことは,10 μM 程 度 の 濃 度 のキナーゼが 繊 毛 内 で 有 効に ATP を 再 生 しうることを 意 味 する。また,シートを CrK を 含 まない 溶 液 で 洗 浄 すると CrK は 繊 毛 内 から 流 出 してきたことから,CrK は 拡 散 により 繊 毛 内に 流 入 ・ 流 出 すると 考 えられる。しかし,CrK の 流入 には ATP の 流 入 より 長 い 時 間 を 要 したことから,ATP の100 倍 以 上 の 分 子 量 の CrK は 繊 毛 基 部 の 開 口部 から 流 入 することができるものの 繊 毛 内 への 拡 散にはかなりの 抵 抗 があると 考 えられる。[ 文 献 ]Noguchi, M., Sawada, T., and Akazawa, T. (2001) ATPregeneratingsystem in the cilia of Paramecium caudatum.J. Exp. Biol. 204, 1063-1071Pazour GJ and Rosenbaum JL (2002) Intraflagellar transportand cilia-dependent diseases. Trends in Cell Biol.,12, 551-555テトラヒメナを 用 いたミトコンドリア 活 性 化 因 子 の 探 索 とその 生 理 効 果藤 原 隆 史 , 小 澤 哲 夫 , 沼 田 治 ( 筑 波 大 学 ・ 生 命 環 境 科 学 研 究 科 )Search of mitochondrial activation factors using Tetrahymena and study on theirphysiological effectsTakashi FUJIHARA, Tetsuo OZAWA, Osamu NUMATA(Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba)SUMMARYUsing Tetrahymena and rhodamine 123, we developed a simple method of measuring mitochondrial membranepotential. We then examined whether several catechins, oolong tea and black tea could increase mitochondrial membranepotential. We found that the high-molecular-weight polyphenols in both teas, and several catechins, could increase mitochondrialmembrane potential and activate the mitochondria. The high-molecular-weight polyphenol was referred asMAF (mitochondrial activation factor). The MAFs were purified from oolong tea and black tea by a combination ofsolvent extraction and Toyopearl HW-40F column chromatography. The MAFs have gallic acid residues, procyanidinstructures and bonding between B ring and B ring of catechin group. The MAF isolated from oolong tea increased themitochondrial membrane potential and ATP content in Tetrahymena and mouse sperm, and elevated their swimmingvelocity. These results suggest that the MAF increases ATP synthesis through activation of oxygen respiration in themitochondria and that the MAF is a first respiratory activator. Since swimming velocity depends on ciliary and flagellarmotility, the MAF directly or indirectly activates ciliary and flagellar movement. When MAF was administered to diabeticmodel mice on a daily basis, their blood sugar level decreased to 80% of the previous level and the occurrence offatty liver was reduced.

