講演要旨 - 日本原生動物学会

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)9型 原 虫 の 重 複 感 染 が 普 通 に 見 られ、 新 しく 出 現 した多 型 を 新 たな 感 染 による 外 部 由 来 の 多 型 と 明 確 に 区別 することが 容 易 でないからである。この 点 において 私 達 は 南 西 太 平 洋 バヌアツの 熱 帯 熱 マラリア 原 虫集 団 に 関 心 を 持 っている。バヌアツでは 島 嶼 間 の 人の 移 動 が 限 られ、また 異 なる 遺 伝 子 型 の 重 複 感 染 もまれである(2)。こうしたマラリア 疫 学 的 状 況 は 新 規に 発 生 した 抗 原 多 型 の 検 出 に 適 している。 本 研 究 ではバヌアツ7 島 の 原 虫 集 団 について、3つの 主 要 表面 抗 原 遺 伝 子 とクロロキン 耐 性 遺 伝 子 の 多 型 を 調 べた。 結 果 は 抗 原 遺 伝 子 におけるSNPs( 単 塩 基 多 型 )が 安 定 であることを 示 した。[ 材 料 と 方 法 ] 1996 年 から2002 年 にかけ、バヌアツの7 島 (Gaua, Santo, Malakula, Ambae, Pentecost,Ngua,Tanna)から 熱 帯 熱 マラリア 原 虫 234 株 を 採 取 し、そのDNAを 抽 出 した。 塩 基 配 列 決 定 は 直 接 シーケンス法 によった。 解 析 対 象 遺 伝 子 は msp1(メロゾイト 表面 タンパク1), msp2( 同 2), csp(スポロゾイト 表面 タンパク), pfcrt(クロロキン 耐 性 トランスポーター 遺 伝 子 )、 及 び、マイクロサテライトのCa 2+ -ATPase 第 2イントロン、TA40, TA101で、それらの座 位 における 単 塩 基 多 型 及 び 反 復 配 列 多 型 を 調 べた。 遺 伝 子 座 位 間 における 対 立 遺 伝 子 どうしの 組 合わせ(non-random association)はχ 2 検 定 によった。[ 結 果 及 び 考 察 ] 1996 年 -1998 年 に4 島 (Gaua, Santo,Malakula, Pentecost)から 採 取 した 原 虫 株 の 解 析 結 果は 既 発 表 である(3)が、 同 一 の 島 々から2000 年 -2002 年にもサンプリングできたので、 結 果 を 合 わせて 報 告する。msp1 遺 伝 子 (n=178) について 4.9 kb でアラインメント 可 能 で、6 個 の 対 立 遺 伝 子 を 認 めた。それらの間 での SNPs の 違 いは 4-33 個 であった。msp2 遺 伝 子(n=228) では 291-321 bp のアライメントで5 個 の 対 立遺 伝 子 を 認 め、それらの 間 では 3-6 個 の 置 換 が 存 在した。csp 遺 伝 子 (n=218) では 687 bp のアライメントで2 個 の 対 立 遺 伝 子 があり、それらには2 個 の 置 換が 見 られた。3つの 抗 原 遺 伝 子 座 位 の 対 立 遺 伝 子 の多 くは 異 なる 複 数 の 島 嶼 に 分 布 していた。 一 方 、msp2, csp 遺 伝 子 では 反 復 配 列 の 反 復 数 の 違 いが 特 定の 島 嶼 だけに 見 られた。 以 上 の 観 察 は、バヌアツで認 められた 抗 原 遺 伝 子 における SNPs はバヌアツで発 生 したものでなく、 外 来 性 であること、 一 方 、 反復 数 の 多 型 はバヌアツにおいて 発 生 したことを 示す。バヌアツのクロロキン 耐 性 はすでに 1967 年 には 広まっていたので、pfcrt 遺 伝 子 多 型 を 調 べたところ、すべての 株 がパプアニューギニア 型 のクロロキン 耐性 SNPs を 示 した。3つのマイロサテライト 座 位 ではバヌアツにおいてそれぞれ3 個 の‘ 対 立 遺 伝 子 ’を 確 認 した。 抗 原 遺 伝 子 とマイクロサテライト 座 位を 合 わせた 計 6 座 位 による 多 座 位 遺 伝 子 型 の 解 析 、及 び、 連 鎖 不 平 衡 解 析 の 結 果 は、 島 嶼 によりマラリア 原 虫 集 団 の 遺 伝 的 構 成 の 度 合 いが 変 化 し、 減 数 分裂 期 における 染 色 体 交 雑 をほとんど 行 わないものから 頻 繁 に 行 うものに 分 かれた。以 上 の 結 果 から 次 のことが 結 論 できる。(i) 調 べた3つの 表 面 抗 原 遺 伝 子 では 少 なくとも 過 去 35 年 間 はバヌアツにおいて 新 規 の SNPs が 発 生 しておらず、抗 原 遺 伝 子 の SNPs が 安 定 である。(ii) バヌアツにクロロキン 耐 性 が 現 れる 以 前 に 存 在 していた 表 面 抗 原の 対 立 遺 伝 子 のあるものは 減 数 分 裂 期 における 染 色体 交 雑 によって、 現 在 まで 存 続 している。(iii) 表 面抗 原 における 反 復 配 列 の 多 型 は 数 年 という 比 較 的 短時 間 で 生 じる。本 研 究 は、バヌアツにおけるように 他 のマラリア流 行 地 域 から 隔 離 され、 遺 伝 子 プールの 限 られた 原虫 集 団 ではマラリアワクチンがより 効 果 的 であることを 示 唆 する。[ 文 献 ]1) Tanabe K, et al. (1987) J. Mol. Biol. 195: 273-287.2) Sakihama N, et al. (2001) Gene 279: 41-48.3) Tanabe K, et al. (2004) Science 303: 493.

10 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年葉 緑 体 を 持 たない 渦 鞭 毛 虫 ヤコウチュウの 遊 走 子 形 成福 田 康 弘 ( 金 沢 大 ・ 院 自 然 科 学 ・ 生 物 )Gametogenesis in the nonphotosynthetic dinoflagellate Noctiluca scintillansYasuhiro FUKUDA (Div. of Biol. Sci., Grad. Sch. of Natural Sci., Kanazawa Univ.)SUMMARYNoctiluca scintillans is one of the organisms responsible for harmful red tides and usually reproduces by binary fission.A small fraction of cells sporadically differentiate into a form for sexual reproduction and produce zoospores. Here,I describe the processes in zoospore formation, which is followed by gamete fusion. Initial signs of differentiation were achange of the cell shape (from eggplant-like to spherical), accompanied by loss of the tentacle, rod organ and cytosome.After this differentiation, the nucleus migrated towards the the cell surface, where it divided twice. Each of the resultantfour nuclei, together with some cytoplasm, protruded from the cell surface. Zoospores (gametes) were produced throughsuccessive divisions in the protrusions (nucleus–cytoplasm complex). During the divisions of zoospore formation, thenuclei seem to be connected to one another with a thin network of cytoplasm. Mature zoospores were biflagellate andhad a semi-spindle shape when they were released from the parental cell ghost. The released biflagellated zoosporesfused in pairs, but their subsequent fate is unknown. In the vegetative phase the cells are highly specialized, so they donot have the typical morphology of dinoflagellates, but the zoospores maintain dinoflagellate-like characteristics. Furtherstudy of the zoospores will shed new light on the evolution of dinoflagellates.[ 目 的 ] 葉 緑 体 を 持 たない 渦 鞭 毛 虫 ヤコウチュウは、大 量 に 増 殖 し 赤 潮 の 原 因 生 物 となる 海 産 の 渦 鞭 毛 虫である。ヤコウチュウは2 分 裂 によって 増 殖 する 無性 生 殖 過 程 のほかに、 遊 走 子 を 形 成 し 遊 走 子 が 融 合する 有 性 生 殖 過 程 が 存 在 することが 報 告 されている。しかし、 遊 走 子 形 成 に 関 する 報 告 は 少 なく、 生活 環 についての 記 述 は 十 分 とは 言 えない。そこで、ヤコウチュウの 全 生 活 環 を 解 明 するため、ヤコウチュウの 遊 走 子 形 成 とその 後 の 過 程 を 観 察 した。[ 材 料 と 方 法 ] 石 川 県 能 登 島 須 曽 で 採 取 し、 単 離 、 株化 したヤコウチュウ(Noctiluca scintillans)(strainname JSO 1)を 用 いた。 遊 走 子 形 成 細 胞 は、 培 養 中に 低 頻 度 で 出 現 した。この 遊 走 子 形 成 細 胞 を 光 学 顕微 鏡 で 観 察 、 記 録 した。また、 同 時 にカルノア 固 定(ethanol : chloroform : acetic acid = 6 : 3 : 1)・オルセイン 染 色 を 行 い、 核 の 状 態 を 観 察 した。[ 結 果 と 考 察 ] 遊 走 子 形 成 期 に 入 ったヤコウチュウの細 胞 には 大 きな 形 態 変 化 が 見 られた。 通 常 、 二 分 裂期 の 細 胞 はナス 型 をしており、 触 手 、 桿 状 体 、 細 胞口 等 の 構 造 が 見 られる。ヤコウチュウが 遊 走 子 形 成期 に 入 ると、 細 胞 は 球 形 に 変 化 し、 触 手 、 桿 状 体 、細 胞 口 が 消 失 した。また、 核 が 細 胞 外 殻 の 直 下 へ 移動 した。その 後 、 核 は 二 回 の 分 裂 後 、 細 胞 質 を 伴 って 細 胞 外 殻 表 面 へ 移 動 し、 突 出 した。この 四 個 の 突出 は 多 数 回 の 分 裂 後 、 将 来 遊 走 子 を 形 成 するので、ここでは 原 遊 走 子 と 呼 ぶ。4つの 原 遊 走 子 はクラスターを 形 成 しながら 分 裂 を 続 けた。 細 胞 数 は 最 小 で256、 最 大 で1024にまで 達 し、その 分 裂 は 完 全 に 同 調していた。また、 原 遊 走 子 の 核 の 分 裂 はほぼ 全 ての原 遊 走 子 間 で 同 調 して 行 われていた。 原 遊 走 子 の 分裂 が 進 むほど、 核 の 形 はより 明 瞭 になり、 核 の 染 色性 は 強 くなった。この 染 色 性 の 変 化 はおそらく、 遊走 子 への 分 化 前 の 核 凝 縮 を 反 映 していると 考 えられる。 分 裂 の 完 了 した 原 遊 走 子 は 遊 走 子 へ 変 化 した。原 遊 走 子 の 分 裂 時 に 見 られたクラスター 構 造 が 失 われ、 原 遊 走 子 は 半 紡 錘 形 になり、 二 本 の 鞭 毛 を 持 った 遊 走 子 へと 分 化 した。この 段 階 ですでに 活 発 な 鞭毛 運 動 が 見 られた。この 後 、 全 ての 遊 走 子 は 親 個 体から 放 出 され、 自 由 遊 泳 を 開 始 した。ヤコウチュウの 遊 走 子 は 半 紡 錘 形 をしており、 頭 部 に 複 数 の 顆 粒と 細 胞 後 部 に 核 を 持 つ。 遊 走 子 は 明 らかに 長 さの 異なる 二 本 の 鞭 毛 を 持 っており、これはこれまでの 報告 とは 異 なっていた。 親 個 体 と 同 様 に、 遊 走 子 には渦 鞭 毛 虫 の 特 徴 である 縦 溝 や 横 溝 は 確 認 できなかっ

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)11た。 遊 走 子 の 中 に2 個 体 が 向 かい 合 って 融 合 しているように 見 える 像 が 観 察 された。 融 合 したと 思 われる 細 胞 は 四 本 の 鞭 毛 と 二 個 の 核 を 持 っていた。また、 細 胞 が 融 合 前 よりも 少 し 大 きくなっていた。 遊走 子 形 成 後 、 遊 走 子 同 士 の 融 合 が 起 こり、 二 倍 体 世代 へと 移 行 すると 考 えられる。このことは、 遊 走 子形 成 のある 段 階 で 減 数 分 裂 が 起 こるということを 意味 している。 減 数 分 裂 が 何 回 目 の 分 裂 時 に 起 こっているのかを 特 定 することが 今 後 の 課 題 である。ヤコウチュウの 遊 走 子 は 二 本 の 鞭 毛 を 持 ち、 親 個 体 より渦 鞭 毛 虫 的 であると 言 える。しかし、 二 本 の 鞭 毛 には、やや 長 さが 異 なることを 除 けば、 明 確 な 分 化 が見 られないことから、 典 型 的 渦 鞭 毛 虫 の 形 態 をもってはいないようである。このことに 加 え、rDNA 分 子系 統 樹 解 析 によると、ヤコウチュウが 渦 鞭 毛 虫 の 中で 最 も 祖 先 的 な 種 とされることから、 以 下 のような進 化 のシナリオが 考 えられる。 渦 鞭 毛 虫 の 祖 先 は、ヤコウチュウの 遊 走 子 のような 細 胞 だったと 考 えられる。 渦 鞭 毛 虫 の 祖 先 は 未 分 化 な 二 本 の 鞭 毛 を 持 った 細 胞 で、その 細 胞 には 明 確 な 縦 溝 や 横 溝 が 無 かった。ヤコウチュウの 成 熟 個 体 は 捕 食 者 から 逃 れるため、 液 胞 の 発 達 によって 巨 大 化 し、 鞭 毛 を 失 うことによって 遊 泳 能 力 はほとんど 失 われてしまった。しかし、 代 わりに 潮 流 に 乗 って 拡 散 し 分 布 域 を 広 げ、また、 捕 食 のために 触 手 を 発 達 させるという 戦 略 をとったものと 考 えられる。 成 熟 個 体 の 形 態 は、 拡 散による 分 布 域 の 拡 大 と、 遊 走 子 ( 配 偶 子 ) 形 成 のために 特 殊 化 したもの、とみなすことができるだろう。[ 文 献 ]1) Soyer M-O (1972) Chromosoma 39: 419-441.2) Zingmark R.G (1970) J. Phycol. 6: 122-126.日 本 産 ミドリゾウリムシは 共 生 藻 の 光 合 成 に 影 響 を 及 ぼす鎌 戸 伸 一 郎 , 今 村 信 孝 ( 立 命 大 ・ 理 工 ・ 化 生 工 )Effect of Japanese Paramecium bursaria on symbiotic algaeShin-ichiro KAMAKO, Nobutaka IMAMURA(Sci. and Eng., Dept. Biosci. and Bioeng., Ritsumeikan Univ.)SUMMARYCells of green paramecium, Paramecium bursaria, have several hundred endosymbiotic algae. To investigate interactionsbetween Paramecium bursaria and its symbiont, we attempted to measure the effect of a cell-free extract of JapaneseP. bursaria on the photosynthetic carbon fixation of the symbiont. A cell-free extract of P. bursaria was preparedby filtration of P. bursaria cells on a membrane filter. Carbon fixation by the symbiotic algae and by free-living Chlorellaspp. in solutions of various concentrations of the extract were measured using NaH[ 14 C]O 3 . The amount of carbonfixed by all algae increased about 3-fold with increasing extract concentration. Since this phenomenon was not affectedby elimination of carbon dioxide from the extract, the existence of a host factor that stimulates algal carbon fixation(without species specificity) is suggested. In addition, the host factor would be a heat-stable low molecular weight substance.From a comparison with pH effects on carbon fixation by the symbiotic alga and a free-living Chlorella sp., thestimulation of algal carbon fixation seemed not to be caused by a change of intracellular pH. It appears that parameciumregulates photosynthesis of the symbiotic alga via a specific host factor.[ 目 的 ] ミドリゾウリムシは 数 百 の 共 生 藻 を 細 胞 内 共生 させており、 宿 主 と 共 生 藻 を 分 離 できることから、 細 胞 内 共 生 関 係 の 良 い 研 究 材 料 として 用 いられてきた。これまでに 共 生 藻 単 離 株 についての 形 態 、生 理 などの 研 究 が 行 われており、また 光 合 成 産 物 のマルトースを 放 出 している 1) ことが 報 告 されている。 著 者 らは 日 本 産 ミドリゾウリムシから 共 生 藻 を

12 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年無 菌 株 として 単 離 、 維 持 することに 成 功 し 2) 、その3)生 理 的 な 特 徴 や18S rDNAの 解 析 からの 解 析 を 進 めて 来 た 4) 。これまでに 共 生 藻 への 宿 主 側 からの 働 きかけについて 検 討 した 研 究 例 は 殆 どなく、 細 胞 内 共生 関 係 での 相 互 の 制 御 機 構 について 知 見 を 得 る 目 的で、 今 回 、 宿 主 無 細 胞 抽 出 液 の 共 生 藻 光 合 成 活 性 への 影 響 を 検 討 した。[ 材 料 と 方 法 ] ミドリゾウリムシF36 株 培 養 液 から、細 胞 をろ 紙 上 に 濃 縮 、 培 地 を 蒸 留 水 に 置 換 し、 細 胞数 を 計 測 した 後 に、メンブランフィルター(0.45 µm)で 吸 引 ろ 過 することで、ミドリゾウリムシ 無 細 胞 抽出 液 ( 以 後 、 抽 出 液 )を 得 た。 抽 出 液 中 の 炭 酸 の 影 響を 検 討 する 際 には、 抽 出 液 に0.1N HClを 添 加 し、 炭酸 を 減 圧 下 で 留 去 しリン 酸 バッファーでpH 調 製 したも のを 試 料 として 用 いた。また、 熱 処 理 (60° C,30min)およびメンブランフィルターで 分 子 量 分 画(MW 5,000)を 行 った 抽 出 液 試 料 についても 共 生 藻 への 影 響 を 検 討 した。 日 本 産 共 生 藻 F36-ZK 株 を、 濃 度調 製 した 抽 出 液 溶 液 中 に 懸 濁 してNaH[ 14 C]O 3 を 添 加後 、インキュベート (120 µmol photons/m 2 s, 25°C,2hours)した。 藻 体 と 外 液 をメンブランフィルターでろ 別 (15,000rpm, 5min)し、 藻 体 の 放 射 線 量 を 測 定 して藻 体 内 炭 素 同 化 量 とした。また、 外 液 中 の 遊 離 炭 酸イオンを 酸 性 条 件 (pH1.0, 90°C) 下 で 留 去 した 後 、 放射 線 量 を 測 定 し 放 出 した 光 合 成 産 物 中 の 炭 素 同 化 量とした。 抽 出 液 の 他 の 共 生 藻 (OK1-ZK, So13-ZK)およびfree-living Chlorella sp. (C. vulgaris NIES-227, C.kessleri IAM C-143) への 影 響 も 同 様 にして 検 討 を 行 った。また、 光 合 成 活 性 へのpHの 影 響 も 比 較 のために検 討 した。[ 結 果 と 考 察 ] 共 生 藻 F36-ZKの 光 合 成 活 性 は、 抽 出液 の 濃 度 に 依 存 して 最 大 3 倍 程 度 上 昇 した。また、 光合 成 産 物 の 放 出 量 に 関 しては、 抽 出 液 の 影 響 はみられなかった。 光 合 成 活 性 を 上 昇 させる 既 知 の 因 子 としては、 光 強 度 とCO 2 濃 度 が 知 られているが、その他 の 要 因 で 光 合 成 活 性 が 上 昇 することは 一 般 的 な 実験 条 件 下 では 殆 どなく、 極 めて 稀 な 現 象 と 思 われた。 今 回 の 実 験 系 では 光 条 件 は 一 定 であるので 無 視できるが、 抽 出 液 中 の 炭 酸 により 光 合 成 が 上 昇 している 可 能 性 は 残 された。そこで 抽 出 液 中 の 炭 酸 を 除去 して 共 生 藻 への 影 響 を 検 討 したが、やはり 光 合 成活 性 が 上 昇 したことから、 抽 出 液 中 に 炭 酸 とは 異 なる 光 合 成 活 性 上 昇 させる 因 子 が 存 在 することが 明 らかになった。さらに、この 因 子 について 知 見 を 得 るべく、 熱 処 理 、 分 子 量 分 画 を 行 ったところ、いずれの 処 理 後 でもほぼ100%の 活 性 を 保 持 していたことから、この 宿 主 因 子 は 熱 安 定 性 な 分 子 量 5000 以 下 の 低分 子 である。また、 抽 出 液 によって 共 生 藻 、 非 共 生 藻 Chlorellasp.に 関 わらず、F36-ZK 同 様 に 抽 出 液 濃 度 に 依 存 して光 合 成 活 性 が3 倍 程 度 上 昇 した。このことから、 抽 出液 中 の 光 合 成 活 性 を 上 昇 させる 宿 主 側 の 因 子 には、種 特 異 性 がないと 考 えられる。 一 方 、 共 生 藻 および非 共 生 藻 Chlorella sp.の 光 合 成 活 性 へのpHの 影 響 を 検討 したところ、 共 生 藻 F36-ZK 株 の 炭 素 同 化 はpHに 依存 性 を 示 したのに 対 し、 非 共 生 藻 Chlorella sp.ではpHの 影 響 を 受 けなかった。 抽 出 液 の 藻 類 への 光 合 成 上昇 作 用 には 種 特 異 性 がなく、 一 方 でpHでは 共 生 藻 のみ 依 存 性 を 示 すことから、 抽 出 液 の 影 響 は 単 なる 藻体 内 のpHの 上 昇 によるものではないと 考 えている。以 上 の 結 果 より、 宿 主 ミドリゾウリムシは、 低 分子 物 質 を 介 して 共 生 藻 の 光 合 成 活 性 を 調 製 していると 考 えられ、 今 後 、この 宿 主 因 子 の 解 明 とメカニズムの 解 析 を 行 う 予 定 である。[ 文 献 ]1. Brown A. J. and Nielsen J. P. (1974) J. Protozool. 21,569-5702. Kamako S., Hoshina R. and Imamura N. (2004) Jpn. J.Protzool. 37, 39-403. Kato Y., Ueno S. and Imamura N. (2004) 原 生 動 物 学会4. Hoshina R., Kamako S. and Imamura N. (2004) PlantBiol. 6, 447-453

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)13ミドリゾウリムシ 共 生 藻 の 窒 素 源 に 関 する 研 究加 藤 豊 , 上 野 聖 子 , 今 村 信 孝 ( 立 命 大 ・ 理 工 ・ 化 生 工 )Nitrogen utilization by endosymbiotic algae isolated from Paramecium bursariaYutaka KATO, Seiko UENO and Nobutaka IMAMURA(Sci. and Eng., Dept. Biosci. and Bioeng., Ritsumeikan Univ.)SUMMARYThe green ciliate, Paramecium bursaria, has several hundred endosymbiotic algae. Symbiont F36-ZK isolated fromJapanese P. bursaria F36 required some amino acids as a nitrogen source for its remarkable growth, rather than nitrate,which is used by endosymbionts of American and European P. bursaria and most of free-living Chlorella spp. To elucidatethis novel nitrogen utilization by F36-ZK, we studied enzymatic activity related to nitrogen assimilation and aminoacid transport. Nitrate reductase (NR) activity was not detectable in F36-ZK, indicating why F36-ZK could not utilizenitrate. Activities of the key enzymes of ammonium assimilation, glutamine synthetase (GS) and glutamate dehydrogenase(GDH), were also assayed. As no GS activity was detectable, it seemed likely that GDH assimilated ammoniumto yield Glu and this was utilized for algal growth. However, our previous results showed that Glu could be taken up, butnot utilized, by F36-ZK. This suggests the presence of an unknown ammonium assimilative pathway in F36-ZK. SymbiontF36-ZK possesses three active amino acid uptake systems, a basic amino acid transport system (Arg and Lys), ageneral amino acid transport system (Lys, His, Glu and neutral amino acids) and an alanine transport system (only Ala).The novel character of F36-ZK may have evolved during symbiosis over a long period.[ 目 的 ] ミドリゾウリムシ 細 胞 内 には 数 百 の 緑 色 藻 類が 細 胞 内 共 生 している。この 共 生 藻 は 宿 主 から 単 離可 能 であることから、 細 胞 内 共 生 に 関 する 研 究 材 料として 古 くから 用 いられてきた。しかしながら、 日本 産 のミドリゾウリムシ 共 生 藻 に 関 しては 無 菌 的 に単 離 、 維 持 することが 困 難 とされ、 無 菌 株 の 生 理 学的 研 究 はほとんどなされていなかった。 当 研 究 室 で日 本 産 共 生 藻 の 無 菌 的 単 離 に 成 功 1 し、その 単 離 の 過1,程 やその 後 の 検 討 2 によって、 無 機 窒 素 である 硝 酸塩 を 利 用 できず、 顕 著 な 増 殖 にいくつかのアミノ 酸を 要 求 することがわかった。 本 研 究 では、 日 本 産 共生 藻 の 特 異 な 窒 素 利 用 性 を 解 明 すべく、 窒 素 代 謝 関連 酵 素 およびアミノ 酸 輸 送 に 着 目 し 検 討 を 行 った。[ 材 料 と 方 法 ] 硝 酸 での 誘 導 による 硝 酸 還 元 酵 素(NR) 及 び 亜 硝 酸 還 元 酵 素 (NiR)の 活 性 を 測 定 するため、まず、free-livingのC. kessleri, C. vulgarisではアンモニアを、アメリカ 産 共 生 藻 NC64A 及 び 日 本 産共 生 藻 F36-ZKではアミノ 酸 (それぞれArgとSer)を窒 素 源 として 培 養 した。 対 数 増 殖 期 の 藻 体 を 洗 浄後 、 硝 酸 を 唯 一 の 窒 素 源 とするC 培 地 へ 移 し、NR 及びNiRの 酵 素 活 性 を 経 時 変 化 ごとに 追 った。 粗 酵 素を 抽 出 後 、 基 質 とNADHを 加 え、 亜 硝 酸 の 量 の 変 化を 測 定 した。グルタミン 酸 脱 水 素 酵 素 (GDH) 及 びグルタミンシンテターゼ(GS)の 酵 素 活 性 測 定 では、アンモニアを 唯 一 の 窒 素 源 とし 生 育 させた 藻 体を 用 い、 前 述 と 同 様 に 粗 酵 素 を 抽 出 後 、 基 質 を 加え、 活 性 を 測 定 した。アミノ 酸 輸 送 系 の 解 析 は、 14C 標 識 アミノ 酸 を 用 いて 行 った。 藻 体 に 14C アミノ 酸 を 添 加 し、 各 時 間 における 藻 体 をろ 取 後 、 液 体 シンチレーションカウンターを 用 いて 藻 体 内 放 射 線 量 を 測 定 した。アミノ 酸輸 送 系 の 種 類 の 数 を 予 測 するためにキネティクスを、また 他 のアミノ 酸 と 取 り 込 みを 競 合 させることにより、 同 一 の 輸 送 系 で 輸 送 されるアミノ 酸 の 同 定を 行 い、F36-ZKのアミノ 酸 輸 送 系 の 解 析 を 行 った。[ 結 果 と 考 察 ] 硝 酸 を 生 育 に 利 用 できるC. kessleri, C.vulgaris 及 びNC64Aでは、 硝 酸 誘 導 によってNR、NiRともに 活 性 が 確 認 できたが、F36-ZKではNR 活 性 が 認められなかった。 従 って、F36-ZK はNRの 酵 素 活 性が 欠 失 しているため、 硝 酸 の 利 用 は 不 可 能 である。F36-ZKはアンモニアの 利 用 はできる。 通 常 、アンモ

14 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年ニアは 主 経 路 としてのGS 及 び 補 助 経 路 としてのGDHにより 同 化 される。 検 討 した4 株 ともにGDHの 活 性は 確 認 できたが、F36-ZKのみがGS 活 性 が 認 められなかった。これらの 結 果 からは、F36-ZKの 主 なアンモニア 同 化 経 路 として、GDHによるグルタミン 酸 の 生成 が 考 えられる。しかし、 既 にグルタミン 酸 は 取 り込 まれるものの 生 育 には 利 用 できないこと 3 を 確 認 しており、F36-ZKのアンモニア 同 化 代 謝 経 路 に、GSとGDH 以 外 の 経 路 の 存 在 が 示 唆 された。F36-ZKはアンモニアを 窒 素 源 とした 場 合 、 非 常 に生 育 速 度 が 遅 いが、アミノ 酸 を 窒 素 源 とすると 顕 著な 増 殖 をみせる。アミノ 酸 の 取 り 込 みを 測 定 したところ、Asp 以 外 の19 種 のアミノ 酸 を 顕 著 に 取 り 込 んだ。 一 般 の 藻 類 は、 硝 酸 を 窒 素 源 として 利 用 しており、アミノ 酸 輸 送 系 は 発 達 していない 4, 5 。 発 達 しているF36-ZKのアミノ 酸 輸 送 系 を 調 べた 結 果 、basicamino acid transport system(Arg, Lysを 輸 送 する 系 )、general amino acid transport system (Lys, His, Glu, 中 性アミノ 酸 を 輸 送 する 系 )、alanine transport systemの3つのアミノ 酸 輸 送 系 が 常 に 発 現 されている 状 態 であることがわかった。特 異 な 窒 素 利 用 性 を 示 すF36-ZKは、NR、GSの 欠落 など 無 機 窒 素 同 化 経 路 に 異 常 が 生 じ、またアミノ酸 輸 送 系 が 常 に 発 現 した 状 態 にあった。このような特 異 な 窒 素 利 用 性 は、 宿 主 との 窒 素 化 合 物 の 永 いやり 取 りの 結 果 とも 考 えられ、 共 生 関 係 で 共 生 藻 が 受け 取 る 窒 素 化 合 物 としてアミノ 酸 が 重 要 な 位 置 を 占めていることが 示 された。[ 文 献 ]1. Shin-ichiro K., Ryo H. and Nobutaka I., (2004) Jpn. J.Protozool. 37(1), 39-40.2. Seiko U., Yutaka K. and Nobutaka I., (2004) Jpn. J.Protozool. 37(1), 42-43.3. 加 藤 豊 ・ 今 村 信 孝 (2004) 日 本 農 芸 化 学 会 大 会講 演 要 旨 集 p.1664. Cho H., Sauer N., Komor E. and Tanner W., (1981)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78(6) 3591-35945. David L. K. and Marilyn M. K. (1978) Plant Physiol. 61556-560ヤマトシロアリの 個 体 数 が 共 生 原 生 生 物 群 集 に 及 ぼす 影 響権 田 まり 子 , 北 出 理 ( 茨 城 大 ・ 理 )Effects of host termite colony size on the symbiotic protist fauna.Mariko GONDA and Osamu KITADE, (Faculty of Science, Ibaraki University)SUMMARYThe symbiotic flagellate community of a termite is characterized by host-specific species composition, definiteboundary, and clear community structure created by social system of host termite. To investigate the effects of metacommunitysize on the symbiotic flagellate community, we set up experimental termite colonies of Reticulitermes speratuscomposed of five, 25, 100 and 300 workers with seven replicates. The colonies were kept in an incubator at 22°C,and on the day 60 and 90 we picked up five termite individuals from each experimental colony and investigated the numbersof each flagellate species. We also investigated the flagellate numbers of the original field colony. Fifteen flagellatespecies were found from the field colony with nearly 100% infection rates. The total numbers of flagellates were significantlysmaller in five-termites colonies than in the field colony, but slightly larger in 25- and 100-termites colonies. Inthe three Trichomonad species with small individual numbers in the community, infection rates and population sizes ofthe flagellates clearly decreased as the meta-community size decreased. However, some flagellate species of large populationsizes did not follow these trends. The diversity of the flagellate community, measured by species number andShannon-Wiener index, tended to decrease as the size of meta-community decreased.

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)15[ 目 的 ] 下 等 シロアリとよばれるシロアリ 類 は 後 腸 内に 共 生 鞭 毛 虫 の 群 集 を 保 有 し、 共 生 鞭 毛 虫 のもつセルラーゼがシロアリの 摂 食 した 材 の 分 解 に 重 要 な 役割 を 果 たしていることが 知 られる。 鞭 毛 虫 は 超 鞭 毛虫 目 、トリコモナス 目 、オキシモナス 目 に 属 し、その 種 組 成 はシロアリの 種 に 特 異 的 である。シロアリのもつ 鞭 毛 虫 群 集 は、その 境 界 が 明 確 であり、かつシロアリの 個 体 ・コロニーの 別 によって 構 造 化 された 群 集 である 点 に 特 徴 がある。また、コロニーを 構成 するシロアリの 個 体 間 では、 時 折 鞭 毛 虫 の 受 け 渡しが 行 われることから、シロアリ1 個 体 の 鞭 毛 虫 群集 にとってコロニー 全 体 はメタ 群 集 であると 考 えることができる。このためシロアリの 共 生 鞭 毛 虫 群 集系 を 使 えば、 宿 主 の 個 体 数 を 操 作 してやることで、メタ 群 集 のサイズの 違 いが 群 集 に 及 ぼす 影 響 を 調 べることが 可 能 である。 本 研 究 ではヤマトシロアリReticulitermes speratusとその 共 生 鞭 毛 虫 群 集 を 用 いてこれを 調 べた。[ 材 料 と 方 法 ] 茨 城 県 ひたちなか 市 において、ヤマトシロアリを 営 巣 している 枯 死 木 ごと 採 集 した。このコロニーの 中 から 職 蟻 を 選 別 し、5 個 体 、25 個 体 、100 個 体 、300 個 体 のワーカーからなる 実 験 コロニーをそれぞれ14ずつ 作 成 した。うち7コロニーは60 日間 、 残 りの7コロニーは90 日 間 の 飼 育 を 行 った。シロアリの 飼 育 は 蒸 留 水 で 湿 らせた 濾 紙 を 敷 いたスチロールケース(5×6×2.5cm 3 ) 内 で22℃、 全 暗 の 条 件で 行 った。 餌 として 市 販 の 昆 虫 飼 育 用 マット(クヌギ 材 )を 与 えた。飼 育 期 間 終 了 時 に 各 実 験 コロニーから5 個 体 の 職 蟻を 選 び、 鞭 毛 虫 の 種 ごとに 個 体 数 を 調 査 した。 消 化管 を 抜 き 取 った 後 に40μlの0.4% 食 塩 水 中 で 切 開 して、 内 容 物 を 縣 濁 し、 血 球 計 算 板 を 用 いて 微 分 干 渉顕 微 鏡 下 で 個 体 数 の 算 定 、 総 個 体 数 の 推 定 を 行 った。 鞭 毛 虫 の 同 定 はKoidzumi (1921)、Kitade (1993)にもとづいて 行 った。また、 実 験 に 用 いた 野 外 コロニーから35 個 体 について 同 様 に 鞭 毛 虫 組 成 を 調 査 した。[ 結 果 と 考 察 ] 野 外 コロニーでは 計 15 種 の 原 生 生 物 が見 出 された。Pyrsonympha grandis と Pyrsonymphamodestaは 生 体 の 観 察 では 判 別 が 困 難 な 場 合 があるため、まとめて 扱 った。 感 染 率 はトリコモナス 目 の3種 を 除 けばすべて100%であった。 平 均 個 体 数 はオキシモナス 目 の 種 が 多 く(32536-3442)、 次 いで 超 鞭毛 虫 目 (752-167)、ト リ コ モナス 目 (97-69)であった。 平 均 の 総 個 体 数 は86373 個 体 であった。実 験 期 間 終 了 後 の 個 体 数 は5 個 体 区 で 野 外 コロニーより 有 意 に 低 くなる 傾 向 がみられた(Tukey-test,P

16 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年SS rDNA 塩 基 配 列 に 基 づくカバの 前 胃 に 生 息 するParentodinium 属 繊 毛 虫 の 系 統 学 的 検 討宮 崎 裕 1 , 池 和 憲 1 , 森 田 達 志 1 , 伊 藤 章 2 , 今 井 壮 一1 ,Wouter van Hoven 3( 1 日 獣 大 ・ 寄 生 虫 , 2 おおくさ 動 物 病 院 , 3 プレトリア 大 学 ・ 野 生 生 物 管 理 センター)Phylogenetic analysis, based on the SS rDNA gene, of Parentodiniumliving in the fore-stomach of HippopotamusYutaka MIYAZAKI 1 , Kazunori IKE 1 , Tatsushi MORITA 1 , Akira ITO 2 Soichi IMAI 1 and Wouter vanHOVEN 3 ( 1 Dept. Parasitol., Nippon Vet. and Ani. Sci. Univ., 2 Ookusa Ani. Hosp., 3 Centre Wildl.Manage., Univ. Pretoria)SUMMARYIt is well known that numbers of ciliate species belonging to the Subclass Trichostomatia live in the digestive tract oflarge herbivores. Phylogenic relationships of rumen ciliates, including the families Ophryoscoleciidae and Isotrichidae,have been inferred by comparison of DNA sequences of small subunit ribosomal RNA region (SSrDNA). But a comparativestudy on molecular phylogenetic relationships of the ciliates living in the fore-stomach of hippopotamus, Hippopotamusamphibius, has never been done. Furthermore, our previous morphological studies suggested that these Parentodiniumciliates do not belong in the family Cycloposthiidae in which the genus has been included. To determine the phylogeneticposition of the genus Parentodinium more clearly, we examined, for the first time, the SSrDNA of Parentodiniumand Cycloposthium ciliates and compared these sequences with those of the other Trichostomatia ciliates. UsingDistance Matrix, Maximum Parsimony and Maximum Likelihood methods, all the results indicated that Parentodiniumdid not belong in any described families of the Subclass Trichostomatia, although the Cycloposthiidae had a close relationshipto the Ophryoscoleciidae as a monophyletic clade. This result indicates the need to establish a new family, Parentodiniidae,in the Subclass Trichostomatia.[ 目 的 ] 草 食 動 物 であるカバの 前 胃 内 に 生 息 する 5 科6 属 の 繊 毛 虫 の 中 で、Parentodinium 属 繊 毛 虫 は、 鍍銀 染 色 標 本 を 用 いた 比 較 形 態 学 的 調 査 によって、 初1記 載 時 より 提 唱 されてきた Cycloposthiidae 科 には 属さず、 本 属 繊 毛 虫 をタイプ 属 とする 新 科 を 設 立 すべき 可 能 性 が 示 唆 された.しかしながら、 形 態 学 的 情報 のみからの 分 類 学 的 位 置 に 関 する 考 察 は、 研 究 者によって 重 視 する 形 質 に 偏 りがあることが 多 いと 考えられる.そこで、 比 較 的 重 視 する 形 質 の 偏 りが 少ない 遺 伝 子 配 列 を 用 いた 系 統 学 的 解 析 を、 Parentodinium属 と 既 知 の 消 化 管 内 繊 毛 虫 との 間 で 行 い、 本属 繊 毛 虫 の 系 統 分 類 学 的 位 置 について 検 討 した.[ 材 料 と 方 法 ] 材 料 として、 90-100% (v/v) のエタノールで 固 定 された、 南 アフリカ 共 和 国 の 野 生 カバより 得 られた Parentodinium 属 繊 毛 虫 約 3,000 個 体 、および 日 本 国 内 で 飼 養 されていたウマより 得 られたCycloposthium 属 繊 毛 虫 約 1,500 個 体 を 回 収 し、 使 用した.DNA の 抽 出 後 、 PCR 法 には Small subunitribosomal RNA をコードする 領 域 の 配 列 (SSrDNA) を増 幅 させるため Universal SSrRNA primer 2 の 一 部 を 取り 出 したものをプライマーとして 使 用 し、シーケンス 後 、 配 列 を 決 定 した.その 後 、 今 回 得 られた 2 種の 系 統 学 的 位 置 について、 反 芻 動 物 の 消 化 管 内 繊 毛虫 12 種 および、 外 群 として Didinium nasutum を 使 用して、 系 統 学 的 解 析 を 行 った. 解 析 における 塩 基 配列 のアライメントには Clustal W 3 を、 系 統 推 定 アルゴリズムには 距 離 行 列 法 、 最 大 節 約 法 、 最 尤 法 を 使用 し、 分 岐 点 に 対 する 信 頼 性 指 数 値 はブートストラップ 法 4 を 1,000 回 繰 り 返 すことで 検 出 した.[ 結 果 と 考 察 ] SSrDNA を 用 いた 系 統 解 析 の 結 果 、 全

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)17ての 系 統 推 定 アルゴリズムにおいて、Parentodinium属 は、Isotrichidae 科 である Dasytricha ruminantium と姉 妹 関 係 を 有 していた. 形 態 学 的 特 徴 に 関 して、Parentodinium 属 は Dasytricha 属 と 核 装 置 の 位 置 が 不定 である 点 や Ophryoscoleciidae 科 が 有 するような 分厚 い 外 質 を 有 さない 点 4 の2 点 を 共 通 点 として 有 している.しかしながらこれらの 形 態 学 的 特 徴 は、SSrDNA 配 列 が 未 解 明 の Buetscheliidae 科 や Blepharocorythidae科 と、 前 者 に 関 しては 核 装 置 の 位 置 が 不 定な 点 および 分 厚 い 外 質 を 有 さない 点 で、 後 者 とは 分厚 い 外 質 を 有 さない 点 (Strelkow 1939) で 共 通 している.また、Parentodinium 属 と Dasytricha 属 の 分 岐 点における 信 頼 性 指 数 値 は、 距 離 行 列 法 では 58―62%と 50% 以 上 の 値 を 得 たが、 最 大 節 約 法 や 最 尤 法 ではそれぞれ 43%、32% と 低 い 値 であり、この 分 岐 点 が成 立 する 可 能 性 が 低 いことを 示 唆 していた.また、Parentodinium 属 と Dasytricha 属 からなるクレイドの分 岐 点 の 信 頼 性 指 数 値 は、 全 ての 方 法 で 50% 以 下 と低 値 を 示 した.これも、 本 分 岐 点 が 成 立 する 可 能 性が 低 いことを 示 すものであった. 従 って、 本 調 査 による 分 岐 図 は、Parentodinium 属 、Dasytricha 属 、Isotricha 属 および Cycloposthiidae 科 と Ophryoscoleciidae科 からなる Entodiniomorpha 目 が 1 つの 分 岐 点 から 分 岐 するポリトミーを 形 成 するも のであ り、SSrDNA 配 列 がすでに 明 らかにされている 消 化 管 内繊 毛 虫 との 間 において Parentodinium 属 が Dasytricha属 と 最 も 近 縁 であることを 示 唆 するものではないと考 えられた. 今 後 、Parentodinium 属 繊 毛 虫 の 系 統 学的 位 置 を 明 らかにするためには、 前 述 の Buetcheliidae科 や Blepharocorythidae 科 繊 毛 虫 の SSrDNA 配 列を 明 らかにし、 系 統 推 定 分 岐 図 の 作 成 を 行 う 必 要 があるものと 考 えられる.本 調 査 結 果 はParentodinium 属 の Trichostomatia 亜綱 内 における 明 確 な 系 統 分 類 学 的 位 置 を 示 すものではなかったが、 少 なくとも Parentodinium 属 がこれまでに 言 われていたような Cycloposthiidae 科 には 属 さず、さらに 形 態 的 に 類 似 している Ophryoscoleciidae科 に 属 することをも 否 定 するものであり、 本 属 をタイプ 属 とする 新 科 設 立 の 必 要 性 を 裏 付 けるものであった.[ 文 献 ]1) Thurston, J. P. and Noirot-Timothée, C. (1973) J. Protozool.,20: 562-565.2) Medlin L., Elwood H.J., Stickel S., and Sogin M.L.(1988) Gene, 71: 491-499.3) Thompson, J. D., Higgins, D. G., and Gibson, T. J.(1994) Nucleic Acids Res., 22: 4673-4680.4) Felsenstein, J. (1985) Evolution, 39: 783-789.5) Ogimoto, K. and Imai, S. (1981) Japan Sci. Soc. Press,Tokyo, p.p. 231.6) Strelkow, A. (1939) Uchen. Zap. Leningrad Pedagog.Inst. Gert., 17: 1-262.

18 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年Entamoebaの 脱 嚢 および 脱 嚢 後 アメーバの 発 育 に 対 するDNAポリメラーゼ 阻 害 剤 アフィディコリンの 効 果牧 岡 朝 夫 1 , 熊 谷 正 広 1 , 小 林 正 規 2 2, 竹 内 勤( 1 慈 恵 医 大 ・ 熱 帯 医 学 , 2 慶 大 ・ 医 ・ 熱 帯 医 学 ・ 寄 生 虫 学 )Effect of aphidicolin on the excystation and metacystic developmentof Entamoeba invadensAsao MAKIOKA 1 , Masahiro KUMAGAI 1 , Seiki KOBAYASHI 2 and Tsutomu TAKEUCHI 2( 1 Department of Tropical Medicine, Jikei University School of Medicine, 2 Department of TropicalMedicine and Parasitology, Keio University School of Medicine)SUMMARYThe effect of aphidicolin, a specific inhibitor of the replicative DNA polymerases, on the excystation and metacysticdevelopment of Entamoeba invadens was examined. The protein profile of metacystic amoebae and their immunogenicityin the presence and absence of aphidicolin were also examined by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresisand immunoblotting. Excystation, which was assessed by counting the number of metacystic amoebae after theinduction of excystation, was inhibited by aphidicolin in a concentration-dependent manner during incubation comparedto the controls. Metacystic development, when determined by the number of nuclei in amoeba, was also inhibited byaphidicolin, because the percentage of 4-nucleate amoebae in cultures with aphidicolin during incubation was higher thanthat in cultures without the drug. The addition of aphidicolin to cultures at day 1 of incubation reduced the number ofmetacystic amoebae thereafter compared to cultures without the drug. The inhibitory effect of aphidicolin on excystationand metacystic development was reversed by removal of the drug. Cellular proteins of metacystic amoebae with 4 nuclei,which were predominant even at day 3 in the cultures with aphidicolin, reacted strongly with rabbit anticyst serum absorbedwith trophozoite proteins. In contrast, those of metacystic amoebae with 1 nucleus, which were predominant atday 3 in cultures without aphidicolin, no longer reacted with the absorbed anticyst serum, suggesting change in the expressionof proteins during metacystic development.[ 目 的 ] Entamoebaの 脱 嚢 および 脱 嚢 したアメ-バの発 育 は 感 染 の 成 立 に とって 必 須 の 過 程 であり、その機 構 の 解 明 は 感 染 予 防 、 新 規 薬 剤 開 発 の 標 的 を 探 求するうえで 重 要 である。 我 々はこれまでこの 機 構 の解 明 のため 種 々の 阻 害 剤 を 用 いて 検 討 してきた。 今回 はDNAポリメラーゼ 阻 害 剤 アフィディコリンの 効果 を 調 べるとともに、この 過 程 の 発 育 型 の 虫 体 構 成蛋 白 の 変 化 およびそれに 対 するアフィディコリンの影 響 についてもSDS-PAGE/イムノブロッティングにより 調 べた。[ 材 料 と 方 法 ] E. invadens 栄 養 型 を 嚢 子 形 成 液 に 移 し3 日 間 培 養 すること により 嚢 子 を 得 、この 嚢 子 を 栄養 型 培 養 液 に 戻 すことにより 脱 嚢 を 誘 導 した。その際 、 種 々の 濃 度 のアフィディコリンを 培 養 液 に 加え、3 日 間 培 養 後 metacystic amoebaeの 数 をカウントし、また 虫 体 当 りの 核 数 を 求 めた。metacystic amoebaeは0.05% sarkosyl 処 理 でlysateを 調 製 し、これをSDS-PAGEに 用 いた。イムノブロッティ ングは 抗 栄養 型 血 清 、 抗 嚢 子 血 清 および 栄 養 型 抗 原 で 吸 収 した抗 嚢 子 血 清 を 用 い 常 法 により 行 った。[ 結 果 と 考 察 ] 種 々の 濃 度 のアフィディコリン 存 在 下で 脱 嚢 後 アメーバ 虫 体 数 を 比 較 した 結 果 、 濃 度 に 依存 した 虫 体 数 の 減 少 が 認 められた。 脱 嚢 後 アメーバの 発 育 に 伴 い、その 核 数 は4 核 から 最 後 に1 核 になる。そこでアメーバの 核 数 により 発 育 に 対 する 効 果を 調 べた 結 果 、アフィディコリン 存 在 下 では 培 養 3 日目 でも4 核 のアメーバの 割 合 が 対 照 に 比 しはるかに高 く、 発 育 の 阻 害 が 認 められた。アフィディコリン