Jpn. J. Protozool. Vol. 40, No. 1. (2007)25[ 目 的 ] ミトコンドリアは 細 胞 が 利 用 するほとんどのATP を 生 産 する。 高 エネルギー 電 子 が 電 子 伝 達 系 を 移動 する 過 程 で 水 素 イオンがミトコンドリア・マトリックスから 内 膜 と 外 膜 の 膜 腔 にくみ 出 される。その 結果 , 内 膜 の 両 側 に 水 素 イオンの 電 気 化 学 的 勾 配 ができ,ミトコンドリア 膜 電 位 が 生 じる。 水 素 イオンが 膜腔 からマトリックスに 戻 る 際 に 内 膜 上 にある ATP 合成 酵 素 によって ADP+Pi から ATP が 産 生 される。このようなミトコンドリアの 酸 素 呼 吸 を 阻 害 する 物 質 はKCN,antimycin A,rotenone,Na 2 S,NaN 3 ,などが 知られている。しかし,ミトコンドリアを 活 性 化 する 物質 についてはほとんど 知 られていない。そこで 我 々は環 境 中 からミトコンドリアの 活 性 を 上 昇 させる 物 質を 探 索 するためにテトラヒメナとローダミン123を 用いてミトコンドリア 活 性 化 因 子 の 簡 便 な 探 索 法 を 開発 した。この 方 法 を 用 いて,カテキン 類 ,ウーロン 茶 ,紅 茶 などがミトコンドリアを 活 性 化 するかどうか 検討 し,ウーロン 茶 や 紅 茶 などの 発 酵 茶 にミトコンドリア 活 性 化 因 子 (MAF : mitochondrial activation factors)が 存 在 することを 発 見 した。 本 研 究 では MAF の 分 離法 , 性 状 , 生 理 活 性 などについて 検 討 した。[ 材 料 と 方 法 ] 細 胞 としては Tetrahymena thermophilaとマウス 精 子 を 用 いた。ミトコンドリアの 活 性 化 は膜 電 位 ,ATP 産 生 量 , 酸 素 消 費 量 を 測 定 して 調 べた。ミトコンドリア 膜 電 位 の 上 昇 については,ローダミン123の 緑 色 蛍 光 強 度 が 膜 電 位 の 大 きさに 比 例 しているので,ミトコンドリア 膜 電 位 をローダミン123の 生 体 染 色 によって 定 量 的 に 測 定 した。MAF の 分 離はウーロン 茶 あるいは 紅 茶 抽 出 物 を 酢 酸 エチルと 酸性 ブタノールで 溶 媒 抽 出 し, 酸 性 ブタノール 画 分 をToyopearl HW-40F カラムにかけ, 吸 着 した MAF をアセトンで 溶 出 して 分 離 した。MAF の 構 造 は 熱 分 解クロマトグラフィーなどを 用 いて 明 らかにした。MAF の 生 理 効 果 は2 型 糖 尿 病 モデルマウス(BSK.Cg-m+/+Lep/Jcl)への MAF の 腹 腔 注 射 によって調 べた。[ 結 果 と 考 察 ] 我 々が 開 発 したミトコンドリア 活 性 化因 子 の 探 索 法 はローダミン123による 生 体 染 色 によってサンプルで 処 理 したテトラヒメナのミトコンドリア 膜 電 位 の 上 昇 を 定 量 的 に 測 定 するものである。 作 業は 簡 単 で, 再 現 性 も 高 い。この 方 法 を 用 いて,カテキン 類 や 発 酵 茶 成 分 のミトコンドリア 活 性 化 能 を 調 べた。その 結 果 ,エピカテキンガレート,エピガロカテキンガレート,そして 発 酵 茶 に 含 まれる 高 分 子 ポリフェノール(MAF)にミトコンドリア 活 性 化 能 があることが 分 かった。 特 に MAF の 活 性 は 顕 著 であった。MAF はテトラヒメナのミトコンドリアの 膜 電 位 ,ATP 産 生 量 ,そして 酸 素 消 費 量 を 上 昇 させた。MAF の構 造 解 析 の 結 果 ,MAF はカテキンが 酸 化 重 合 した 高分 子 ポリフェノールであること, 分 子 量 は9,000~18,000であること,カテキンが 持 つ A,B,C の3つの環 のうちの B 環 同 士 の 結 合 を 分 子 内 に 持 つことなどが 明 らかになった。また,MAF はマウス 精 子 や 培 養 細胞 のミトコンドリア 膜 電 位 を 上 昇 させ, 種 を 超 えてミトコンドリアを 活 性 化 する 能 力 を 持 つことが 分 った。これらの 結 果 は MAF がミトコンドリアの 酸 素 呼 吸 を活 性 化 する 世 界 初 の 物 質 であることを 示 している。 現在 ,MAF によるミトコンドリア 活 性 化 の 分 子 機 構 に関 して,MAF 処 理 によって 発 現 量 が 顕 著 に 変 動 する遺 伝 子 の 探 索 などを 行 い 検 討 している。MAF はテトラヒメナの 繊 毛 運 動 を 活 性 化 させ 遊 泳速 度 を35% 上 昇 させた。この 結 果 から,MAF の 精 子 鞭毛 運 動 に 対 する 効 果 を 調 べた。マウス 精 子 を 室 温 で90分 間 置 くと, 遊 泳 速 度 が4 分 の1に 減 少 する。このような 精 子 に MAF を 処 理 すると 遊 泳 速 度 が2 倍 近 く 上 昇した。これらの 結 果 は MAF が 繊 毛 運 動 や 鞭 毛 運 動 を活 性 化 することを 示 唆 している。次 にMAF の 生 体 内 での 生 理 作 用 を 調 べるために,2型 糖 尿 病 モデルマウス(BSK.Cg-m+/+Lep < db >/Jcl)の 腹 腔 に90 μg ずつ,MAF を70 日 間 注 射 した。その 結果 , 血 糖 値 が20% 低 下 し, 脂 肪 肝 の 発 症 が 抑 制 されることが 分 かった。これらの 結 果 から, 我 々は MAF がミトコンドリアを 活 性 化 することによって, 糖 代 謝 を 促進 して 血 糖 値 を 低 下 させ,また 脂 肪 代 謝 を 促 進 して 脂肪 肝 の 発 症 を 抑 制 させると 考 えた。すなわち MAF によるミトコンドリア 活 性 化 のメカニズムを 明 らかにすることは, 生 物 学 的 な 意 義 があるばかりではなく,糖 尿 病 や 脂 肪 肝 などの 生 活 習 慣 病 の 予 防 や 治 療 にも道 を 開 くものである。以 上 の 研 究 結 果 から, 我 々が 開 発 したテトラヒメナとローダミン123を 用 いたミトコンドリア 活 性 化 因 子の 探 索 法 は, 応 用 面 で 威 力 を 発 揮 することが 明 らかに