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)19を 培 養 1 日 目 に 加 えた 場 合 もアメーバ 虫 体 数 の 減 少が 認 められた。アフィディコリンを 培 養 1 日 目 に 除去 することにより 虫 体 数 が 回 復 したことから、その効 果 は 可 逆 的 であった。 栄 養 型 、 嚢 子 に 対 するウサギ 抗 血 清 ならびに 栄 養 型 抗 原 で 吸 収 した 嚢 子 抗 血 清を 用 いたイムノブロッティングにより 虫 体 タンパク質 の 変 化 を 調 べた 結 果 、アフィディ コリン 存 在 下 で高 い 割 合 を 占 める4 核 のアメーバには88 kDaおよび66 kDaの 嚢 子 特 異 的 タンパク 質 が 存 在 するが、 対 照の 培 養 3 日 目 で 大 部 分 を 占 める1 核 のアメーバには存 在 せず、この 過 程 で 遺 伝 子 発 現 の 変 化 が 起 こっていることが 明 らかになった。 以 上 の 結 果 から、アフィディコリンがEntamoebaの 脱 嚢 および 発 育 を 阻 害し、それにより 遺 伝 子 発 現 の 変 化 も 阻 害 することが示 唆 された。[ 文 献 ]Makioka, A. et al. (2002). Parasitol. Res., 88: 873-843爬 虫 類 におけるCryptosporidiumの 保 有 状 況黒 木 俊 郎 1 , 泉 山 信 司 2 , 八 木 田 健 司 2 , 宇 根 有 美 3 , 鳥 羽 道 久 4 2, 遠 藤 卓 郎( 1 神 奈 川 衛 研 ・ 微 生 物 , 2 感 染 研 ・ 寄 生 動 物 , 3 麻 布 大 ・ 獣 医 ・ 病 理 , 4 日 本 蛇 族 学 術 研 究 所 )Occurrence of Cryptosporidium spp. among reptile hostsToshiro KUROKI 1 , Shinji IZUMIYAMA 2 , Kenji YAGITA 2 , Yumi UNE 3 , Michihisa TORIBA 4 , andTakuro ENDO 2 ( 1 Dept. of Microbiol., Kanagawa Inst. of Public Health, 2 Dept. of Parasitol., Natl. Inst.of Infect. Dis., 3 Lab. of Vet. Pathol., School of Vet. Med., Azabu Univ., 4 The Japan Snake Inst.)SUMMARYWaterborne transmission of Cryptosporidium is one of the most prominent public health concerns in drinking-watersafety, since the oocysts are highly resistant to chlorine disinfection. In 2001, high levels of cryptosporidial oocysts weredetected in a community water treatment plant in western part of Japan, where well water was supplied to the consumerswithout filtration. Studies by PCR and sequencing revealed that the isolate is identified as the W11 genotype, suggestingthe wild reptile(s) to be the source of contamination. This study aimed at obtaining the prevalence of cryptosporidialinfection among reptiles in Japan, which might again be microbial contaminants of drinking-water. A total of 598 stoolsamples from wild reptiles, including snakes, lizards and tortoises, and 524 samples from captive bred reptiles, mostlyexotics, were examined occurrence of Cryptosporidium by means of sedimentation method followed by fluorescent antibodystaining. Only one domestic wild lizard was positive for Cryptosporidium, whereas 45 bred reptiles were positive.Until now 14 isolates were genotyped and obtained 4 distinct species/genotypes; C. serpentis (1), C. saurophilum (9), C.parvum bovine genotype (3) and C. andersoni (1), though the latter 2 might have originated from the food fed that hadtransiently been shed into feces.[ 目 的 ] Cryptosporidiumは 塩 素 耐 性 を 有 し、 大 きさが5 µm 程 度 と 小 さく 浄 水 処 理 では 完 全 に 除 けないことから、 水 道 を 介 した 集 団 感 染 が 生 じる 恐 れがあり 問題 となっている。 平 成 13 年 に、ある 簡 易 水 道 においてCryptosporidiumによる 汚 染 事 例 が 発 生 し、 給 水 停止 に 至 った (1) 。 問 題 となった 簡 易 水 道 では 井 戸 水 を水 源 として 利 用 し、ろ 過 処 理 なしの 塩 素 消 毒 のみで給 水 していたことから、オーシストによる 井 戸 水 の汚 染 は 上 水 の 汚 染 に 直 結 した。 汚 染 源 の 把 握 を 目 的としてオーシストの 遺 伝 子 型 別 を 実 施 した 結 果 、 爬虫 類 由 来 と 推 定 される 配 列 W11 型 と100% 一 致 した。これに 呼 応 して、 地 域 住 民 に 患 者 は 認 められなかっ

20 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年た。 井 戸 の 汚 染 は 周 辺 に 棲 息 する 爬 虫 類 動 物 に 由 来するものと 考 えられたが、 汚 染 原 因 は 未 だ 不 明 である。 爬 虫 類 に 寄 生 するCryptosporidiumに 関 する 情 報は 国 内 外 共 に 限 られており (2,3) 、 本 研 究 では 野 外 および 飼 養 されている 爬 虫 類 における 保 有 状 況 の 調 査 を行 った。[ 材 料 と 方 法 ] 野 外 に 生 息 する 爬 虫 類 の 試 料 としてカメ 類 8 種 345 検 体 、トカゲ 類 3 種 76 検 体 、ヘビ 類 4 種 177検 体 の 計 15 種 598 検 体 を 得 た。トカゲ 類 とカメ 類 は 関東 地 方 での 採 取 が 多 く、ヘビ 類 は 青 森 から 宮 崎 までの 広 い 地 域 より 採 取 した。 動 物 飼 養 施 設 で 飼 育 されている 爬 虫 類 の 試 料 は9 施 設 の 協 力 の 下 、カメ 類 51 種151 検 体 、トカゲ 類 47 種 181 検 体 、ヘビ 類 64 種 185 検体 、ワニ 類 6 種 7 検 体 の 計 168 種 524 検 体 を 得 た。 本 調査 では 糞 便 を 検 査 対 象 とし、FEA 法 による 固 定 と 濃縮 を 行 なった。 沈 渣 をCryptosporidiumのオーシスト壁 に 特 異 的 な 蛍 光 抗 体 (Aqua-Glo G/C Direct FL、Waterborne)で 染 色 した。 同 時 にDAPIを 用 いた 核 酸染 色 を 行 なった。 微 分 干 渉 蛍 光 顕 微 鏡 を 用 いて 染 色試 料 を 観 察 し、 特 異 蛍 光 、 細 胞 核 、 形 態 を 根 拠 にオーシストの 同 定 を 行 った。PCRは18S rDNAの 一 部 領 域 を 標 的 としたJohnsonらの 方 法 を 用 いた (4) 。 得 られたPCR 産 物 の 塩 基 配 列 を決 定 し、 既 存 の 配 列 との 相 同 性 を 確 認 した。[ 結 果 と 考 察 ] 野 外 の 爬 虫 類 15 種 598 検 体 の 中 で、 唯一 ニホンヤモリの1 個 体 からオーシストが 検 出 された。 野 外 の 爬 虫 類 全 体 から 見 た 感 染 率 は0.2%であり、Cryptosporidiumの 感 染 は 極 めて 稀 であった。 飼養 されている 爬 虫 類 では 複 数 の 個 体 でCryptosporidiumの 感 染 が 確 認 され、ワニ 類 、トカゲ類 、 並 びにヘビ 類 ではいずれも10% 程 度 の 感 染 率 を示 した。 一 方 、カメ 類 での 陽 性 率 は2%と 少 なかった。トカゲ 類 とヘビ 類 を 扱 う8 施 設 中 7 施 設 でオーシストが 検 出 された。 国 内 で 飼 養 されている 爬 虫 類 にCryptosporidiumが 蔓 延 しており、 環 境 汚 染 が 憂 慮 される。これまでに 国 内 の 爬 虫 類 より 得 たオーシストの 遺伝 子 型 別 を 行 った 結 果 、C. serpentisの 配 列 が1 試 料 から、C. saurophilumの 配 列 が9 試 料 から 得 られた。その 他 にC. parvumの 配 列 が3 試 料 から、C. andersoniが1試 料 から 得 られたが、これらについては 餌 由 来 である 可 能 性 を 含 め、 再 検 討 する 必 要 があるものと 考 えている。ちなみに、 井 戸 水 のオーシストより 取 得 されたCryptosporidium sp. W11 型 の 配 列 は 得 られなかった。[ 文 献 ]1) 辻 英 高 、 押 部 智 宏 、 小 野 一 男 、 近 平 雅 嗣 、 増 田 邦義 、 山 本 昇 五 、 八 木 田 健 司 、 遠 藤 卓 郎 簡 易 水 道から 検 出 された 爬 虫 類 由 来 のクリプトスポリジウム 2002 年 感 染 症 学 会 講 演 要 旨 集 感 染 症 学 雑 誌2002 76:680-6812) 黒 木 俊 郎 、 宇 根 有 美 、 遠 藤 卓 郎 爬 虫 類 のクリプトスポリジウム 感 染 野 生 動 物 医 学 会 誌 20038:27-34.3) Xiao L, Ryan UM, Graczyk TK, Limor J, Li L, KombertM, Junge R, Sulaiman IM, Zhou L, ArrowoodMJ, Koudela B, Modry D, Lal AA. Genetic diversityof Cryptosporidium spp. in captive reptiles. ApplEnviron Microbiol. 2004 Feb;70(2):891-9.4) Johnson DW, Pieniazek NJ, Griffin DW, Misener L,Rose JB. Development of a PCR protocol for sensitivedetection of Cryptosporidium oocysts in watersamples. Appl Environ Microbiol. 1995 Nov;61(11):3849-55.

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)21赤 痢 アメーバのゲラニルゲラニル 転 移 酵 素 I 型 の 解 析熊 谷 正 広 1 , 牧 岡 朝 夫 1 , 竹 内 勤 2 , 野 崎 智 義3,4 ( 1 慈 恵 医 大 ・ 熱 帯 医 学 , 2 慶 大 ・ 熱 帯 医 学 ・ 寄 生虫 学 , 3 感 染 研 ・ 寄 生 動 物 , 4 PRESTO・ 科 技 団 )Molecular cloning and characterization of a protein geranylgeranyltransferasetype I from Entamoeba histolyticaMasahiro KUMAGAI 1 , Asao MAKIOKA 1 , Tsutomu TAKEUCHI 2 and Tomoyoshi NOZAKI 3,4( 1 Dept. Trop. Med., Jikei Univ. Sch. Med., 2 Dept. Trop. Med. Parasitol., Keio Univ. Sch. Med., 3 Natl.Inst. Infect. Dis. 4 PRESTO, JST)SUMMARYProtein prenylation is essential for the Ras superfamily small G proteins to function. Protein prenylation includesprotein farnesylation and protein geranylgeranylation, which are catalyzed by protein farnesyltransferase (FT), proteingeranylgeranyltransferases type I (GGT-I) and type II. FT and GGT-I have attracted attention as an anti-cancer agent,and attempts have been made to use the enzymes as a target of anti-protozoan chemotherapy. Following the study on FTof Entamoeba histolytica (Eh), we characterized EhGGT-I. The α subunit of EhGGT-I was shared with FT. The β subunitof EhGGT-I had 337 amino acids, and showed 22 to 28% identities to those of other organisms. The recombinantEhGGT-I, expressed by Escherichia coli, was a complex of 38 kD and 35 kD proteins. The rabbit anti-EhGGT-I serumdid not reacted with rat GGT-I, showing difference in antigenicity. Rat GGT-I geranylgeranylates human mutant H-Ras-CVLL, but does not H-Ras-CVLS. EhGGT-I, however, geranylgeranylated both substrates. In mammals, Ras proteinsare farnesylated by FT, and Rac proteins are geranylgeranylated by GGT-I. In contrast, EhGGT-I geranylgeranylatedRas proteins as well as Rac proteins. To inhibitors for mammalian GGT-I, EhGGT-I was much more resistant than ratGGT-I. In conclusion, EhGGT-I was significantly different from mammalian GGT-I in substrate specificity and sensitivityto the inhibitors, and thus EhGGT-I would become a possible chemotherapeutic target of amoebiasis.[ 目 的 ] Ras スーパーファミリーの 低 分 子 量 G タンパク 質 は 細 胞 内 の 分 子 スイッチとして、 細 胞 の 増 殖 、分 化 、 細 胞 内 小 胞 輸 送 等 の 制 御 に 関 与 している。これらのタンパク 質 の 細 胞 内 膜 構 造 への 結 合 および 機能 発 現 には、プレニル 化 とよばれる 翻 訳 後 脂 質 修 飾が 必 須 である。プレニル 化 にはファルネシル 基 が 転移 されるファルネシル 化 とゲラニルゲラニル 基 が 転移 されるゲラニルゲラニル 化 があり、それぞれファルネシル 転 移 酵 素 (FT)、ゲラニルゲラニル 転 移 酵 素I 型 および II 型 (GGT-I, GGT-II) により 触 媒 される。これらの 酵 素 はαおよびβサブユニットからなる2 量体 で、FT と GGT-I のαサブユニットは 同 一 である。Ras および Rho/Rac ファミリーの 低 分 子 量 G タンパク 質 はその C 末 に CaaX モチーフ (C はシステイン、a は 脂 肪 族 アミノ 酸 、X は 何 らかのアミノ 酸 ) をもち、このシステインにプレニル 基 が 結 合 する。Rasファミリーでは X は 主 として S、M、Q で FT によってファルネシル 化 され、Rho/Rac ファミリーでは Xは L、F で GGT-I によってゲラニルゲラニル 化 される。 一 方 、GGT-II は Rab (CC または CXC モチーフ)に 特 異 的 に 作 用 する。 我 々は 赤 痢 アメーバ (Eh) の 増殖 と 分 化 における 制 御 因 子 として、また、 化 学 療 法の 標 的 分 子 として、プレニル 化 酵 素 の 解 析 を 行 っており、 先 に、FT の 1 次 構 造 および 組 換 え 酵 素 の 性 状について 報 告 した。 今 回 は Eh の GGT-I について 解析 した。[ 材 料 と 方 法 ] Eh の ゲノム・データベースから 相 同検 索 により EhGGT-I の N 末 端 と C 末 端 の 配 列 を 見 つけ、PCR プライマーを 設 計 し、cDNA ライブラリーをテンプレイトとしてクローニングを 行 なった。EhGGT-I は、 発 現 プラスミドを 作 成 して 大 腸 菌 に 発現 させ、 付 加 したヒスチジン・タグを 用 いて 精 製 した。 酵 素 活 性 は 低 分 子 量 G タンパク 質 への [ 3 H] ゲラ

22 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年ニルゲラニル・ピロリン 酸 の 取 り 込 みによって 測 定した。 阻 害 効 果 については、 種 々の 濃 度 の 阻 害 剤 存在 下 での 酵 素 活 性 の 低 下 率 から IC 50 を 求 めた。 近 隣結 合 法 による 系 統 樹 は ClustalW と TreeView を 用 いて 作 成 した。[ 結 果 と 考 察 ] GGT-I のαサブユニットは FT と 共 通 である。EhGGT-I のβサブユニットは、337 アミノ 酸 からなり、 他 種 生 物 と 22 から 28%の 相 同 性 があった。 系 統 解 析 を 行 なったところ、EhGGT-I のβサブユニットは 他 種 生 物 のものとは 離 れており、 独 自 の 進化 をしたものと 考 えられた。 大 腸 菌 に 発 現 させた 組換 えタンパク 質 は、38 kD と 35 kD の 複 合 体 として 精製 された。ウサギを 免 疫 して 得 た 抗 EhGGT-I 血 清 はEhGGT-I と 反 応 したが、ラット GGT-I とは 反 応 せず、 抗 原 性 に 違 いが 認 められた。ラット GGT-I がヒトの 変 異 型 H-Ras-CVLL を 基 質 とし、H-Ras-CVLS を基 質 としないのに 対 し、EhGGT-I は 両 方 を 基 質 とした。 哺 乳 類 では、Ras タンパク 質 は FT によってファルネシル 化 され、GGT-I によってゲラニルゲラニル化 されるのに 対 し、EhGGT-I は, EhRacA-CLLF やEhRacG-CSLF のような Rac の みならず、EhRas1-CIMF や EhRas2-CELL のような Ras をもゲラニルゲラニル 化 した。 哺 乳 類 の GGT-I 阻 害 剤 に 対 して、EhGGT-I はラット GGT-I に 比 べて 8 から 500 倍 抵 抗性 であった。以 上 のことから、Eh の GGT-I は、 基 質 特 異 性 も 阻害 剤 に 対 する 感 受 性 も 哺 乳 類 の GGT-I と 著 しく 異なっていることが 明 らかとなり、 生 物 の 多 様 性 という 点 から 興 味 深 いのみならず、 抗 アメーバ 薬 の 標 的としての 可 能 性 が 示 唆 された。[ 文 献 ]1) Zhang F.L. and Casey P.J.(1996) Annu. Rev. Biochem.,65: 241-269.2) Kumagai, M., Makioka, A., Takeuchi T. and Nozaki T.(2004) J. Biol. Chem., 279: 2316-2323.18S rDNAに 基 づく 放 散 虫 類 の 分 子 系 統 関 係湯 浅 智 子 1 , 高 橋 修 2 , 真 山 茂 樹 3 , 本 多 大 輔 4 , 松 岡 篤5 ,Kjell R. Bjørklund 6( 1 東 学 大 ・ 院 教 ・ 自 然 系 教 育 , 2 東 学 大 ・ 教 ・ 地 学 , 3 東 学 大 ・ 教 ・ 生 物 , 4 甲 南 大 ・ 理 工 ・ 生物 , 5 新 潟 大 ・ 理 ・ 地 質 科 学 , 6 Oslo Univ.)Phylogenetic position of Radiolaria based on 18S rDNAs sequencesTomoko YUASA 1 , Osamu TAKAHASHI 2 , Shigeki MAYAMA 3 , Daisuke HONDA 4 ,Atsushi MAYSUOKA 5 and Kjell R. BJØRKLUND 6( 1 Div. Math.Natural Sci. Edu., Grad. Sch. of Edu., Tokyo Gakugei Univ., 2 Dept. Astro. and EarthSci.,Tokyo Gakugei Univ., 3 Dept. Biology,Tokyo Gakugei Univ., 4 Dept. Biology, Fac. Sci. and Engineering,Konan Univ., 5 Dept. Geology , Fac. Sci., Niigata Univ., 6 Paleont. Musium, Oslo Univ.)SUMMARY‘Radiolaria’ (classes Acantharea, Polycystinea, and Phaeodarea) are planktonic protists widely distributed in tropical,subtropical, and even polar marine environments. Some recent studies based on 18S rDNA sequences have reported thatthe Polycystinea and the Acantharea form a monophyletic group, but the Phaeodarea branch with the phylum Cercozoa,separately from the Polycystinea and the Acantharea (Polet et al., 2004). Here we show the phylogenetic relationships of‘Radiolaria’, using the 18S rDNA regions of the solitary shell-bearing polycystines and phaeodarians. Their molecularanalyses have never been reported. Phylogenetic analyses of our sequences indicate that the Polycystinea and the Acanthareaare monophyletic, and the Phaeodarea diverge with the phylum Cercozoa as already suggested by Polet et al.

24 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年Naegleria fowleri 総 タンパク 質 のアミノ 酸 配 列 解 析— 2D-PAGEデータベースの 拡 充 を 目 指 して —小 村 麻 子 , 八 木 田 健 司 , 泉 山 信 司 , 下 河 原 理 江 子 , 遠 藤 卓 郎( 国 立 感 染 症 研 究 所 ・ 寄 生 動 物 )Amino acid sequence analysis on Naegleria fowleri proteins separated by 2D-PAGEMako OMURA, Kenji YAGITA, Shinji IZUMIYAMA, Rieko SHIMOGAWARA and Takuro ENDO(Dept Parasitol., NIID, Japan)SUMMARYWe have established and released partially on a website as database of 2D-PAGE map of Naegleria fowleri totalproteins obtained by a combination of 2D-PAGE image analysis with direct N-terminal amino acid analysis. Until now,N-terminal sequences of 38 proteins out of 59 major proteins spots examined have been successfully determined. Further,internal sequences of 11 and 24 proteins have, then, been analyzed along either with Cleveland peptide mapping orwith EST-IT tandem MS followed by similarity search for known proteins against NCBInr database using Mascot searchengine, and 3 and 4 proteins were identified with high confidence as cyclophilin, nucleoside diphosphate kinase andisocitrate dehydrogenase [NADP], and MP2CL5, N.fowleri HSP70, albumin and actin , respectively. In addition, MS/MSspectra have been de novo sequenced by means of PEAKS Studio v2.4 and revealed many peptide candidates from eachof 24 spots. The methods reported in the present experiments showed an ultimate advantage for the identification of theproteins from the internal sequences of protein spots especially of which N-terminal are blocked like many of those ofN.fowleri. The 2D-PAGE database will be updated spot by spot without delay for public access.[ 目 的 ] 本 研 究 では 強 い 病 原 性 を 持 つNaegleria fowleriと 非 病 原 性 のN. lovaniensisの 総 タンパク 質 について、2D-PAGEによる 比 較 を 行 ってきた(1,2,3)。2 種 それぞれのスポットパターンの 特 徴 が 判 明 したことで、N. fowleriの1 株 の2D-PAGEゲルから、 種 特 異 的あるいは2 種 間 共 通 な 特 徴 を 持 つタンパク 質 を 選 択 できるようになった。この 情 報 をもとにスポットの 解析 を 進 め、 得 られた 情 報 を 統 合 するため、N. fowleri2D-PAGEデータベースを構 築 した。プロテオミクスの 主 流 であるMALDI-TOF MSを 用 いたPeptide massfingerprinting(PMF) 法 はデータベースの 充 実 していないNaegleria 属 アメーバの 解 析 には 不 向 きであるため、これまではN 末 端 アミノ 酸 配 列 解 析 を 中 心 としたスポット 解 析 を 行 ってきたが、 中 間 配 列 についても 解 析 する 必 要 があった。 今 回 はデータベース 情 報の 拡 充 を 目 的 に、より 簡 便 な 中 間 アミノ 酸 配 列 解 析法 として、クリーブランド 法 によるペプチドマッピングを 中 間 配 列 解 析 に 応 用 した(4)。さらにより 迅 速な 解 析 法 としてLC-MS/MS 解 析 を 行 い、MS/MSデータのde novo Sequencing を 試 みた。[ 材 料 と 方 法 ] N. fowleriNf66 株 から 総 タンパク 質 を 抽出 し、1 次 元 目 はpH3-10、18cmイモビリンストリップ(Amersham biosciences 社 )、2 次 元 目 は12.5%ゲルを 用 いて2D-PAGEを 行 った。2D-PAGE 後 CBB 染 色 したゲルを 乾 燥 させた 後 、クリーブランド 法 によるペプチドマッピングを 行 った。 目 的 のスポットを 切 り出 し、 濃 縮 ゲルの 高 さを5cmとしたSDS-PAGEゲル(20% ) のウェ ルに 入 れ、Tris-SDS 緩 衝 液 (125mMTris-HCl (pH6.8), 0.1% SDS, 10% Glycerol, 5% 2-ME)を 加 えてゲル 片 を 膨 潤 した。S. aureus V8 proteaseを 溶 解 したTris-SDS 緩 衝 液 (125 mM Tris-HCl(pH6.8), 0.1% SDS, 5% Glycerol) を 各 ウェルに 重 層 して 電気 泳 動 を 開 始 した。 試 料 のバンドが 濃 縮 ゲルの 下 端に 濃 縮 されたところで1 時 間 泳 動 を 停 止 してタンパク 質 の 部 分 酵 素 分 解 を 行 った。その 後 泳 動 を 再 開し、 終 了 後 にPVDF 膜 にブロットし、 得 られたペプチドのバンドを 気 相 シークエンサー(Procise cLC494(Applied Biosystems 社 ))で 解 析 した。LC-MS/MS 解 析では2D-PAGE 後 スポットを 切 り 出 し、Trypsinによるゲル 内 消 化 の 後 、 抽 出 液 を 試 料 とした。HPLC 部 にMAGIC2002(Michrom BioResources 社 )、 質 量 分 析部 にはLCQ-Deca XP(ESI-IT MS (Thermo Electron社 ))を 用 いた。 得 られたMS/MSデータはMascotプロ

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)25グラムを 用 いてNCBInrデータベースと 照 合 した。MS/MSデータの de novo Sequencing にはPEAKS Studiov2.4 (infocom 社 )を 用 いた。[ 結 果 と 考 察 ] N 末 端 ブロックあるいはN 末 端 アミノ酸 配 列 では 未 知 のスポットについて、 中 間 アミノ 酸配 列 解 析 を 試 みた 結 果 、シークエンシング 可 能 なペプチド11 個 を 得 、その 内 3 個 のスポットは 相 同 性 検 索により 同 定 できた。クリーブランド 法 による 解 析 では1サンプル 当 たり100 pmol 以 上 を 要 し、したがって複 数 枚 の2D-PAGEゲルが 必 要 となるが、 培 養 が 容 易なNaegleriaは 比 較 的 タンパク 量 を 確 保 しやすいことから、 中 間 アミノ 酸 配 列 解 析 を 効 率 的 に 行 う 上 でクリーブランド 法 は 有 効 であると 考 えた。MS/MS 解 析を 行 った24 個 のスポットの 内 4 個 がMascotサーチにより 同 定 できた。また 同 定 できたMS/MSデータで denovo Sequencingを 行 い、 得 られた 配 列 がMascotサーチの 結 果 とよく 一 致 したことを 確 認 した。さらに 未知 のスポットからもそれぞれ 複 数 の 中 間 配 列 情 報 を得 た。MS/MS 解 析 による de novo Sequencing では 質量 で 区 別 できないアミノ 酸 やジペプチドが 一 部 含 まれるため、 候 補 となる 配 列 が 複 数 生 ずる 不 都 合 もあるが、Naegleriaのように 未 知 のタンパク 質 が 多 い 試料 について 質 量 分 析 を 行 う 場 合 は、 部 分 配 列 情 報 を得 ることができるMS/MS 解 析 を 中 心 に 進 めるのが 妥当 だと 考 えられた。[ 文 献 ]1) Omura, M. et al. (2002) Jpn. J.Protozool., 35: 33-33.2) Omura, M. et al. (2003) Jpn. J.Protozool., 36: 22-23.3) Omura, M. et al. (2004) Jpn. J.Protozool., 37: 91-93.4) Woo, SH. et al. (2002) Electrophoresis, 23: 647-654.テトラヒメナで 得 られた 分 子 量 60 kDa の 微 小 管 結 合 蛋 白 質 の 解 析松 井 孝 憲 1 , 徳 楽 清 孝 2 , 島 崎 由 佳 1 3, 小 谷 享( 1 九 工 大 ・ 情 報 工 ・ 生 物 , 2 都 城 高 専 ・ 物 質 , 3 神 奈 川 大 ・ 理 ・ 生 物 )Characterization of the 60 kDa microtubule-associated proteinfrom Tetrahymena pyriformisTakanori MATUI 1 , Kiyotaka TOKURAKU 2 , Yuka SHIMAZAKI 1 , Susumu KOTANI 3( 1 Dep. of Biochim. Engineering and Sci., Fac. of Comp. Sci. and Sys. Engineering, Kyushu Inst. ofTech., 2 Dep. of Chemical Sci. and Engineering, Miyakonojo Natl. College of Tech., 3 Dep. of Biol.Sci., Fac. of Sci., Kanagawa Univ.)SUMMARYIn preparing the microtubule-associated proteins (MAPs) of Tetrahymena pyriformis, we identified three polypeptides,with apparent molecular masses of 90 kDa, 60 kDa, and 37 kDa, that co-sedimented with taxol-stabilized mammalianmicrotubules. The 60 kDa MAP was heat-stable. Using this characteristic, the protein was purified to homogeneity,and was further characterized biochemically. Partial amino acid sequences of the 60 kDa MAP were homologous tothose of Xenopus XMAP215. The 60 kDa MAP enhanced both the initial rate and the plateau level of mammalian tubulinpolymerization, in a concentration-dependent manner. Electron microscope observations showed that the assembledstructures were normal microtubules. The 60 kDa MAP existed abundantly in the soluble fraction, rather than the membranousone, as revealed by a partial cell fractionation. Immunofluorescence microscope observations using anti-60 kDaMAP antibody also revealed that the 60 kDa MAP existed in the cytoplasm. The 60 kDa MAP appeared as particles,suggesting that the 60 kDa MAP was associated with granules or vesicles. The cellular 60 kDa MAPs were mostly co-

26 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年図 1 60 kDa MAPとXMAP215ファミリーのアミノ 酸 配 列 比 較60 kDaMAPから 得 られたアミノ 酸 配 列 とアフリカツメガエル(XMAP215)、ヒト(ch-TOG)、ショウジョウバエ(Msps)、 線 虫 (Zyg-9)、シロイヌナズナ(Mor1)、 細 胞 性 粘 菌 (DdCP224)の 配 列 の 一 部 。XMAP215ファミリーの 各 メンバーはXMAP215と 相 同 性 を 比 較 して、 最 も 一 致 するように 並 べた 際 の 前 後 10残 基 を 含 めて 示 した。XMAP215と 相 同 なアミノ 酸 残 基 は 白 字 で 示 し、 残 基 数 はかっこ 内 に 示 した。localized with cytoplasmic microtubules, while some of the 60 kDa MAPs were situated near microtubules, but withoutclear associations. Nocodazole treatment resulted in a change in the 60 kDa MAP localization, which probably accompaniedthe disruption of microtubule networks.[ 目 的 ] 微 小 管 には 微 小 管 結 合 蛋 白 質 (MAPs)と 呼ばれる 多 種 多 様 な 蛋 白 質 が 結 合 しており、 細 胞 内 の微 小 管 の 機 能 に 深 く 関 わっている。 我 々はテトラヒメナをモデル 細 胞 として 用 いMAPsの 生 理 機 能 を 明 らかにしたいと 考 えている。そのためにはin vitroとinvivoの 両 面 からMAPsの 解 析 をおこなう 必 要 があった。そこで 我 々は、まずテトラヒメナからMAPsを 得て 生 化 学 的 な 解 析 をおこない、そのMAPsの 細 胞 内 の挙 動 を 調 べようと 考 えた。 得 られたMAPs 画 分 には 三種 類 のMAPsが 含 まれた。そのうち、 新 規 に 得 られたみかけの 分 子 量 が60kDaのMAPについて、そのアミノ 酸 配 列 やチューブリン 重 合 促 進 活 性 と 細 胞 内 の 局在 を 調 べた。[ 方 法 ] テトラヒメナ(T. pyriformis W 株 )は 筑 波 大 学 の沼 田 先 生 に 頂 いた。PYD 培 地 中 26℃で 二 日 培 養 し、破 砕 後 に 超 遠 心 分 離 で 得 た 上 清 を 粗 抽 出 液 とした 1 。粗 抽 出 液 からTaxol 安 定 化 微 小 管 との 共 沈 でMAPs 画分 を 得 た。60kDaMAPはテトラヒメナの 粗 抽 出 液 から 熱 処 理 、DEAE-セルロースカラムクロマトグラフィー、Taxol 安 定 化 微 小 管 との 共 沈 などを 経 て 精 製した 1 。チューブリンの 重 合 は350nmの 波 長 で 測 定 し( 濁度 法 )、 微 小 管 のサンプルを 逆 染 色 しJEOL 社 のJEM-100Sで 電 子 顕 微 鏡 観 察 をおこなった。 間 接 蛍 光 抗 体法 は 抗 チューブリン 抗 体 と 抗 60kDaMAP 抗 体 を 用 いて 藤 生 らの 方 法 2 に 従 いおこなった。[ 結 果 ] テトラヒメナの 粗 抽 出 液 からTaxol 安 定 化 微小 管 との 共 沈 でMAPs 画 分 を 得 た。そのMAPs 画 分 には 再 現 的 に90kDa、60kDa、37kDaの 三 つのMAPsが 得られ、60kDaMAPの 詳 しい 解 析 をおこなった。37kDaのMAPはグリセルアルデヒド 三 リン 酸 脱 水 素 酵 素 であり、 既 知 の 蛋 白 質 であった。60kDaMAPは 熱 安 定な 蛋 白 質 であった。 哺 乳 類 の 熱 安 定 なMAPの 一 つであ る Tau と 分 子 量 が 似 ていたが、 哺 乳 類 の MAPs(MAP2、MAP4、Tau)と は 免 疫 交 叉 性 を 示 さなか っ た。ま た 60kDaMAP から 得 られた8 残 基(QRIERLEE)と9 残 基 (APTKEVEEK)のアミノ 酸 配 列 はアフリカツメガエルのMAPであるXMAP215と 高 い 相

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)27同 性 を 示 した。 精 製 した60kDaMAPを 用 いてチューブリン 重 合 促 進 活 性 を 調 べた。すると 濁 度 法 の 結果 、60kDaMAPは 濃 度 依 存 的 にチューブリンの 重 合を 促 進 し、 電 子 顕 微 鏡 観 察 では 典 型 的 な 微 小 管 が 観察 された。 間 接 蛍 光 抗 体 法 の 結 果 、60kDaMAPのほとんどは 粒 状 に 光 って 細 胞 質 に 存 在 していた。また、 細 胞 質 の60kDaMAPの 多 くは 微 小 管 上 に 局 在 していたが、いくつかは 微 小 管 上 にはおらず 微 小 管 の近 くに 局 在 していた。ノコダゾール 処 理 した 細 胞 では 微 小 管 の 崩 壊 に 伴 う60kDaMAPの 局 在 の 変 化 が 見られた。[ 考 察 ] 今 回 、テトラヒメナから 得 た60kDaMAPはチューブリン 重 合 促 進 活 性 を 持 つテトラヒメナの 新規 のMAPであった。60kDaMAPから 得 られた8 残 基 と9 残 基 のアミノ 酸 配 列 はXMAP215と 高 い 相 同 性 を 示した。XMAP215は 広 範 囲 の 種 にわたって 保 存 されたMAPのファミリーに 属 しており、 各 メンバーは 微 小管 のダイナミクスを 調 節 することで 知 られている 3 。二 つの 配 列 のうち、QRIERLEEはファミリーの 各 メンバーに 保 存 されているが、APTKEVEEKは 全 長 にわたって 相 同 性 なメンバーであるXMAP215とch-TOGにしか 保 存 されていなかった( 図 1)。 二 つの 配列 を 得 た 限 定 分 解 後 の 断 片 の 分 子 量 から、60kDaMAPはXMAP215のC 端 側 に 相 当 する 分 子 ではないかと 考 えている。分 裂 中 のテトラヒメナは 細 胞 質 に 発 達 した 微 小 管網 を 持 つ 2 。 今 回 60kDaMAPは 主 に 可 溶 性 画 分 に 回 収され、 間 接 蛍 光 抗 体 法 の 結 果 でも60kDaMAPは 主 に細 胞 質 の 微 小 管 と 結 合 していた。60kDaMAPは 粒 状に 光 って 見 えたことから、 細 胞 質 の 顆 粒 や 小 胞 体 と結 合 している 可 能 性 がある。また、チューブリン 重合 促 進 活 性 を 持 っていたことから、60kDaMAPは 細胞 質 微 小 管 の 調 節 に 関 わっている 可 能 性 がある。[ 文 献 ]1) Matui,T., Tokuraku,K., Shimazaki,Y. and Kotani,S.(2004) Jpn. J. Protozool. 37,11-18.2) Fujiu,K. and Numata,O.(2000) Cell Motil. Cytoskeleton46,17-27.3) Ohkura,H., Garcia,M.A. and Toda,T.(2001) J. CellSci.114,3805-3812.テトラヒメナの 細 胞 分 裂 における 細 胞 質 オルガネラの 分 配菅 井 俊 郎 ( 茨 城 大 ・ 理 ・ 自 然 機 能 )Division inheritance of free cytoplasmic organelles in Tetrahymena thermophilaToshiro SUGAI(Department of Materials and Biological Sciences, Faculty of Science, Ibaraki University)SUMMARYCells of Tetrahymena thermophila are full of membrane-bound cytoplasmic organelles such as food vacuoles orlysosomes that are free in the cytoplasm, while all mitochondria are attached to the cell cortex. There is no protoplasmicstreaming. When cells were slightly starved, cytoplasmic organelles were found in the posterior half of a cell. Whenthese cells divided, cytoplasmic organelles moved from this posterior position to the surface of the macronucleus (MAC)just after completion of micronuclear division and covered the whole surface of the MAC. During division, cytoplasmicorganelles were partitioned almost equally to the daughter cells by hitchhiking on the dividing MAC, and they dispersedinto the cytoplasm just after MAC division and before separation of the daughter cells. The MAC is the partition apparatusfor cytoplasmic organelles. Similar partition was also observed in T. pyriformis W. During the first division of exconjugantsafter conjugation, there is no MAC division. Organelles located in the posterior part of exconjutants also movedto the central part of the cell and partitioned almost equally to daughter cells. This shows that Tetrahymena cells haveprecise mechanisms for organelle partitioning.

28 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年[ 目 的 ] 細 胞 分 裂 の 際 、 染 色 体 は 正 確 に 娘 細 胞 に 分 配されるが、 細 胞 質 のオルガネラに 関 しては 一 般 にはランダムに 分 配 されると 考 えられている。テトラヒメナ 細 胞 ではミトコンドリアは 細 胞 皮 層 に 付 着 しているが、 細 胞 質 には 食 胞 やリソゾームなどの 遊 離 のオルガネラが 充 満 している。これらの 遊 離 オルガネラが 細 胞 分 裂 の 際 にランダムに 分 配 されるのかについて、オルガネラの 数 を 減 少 させて 生 細 胞 で 調 べた。[ 材 料 と 方 法 ] Tetrahymena thermophila inbred strainB、およびT. pyriformis Wを 使 用 した。 最 近 開 発 した細 胞 を 透 明 にする 培 地 (T 培 地 )で 培 養 し、 対 数 増 殖期 の 細 胞 分 裂 と、T. thermophila については10mMTris 中 で 軽 い 飢 餓 状 態 にして、 異 なる 交 配 型 の 細 胞 と接 触 させて 誘 導 される 細 胞 分 裂 について 主 に 調 べた。 観 察 は 全 て 生 細 胞 について 行 い、 主 に 位 相 差 を使 用 した。 蛍 光 観 察 では、DNAはHoechst 33342で,リソゾームはアクリジンオレンジで 染 色 した。[ 結 果 と 考 察 ] ペプトン 培 地 のような 栄 養 豊 富 な 培 地中 では、テトラヒメナ 細 胞 は、 通 常 食 胞 が 充 満 していて 内 部 が 観 察 できない。 飢 餓 状 態 にすると、 遊 離のオルガネラの 数 が 減 少 し、 小 さい 少 数 のものは、細 胞 前 端 と 口 部 装 置 付 近 にあるが、 大 部 分 は 細 胞 の後 部 に 局 在 する。 本 種 では 原 形 質 流 動 は 認 められなかった。 細 胞 内 の 小 さいオルガネラは、 通 常 の 跳 躍運 動 を 行 い、 方 向 はランダムであった。 飢 餓 状 態 であっても 異 なる 交 配 型 の 細 胞 を 混 合 すると、 細 胞 分裂 が 誘 導 される。こ 細 胞 分 裂 では、 最 初 に 小 核 が 分裂 し 長 いspindleを 形 成 した。 小 核 の 分 裂 が 完 了 した直 後 に 大 核 が 不 規 則 な 形 になるが、 後 部 にあったオルガネラはこの 時 期 に、 大 核 表 面 に 移 動 した。オルガネラは 大 核 に 直 接 付 着 してはおらず 表 面 付 近 で 細かい 運 動 を 繰 り 返 し、 大 核 表 面 全 体 に 分 布 するようになった。オルガネラは、その 後 分 裂 する 大 核 にヒッチハイクする 形 で 娘 細 胞 にほぼ 均 等 に 配 分 された。 細 胞 質 分 裂 が 完 了 する 前 に、オルガネラは 大 核から 離 れて 細 胞 質 に 分 散 し、 娘 細 胞 の 分 離 後 、また細 胞 後 部 に 移 動 した。この 現 象 は、 対 数 増 殖 期 でも観 察 され、またT. pyriformis Wでも 同 様 に 見 られることがわかった。 微 小 管 阻 害 剤 のBenomylで 細 胞 を 処理 すると、 大 核 の 位 置 が 細 胞 中 心 より 動 くが、オルガネラはやはり 位 置 のずれた 大 核 表 面 にあり、 分 裂溝 が 入 る 細 胞 の 中 心 に 位 置 することはなかった。接 合 後 、 新 大 核 を2つ 持 つ 接 合 完 了 体 は、 最 初 の細 胞 分 裂 では 大 核 は 分 裂 せずに 娘 細 胞 に1 個 ずつ 配分 される。この 時 のオルガネラの 配 分 を 観 察 した 結果 、 細 胞 後 部 にあったオルガネラは 細 胞 の 中 心 , 特 に新 大 核 の 間 に 移 動 し、やはり 均 等 に 配 分 されることがわかった。 テトラヒメナ 細 胞 には、 細 胞 質 内 の 多数 の 遊 離 のオルガネラを 均 等 に 配 分 する 機 構 が 存 在することがわかった。 大 核 が 分 裂 する 通 常 の 細 胞 分裂 では、 大 核 が 分 配 装 置 であり、 接 合 完 了 体 では 細胞 の 中 心 にオルガネラが 集 まり、そこで 分 裂 溝 が入 って 均 等 分 配 されることがわかった。この 場 合 、細 胞 の 中 心 は 新 大 核 の 間 であり、やはり 核 に 集 まるという 可 能 性 がある。 大 核 と 細 胞 の 皮 層 の 間 には 微小 管 が 存 在 し、 分 裂 期 には 核 から 前 後 方 向 と 分 裂 溝ができる 部 分 との 間 によく 発 達 する(Fujiu and Numata,1999)。オルガネラの 移 動 のパターンは、この微 小 間 の 分 布 のパターンとほぼ 同 じであり、 微 小 管阻 害 剤 によっても 影 響 をうけたので、 微 小 管 上 を 移動 している 可 能 性 が 高 い。このような 劇 的 な 現 象 が、モデル 生 物 の 一 つであるテトラヒメナで 発 見 されたことは、 単 細 胞 生 物 では 生 細 胞 の 観 察 方 法 が 未 開 拓 であり、これから 有 望な 方 向 であることを 意 味 すると 思 われる。[ 文 献 ]Fujiu, K. and Numata, O. (1999) Cell Struct. Funct.,24:401-404

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)29繊 毛 虫 ブレファリズマにおけるガモン1 遺 伝 子 のゲノム 配 列 とその 上 流 配 列 の 決 定高 見 梨 沙 1 , 杉 浦 真 由 美 2 2, 春 本 晃 江( 1 奈 良 女 大 院 ・ 人 間 文 化 ・ 生 物 科 学 , 2 奈 良 女 大 ・ 人 間 文 化 ・ 共 生 自 然 科 学 )Determination of the genomic sequence and the upstream sequence of thegamone 1 gene in the ciliate Blepharisma japonicumRisa TAKAMI 1 , Mayumi SUGIURA 2 and Terue HARUMOTO 2( 1 Div. of Biol. Sci., Grad. Sch. of Human Culture, Nara Women’s Univ., 2 Dept. Biol. Sci. and Environ.,Grad. Sch. of Human Culture, Nara Women’s Univ.)SUMMARYIn the conjugation of Blepharisma japonicum, cells of complementary mating types I and II participate in the interactionwhich leads to mating pair formation. Pair formation is induced by conjugation-inducing substances, called gamones,which are secreted by cells of each mating type. Gamone 1 is not constitutively secreted, but is secreted exclusivelyby moderately starved, sexually mature type I cells. Moreover, synthesis of gamone 1 is further promoted by gamone2 which is secreted by cells of mating type II. It was clearly shown in our laboratory that the expression of gamone1 was regulated by its transcription level in various conditions. In this study, we aimed to find the transcriptionregulatory region of the gamone 1 gene. First, we determined the genomic sequence of the gamone 1 gene, and foundthat an intron was not included in the gene. Second, we amplified the 5'-flanking region of the gamone 1 gene usinginverse PCR, and an upstream sequence of 868 bp was determined. The sequence contained a proximal sequence element(PSE)-like sequence, which is considered to be the transcriptional regulatory sequence for RNA polymerase III, a TATAbox sequence, CCAAT box sequence, and several recognition sequences of various transcription factors.[ 目 的 ] Blepharisma japonicumには 相 補 的 な 接 合 型 であるI 型 とII 型 がある。 性 的 に 成 熟 し、かつ 適 度 な 飢餓 状 態 にある 両 者 が 出 会 うと、 接 合 対 が 形 成 され、一 連 の 有 性 生 殖 過 程 が 引 き 起 こされる。この 接 合 対形 成 は、それぞれの 細 胞 が 放 出 するガモンという 物質 により 誘 導 される。これまでに、I 型 細 胞 が 合 成し、 分 泌 する 接 合 誘 導 物 質 であるガモン1のcDNAの塩 基 配 列 が 決 定 され、またガモン1の 発 現 は 接 合型 、 性 成 熟 度 、 栄 養 条 件 、ガモン2などの 条 件 により 転 写 レベルで 制 御 されていることが 本 研 究 室 により 明 らかにされている 1) 。しかしガモン1 遺 伝 子 のゲノム 遺 伝 子 の 配 列 はまだ 明 らかにされておらず、転 写 調 節 機 構 についての 研 究 も 進 められていない。そこで 本 研 究 では、ガモン1 遺 伝 子 の 転 写 調 節 機構 を 解 明 するための 第 一 段 階 として、 接 合 型 Iの 細 胞におけるガモン1 遺 伝 子 のゲノム 配 列 と5´ 側 上 流 配列 を 決 定 することを 目 的 とした。[ 材 料 と 方 法 ] ブレファリズマのI 型 細 胞 (B. japonicum,R1072 株 )からゲノムDNAを 抽 出 し、ガモン1のcDNA 配 列 のほぼ 端 と 端 からORFを 全 て 含 むように設 計 したプライマーを 用 いてPCRを 行 い、 増 幅 されたPCR 産 物 のクローニング 及 びシークエンスを 行 った。さらに、 決 定 した 配 列 から 新 たにプライマーを設 計 し、Sau3 AI, Hind IIIによってそれぞれ 制 限 酵 素処 理 したゲノムDNAを 用 いてインバースPCRを 行い、 増 幅 されたインバースPCR 産 物 のクローニング及 びシークエンスを 行 った。アライメントの 解 析 にはClustalWを、 上 流 配 列 における 転 写 調 節 因 子 の 結合 領 域 予 測 にはTF SEARCHを 用 いた。[ 結 果 と 考 察 ] まずPCRによってガモン1 遺 伝 子 をコードしている 領 域 を 増 幅 させたところ、 約 1000 bpのPCR 産 物 が 得 られ、この 産 物 のクローニング 及 びシークエンスを 行 い、ゲノム 配 列 933 塩 基 を 決 定 した。この 配 列 とcDNAの 配 列 をアライメントさせると