26 原 生 動 物 学 雑 誌 第 40 巻 第 1 号 2007 年なった。 今 後 ,この 方 法 を 用 いて, 新 たなミトコンドリア 活 性 化 因 子 の 探 索 を 進 めたいと 考 えている。感 染 初 期 過 程 でのクロレラのミドリゾウリムシに 対 する 感 染 能 は食 胞 から 脱 出 したクロレラが 細 胞 表 層 に 定 着 できるかどうかに 依 存 する児 玉 有 紀 1,2 , 藤 島 政 博3( 1 山 口 大 ・ 院 理 工 ・ 自 然 共 生 科 学 専 攻 , 2 学 振 DC2, 3 山 口 大 ・ 院 理 工 ・ 環 境 共 生 )Infectivity of Chlorella species for the ciliate Paramecium bursaria is based on theirability to localize beneath the host cell membrane after escapingfrom the host digestive vacuole in the early infection processYuuki KODAMA 1,2 and Masahiro FUJISHIMA 3( 1 Dept. Natural Sci. and Symbiosis, Grad. School of Sci. and Engineering, Yamaguchi Univ.2Res. Fellow of JSPS DC2,3Dept. Env. Sci. and Engineering, Grad. School of Sci. and Engineering, Yamaguchi Univ.)SUMMARYParamecium bursaria cells harbor several hundred symbiotic algae in their cytoplasm. Algae-free cells can bereinfected through their digestive vacuoles with algae isolated from algae-bearing cells or with cultivated Chlorella species.To determine the relationship between the infectivity of various Chlorella species and the nature of their cell wallcomponents, algae-free P. bursaria cells were mixed with 15 strains of cultivated Chlorella and observed for the establishmentof endosymbiosis. Only 2 free-living Chlorella strains were maintained in the host cells. Infection-incapablestrains could escape from the host digestive vacuole but failed to localize beneath the host cell membrane and were eventuallydigested. Labeling of their cell walls with 3 lectins, with or without pre-treatment with 0.4 N NaOH, showed norelationship between their infectivity and stainability with these lectins. Our results indicate that the infectivity of Chlorellaspecies for P. bursaria is not based on the sugar residues on their cell wall or the alkali-insoluble part of the cell wallcomponents, but on their ability to localize just beneath the host cell membrane after escaping from the host digestivevacuole.[ 目 的 ] ミドリゾウリムシとクロレラの 細 胞 内 共 生 は 古 くから 知 られている 相 利 共 生 の 例 であるが,それぞれ単 独 でも 生 活 できる 能 力 を 維 持 している。 従 ってミドリゾウリムシとクロレラの 細 胞 内 共 生 は, 真 核 細胞 が 葉 緑 体 を 獲 得 しようとする 過 渡 的 段 階 にあると考 えることができる。クロレラを 除 去 したミドリゾウリムシに 共 生 藻 を 再 感 染 させることは 容 易 であり, 自 由 生 活 のクロレラも 共 生 することが 報 告 されている 1, 2) 。Takeda et al. (1998) は,クロレラの 細 胞 壁をアルカリ 溶 液 で 処 理 して 残 る 不 溶 性 画 分 (rigidwall)の 糖 組 成 が, 共 生 可 能 なクロレラ 種 はグルコサミン 型 であり, 不 可 能 な 種 はグルコース&マンノース 型 であると 報 告 している。さらに,ミドリゾウリムシの 共 生 藻 をレクチンの 一 種 であるConcanavalin A (Con A)で 処 理 した 時 に,コントロールの 未 処 理 の 場 合 と 比 較 して 再 感 染 率 が 低 下 することから,クロレラの 細 胞 壁 の 表 面 に 存 在 する 糖 が 共生 藻 の 認 識 に 必 要 であるとの 報 告 がある 4-6) 。そこで,アルカリ 溶 液 処 理 を 行 った 各 種 クロレラの 細 胞壁 と 処 理 しなかった 細 胞 壁 に 対 する 蛍 光 標 識 レクチ