30 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年完 全 に 一 致 し、イントロンを 含 んでいないことが 明らかになった。B. japonicumにおいてはα-tubulin 2) やHSP-90 3) のゲノム 遺 伝 子 がすでに 単 離 されており、これらもイントロンを 含 んでいないことが 分 かっている。 次 に、Sau3 AIによって 制 限 酵 素 処 理 したゲノムDNAを 用 いてインバースPCRを 行 うと、 約 150 bpのPCR 産 物 が 得 られ、この 産 物 のクローニング 及 びシークエンスを 行 い、ガモン1 遺 伝 子 の5´ 側 上 流 配列 を112 塩 基 決 定 した。そして 決 定 した 配 列 から 新 たにプライマーを 設 計 し、Hind IIIによって 制 限 酵 素 処理 したゲノムDNAを 用 いて 再 度 インバースPCRを行 ったところ、より 大 きな 断 片 を 増 幅 することができ、 最 終 的 にガモン1 遺 伝 子 の5´ 側 上 流 配 列 を868塩 基 決 定 した。 決 定 したガモン1 遺 伝 子 の 上 流 配 列をTF SEARCHを 用 いて 解 析 したところ、TATAボックスが2 箇 所 、また 繊 毛 虫 のRNAポリメラーゼIIIで転 写 される 遺 伝 子 のプロモーター 構 造 で 共 通 して 見4)られるPSE 配 列 、そしてCCAATボックスなどのプロモーター 構 造 が 見 られ、また 様 々な 転 写 因 子 の 認識 配 列 が 見 られた。 例 えば 飢 餓 ストレスなどで 働 く転 写 因 子 として 知 られるCREBや HSFの 認 識 配 列 が見 られ、これらはガモン1 遺 伝 子 の 転 写 開 始 必 須 条件 でもある 飢 餓 刺 激 と 何 らかのかかわりがある 可 能性 もある。今 後 は、I 型 とII 型 それぞれの 細 胞 におけるガモン1 遺 伝 子 の 上 流 領 域 を 比 較 することや、 上 流 配 列 のさまざまな 領 域 を 欠 失 させることによって、 実 際 にどの 転 写 制 御 因 子 や 領 域 がガモン1 遺 伝 子 発 現 の 制御 に 関 わっているのかについて 実 験 的 に 調 べる 必 要がある。また、ガモン1 遺 伝 子 の 転 写 制 御 に 関 わる領 域 は、より5´ 上 流 または3´ 下 流 に 存 在 することも 考 えられるのでより 広 い 範 囲 での 塩 基 配 列 の 決 定を 試 みるつもりである。[ 文 献 ]1) Harumoto, T. and Sugiura, M. (2003) Jpn. J. Protozool.,36(2), 147-172 (in Japanese).2) Tourancheau, A.B., Villalobo, E., Tsao, N., Torres, A.and Pearlman, R.E. (1998) Mol. Phylogenet. Evol. 10(3), 299-309.3) Leander, B.S. and Keeling, P.J. (2004) J. Phycol. 40(2),341-350.4) Hargrove, B.W., Bhattacharyya, A., Domitrovich,A.M., Kapler, G.M., Kirk, K., Shippen, D.E. andKunkel, G.R. (1999) Nucleic Acids Res. 27(21), 4269-4275.ブレファリスマにおける 光 刺 激 応 答 性グルタチオンS-トランスフェラーゼ 遺 伝 子 の 解 析高 田 雄 一 , 松 岡 達 臣 ( 高 知 大 ・ 理 ・ 生 物 )Analysis of glutathione S-transferase gene inducedby light stimulation in Blepharisma japonicumYuichi TAKADA and Tatsuomi MATSUOKA (Dept. Biol., Fac. Sci., Kochi Univ.)SUMMARYThe ciliated protozoan Blepharisma japonicum possesses a photosensitive pigment called blepharismin that causesthe generation of reactive oxygen species (ROS) such as hydroxyl radicals and singlet oxygen. In order to elucidate themechanism of resistance to photooxidative stress caused by ROS, cDNA clones induced by light stimulation were isolatedfrom a cDNA library of B. japonicum by a differential screening method, and their light-dependent expression was

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)31checked by semi-quantitative RT-PCR analysis. Sequence analysis showed that one of these clones encodes glutathioneS-transferase (GST), which is known as an antioxidative enzyme. Further cDNA library screening with a B. japonicumGST (BjGST1) cDNA probe revealed the presence of another GST cDNA (BjGST2), and the two BjGST (BjGST1 andBjGST2) clones showed 86% sequence identity at the amino acid level. Both BjGST sequences were overexpressed inEschericia coli, and the quaternary structure was investigated using gel filtration chromatography and Native-PAGE. Itwas found that BjGST could form homodimers and heterodimers. Furthermore, Southern blot analysis showed that thetwo BjGST genes were tandemly arranged in the Blepharisma genome. These results indicate that Blepharisma GSTscould act cooperatively in response to photooxidative stress.[ 目 的 ] 繊 毛 虫 Blepharisma japonicumはブレファリスミンと 呼 ばれる 光 感 受 性 色 素 を 有 している。この 色素 はこれまでの 研 究 において2つの 機 能 、1) 光 回避 行 動 の 起 点 となる 1 、2) 外 敵 からの 防 御 物 質 としてはたらく 2 ということが 知 られている 一 方 で、 光 条件 下 においてヒドロキシルラジカルや 一 重 項 酸 素 といった 活 性 酸 素 種 を 発 生 させることが 分 かっている3,4 。 活 性 酸 素 は 生 体 内 において 細 胞 傷 害 性 の 反 応 を引 き 起 こし、 老 化 や 細 胞 死 といった 現 象 と 密 接 に 関わっている 5 。 本 研 究 では、Blepharismaが 活 性 酸 素 に起 因 する 光 酸 化 ストレスに 対 してなんらかの 耐 性 機構 を 備 えているはずであるという 仮 説 を 立 てた。そして、それを 実 証 するために、 光 刺 激 に 応 答 して 発現 する 遺 伝 子 の 探 索 、ならびにその 機 能 ・ 構 造 解 析をおこなった。[ 材 料 と 方 法 ] Differential screening 法 :24 時 間 光 条 件下 (5 W/m -2 )に 置 いたB. japonicumからmRNAを 抽 出し、cDNAライブラリーを 作 製 した。 次 に、 光 条 件下 、 暗 条 件 下 に 置 いた 細 胞 からそれぞれcDNAプローブを 調 整 し、プラークハイブリダイゼーションをおこない、 光 条 件 下 で 特 異 的 に 発 現 する 遺 伝 子 をスクリーニングした。 発 現 の 最 終 的 な 確 認 は 半 定 量 的RT-PCR 法 でおこなった。リコンビナントタンパク 質 の 発 現 と 精 製 : 発 現 ベクター(pET も し く は pMAL)を 構 築 後 、 大 腸 菌BL21 株 を 形 質 転 換 した。タンパク 質 の 精 製 はGSTrapFF(Amersham Biosciences)を 用 いておこなった。多 量 体 形 成 の 検 討 :ゲル 濾 過 カラムSuperdex 75(Pharmacia Biotech)を 用 いたクロマトグラフィーとNative-PAGEによって 多 量 体 形 成 の 可 能 性 を 検 討 した。サザンブロッティング:5 µgの 大 核 DNAを 制 限 酵素 (Hind III, Sac I, Xba I)を 用 いてそれぞれ 消 化 し、電 気 泳 動 により 分 離 した。ナイロンメンブレンにトランスファーした 後 、cDNAプローブを 用 いて 検 出 した。[ 結 果 と 考 察 ] スクリーニングおよび 半 定 量 的 RT-PCRの 結 果 から、4 種 類 の 遺 伝 子 が 光 刺 激 に 応 答 して 発 現 することを 確 認 した。 決 定 した 部 分 塩 基 配 列についてBlastXプログラムにより 相 同 性 検 索 をおこなった 結 果 、その 中 の1 種 類 については 他 生 物 種 のGlutathione S-transferase(GST)と 相 同 性 を 示 した 6 。B. japonicumのGSTについてさらに 検 討 するために、今 回 スクリーニングされたGST ホモログ 遺 伝 子(BjGST1)をプローブとしてcDNAライブラリーをスクリーニングしたところ、 新 たにBjGST2を 得 た。2つの 遺 伝 子 の 推 定 アミノ 酸 配 列 は86% 一 致 し、さらにBjGST2の 発 現 もまた 光 刺 激 によって 誘 導 されることを 確 認 した。 次 に、BjGST 分 子 のサブユニット構 造 を 検 討 するためにリコンビナントタンパク 質 の発 現 をおこなった。rBjGST1(pET で 発 現 、25kD)、rBjGST2(pET で 発 現 、25 kD)、rBjGST2-MBP(MBP 融 合 タンパク 質 としてpMALで 発 現 、65kD)の3 種 類 のタンパク 質 を 発 現 させ、ゲルろ 過 クロマトグラフィーとNative-PAGEで 解 析 したところホモダイマーを 形 成 することが 明 らかになった。また、rBjGST1とrBjGST2-MBPを 同 時 に 発 現 させた 場合 、Native-PAGE 上 で3つのバンドが 確 認 できたことからBjGST1とBjGST2のヘテロダイマーが 形 成 されることも 強 く 示 唆 された。また、サザンブロッティングの 結 果 から2つのGST 遺 伝 子 はゲノム 上 にタンデムに 配 置 していることが 明 らかになった。 以 上 の結 果 から、BjGST1とBjGST2が 光 刺 激 (おそらくは光 酸 化 ストレス)に 対 して 協 調 的 に 働 いていることが 示 唆 された。[ 文 献 ]1) Matsuoka, T. et al. (1995) Photochem. Photobiol. 62,190-193.2) Noda Terazima, M. et al. (1999) Photochem. Photobiol.

32 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年69, 47-54.3) Kato, Y. et al. (1996) J. Photochem. Photobiol. 34, 29-33.4) Checcucci, G. et al. (1991) J. Photochem. Photobiol. 11,49-55.5) Cabiscol, E. et al. (2000) Int. Microbiol. 3, 3-8.6) Takada, Y. et al (2004) FEMS Microbiol. Lett. 231,185-189.ミドリムシEuglena gracilis の 膜 内 在 性 タンパク 質 IP39の 分 子 生 物 学 的 解 析末 友 靖 隆 , 洲 崎 敏 伸 ( 神 戸 大 ・ 理 ・ 生 物 )Molecular biological analyses of IP39, the intramembrane protein of Euglena gracilisYasutaka SUETOMO and Toshinobu SUZAKI(Department of Biology, Faculty of Science, Kobe University)SUMMARYThe euglenoid flagellates perform a characteristic movement called euglenoid movement. Intramembrane proteinscalled IP39, which are regularly and densely arranged in the plasma membrane, have been implicated in this movement.We carried out PCR-based cDNA cloning of IP39 from Euglena gracilis in our previous studies, and found two types ofIP39-encoding cDNAs (α- and β-types). The α- and β-type cDNAs consisted of 792 and 795 base pairs, respectively.Between α- and β-type cDNAs, differences were found over the whole sequence. However, between the deduced aminoacid sequences, differences were restricted to the C-terminal region, except for two residues in the middle part. To examinethe expression of these two types of IP39 mRNA, we carried out northern blot analyses of mRNA extracted fromcells in the logarithmic growth phase. The specific DNA probes were designed from the 3' untranslated region of theIP39 mRNA. Results of northern blotting showed that both mRNAs are expressed in the cell and suggested that expressionlevels of the two types of IP39 mRNA were similar.[ 目 的 ] ユーグレナ 類 は、 古 くからユーグレナ 運 動 と呼 ばれる 活 発 な 細 胞 変 形 運 動 を 行 うことが 知 られている(1)。この 運 動 の 仕 組 みとして、ユーグレナ 類 の一 種 であるEuglena gracilis では、 細 胞 体 表 面 全 体 を覆 う 膜 状 外 被 ペリクルの 細 胞 膜 中 に 密 に 規 則 正 しく存 在 する 膜 内 在 性 タンパク 質 IP39の 構 造 変 化 が 細 胞表 層 部 の 湾 曲 を 引 き 起 こすことで 細 胞 の 変 形 が 生 じるという 仮 説 が 提 唱 されている(2)。そこで 本 研 究 では、IP39のユーグレナ 運 動 に 対 する 関 与 を 明 らかにするために、IP39タンパク 質 のcDNAのPCRクローニングを 行 い、その 結 果 を 基 に、 種 々の 分 子 生 物 学 的解 析 を 行 った。[ 材 料 と 方 法 ] Euglena gracilis の 膜 内 在 性 タンパク 質IP39のN 末 端 アミノ 酸 配 列 データを 基 にプライマーを設 計 し、それを 用 いてcDNAのPCRクローニングを行 った。アミノ 酸 配 列 解 析 にはALL-IN-ONE-SEQ-ANALYZERを、 相 同 性 検 索 にはBLASTを 用 いた。Northern blot 解 析 に 用 いたIP39の 二 種 類 の 型 それぞれに 特 異 的 に 結 合 するDNAプローブは、ともにIP39mRNAの3’ 非 翻 訳 領 域 の 一 部 を 用 い、α 型 では176bp、β 型 では150 bpの 全 長 となるように 設 計 し、DIG(Digoxigenin)をラベリングした。また、 解 析 に 用いたEuglena のmRNAには、 対 数 増 殖 期 にある 細 胞 を液 体 窒 素 で 瞬 間 凍 結 したうえで、 抽 出 、 精 製 したものを 用 いた。[ 結 果 と 考 察 ] IP39のcDNAの 塩 基 配 列 を 解 析 した 結果 、2 種 類 のcDNAが 見 つかった。そこで 我 々は、 一方 をα 型 、もう 一 方 をβ 型 と 名 付 けた。α 型 は792 塩

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)33基 、β 型 は795 塩 基 から 構 成 されていた。α 型 とβ 型 の塩 基 配 列 の 間 には、 全 体 に 渡 って 違 いが 見 られ、 相同 性 は 約 88%であった。また、α 型 とβ 型 のアミノ 酸配 列 の 間 には、C 末 端 付 近 とその 他 一 部 のアミノ 酸残 基 に 違 いが 見 られ、 相 同 性 は94%であった。さらに、α 型 、β 型 は 共 に、 全 ての 構 造 予 測 において、ほぼ 同 じ 結 果 が 得 られた。 相 同 性 検 索 の 結 果 、 既 存 のどのタンパク 質 とも 高 い 相 同 性 が 見 られなかったことから、IP39は 新 しいタンパク 質 であることが 示 された。 膜 貫 通 領 域 予 測 、 及 びタンパク 質 局 在 部 位 予測 、2 次 構 造 予 測 の 結 果 と 過 去 のIP39に 関 する 研 究 論文 の 結 果 (3-6)を 総 合 すると、IP39は2 回 膜 貫 通 型 タンパク 質 である 可 能 性 が 最 も 高 いことが 示 唆 された。Northern blot 解 析 により、IP39の2 種 類 の 型 のmRNAレベルでの 発 現 量 を 調 べたところ、α 型 、β 型 ともに同 程 度 であることが 確 認 できた。 過 去 の 研 究 (2)で、Euglena の 細 胞 膜 中 におけるIP39の 配 列 は、2つの 形の 異 なるタンパク 顆 粒 から 構 成 される 瓢 箪 型 ユニットの 規 則 的 なパターンから 構 成 されており、そのパターンがユーグレナ 運 動 時 の 細 胞 形 態 変 化 に 応 じて変 化 していることが 確 認 されている。Northern blot 解析 の 結 果 から、 瓢 箪 型 ユニットは、α 型 とβ 型 が 一 組となって 形 成 されているのかもしれない。 現 在 は 本研 究 結 果 を 基 に、RNAi 技 術 を 用 いたIP39タンパク 質の 発 現 抑 制 を 試 み、IP39とユーグレナ 運 動 の 間 の 関連 性 を 探 っている。 今 後 は、α 型 とβ 型 の 細 胞 内 での局 在 性 について 調 べ、さらに、IP39がどのようにユーグレナ 運 動 に 関 与 しているのかを 解 明 していく予 定 である。[ 文 献 ]1) Suzaki, T. and Williamson, R. E. (1985) Protoplasma124, 137-146.2) Murata, K. et al. (2000) Protoplasma 214, 73-79.3) Dubreuil, R. R. and Bouck, G. B. (1985) J. Cell Biol.,101, 1884-1896.4) Dubreuil, R. R. et al. (1988) J. Cell Biol., 107, 191-200.5) Fazio, M. J. et al. (1995) J. Euk. Microbiol., 42, 570-579.6) Murata, K. and Suzaki, T. (1998) Protoplasma 203,125-129.繊 毛 虫 Sterkiella cavicola のシスト 形 成 ・ 脱 シスト 時 における140 kDタンパク 質 の 消 長 と 小 核 クロマチンの 微 細 構 造 変 化小 田 明 日 香 1 , 松 坂 理 夫2 ( 1 熊 本 大 ・ 自 然 科 学 ・ 自 然 システム, 2 熊 本 大 ・ 理 ・ 理 )Appearance and disappearance of the 140 kD protein of the ciliate,Sterkiella cavicola, and the ultrastructural changes of micronuclearchromatins during encystment and excystmentAsuka ODA 1 and Tadao MATSUSAKA 2( 1 Syst.Nat.Env.,Grad.Sch.Sci.Technol.,Kumamoto Univ., 2 Dept.Sci.,Fac.Sci.,Kumamoto Univ.)SUMMARYHongo (1984) has discovered a cyst specific 140 kD protein in the ciliate, Sterkiella cavicola, assuming its localizationin the outermost layer of the cyst wall. Himura (1993) has made clear that this protein localizes in the cystic micronuclearchromatins by immunoelectron microscopy. Kikukawa (1996) has shown that the cysts contain 2 types of micronuclei,with thin compact chromatins and with thick rough chromatins, and that the 140 kD protein is recognized only inthe micronuclei with thin compact chromatins. In order to elucidate the function of the 140 kD protein, we compared theappearance and disappearance of the protein by Western blotting technique and the ultrastructural changes of micronu-

34 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年clear chromatins during encystment and excystment. The results of the Western blots indicated that the 140 kD proteinappeared at the stage 4-5 of the encystment, and remained in the ciliates immediately after excystment but disappearedduring a few hours after excystment. Ultrastructurally the thin compact chromatins were first found at the stage 5 of theencystment, and remained immediately after excystment but was not found in the cells a few hours after excystment. Wesupposed that the 140 kD protein condensed micronuclear chromatins and the condensation of chromatins might protectgenetic information of the cyst against adverse environmental conditions.[ 目 的 ] 本 研 究 で 用 いた 繊 毛 虫 Sterkiella cavicolaは 環境 が 悪 化 するとシストを 形 成 して 休 眠 し、 環 境 が 改善 すると 脱 シストして 栄 養 増 殖 活 動 を 再 開 する。 当研 究 室 ではこれまで、この 繊 毛 虫 のシスト 形 成 に 関する 様 々な 研 究 を 行 ってきた。 本 郷 (1984) はシスト特 有 の140kDタンパク 質 を 発 見 し、このタンパク 質はシスト 壁 最 外 層 に 存 在 すると 推 論 した。 樋 村(1993) はこのタンパク 質 に 対 する 抗 体 を 作 成 し、140kDタンパク 質 がシスト 壁 最 外 層 ではなく、シストの 小 核 に 存 在 することを 明 らかにした。 更 に、 菊川 (1996)は 樋 村 (1993) が 作 成 した 抗 体 を 用 いて、シストには 栄 養 体 に 存 在 するクロマチンが 太 く( 径 約50nm) 粗 い 小 核 ( 栄 養 体 型 小 核 )とクロマチンが 細 く( 径 約 25nm) 密 に 凝 縮 した 小 核 (シスト 型 小 核 )の2種 類 が 存 在 することを 明 らかにし、140kDタンパク質 はシスト 型 小 核 クロマチンにのみ 存 在 することを示 した。 本 研 究 ではシスト 形 成 および 脱 シストの 過程 における140kDタンパク 質 の 消 長 と、 透 過 型 電 顕によるシスト 小 核 のクロマチンの 形 態 変 化 を 観 察し、140kDタンパク 質 とクロマチン 凝 縮 との 関 わりを 明 らかにし、クロマチン 凝 縮 の 持 つ 意 義 を 推 定 することを 目 的 とした。[ 材 料 と 方 法 ] 繊 毛 虫 をChrologonium elongatumを 餌として 培 養 し、シスト 形 成 過 程 の 研 究 にはMatsusaka(1979)の 方 法 で 同 調 的 なシスト 形 成 を 誘 導 した。 多数 のシストを 必 要 とする 場 合 には、 餌 を 消 費 し 尽 くした 繊 毛 虫 をそのまま 放 置 し 自 然 にシストを 形 成 させた。 脱 シストの 誘 導 はシストを0.1% 野 菜 マッシュ溶 液 に 移 すことで 行 った。シスト 形 成 及 び 脱 シストの 誘 導 後 、 適 当 な 時 間 間隔 でSDS-PAGE 用 サンプルと 電 顕 用 サンプルの 作 成を 行 った。SDS-PAGE 用 サンプルは7.5%アクリルアミドゲルで 電 気 泳 動 し、ウェスタンブロッティングを 行 った。 形 態 観 察 のための 電 顕 用 サンプルはグルタルアルデヒド・オスミウム 混 合 液 で 固 定 し、エポキシ 樹 脂 で 包 埋 した。 免 疫 電 顕 用 のシストは 急 速 凍結 後 アセトンで 置 換 し、L-Rホワイト 樹 脂 で 包 埋 した。 包 埋 した 試 料 をガラスナイフを 用 いて 超 薄 切 片を 作 成 し、 抗 体 染 色 後 あるいは 直 接 電 子 染 色 を 施 して 観 察 した。[ 結 果 と 考 察 ] ウェスタンブロッティングの 結 果 、140kDタンパク 質 はシスト 形 成 のステージ4~5の 段階 で 出 現 し、 脱 シスト 直 後 まで 保 持 されており、 最終 的 な 消 失 には 脱 シスト 後 数 時 間 かかることが 明 らかになった。シスト 形 成 及 び 脱 シストの 過 程 を 電 子顕 微 鏡 で 観 察 した 結 果 、i) 栄 養 体 とシストでは 細 胞内 部 の 様 子 ( 細 胞 質 やミトコンドリア)が 異 なること、ii) 栄 養 体 ではシスト 型 小 核 が 発 見 できないこと、iii)シスト 形 成 末 期 のシスト 壁 ができ 始 めた 細胞 にはシスト 型 小 核 が 存 在 すること、iv) 脱 シスト直 後 の 栄 養 体 と 同 じように 遊 泳 している 個 体 でもシスト 型 小 核 から 栄 養 体 型 小 核 へ 移 行 中 と 思 われる 小核 が 存 在 していることなどが 明 らかになった。このように、ウェスタンブロッティングによる140 kDタンパク 質 の 消 長 と 電 顕 観 察 によるシスト 型 小 核 の 出現 ・ 消 失 のステージがほぼ 一 致 した。免 疫 電 顕 法 によって、140 kDタンパク 質 はシスト型 小 核 の 凝 縮 したクロマチンに 存 在 することが 明 らかになっており、140 kDタンパク 質 はシスト 形 成 のほとんど 最 終 段 階 で 形 成 され、 徐 々にクロマチンを凝 縮 させているのではないかと 推 定 される。その後 、 脱 シストが 始 まると140kDタンパク 質 は 徐 々に消 失 していき、それまで 凝 縮 されていたクロマチンがほどかれて 栄 養 体 型 小 核 へと 戻 り、 再 び 分 裂 を 始めるのではないかと 推 定 される。シストには 栄 養 体型 小 核 とシスト 型 小 核 の2 種 類 が 存 在 する。 元 々 栄 養体 に 存 在 する1 種 類 の 小 核 がどのような 基 準 でシスト型 小 核 として 選 ばれクロマチンが 凝 縮 されるのかはわかっていない。しかし、 休 眠 状 態 から 活 動 を 再 開するまで、シスト 型 小 核 はクロマチンを 凝 縮 させることで 自 身 の 遺 伝 情 報 を 保 護 しているのではないだろうか。 今 後 、シスト 小 核 の 役 割 についてさらに 研究 を 進 める 必 要 がある。

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)35[ 文 献 ]Himura, M.(1993)Master’s thesis, Kumamoto Univ.本 郷 文 和 (1984) 熊 本 大 学 修 士 論 文菊 川 雅 子 (1996) 熊 本 大 学 卒 業 論 文Matsusaka, T.(1979)J. Protozool., 26, pp. 619-625Colpoda sp. におけるシスト 形 成 抑 制 因 子 の 研 究木 田 明 美 , 松 岡 達 臣 ( 高 知 大 ・ 理 ・ 生 物 科 学 )Suppressing factors for encystment in Colpoda sp.Akemi KIDA and Tatsuomi MATSUOKA (Inst. Biol, Fac. Sci., Kochi Univ.)SUMMARYCa 2+ -induced encystment of Colpoda sp. is cancelled by bacterial products such as proteins and peptides in the surroundingmedium. In the presence of bovine serum albumin (BSA), suppression of Ca 2+ -induced encystment occurredconcomitantly with uptake of BSA into endocytic vesicles. Such suppression of encystment was not affected when endocytosiswas inhibited by chlorpromazine. The result suggests that the suppression of encystment is not correlated withendocytosis and/or nutrient supply via endocytosis. In order to elucidate whether the Colpoda cells detect the specificconformation of the proteins or peptides, we examined the suppression effects of BSA, peptides obtained by digestion ofBSA, or a mixture of the total amino acids constituting BSA, on Ca 2+ -induced encystment. All of them had a markedencystment-suppression effect, implying that the receptors involved in suppression of encystment might recognize sidechains of amino acids or certain structures common between amino acid residues and free amino acids.[ 目 的 ] 繊 毛 虫 コルポーダ(Colpoda sp.)のシスト 形成 は 外 液 塩 濃 度 の 上 昇 ( 主 としてCa 2+ )によって 誘導 される 1) が、 外 液 中 に 放 出 されたバクテリア 由 来成 分 (タンパク 質 やペプチドなどの 低 分 子 )によって 抑 制 される 2) 。 外 液 に 存 在 するタンパク 質 などはエンドサイトーシスを 介 して 細 胞 内 に 取 り 込 まれるので、シスト 化 の 抑 制 機 構 がエンドサイトーシスのプロセスやエンドサイトーシスを 介 した 栄 養 供 給 と 関係 があるかもしれない。 本 研 究 では、シスト 化 の 抑制 は、エンドサイトーシスのプロセスやこれによってもたらされる 栄 養 供 給 と 関 連 があるかどうかについて 検 討 し、これらの 間 に 関 連 性 がないことを 示 唆した。シスト 化 の 抑 制 は、コルポーダ 栄 養 細 胞 の 受容 体 が 外 液 に 存 在 するタンパク 質 やペプチドの 立 体構 造 を 認 識 することによってもたらされると 推 察 される。そこで、ウシ 血 清 アルブミン(BSA)とその消 化 産 物 および 遊 離 のアミノ 酸 を 用 いてCa 2+ 依 存 的シスト 誘 導 に 対 する 抑 制 効 果 を 調 べた。[ 材 料 と 方 法 ] Colpoda sp.はバクテリア(Enterobacteraerogenes)を 植 え 付 けた0.1% 麦 葉 浸 出 液 で 培 養 した。シスト 形 成 は、 脱 シスト 後 培 養 2 日 目 の 細 胞 を時 計 皿 ( 直 径 5 cm)に 満 たしたシスト 誘 導 用 塩 類 溶液 (1mM CaCl 2 , 1mM KCl, 5mM Tris-HCl, pH 7.2)で数 回 洗 った 後 、 同 液 に50~100 細 胞 /mlの 密 度 で 懸 濁 することによって 誘 導 した。BSAをトリプシン 消 化 する 場 合 は、BSA 量 1に 対 して1/10 量 のトリプシンを 反応 液 (2% 2-メルカプトエタノール, 10 mM NH 4 HCO 3を 含 む)に 加 え、37℃で48 時 間 処 理 した。 処 理 後 、遠 心 して(8,000g, 10 分 ) 沈 殿 を 取 り 除 き、 透 析チューブ( 分 画 分 子 量 :100)を 用 いて 塩 類 溶 液 中 で72 時 間 透 析 ( 氷 上 )した。BSAの 消 化 産 物 の 濃 度 は280nmにおける 吸 光 度 から 推 定 した。[ 結 果 と 考 察 ] コルポーダをシスト 誘 導 用 塩 類 溶 液(1mM CaCl 2 , 1mM KCl, 5mM Tris-HCl, pH 7.2)に 移すと、 数 時 間 以 内 にシスト 形 成 が 誘 導 される。このようなCa 2+ 依 存 的 に 誘 導 されるシスト 形 成 はBSA(2

36 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年mg/ml, 0.03 mM)を 含 む 塩 類 溶 液 中 で 著 しく 抑 制 された。BSAはエンドサイトーシスによって 細 胞 内 に取 り 込 まれる。したがって、BSAによるシスト 化 の抑 制 がエンドサイトーシスを 介 した 栄 養 供 給 と 関 係があるかも 知 れない。そこで、クロルプロマジン(0.5μg/ml)によりエンドサイトーシスを 阻 害 した 条 件 下 でシスト 化 の 抑 制 がおきるかどうかを 調 べた 結 果 (エンドサイトーシスが 抑 制 されていることはBSA-FITCにより 確 認 )、シスト 化 抑 制 には 全 く 影響 がみられなかった。このことから、シスト 形 成 の抑 制 は、 受 容 体 によるBSA 分 子 の 認 識 を 含 む 一 連 のエンドサイトーシスおよび 栄 養 供 給 のプロセスとは独 立 したシグナリング 機 構 によってもたらされることが 示 唆 される。Ca 2+ 依 存 的 に 誘 導 されるシスト 形 成 の 抑 制 は、コルポーダ 栄 養 細 胞 がBSAの 高 次 構 造 を 認 識 することによってもたらされる 可 能 性 がある。そこでBSAのトリプシン 消 化 産 物 (ペプチド 断 片 )の 効 果 を 調 べた。この 場 合 もBSAと 同 様 に 顕 著 なシスト 化 抑 制 効果 が 認 められた。この 結 果 は、コルポーダ 細 胞 表 層に 存 在 すると 推 定 される 受 容 体 がBSAの 高 次 構 造 を認 識 するのではないことを 示 している。さらに、 短いペプチド 鎖 が 形 成 するコンフォメーションが 受 容体 を 活 性 化 することが 考 えられるため、BSAを 構 成するアミノ 酸 組 成 を 求 め、2 mg/ml BSAの 酸 加 水 分 解によって 得 られる 組 成 に 相 当 する 遊 離 アミノ 酸 混 合液 を 作 成 した( 水 に 難 溶 なアミノ 酸 は 除 いた)。このアミノ 酸 混 合 液 も 顕 著 なシスト 化 抑 制 作 用 を 示 したことから、BSAやペプチドによるシスト 化 抑 制 作用 はそれを 構 成 するアミノ 酸 残 基 の 側 鎖 に 起 因 することが 示 唆 される。 特 別 な 側 鎖 が 認 識 されるのかどうかを 知 るために、 複 数 の 水 溶 性 アミノ 酸 (1 mM)の 効 果 を 調 べた 結 果 、どのアミノ 酸 もシスト 化 を 抑制 する 傾 向 がみられた(アラニン、グルタミン、トレオニン、ヒスチジン、フェニルアラニンは 有 意 に抑 制 ; p ≦ 0.05, Mann-Whitney test)。この 結 果 から、シスト 化 抑 制 に 関 わる 受 容 体 が 存 在 する 場 合 、 次 のような 可 能 性 が 推 察 される。(1)それぞれのアミノ酸 側 鎖 に 対 応 した 受 容 体 が 存 在 する;(2) 単 一 または 少 数 の 受 容 体 がアミノ 酸 側 鎖 中 の 共 通 構 造 を 認 識する:(3) 単 一 の 受 容 体 がアミノ 酸 残 基 と 遊 離 アミノ 酸 に 共 通 する 基 本 骨 格 を 認 識 する。[ 文 献 ]1) Yamaoka M. et al. (2004) Acta Protozool. 43: 93 - 982) Yamasaki C. et al. (2004) Jpn. J. ProtoZool. 37:111-117ゾウリムシの Clonal Aging におけるテロメアの 伸 張太 田 聡 , 芳 賀 信 幸 ( 石 巻 専 修 大 ・ 理 工 )Evidences for the increase of telomere length with clonal agingin Paramecium caudatumSatoshi OHTA and Nobuyuki HAGA (Dept. of Biotech. Ishinomaki Senshu Univ.)SUMMARYTelomere shortening is associated with proliferative senescence in cultured human cells. However, stable maintenanceof telomere length is found in proliferative senescence in Paramecium tetraurelia. In previous studies of P. caudatum,we found that the length of telomeres increased for about 700 fissions after conjugation. In this study we altered theconditions of Southern hybridization by changing both the non-RI detection system and the length of telomere probes.The biotin-labeled telomere probes (TTGGGG: 4 repeats) enabled us to increase the hybridization temperature from42.5°C to 68°C. Under these conditions, we have reconfirmed that the signals obtained in the previous experiments werefrom the terminal restriction fragments. Furthermore, under the new experimental conditions, we could estimate the telomereelongation ratio as about 2.5 bp per cell division in KNZ52 strain and about 1.0 bp per division in SOS2. How-

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)37ever, there was no statistically significant difference between the two strains. Paramecia have detectable telomerase reversetranscriptase (TERT) activity during sexual maturation and until about 170 fissions after conjugation. Althoughthere is no information about TERT activity in senescent cells, this enzyme is one of the candidates for telomere elongation.In some cell lines, homologous recombination is thought to be an alternative mechanism. Our results suggest thattelomere length may be useful as a molecular indicator of the clonal age in P. caudatum. For an understanding of thebiological meaning of telomere elongation, it would be necessary to establish methods of artificial manipulation of telomerelength in future.[ 目 的 ] ゾウリムシ ( Paramecium caudatum ) は 細 胞 分裂 齢 およそ700 回 で 死 を 迎 えるまでに、 細 胞 増 殖 速 度の 低 下 や 子 孫 の 生 存 率 の 低 下 などの 細 胞 分 裂 齢 に 依存 した 細 胞 機 能 の 低 下 を 起 こす。しかしながら、ヒト 培 養 細 胞 に 見 られるような 細 胞 分 裂 齢 に 依 存 したテロメアの 短 縮 は 確 認 されていない。ヨツヒメゾウリムシ( P. tetraurelia ) では 生 涯 を 通 して 細 胞 分 裂 齢に 依 存 したテロメア 長 の 著 しい 変 化 は 起 こらないことが 報 告 されている 1) 。また、ゾウリムシでは 分 裂 齢170 回 まではテロメアが 伸 張 することが 報 告 されている 2) 。本 研 究 では 分 裂 齢 およそ600 回 の 老 化 の 兆 候 が 見 られる 細 胞 においてもテロメアが 伸 張 しているということを 第 35 回 大 会 で 報 告 した。しかし、 本 研 究 で 用 いた 測 定 法 にはテロメアを 検 出 する 特 異 性 の 点 でまだ改 善 しうる 可 能 性 が 残 されていた。そこで 今 回 、我 々はテロメア 長 を 測 定 するサザンブロットの 系 において、プローブや 標 識 法 などの 条 件 を 検 討 し、より 特 異 的 にテロメアを 検 出 できる 系 を 再 構 築 した。[ 材 料 と 方 法 ] 遺 伝 的 背 景 の 異 なる2つの 株 ( KNZ52,SOS2 ) について 細 胞 分 裂 齢 の 異 なる 細 胞 ( KNZ52 :f=50, 100, 500, 750, 850, 1000. SOS2 : f=50, 350, 500,600, 750, 850)を 準 備 した。 細 胞 分 裂 齢 は 全 ての 細 胞が 同 じ 速 度 で 分 裂 すると 仮 定 して、 試 験 管 に 植 え 継いだ 細 胞 数 と 次 の 試 験 管 に 植 え 継 ぐ 前 の 全 細 胞 数 から 計 測 した。細 胞 老 化 の 指 標 として2つの 株 の 各 分 裂 齢 の 細 胞について 細 胞 増 殖 速 度 を 計 測 し、さらにテロメア 長を 測 定 した。 増 殖 速 度 の 計 測 には、 毎 日 新 しい 培 養液 の 入 ったデプレッションスライドに1 細 胞 ずつ 植 え継 いでいくDaily Isolation Cultureを 用 いた。テロメアの 測 定 法 にはTRFs (Terminal Restriction Fragments) 法を 用 いた。 制 限 酵 素 はこれまでと 同 様 にSsp Ⅰを 用 いたが、プローブがテロメアにハイブリダイズする 特異 性 を 高 くするために 以 下 の 点 を 改 良 した。・プローブの 標 識 法 を 高 温 に 不 安 定 なアルカリフォスファターゼから 安 定 なビオチンに 変 更 し、ハイブリダイゼーションの 温 度 を42.5℃から68℃の 高 温 に設 定 した。・プ ローブのテ ロ メ ア 配 列 の 繰 り 返 しを3 回(TTGGGG) 3 から4 回 (TTGGGG) 4 に 増 やすことでプローブの 非 特 異 的 なハイブリダイズの 可 能 性 を 低 くした。・ハイブリダイゼーションバッファーはSDS 濃 度 の高 い0.5M NaPO 4 (pH7.1), 2mM EDTA, 7% SDS, 0.1%Sodium Pyrophosphateに 変 更 し、プローブの 非 特 異 的なハイブリダイズの 可 能 性 を 低 くした。・シグナルの 検 出 にはBioLabsのPhototope-Star DetectionKitを 用 いた。[ 結 果 ] 細 胞 増 殖 速 度 はKNZ52, SOS2のどちらの 株 においても 細 胞 分 裂 齢 に 依 存 した 低 下 が 確 認 された。それぞれの 増 殖 速 度 は、KNZ52では 分 裂 齢 50 回 で4.0±0.26 fission/day (mean±S.D, n=10)、1000 回 で1.9±0.66 fission/day (mean±S.D, n=10)、SOS2では 分 裂齢 50 回 で 3.7±0.41 fission/day (mean±S.D, n=10) 、850回 で 1.5±1.08 fission/day (mean±S.D, n=10)であった。一 方 、テロメアは2つの 株 において 分 裂 齢 50 回 から750 回 まで 伸 張 していた。このときのテロメア 長 は、KNZ52では 約 0.5kbpから3.0kbpに, SOS2では0.5kbpから1.3kbpに 伸 張 していた。しかし、 分 裂 齢 750 回 以降 の 細 胞 では 伸 張 は 確 認 されなかった。テロメアの伸 張 率 は1 回 の 細 胞 分 裂 でKNZ52では 約 2.5bp, SOS2では 約 1.0bpずつ 伸 張 していると 算 出 されたが、2つの株 の 間 では 統 計 的 に 有 意 な 差 は 確 認 されなかった。[ 考 察 ] 本 研 究 においてテロメアの 測 定 に 用 いた 方 法は、non-RIでのハイブリダイゼーションの 系 では 最もストリンジェンシーの 高 い 系 であり、 今 回 得 られたシグナルには 非 特 異 的 な 配 列 はほとんど 含 まれていないと 考 えられる。 一 方 、 細 胞 分 裂 齢 に 伴 ってテロメアが 伸 張 することから、ゾウリムシのClonalAgingではテロメアが 伸 張 することで 細 胞 増 殖 速 度 の

38 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年低 下 などの 老 化 形 質 が 発 現 する 可 能 性 が 示 唆 された。このことを 確 かめるためには 今 後 テロメア 長 を実 験 的 に 操 作 する 方 法 を 確 立 することが 重 要 であると 考 える。[ 文 献 ]1) D. Gilley., E. H. Blackburn. (1994) Proc. Natl. Acad.Sci. USA. 91, 1955-1958.2) Y. Takenaka., T. Matsuura., N. Haga., Y. Mitsui. (2001)Gene. 264, 153-161.Paramecium tetraureliaにおける 子 孫 のagingに 対 する 親 のageの 影 響荻 野 友 義 , 三 輪 五 十 二 ( 茨 城 大 ・ 理 ・ 自 然 機 能 )The effects of parental age on the aging of offspring in Paramecium tetraureliaTomoyoshi OGINO and Isoji MIWA (Dept. Biol., Fac. Sci., Ibaraki Univ.)SUMMARYIt is known that the germinal age of the parent affects the initial mortality of offspring after fertilization in Parameciumtetraurelia. In this experiment, we examined the length of autogamy immaturity, life span and the fission rate, ofoffspring induced by autogamy for various parental ages and generations. When we examined the initial mortality ofoffspring induced at each parental age, we found, as did the previous study, that the initial mortality of offspring inducedfrom aged parents increased rapidly. Furthermore, the offspring induced from cells after 30 fissions in the second generationshowed a lower initial mortality than that of the parent. The length of autogamy immaturity, life span and agingspeed of offspring, however, were not affected by parental age, and they maintained a constant value in all offspringinduced from every generation. These results indicate that parental age may be reset in a viable offspring induced byautogamy.[ 目 的 ] 親 のageが 子 孫 のagingに 与 える 影 響 として、老 齢 細 胞 による 有 性 生 殖 誘 導 直 後 の 死 亡 率 の 増 加 が知 られている。 今 回 はその 確 認 の 他 、 子 孫 のautogamy 未 熟 期 の 期 間 、 寿 命 、 加 齢 速 度 に 対 して 親のageがどのように 影 響 を 与 えるのか 調 べることを 目的 とした。[ 材 料 と 方 法 ] Paramecium tetraurelia stock 51を 使 った。 毎 回 のisolationを 行 う 間 隔 は、autogamyを 間 に 含むと 細 胞 分 裂 の 周 期 はおよそ18 時 間 になることが 予備 実 験 から 分 かったので、12 時 間 毎 に 行 った。この方 法 で 行 うと 培 養 中 のautogamyを 正 確 に 把 握 できる。 次 世 代 を 得 るために、autogamyの 誘 導 は30 回 分裂 齢 から150 回 分 裂 齢 までの 間 を30 回 分 裂 齢 ごとに3世 代 まで、 計 30 回 行 った。 世 代 誘 導 後 のautogamy 未熟 期 の 長 さはautogamy 率 50%までの 期 間 とした。それぞれのautogamyの 誘 導 はculture agingが 進 まない 時期 に 行 った。また、 加 齢 速 度 を 調 べるためには5 日 間毎 の 分 裂 回 数 の 平 均 を 指 標 とした。autogamy 誘 導 後初 期 に 死 亡 したcloneは、 誘 導 直 後 から 分 裂 速 度 が 遅く、20 回 分 裂 齢 程 度 までに 死 亡 したものとした。このような 方 法 でautogamy 未 熟 期 の 期 間 、 加 齢 速 度 、寿 命 、autogamy 誘 導 後 の 子 孫 の 初 期 死 亡 率 に 対 する親 のageの 影 響 を 調 べた。[ 結 果 と 考 察 ] 今 回 の 実 験 で 以 下 のような 結 果 が 得 られた。1autogamy 誘 導 後 の 子 孫 の 初 期 死 亡 率 は 親 のageが90 回 分 裂 齢 以 前 ではおよそ6.8~16.8%という 低い 値 を 示 したのに 対 し、それ 以 降 急 増 した。しかし、 親 が 老 齢 で 高 い 初 期 死 亡 率 を 示 した 世 代 でも、その 世 代 が30 回 分 裂 齢 時 に 誘 導 した 子 孫 では 死 亡 率が 低 下 し、その 後 90 回 分 裂 齢 時 以 降 に 誘 導 された 子孫 で 高 い 死 亡 率 を 示 した。2autogamy 未 熟 期 の 測 定はなるべくculture agingの 影 響 が 小 さくなるように 注

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)39意 した。その 結 果 、どの 世 代 においても 親 のageによらずおよそ25 回 分 裂 齢 でautogamy 率 50%に 達 し、ほぼ 一 定 であった。3 加 齢 速 度 は 世 代 誘 導 後 およそ10日 目 以 降 から 直 線 的 に 減 少 した。その 減 少 速 度 においても 親 のageによらずほぼ 一 定 であった。4 寿 命 に関 しては、 各 世 代 の 平 均 寿 命 を 検 討 した 結 果 、 子 孫誘 導 後 初 期 の 死 亡 を 免 れたそれぞれ 世 代 内 のcloneは親 のageの 影 響 を 受 けず、 同 程 度 の 分 裂 寿 命 を 示 した。 以 上 の 結 果 をもとにして 考 察 すると、もし 親 のageが 子 孫 のagingに 影 響 があるなら、 子 孫 を 誘 導 したときの 親 の 分 裂 齢 の 加 算 に 伴 いその 影 響 が 見 られるはずである。 親 のageとその 子 孫 の 初 期 死 亡 率 の 関 係については、 以 前 の 報 告 の 結 果 と 同 じように90 回 分裂 齢 以 降 で 初 期 死 亡 率 が 急 増 した。 今 回 、 初 期 死 亡を 免 れたcloneの3 世 代 目 の 子 孫 の 初 期 死 亡 率 の 変 化を 調 べると、autogamy 誘 導 後 初 期 の 死 亡 率 に 関 して親 のageの 影 響 がリセットされていることが 示 唆 された。また、 初 期 死 亡 を 免 れたcloneのautogamy 未 熟期 、 加 齢 速 度 、 寿 命 を 調 べた 結 果 、これらの 値 は 親のageによらずほぼ 一 定 であった。このことから、autogamy 誘 導 後 初 期 に 生 存 を 許 された 子 孫 のagingには 親 のageは 影 響 しないことがわかった。ただし、 今回 はautogamyを 誘 導 する 際 にculture agingの 影 響 が 少ない 条 件 下 で、 親 のageのみが 子 孫 のagingに 対 する 因子 となるように 考 慮 して 行 った。 以 前 の 実 験 で、autogamy 未 熟 期 の 期 間 を 調 べる 際 にculture ageを 進 ませると 子 孫 を 誘 導 する 際 の 親 のageの 加 算 に 伴 いautogamy 未 熟 期 の 期 間 が 同 じ 世 代 のclone 間 で 大 きく変 動 する 傾 向 があった。そのため、 子 孫 誘 導 時 の 親のageは 単 独 では 影 響 しないが、culture ageなどの 第 2の 因 子 の 存 在 でその 影 響 が 現 れる 可 能 性 がある。[ 文 献 ]Ishikawa, Y., Suzuki, A., Takagi, Y. (1998) Zool. Sci., 15:707-712Rodermel, S., R., Smith-Sonneborn, J. (1977) Genetics 87:259-274セントリンのCa 2+ 感 受 性 は 電 位 依 存 性 Ca 2+ チャンネルの 活 性 に 重 要 である権 田 幸 祐 , 高 橋 三 保 子 ( 筑 波 大 学 、 生 命 環 境 科 学 研 究 科 )Ca 2+ -sensitivity of centrin is important for the activity of the voltage-gatedCa 2+ channels in Paramecium caudatum.Kohsuke GONDA and Mihoko TAKAHASHI(Inst. Biol. Scis., Univ. Tsukuba)SUMMARYInternal Ca 2+ concentration regulates the waveform or beat direction of flagella/cilia of various eukaryotes. Ciliaryreversal in Paramecium depends on a Ca 2+ influx through voltage-gated Ca 2+ channels on the ciliary membrane. However,little is known about the molecular mechanisms of the Ca 2+ channels that control ciliary reversal. One of the voltage-gatedCa 2+ channel mutants in P. caudatum, cnrC, neither produces Ca 2+ action potentials nor responds to any depolarizingstimuli. Previously, we reported that the cnrC + gene product is P. caudatum centrin (Pccentrin1p), a member ofthe calmodulin superfamily. Like calmodulin, centrin possesses four Ca 2+ -binding sites called EF-hand. To examinewhether Pccentrin1p controls the voltage-gated Ca 2+ channels in a Ca 2+ -dependent manner in vivo, the curing effect ofPccentrin1p genomic DNA that had mutations in the EF-hand was examined. The DNA was microinjected into cnrCcells, and then the responses of the cells to depolarizing current were investigated. The results showed that the Ca 2+ sensitivityof Pccentrin1p is important to the regulatory mechanisms of the voltage-gated Ca 2+ channels. In particular, it wassuggested that the cooperative work of EF-hand 3 and 4 in the presence of Ca 2+ is indispensable to the Ca 2+ channel activity.

40 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年[ 目 的 ] 繊 毛 は 波 打 ち 運 動 を 行 う 細 胞 小 器 官 であり、この 運 動 の 調 節 にはCa 2+ が 重 要 な 役 割 を 果 たしている。ゾウリムシでは、 繊 毛 膜 に 存 在 する 電 位 依 存 性Ca 2+ チャンネルの 活 性 化 によって 繊 毛 内 Ca 2+ 濃 度 が 上昇 すると、 繊 毛 打 の 方 向 が 逆 転 し( 繊 毛 逆 転 )、 後 退遊 泳 を 行 う。しかし、このCa 2+ チャンネルの 実 体 や制 御 機 構 はよく 分 かっていない。ゾウリムシでは、Ca 2+ チャンネルの 制 御 機 構 に 欠 陥 があるため 後 退 遊泳 を 行 うことができない 突 然 変 異 株 cnrCが 単 離 されている(1, 2)。これまでに、 我 々はcnrC + 遺 伝 子 産 物 の実 体 がCa 2+ 結 合 蛋 白 質 セントリン(Pccentrin1p)であることを 明 らかにしてきた(3)。セ ントリンはCalmodulinファミリーに 属 し、Ca 2+ 結 合 部 位 であるEF-handを4つ 持 つ(EF-hand1~4)。そこで、 本 研 究 ではPccentrin1pのCa 2+ 感 受 性 が 電 位 依 存 性 Ca 2+ チャンネルの 活 性 にどの 様 に 関 わるのかを 検 討 した。[ 方 法 ] 野 生 型 の1213bpのPccentrin1pゲノムDNA 断 片を cnrC に Microinjection すると、cnrC の 電 位 依 存 性Ca 2+ チャンネルの 機 能 が 回 復 し、cnrCは 脱 分 極 性 の刺 激 に 反 応 して 後 退 遊 泳 を 行 う。セントリンを 含 むCalmodulinファミリーでは、EF-hand 内 の 酸 性 アミノ酸 (D、E)がCa 2+ 感 受 性 に 重 要 な 役 割 を 果 たしており、これらのアミノ 酸 を 非 極 性 のアミノ 酸 に 置 換 すると(D→A、E→V)、Ca 2+ 結 合 能 が 失 われることが 報告 されている。また、セ ントリンやCalmodulin では、EF-hand 1と2およびEF-hand 3と4それぞれがペアになって 機 能 していると 考 えられている。そこで、1213bpのPccentrin1pゲノムDNAのEF-handをコードする 領 域 に 塩 基 置 換 を 与 え、 各 EF-hand (EF-hand1~4)の 酸 性 アミノ 酸 を 全 て 非 極 性 のアミノ 酸 に 置 換 したコンストラクトを 調 製 した。そしてこれらのコンストラクトをcnrCにMicroinjectionした 後 、 脱 分 極 性 の刺 激 ( 高 K + 刺 激 、 定 電 流 刺 激 )を 与 え、 電 位 依 存 性 Ca 2+チャンネルの 機 能 回 復 効 果 を 検 討 した。[ 結 果 と 考 察 ] EF-hand 1 変 異 型 、EF-hand 2 変 異 型 、EF-hand 3 変 異 型 をMicroinjectionした 細 胞 では、 高 K +刺 激 溶 液 中 において、 野 生 型 Pccentrin1pゲノムDNAの 効 果 と 同 様 に 約 30 秒 前 後 の 後 退 遊 泳 を 行 った。また、EF-hand 3 変 異 型 をMicroinjectionした 細 胞 では、定 電 流 刺 激 に 反 応 して 野 生 株 と 同 様 のCa 2+ 活 動 電 位が 観 察 された。 以 上 の 結 果 はEF-hand 1、2、3のCa 2+感 受 性 がCa 2+ チャンネルの 機 能 に 必 須 ではないことを 示 している。 次 に、EF-hand 4 変 異 型 では、 高 K + 刺激 溶 液 中 において 後 退 遊 泳 の 時 間 が 短 くなっており( 約 7 秒 )、 定 電 流 刺 激 に 対 するCa 2+ 活 動 電 位 も 野 生 株に 比 べ 非 常 に 小 さくなっていた。この 結 果 はEF-hand4のCa 2+ 感 受 性 がCa 2+ チャンネルの 機 能 に 重 要 であることを 示 している。またEF-hand 1 & 2 変 異 型 では、高 K + 刺 激 溶 液 中 において 後 退 遊 泳 の 時 間 が 短 くなっており( 約 12 秒 )、 定 電 流 刺 激 に 対 するCa 2+ 活 動 電 位 もEF-hand 4 変 異 型 ほどではないが 野 生 株 に 比 べ 小 さくなっていた。この 結 果 とEF-hand 1や2の 単 独 の 変 異の 結 果 を 合 わせて 考 えると、EF-hand 1もしくは2のどちらか 一 方 にCa 2+ 感 受 性 があることがCa 2+ チャンネルの 機 能 に 重 要 であることを 示 している。さらに 驚くべきことに、EF-hand 3 & 4 変 異 型 をMicroinjectionした 細 胞 では、98% 以 上 の 細 胞 が 高 K + 刺 激 溶 液 に 反応 せず、 定 電 流 刺 激 に 対 するCa 2+ 活 動 電 位 もほとんど 見 られなかった。この 結 果 とEF-hand 3や4の 単 独の 変 異 の 結 果 を 合 わせて 考 えると、EF-hand 3と4がCa 2+ 存 在 下 で 協 調 的 に 立 体 構 造 を 変 化 させることが、 電 位 依 存 性 Ca 2+ チャンネルの 活 性 に 必 須 であり、その 際 EF-hand 4はEF-hand 3に 比 べより 機 能 的 であることを 示 している。cnrCのPccentrin1pは、 突 然変 異 によりEF-hand 4を 含 むC 末 側 の28アミノ 酸 を失 っている。この 結 果 からもEF-hand 3と4の 協 調 的なCa 2+ 感 受 性 が 電 位 依 存 性 Ca 2+ チャンネルの 活 性 に 重要 であることが 示 唆 された。[ 文 献 ]1) Takahashi, M. & Naitoh, Y. (1978) Nature 271, 656-659.2) Takahashi, M. (1979) Genetics 91, 393-408.3) Gonda, K. et al. (2004) Biochem. Biophys. Res. Commun.323, 891-897

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)41繊 毛 虫 ブレファリズマの 性 成 熟 過 程 におけるガモン1 遺 伝 子 の 発 現杉 浦 真 由 美 1,2 , 川 原 聖 子 1 1,2, 春 本 晃 江( 1 奈 良 女 子 大 ・ 理 ・ 生 物 科 学 , 2 奈 良 女 子 大 ・ 院 ・ 共 生 自 然 科 学 )Expression of gamone 1 gene during sexual maturation in the progeny clones of theciliate Blepharisma japonicumMayumi SUGIURA 1,2 , Seiko KAWAHARA 1 and Terue HARUMOTO 1,2( 1 Department of Biological Science, Faculty of Science, Nara Women’s University, 2 Department ofBiological Science and Environment, Graduate School of Human Culture, Nara Women’s University)SUMMARYThe ciliate Blepharisma japonicum switches the reproductive process from asexual (binary fission) to sexual(conjugation) when cells are deprived of food . This switching mechanism has not been elucidated yet. Conjugation in B.japonicum is induced by interaction between cells of complementary mating types I and II. Substances that act as signalingmolecules for conjugation are called gamones. The glycoprotein gamone 1, produced by mating type I cells, is a keyfactor that triggers interaction. In this study, we examined the influence of nutritional conditions on the expression ofgamone 1. We found that mature mating type I cells do not transcribe gamone 1 in the logarithmic phase, but start transcribingit when they are starved, and that the level of transcription increases as starvation progresses. We isolated progenyclones and examined their level of maturation and the expression of gamone 1 at different clonal ages. We showedthat most progeny clones differentiated into mating type I, becoming mature at about age 25 and continuing maturationgradually. The expression of gamone 1 was examined at the clonal ages of 10, 18, 25 and 39 by northern blot analysis.Gamone 1 mRNA was not detected in immature cells (clonal age of 10 and 18), first faintly detected at age 25, and becamedistinct at age 39. Gamone 1 activity in cell-free fluid prepared from each sample corresponded to the level ofgamone 1 mRNA. These results suggest that the transcription of gamone 1 is strictly linked to the process of sexualmaturation and clonal age.[ 目 的 ] 繊 毛 虫 類 異 毛 綱 に 属 するブレファリズマは、富 栄 養 条 件 下 では 二 分 裂 で 増 殖 し、 貧 栄 養 条 件 下 におかれると 相 補 的 な 接 合 型 細 胞 (I 型 、II 型 ) 間 で 有性 生 殖 ( 接 合 )を 行 う。 接 合 は、 両 接 合 型 細 胞 が 分泌 する 接 合 誘 導 物 質 、ガモン1、ガモン2を 介 した細 胞 間 相 互 作 用 の 結 果 引 き 起 こされる。ブレファリズマのガモンはすでに 単 離 同 定 されており、ガモン1は、272アミノ 酸 と7つの 糖 からなる 糖 タンパク 質であることが 報 告 されている 1) 。また、ガモン2は、3-(2’-formylamino-5’-hydroxybenzoyl) lactate として 同定 されている 1) 。しかし、これらの 物 質 を 介 した 接 合誘 導 機 構 の 分 子 メカニズムは 解 明 されていない。我 々は、ブレファリズマにおける 接 合 誘 導 の 第 一 イベントであるI 型 細 胞 によるガモン1の 合 成 ・ 分 泌 に注 目 し、これまでにガモン1の 発 現 が 接 合 型 特 異 的な 機 構 により 転 写 レベルで 制 御 されていること、ガモン2によってその 転 写 が 著 しく 促 進 されることを明 らかにした 1) 。 本 研 究 では、 接 合 に 関 わる 様 々な 内的 要 因 ・ 外 的 要 因 によるガモン1の 発 現 制 御 を 分 子レベルで 明 らかにするために、 栄 養 条 件 と 性 成 熟 過程 のガモン1 遺 伝 子 の 転 写 に 及 ぼす 影 響 を 調 べた。[ 材 料 と 方 法 ] 栄 養 条 件 のガモン1 遺 伝 子 発 現 へ 及 ぼす 影 響 を 調 べるために、 増 殖 期 、 定 常 期 1 日 目 、 定常 期 5 日 目 のI 型 細 胞 を 用 意 し、total RNAの 抽 出 を行 った。また、 分 裂 齢 の 進 行 ( 性 成 熟 過 程 )におけるガモン1 遺 伝 子 の 発 現 を 調 べるために、I 型 細 胞 とII 型 細 胞 を 交 配 させて 接 合 完 了 体 を 単 離 し、 一 回 分裂 させることによってcaryonidal cloneを 単 離 した。 単離 した 子 孫 株 をWGP(Wheat-grass-powder) 培 養 液 で培 養 して 分 裂 を 繰 り 返 させ、 各 分 裂 齢 時 に 接 合 型 の判 別 、 成 熟 度 の 測 定 およびサンプリング(total RNAの 抽 出 と 細 胞 外 液 の 回 収 )を 行 った。 接 合 型 の 判 別および 成 熟 度 の 測 定 は、 各 分 裂 齢 時 の 細 胞 とテス

42 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年ター 細 胞 (I 型 、II 型 )を 混 合 し、 接 合 するかどうかで 成 熟 度 の 測 定 を、どちらの 型 のテスター 細 胞 と 接合 するかで 接 合 型 の 判 別 を 行 った。また、 各 細 胞 から 抽 出 したtotal RNAを 用 い、ガモン1cDNAをプローブとしてノーザンハイブリダイゼーションを 行い、ガモン1 遺 伝 子 の 転 写 レベルを 検 出 した。さらに、ガモン1の 翻 訳 および 分 泌 を 確 認 するために 細胞 外 液 のガモン1 活 性 を 測 定 した。[ 結 果 と 考 察 ] 栄 養 条 件 の 異 なるI 型 細 胞 におけるガモン1 遺 伝 子 の 転 写 レベルをノーザンハイブリダイゼーションによって 調 べた 結 果 、ガモン1mRNAは、増 殖 期 の 細 胞 では 検 出 されず、 定 常 期 1 日 目 に 入 って飢 餓 状 態 におかれた 細 胞 で 初 めて 検 出 され 始 め、さらに 飢 餓 が 進 行 した 定 常 期 5 日 目 の 細 胞 で、その 量 が増 加 していることが 分 かった。このことより、ガモン1 遺 伝 子 の 転 写 は、 成 熟 期 にあるI 型 細 胞 が 栄 養 の欠 乏 という 刺 激 を 感 知 することが 引 き 金 となって 開始 され、その 程 度 によって 促 進 される 可 能 性 が 考 えられた。単 離 した 子 孫 株 を 用 いて 分 裂 齢 の 進 行 に 伴 う 性 成熟 度 の 測 定 を 行 った 結 果 、 約 25 分 裂 齢 時 まではどちらのテスター 細 胞 とも 接 合 を 行 わず、これらのクローンは 性 的 に 未 熟 期 にあると 考 えられた。 約 25 分裂 齢 を 境 にII 型 のテスター 細 胞 と 接 合 を 行 う 細 胞 が現 れ 始 め、その 割 合 は 分 裂 齢 が 進 行 するにつれて 増加 した。したがって、これらの 子 孫 株 は、 約 25 分 裂齢 を 境 に 未 熟 期 から 成 熟 期 への 移 行 を 開 始 し、 分 裂を 繰 り 返 すことによってさらに 成 熟 度 を 増 すと 考 えられた。また、II 型 のテスター 細 胞 とのみ 接 合 したことから、 接 合 型 I 型 に 分 化 したと 考 えられた。 各 分裂 齢 時 (10、18、25、39)の 細 胞 を 飢 餓 状 態 においた 時 のガモン1の 発 現 を 調 べた 結 果 、ガモン1mRNAは 未 熟 期 の 細 胞 では 検 出 されず、 成 熟 期 への 移 行 が見 られ 始 めた25 分 裂 齢 の 細 胞 でわずかに 検 出 され、39 分 裂 齢 ではっきりと 検 出 された。このことから、ガモン1 遺 伝 子 の 転 写 レベルは 性 成 熟 度 合 と 対 応 しており、 分 裂 回 数 をカウントする 機 構 の 下 流 で 制 御 されていると 考 えられた。また、 細 胞 外 液 の 活 性 テストを 行 った 結 果 、ノーザンハイブリダイゼーションの 結 果 と 一 致 し、ガモン1の 発 現 は 転 写 レベルで 制 御されていることを 確 認 した。これまでの 報 告 と 本 研 究 によって、ブレファリズマの 接 合 誘 導 の 第 一 イベントであるガモン1の 発 現 は転 写 レベルで 制 御 されていることが 遺 伝 子 レベルで明 らかになった。また、「 接 合 後 約 25 回 以 上 分 裂 すること」、「 接 合 型 がI 型 に 分 化 すること」、「 栄 養の 欠 乏 」が、ガモン1 遺 伝 子 の 転 写 開 始 必 須 条 件 であり、ガモン2は 転 写 促 進 にはたらくことを 示 した。[ 文 献 ]1) 春 本 晃 江 、 杉 浦 真 由 美 (2003) 原 生 動 物 学 雑 誌 , 36(2), 147-172. 総 説太 陽 虫 Actinophrys sol の 捕 食 機 構 の 解 析角 田 宗 一 郎 、 洲 崎 敏 伸 ( 神 戸 大 ・ 理 ・ 生 物 )Analysis of the feeding system in the heliozoon Actinophrys solSoichiro KAKUTA and Toshinobu SUZAKI (Dept. Biol., Fac. Sci., Kobe Univ.)SUMMARYActinophrys sol is a predatory protozoan which captures prey organisms with its axopodia. When capturing preyorganisms, A. sol discharges the contents of extrusomes, which are secretory granules located beneath the cell membrane.It has been reported that extrusomes contain concanavalin A (Con A)-binding materials. At least two proteins are knownto be involved in feeding of A. sol. The first is a 40-kDa glycoprotein (gp40) that binds Con A, and gp40-adsorbed agarosebeads induce phagocytosis by A. sol. This suggests that gp40 functions in prey recognition. Another protein involvedin feeding is TPPI , which is deduced to be a peptidase involved in lysosomal digestion. By immuno-microscopic

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)43observation, it was found that TPPI was localized in lysosomes and discharged into late phagosomes. From the results ofa homology search, it is conceivable that TPPI is a peptidase belonging to the sedolisin family. Immuno-electron microscopyconfirmed that gp40 was localized in extrusomes. After gp40 was purified with Con A-agarose, and then digestedwith N-glycosidase, SDS-PAGE and western blotting showed that its molecular mass, without the Con A- binding sugarchain, was 37.5 kDa.[ 目 的 ] 太 陽 虫 Actinophrys sol は 捕 食 性 の 原 生 動 物で、 軸 足 と 呼 ばれる 仮 足 を 用 いてエサを 捕 らえる。その 際 、 細 胞 表 層 にあるエクストルソームという 細胞 小 器 官 から 内 容 物 が 放 出 されることが 分 かっており、その 中 には Concanavalin A (Con A) に 結 合 する 物質 が 含 まれている。これまでにCon A に 結 合 する 糖タンパク 質 としてgp40が 見 つかっており、gp40 はA.sol がエサを 認 識 して 細 胞 内 に 取 り 込 むという 機 構 に関 与 していると 考 えられている。 今 回 この gp40 の 抗体 を 用 いた 顕 微 鏡 観 察 により 細 胞 内 での 局 在 を 観 察した。またCon Aによりgp40の 精 製 を 行 ったうえでグリコシダーゼによる 糖 鎖 分 解 を 行 い 糖 鎖 の 種 類 と 分子 量 を 推 定 した。また A. sol ではこれまでに、ライソソーム 酵 素 の 一 種 ではないかと 思 われるタンパク質 TPPIのクローニングがされている。TPPIがライソソームに 関 するタンパク 質 であれば、gp40とともに用 いることで 捕 食 の 経 路 に 関 してより 詳 細 に 解 析 できると 考 え、TPPI についても gp40 同 様 に 抗 体 を 作製 し、 局 在 性 を 調 べるため 顕 微 鏡 による 観 察 を 行 った。[ 材 料 と 方 法 ] A. solはSakaguchi and Suzaki (1) に従 って 無 菌 培 養 したものを 用 いた。 抗 体 はgp40はN末 端 のアミノ 酸 配 列 2) に 対 するペプチド 抗 体 、TPPIは大 腸 菌 に 発 現 させ 精 製 したタンパク 質 からウサギポリクローナル 抗 体 を 作 製 して 使 用 した。 免 疫 蛍 光 法では、 細 胞 を4% ホルムアルデヒドで 固 定 後 エタノールで 透 過 処 理 をし、 一 次 抗 体 及 びAlexa488 二 次 抗 体を 反 応 させて 共 焦 点 レーザー 顕 微 鏡 で 観 察 した。またTPPIでは 飢 餓 状 態 の 細 胞 に 餌 を 与 えてから30 分 ごとに 固 定 染 色 し、 局 在 性 の 経 時 変 化 を 観 察 した。 免疫 電 子 顕 微 鏡 法 では4% ホルムアルデヒドと0.4% グルタルアルデヒドで 固 定 後 0.5% のTritonX-100で 脱 膜処 理 をした 細 胞 を、 一 次 抗 体 および 金 粒 子 で 標 識 した。 包 埋 、 超 薄 切 片 化 した 試 料 を 電 子 顕 微 鏡 で 観 察した。またCon Aアガロースを 用 いてgp40を 精 製 した後 、N-glycosidaseにより 糖 鎖 を 分 解 しSDS-PAGE 及 びWestern blottingにより 糖 鎖 を 除 いたタンパク 質 の 分子 量 を 推 定 した。[ 結 果 と 考 察 ] 抗 体 を 用 いた 顕 微 鏡 観 察 によりTPPIがライソソーム 内 に 存 在 し、かつ 捕 食 開 始 後 およそ90分 以 降 という 比 較 的 遅 い 時 期 に 食 胞 内 に 放 出 されるタンパク 質 であることが 分 かった。クローニングされたcDNAと 相 同 性 の 高 かったタンパク 質 においての3)過 去 の 研 究 結 果 と 合 わせて、このタンパク 質 がsedolisinと 呼 ばれるペプチダーゼファミリーに 属 するライソソーム 酵 素 であることが 強 く 示 唆 された。 一方 gp40は 顕 微 鏡 観 察 の 結 果 からエクストルソーム 内に 存 在 するタンパク 質 であることが 確 認 できた。 同じ 抗 体 を 用 いての 免 疫 沈 降 ではgp40を 集 めることができなかったが、Con Aを 用 いてgp40を 精 製 することができた。この 精 製 gp40をN-glycosidaseによって 処理 したところ 分 子 量 が 約 37.5 kDaに 減 少 した。ウェスタンブロッティングの 結 果 からこれがgp40であることは 確 認 でき、Con A 結 合 型 の 糖 鎖 を 除 いたタンパク 質 の 分 子 量 を 推 定 することができた。 今 後 は 精 製したgp40をもちいて 内 部 アミノ 酸 配 列 を 読 み、cDNAのクローニングを 行 っていきたい。[ 文 献 ]1) Sakaguchi, M. and Suzaki, T. (1999) Europ. J. Protistol.,35, 411-415.2) Sakaguchi, M., Suzaki, T. and Murakami, H. (2001)Protist, 152, 33-41.3) Yoo, S. Y., Choi, J. Y., Kim, H. and Ahn. T.I. (1996)Molecules and Cells, 6, 316-324.

44 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年Toxic effect of heavy metal ions on the axopodia of heliozoonRaphidiophrys contractilisS. M. Mostafa Kamal KHAN 1 , Mikihiko ARIKAWA 1, 2 , and Toshinobu SUZAKI 1( 1 Dept. Biol., Fac. Sci., Kobe Univ., 2 Dept. Biol. Sci. Environ., Nara Women's Univ.)SUMMARYIn this study we have observed the effect of zinc, lead, copper, mercury and cadmium ions on the heliozoon Raphidiophryscontractilis. The effects of heavy metal ions on the axopodial length, food uptake mechanism and axopodialcontraction were examined, and we found that the axopodial length decreased significantly, the food uptake mechanismand axopodial contraction prolonged. The half strength effects of these heavy metals are around 1 µM, i.e., in 1 µMheavy metal ions axopodial length became almost half. In the same concentration of these heavy metal ions, the affect ofmercury is higher than those of zinc, lead, copper and cadmium. In high concentration of these heavy metals, it wasobserved that axopodia were disappeared and cells were disrupted very quickly.[INTRODUCTION] Heavy metal pollution is a worldwideproblem, due to the industrial discharge. Considerableefforts have therefore been made to identify polluted areasand to develop efficient methods for their quantitativeassessment (1, 2). In natural and polluted environments,the uptake and handling of essential toxic metals by differentcells constitute critical steps in the cell survival (3).Heavy metal pollutants, found in the environment, areserious toxicants in the aquatic environment. Heavy metalions form unspecific complex compounds in the cell thatlead to toxic effects. Even highly reputable trace elementslike Zn 2+ or Ni 2+ and especially Cu 2+ are toxic at higherconcentrations. Thus, the intracellular concentration ofheavy metal ions has to be tightly controlled, and heavymetal resistance is just a specific case of the general demandof every living cell for some heavy metal homeostasissystem. However, heliozoa are primarily freshwaterand sub-benthic species from brackish or marine water inthe euphotic zone. The heliozoon Raphidiophrys contractilispossesses lot of axopodia radiating from the cell bodyand food organisms are captured by axopodial contraction(4). In the present study we have observed the physiologicaleffect of zinc, lead, mercury, copper and cadmium onR. contractilis.[MATERIALS AND METHODS]Organism and Culture: The heliozoon Raphidiophryscontractilis was originally collected from a brackish pondin Shukkei-en Garden, Hiroshima City, Japan. Organismswere cultured monoxenically at 20 ± 1 ° C in a culture mediumbased on 10% artificial sea water and food flagellateChlorogonium elongatum (5). C. elongatum was added tothe culture medium as food source sub-culturing was carriedout at intervals of about 7 to 10 days.Methods: Floating heliozoans were placed on a glass slide,surrounded with rectangular mounting ridges of petroleumjelly. The cells were allowed to settle for 5-10 minutes sothat they might recover from axopodial disturbance causedby pipetting. Then metal ions were added and cells werecovered with a cover slip, observed under microscope(Nomarski differential interference optics, BX50, Olympus,Tokyo, Japan) and recorded on S-VHS video tapeusing a video recorder (Mitsubishi HV-S77 and BR-S822,Victor, Tokyo, Japan).[RESULTS AND DISCUSSION] Heavy metal pollutionresulting from human, industrial and agricultural activitiesaffect biological systems. This pollution affects thegrowth, development, morphology, metabolism and manyother cellular and molecular biological activities of alleukaryotic organisms from higher to lower, including, ofcourse, unicellular microorganisms. In the present studywe have observed the physiological effect of zinc, lead,mercury, copper and cadmium on the heliozoon R. contractilis.The cells displayed different sensitivities to thesemetals, such as, axopodial degradation, number of kinetocystdecreased, movement of kinetocyst become slower,food uptake mechanism and axopodial contraction byexternal stimuli prolonged. The effect of Zn 2+ , Pb 2+ , Cu 2+and Cd 2+ observed less severe and it took little more timethan Hg 2+ to disappear all axopodia. The effect of mercuryseverely damaged the axopodia. Mercury produced a

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)45high-pronounced effect on the axopodia. We have observedthat in the presence of these heavy metal ions theaxopodia of R. contractilis become shorter than its normallength and in the Hg 2+ all axopodia disappear with in theshortest period of time. The axopodial length of the heliozoonwas observed, recorded and calculated up to 20 minafter the addition of metal ions. These observations indicatethe toxic affect of heavy metal ions for the survival ofthe heliozoon and affect on aquatic ecosystem, and alsosignify that R. contractilis is an effective biological modelfor the study of metal poisoning of eukaryotic cell.[References]1) Anton A. et al. (2000): The Sci. of the Total Environ.,247 (2-3), 239-2512) Carvan M. J. et al. (2000): N.Y., Acad. Sci., 919, 133-1473) Lamas M. E. et al. (2002): Environ. Pollu., 120, 779-7864) Kinoshita E. et al., (1995): J. Euk. Microbiol. 42(3):283-2885) Sakaguchi M. and Suzaki T. (1999): Eur. J. Protistol.35, 411- 415テトラヒメナの 細 胞 質 分 裂 におけるADF/cofilinの 研 究汐 崎 七 海 , 中 野 賢 太 郎 , 沼 田 治 ( 筑 波 大 ・ 生 物 科 学 )Isolation of a gene encoding ADF/cofilin in Tetrahymena thermophilaNanami SHIOZAKI, Kentaro NAKANO and Osamu NUMATA (Inst. of Biol. Sci., Univ. of Tsukuba)SUMMARYCytokinesis is one of the most important events for cell growth and is accomplished by contraction of the contractilering. Although the contractile ring is mainly composed of actin filaments and myosin, it is not well understood how theseproteins are assembled in the ring. Therefore, we decided to study the function of actin-regulating proteins in Tetrahymenathermophila, and identified an ADF/cofilin-homologous gene, ADF73, from its genome project. ADF/cofilin is aprotein that severs and depolymerizes actin filaments and plays an important role in establishing cytokinesis in manyeukaryotic cells. First, we cloned ADF73 and deduced its encoded amino acid sequence. It was revealed that Adf73p is a136-amino acid protein and is most similar to starfish and Schistosoma ADF/cofilin. Next, we determined that the molecularweight of Adf73p is about 14.5 kDa, by subjecting its recombinant protein, expressed in E. coli, to SDS-PAGE.In addition, we confirmed the intercellular interaction of Adf73p with actin from the fission yeast, Schizosaccharomycespombe. In future, we will study the biochemical reactivity of Adf73p to actin in vitro, and the function of Adf73p incytokinesis in Tetrahymena, by knocking out its gene and by immunofluorescence microscopy.[ 目 的 ] 細 胞 質 分 裂 は、 細 胞 の 増 殖 に 不 可 欠 な 生 命 現象 の1つである。 動 物 細 胞 では、 細 胞 質 分 裂 はアクチン 繊 維 とミオシンからなる 収 縮 環 の 収 縮 により 起 こる。しかし、 収 縮 環 形 成 のメカニズムの 詳 細 はよく分 かっていない。テトラヒメナTetrahymena thermophilaは動 物 細 胞 と 同 様 に 収 縮 環 による 細 胞 質 分 裂 を行 う。これまでに 本 研 究 室 では、テトラヒメナを 用いて 収 縮 環 形 成 のメカニズムについて 解 析 してきた。すでに、アクチン 重 合 調 節 タンパク 質 であるプロフィリンやEF1αが 収 縮 環 形 成 に 関 わることを 示している。しかし、これらのタンパク 質 のみの 働 きでは、 収 縮 環 におけるアクチン 繊 維 の 制 御 を 説 明 するには 不 十 分 である。 一 方 、テトラヒメナのゲノムプロジェクトが 進 行 し、 最 近 その 全 貌 が 明 らかになりつつある。そこで 私 たちは、この 情 報 をもとにアクチン 調 節 タンパク 質 の 遺 伝 子 の 網 羅 的 な 探 索 にの

46 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年りだした。ここではADF/cofilin 様 のアクチン 調 節 タンパク 質 をコードする 遺 伝 子 ADF73の 同 定 と 機 能 について 報 告 する。ADF/cofilinはアクチン 繊 維 を 脱 重 合 ・ 切 断 する 活性 をもつ。テトラヒメナにおいては、この 他 にアクチン 繊 維 の 切 断 や 脱 重 合 に 関 わるタンパク 質 は 見 つかっていないため、Adf73pの 収 縮 環 形 成 における 働きは 大 変 に 興 味 深 いと 考 えた。[ 方 法 ] テトラヒメナのゲノムDNAとcDNAライブラリーを 鋳 型 とし、ADF73をPCR 法 により 増 幅 し、クローニングした。 得 られたそれぞれのDNA 断 片 についてはシークエンスを 明 らかにし、 目 的 の 遺 伝 子 であることを 確 認 した。次 に、ADF73のcDNAを 大 腸 菌 を 用 いて 発 現 させるため、テトラヒメナではGlnをコードするTAAコドンを 大 腸 菌 では 終 止 コドンとなるためMutagenesis SystemとPCR法 を 用 いてCAAコドンへ 置 換 した。これを大 腸 菌 発 現 用 ベクターpGEX4T-1に 組 み 込 み、 発 現 ・精 製 した。 精 製 産 物 についてはSDS-ポリアクリルアミドゲル 電 気 泳 動 法 (SDS-PAGE)でチェックした。さらに、Adf73pとYellow fluorescence protein (YFP)の 融合 タンパク 質 を 分 裂 酵 母 細 胞 内 で 発 現 させ、 蛍 光 顕微 鏡 を 用 いてその 局 在 を 観 察 した。[ 結 果 と 考 察 ] テトラヒメナのゲノムDNAとcDNAライブラリーからADF73をクローニングすることに 成功 した。cDNAが 単 離 できたため、この 遺 伝 子 はテトラヒメナで 発 現 していることが 確 認 された。ADF73のDNA 配 列 から 推 定 される 遺 伝 子 産 物 のアミノ 酸 配列 は 全 長 が136a.a.で、 分 子 量 は 約 15 kDaである。 推定 遺 伝 子 産 物 であるAdf73と 他 の 生 物 のADF/cofilinとのアミノ 酸 配 列 の 相 同 性 を 調 べた 結 果 、ヒ ト デA.amurensis やジュウケツキュウチュウS. japonicumと相 同 性 が 高 いことが 判 明 した。大 腸 菌 の 発 現 システムを 利 用 して 精 製 したAdf73pをSDS-PAGEで 調 べたところ、 約 14.5 kDaの 位 置 にバンドが 検 出 された。これはADF73のcDNAのアミノ 酸配 列 から 推 定 される 分 子 量 の 大 きさと 一 致 する。また、 分 裂 酵 母 におけるAdf73pの 局 在 を 調 べたところ、Adf73pが 分 裂 酵 母 のアクチン 構 造 体 に 局 在 している 様 子 が 観 察 された。さらに、アクチンを 破 壊するとAdf73pが 細 胞 内 に 分 散 したことから、Adf73pは 分 裂 酵 母 のアクチンと 結 合 していることが 示 された。現 在 、Adf73pのアクチンに 対 する 生 化 学 的 活 性 を検 討 している。また、Adf73pの 抗 体 を 作 製 し、 免 疫抗 体 法 により 細 胞 質 分 裂 時 のテトラヒメナ 細 胞 内 のAdf73pの 局 在 性 を 解 析 する。また、アンチセンスrRNA 法 を 用 いてテトラヒメナのADF73 遺 伝 子 ノックダウン 株 を 作 製 し、Adf73pの 収 縮 環 形 成 における 働きについて 検 討 を 行 う。アメーバ 細 胞 運 動 におけるイノシトールリン 脂 質 の 役 割新 木 良 子 , 前 田 佳 祥 子 , 鎌 田 英 明 , 平 田 肇 , 新 免 輝 男 , 園 部 誠 司 , 八 木 澤 仁( 兵 庫 県 立 大 学 大 学 院 生 命 理 学 研 究 科 )Role of phospholipase C in the motility of Amoeba proteusRyoko SHINKI, Kayoko MAEDA, Hideaki KAMATA, Hajime HIRATA, Teruo SHIMMEN, SeijiSONOBE, Hitoshi YAGISAWA (Graduate School of Life Science, University of Hyogo)SUMMARYWe have examined the role of phospholipase C (PLC) in the cell movement of Amoeba proteus. Although mechanismsof regulation of actin-based cell motility by phosphoinositide in mammalian cells have been well explored, thoseof Amoeba proteus still remain poorly understood. The Amoeba movement was examined as a model system to dissect

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)47locomotion of mammalian cells, such as macrophages, neutrophils as well as some cancer cells, exhibiting a rapid amoeboidmovement. Amoeba cell lysates showed the PtdIns(4,5)P 2 hydrolyzing activity. Microinjection of Ins(1,4,5)P 3 , oneof the products of PtdIns(4,5)P 2 hydrolysis, into the cytoplasm of resting Amoeba caused pseudopod extension and cellmovement. We have isolated cDNA clone encoding a functional PLC from Amoeba by RT-PCR cloning method. Thededuced amino acid sequence and the domain structure show a marked similarity to the eukaryotic PLCs, especiallythose of mammalian delta type isoforms except that the structure includes an additional C2 domain at the N-terminusinstead of the pleckstrin homology (PH) domain. We designate the gene as Applc (Amoeba proteus phospholipase C).[ 目 的 ] Amoeba proteus の 細 胞 運 動 におけるイノシトールリン 脂 質 とその 加 水 分 解 酵 素 であるホスホリパーゼ C(PLC) の 役 割 について 解 析 した。パク 質 GST-ApPLC の 発 現 を 誘 導 した。 発 現 タンパク 質 はグルタチオン-セファロース 4B(アマシャムバイオサイエンス 社 )を 用 いて 精 製 した。[ 材 料 と 方 法 ]Amoeba proteus 培 養Amoeba proteus は KCM 溶 液 (KCl 94 µM, CaCl 2 72µM, MgSO 4 -7H 2 O 32 µM) で 培 養 し、 餌 として Tetrahymenapyriformis を 与 えた。PtdIns(4,5)P 2 加 水 分 解 活 性 の 測 定アメーバに 溶 解 液 (10% Sucrose, 50 mM PIPES/KOH(pH7.0), 1 mM DTT, プロテアーゼ 阻 害 剤 )を加 え、シリンジで 破 砕 した。 超 遠 心 (100,000 rpm 20分 4°C)を 行 い、その 上 清 を 測 定 試 料 とした。[ 3 H]PtdIns(4,5)P 2 を 含 むリポソームを 基 質 として 10 -4 MCa 2+ 存 在 下 で 37°C、10 分 間 測 定 試 料 と 反 応 させた。遊 離 した [ 3 H] Ins(1,4,5)P 3 を 液 体 シンチレーションカウンターで 測 定 した。Ins(1,4,5)P 3 インジェクションの 影 響静 止 状 態 のアメーバ( 貪 食 後 1 ~ 2 日 )に Ins(1,4,5)P 3 を 顕 微 注 入 し、その 後 の 仮 足 の 形 成 および運 動 速 度 を 画 像 解 析 によって 定 量 化 した。cDNA クローニング飢 餓 状 態 に 1 週 間 以 上 おいたアメーバから 総 RNAを 抽 出 し、RT-PCR 法 により cDNA を 合 成 した。 哺乳 類 PLC β、γ、δの X ドメインで 保 存 されているアミノ 酸 配 列 から 設 計 した 縮 重 プライマーを 用 いて、cDNA を 鋳 型 として PCR を 行 った。ノーザンブロットによる 発 現 解 析アメーバと 餌 であるテトラヒメナのそれぞれの 総RNA 5 µg に 対 して、[ 32 P]dCTP で 標 識 した Applc 3’ 末端 の 1 kb に 対 応 する DNA 断 片 を 用 いてノーザンブロット 解 析 を 行 った。大 腸 菌 によるタンパク 質 発 現 と 精 製pGEX-4T ベクター(アマシャム バイオサイエンス社 )に Applc の 全 長 をサブクローニングし、 大 腸 菌BL21(DE3) 株 に 形 質 転 換 させ、IPTG により 融 合 タン[ 結 果 と 考 察 ]アメーバにおける PLC の 存 在 とその 意 味アメーバ 粗 抽 出 液 は 用 量 依 存 的 に PtdIns(4,5)P 2 を加 水 分 解 することから、PLC の 存 在 が 推 定 された。また、 注 入 した Ins(1,4,5)P 3 濃 度 依 存 的 にアメーバの運 動 性 が 更 新 することより、PtdIns(4,5)P 2 の 加 水 分 解がアメーバの 細 胞 運 動 に 関 与 していることが 示 唆 された。遺 伝 子 クローニング哺 乳 類 PLC β、γ、δの X ドメインで 保 存 されているアミノ 酸 配 列 から 設 計 した 縮 重 プライマーを 用 いて、cDNA を 鋳 型 として PCR を 行 ったところ、118bp の DNA 断 片 が 得 られた。この 塩 基 配 列 をもとに3’RACE 法 および 5’RACE 法 を 行 い、 遺 伝 子 全 長 を 含むと 推 定 される 配 列 を 得 た。ノザンブロッティングによる mRNA 発 現 解 析 を 行 ったところ、アメーバRNA のレーンにのみ 約 2.5 kb に 相 当 する 位 置 にシグナルが 検 出 された。これは 単 離 した cDNA のサイズ2544 bp とほぼ 一 致 し、 得 られた 遺 伝 子 がアメーバ 由来 の 転 写 産 物 であることが 示 唆 された。 得 られた 遺伝 子 を Applc (Amoeba proteus phospholipase C) と 命 名した。 大 腸 菌 で 発 現 させ、 精 製 した GST-ApPLC には PtdIns(4,5)P 2 加 水 分 解 活 性 が 存 在 した。ApPLCは 新 規 のPLCであるApPLC のアミノ 酸 配 列 について DDBJ の FASTAで 検 索 したところ、 種 々の PLC と 相 同 性 があった。また、ApPLC のアミノ 酸 配 列 について Pfam のドメインサーチを 行 ったところ、N 末 端 側 から C2 ドメイン、EF ハンドモチーフ、XY ドメイン、C2 ドメインを 持 つことが 示 された。すなわち、 哺 乳 動 物 の PLCアイソフォームに 存 在 する PH ドメインの 代 わりにC2 ドメインが 存 在 していた。C2 ドメインは Ca 2+ 依存 的 にリン 脂 質 膜 に 結 合 することが 知 られるドメイ

48 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年ンであるが、 現 在 までに、N 末 端 側 に C2 ドメインが存 在 する PLC は 報 告 されていない。すなわち、ApPLC は 新 規 の PLC である。また、ApPLC の C 末端 側 の C2 ドメインは PLC ファミリーの C 末 端 に 存在 する C2 ドメインと 相 同 性 があったが、N 末 端 側の C2 ドメインは PLC の C2 ドメインよりも、エキソサイトーシスに 関 与 する Doc2 やシナプトタグミンの C2 ドメインと 相 同 性 が 高 いことがわかった。PtdIns(4,5)P 2 の 加 水 分 解 産 物 である Ins(1,4,5)P 3 の 注入 により 運 動 が 引 き 起 こされたことから、アメーバの 細 胞 運 動 には PLC の 活 性 化 が 関 与 していることが強 く 示 唆 された。 細 胞 運 動 との 関 係 はまだ 不 明 であるが、 我 々は Amoeba proteus からユニークなドメイン 構 造 をもつ PLC をコードする 遺 伝 子 をクローニングした。 今 後 、ApPLC とアメーバの 細 胞 運 動 との 関与 について 解 析 していきたい。[ 文 献 ]1) Kawakatsu, T. et al. (2000) Cell Struct. Funct., 25,269-277.2) Rebecchi, M. J. et al. (2000) Physiol. Rev., 80, 1291-1335.Paramecium caudatum における 低 温 条 件 での 細 胞 増 殖 に 関 する遺 伝 学 的 研 究佐 々 木 大 , 芳 賀 信 幸 ( 石 巻 専 修 大 学 ・ 理 工 )Genetical research on cell proliferation at low temperature in Paramecium caudatumHajime SASAKI and Nobuyuki HAGA (Dept. of Biotech., Ishinomaki Senshu Univ.)SUMMARYThe question of how paramecia survive the winter season involves many interesting problems in the fields of ecology,physiology and genetics. Using growth experiments under low temperature, we have examined the importance ofheritable characters for both proliferation and survival. To elucidate genetic effects on cell proliferation and survival inlow temperature cultivation, we have examined the acclimation effect, a short-term physiological adaptation, by changingthe cooling rate leading to low temperature cultivation. Two proliferative lines (KNZ2S1 #24, #26) showed growthcurves after acclimation treatment (20 days incubation with a cooling rate of 1°C per day from 25°C) similar to thegrowth curves obtained in rapid-cooling conditions; and two non-proliferative lines (#11, #22) still showed no proliferationafter acclimation treatment. These results indicate that neither proliferation nor survival under low temperature dependon the cooling rate. Average survival ratio and average proliferative activity in the progeny of a selfing conjugationof KNZ2, the original low-temperature proliferative stock, showed positive correlation. However, we could not obtainclear segregation ratios in either proliferative ability or survival in these experiments. We must therefore consider thepossibility of genetic complexity underlying the mechanisms of low-temperature acclimation, and hence the winteringmechanisms.[ 目 的 ] P. caudatumの 越 冬 に 関 する 研 究 を 行 う 上 で、低 温 条 件 での 細 胞 増 殖 能 力 に 関 わる 遺 伝 的 要 因 を 調べる 実 験 の 基 礎 として、 急 激 な 温 度 の 低 下 と 緩 やかな 温 度 の 低 下 が 細 胞 増 殖 能 に 与 える 影 響 を 低 温 条 件下 (5°C)における20 日 間 の 細 胞 増 殖 を 調 べる 事 によって 推 測 するとともに、P. caudatumの 低 温 増 殖 能力 が 遺 伝 学 的 特 性 を 調 べることを 目 的 とした。 本 実験 では4 系 統 のP. caudatumをそれぞれ 低 温 条 件 下 で 培養 し、 増 殖 曲 線 を 比 較 解 析 し、 自 系 接 合 の 子 孫 が 低温 条 件 下 でどのような 増 殖 曲 線 を 示 すかを 調 べるこ

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)49とで、 培 養 の 温 度 条 件 を 検 討 した。[ 材 料 と 方 法 ] 今 回 使 用 した 株 は、KNZ2という 低 温条 件 下 でも 高 い 細 胞 増 殖 能 力 を 持 つ 株 の 自 系 接 合 によって 作 り 出 した 子 孫 、KNZ2S1#11・#22・#24・#26である。実 験 A: 緩 やかな 温 度 の 低 下 が 細 胞 増 殖 に 与 える影 響 を 調 べる 実 験 系 で、1 培 養 温 度 が25℃から24 時間 毎 に1°Cずつ 低 下 していくインキュベータのなかで1 細 胞 単 離 培 養 法 を 用 いて20 日 間 培 養 した 後 、25℃で20 日 間 培 養 し、その 細 胞 増 殖 能 力 と 生 存 率 を 調 べた。(2では 培 養 液 は3 日 に1 度 交 換 した。)実 験 B: 急 激 な 温 度 の 低 下 を 伴 う 実 験 系 で、 培 養温 度 25℃から 前 述 行 程 2に 入 れた。各 株 ともに25℃で 最 低 8 日 間 培 養 した 後 、 上 述 の 実験 系 を 用 いて、 低 温 培 養 20 日 間 における 平 均 生 存 細胞 数 を 調 べ、 細 胞 増 殖 の 様 子 をグラフに 表 した。[ 結 果 と 考 察 ] 実 験 A および B 共 に、 低 温 条 件 下で#24・#26は 増 殖 可 能 であり、#11・#22はほとんど 増 殖 することができなかった。このことより、低 温 条 件 下 での 細 胞 増 殖 能 力 を 調 べる 際 の 実 験 系 としてはどちらの 実 験 系 も 有 効 であることが 示 唆 されたが、(ⅰ)20 日 間 における 死 亡 細 胞 数 や、(ⅱ) 実 験 Aでは 細 胞 増 殖 は 実 験 開 始 直 後 から 始 まるのに 対 し、Bでは 実 験 開 始 5 日 後 から 増 殖 を 始 め、 増 殖 速 度 はAよりも 早 い、など 幾 つかの 相 違 点 も 見 られた。 以 上の 結 果 より、 実 験 結 果 が 出 るまでの 時 間 が 短 く 手 間がかからないという 点 から、Bの 実 験 系 を 用 いて 以後 の 実 験 を 行 うことにした。次 に、KNZ2の 自 系 接 合 によって 得 られた 子 孫 40 系列 について 低 温 条 件 下 での 細 胞 増 殖 能 力 を 調 べた。低 温 条 件 下 での 細 胞 増 殖 には 少 なくとも 低 温 でも 生存 できる 能 力 と 分 裂 する 能 力 が 必 要 だと 考 え、20 日間 における 平 均 生 存 率 に 対 する 平 均 分 裂 回 数 をプロットしたグラフを 作 成 した。その 結 果 、5℃における20 日 間 の 平 均 生 存 率 と 平 均 分 裂 回 数 との 間 には 弱い 正 の 相 関 があることが 明 らかになった。しかし、遺 伝 学 的 な 分 離 比 に 分 けることが 出 来 なかったので、 低 温 条 件 での 生 存 ・ 分 裂 の 能 力 にはそれぞれ 複数 の 遺 伝 子 が 関 与 ているのではないかと 考 えられる。そこで、#22の 自 系 接 合 による 子 孫 を7 系 列 獲 得し、その 低 温 条 件 下 における 細 胞 増 殖 能 力 について調 べたところ、 親 である#22とは 異 なる 増 殖 曲 線 を示 す 子 孫 も 出 現 した。以 上 の 結 果 は、これまで 低 温 条 件 下 での 生 存 能 力について 不 明 な 点 が 多 かったP. caudatumの 増 殖 能 に関 して 個 々の 細 胞 が 持 つ 遺 伝 的 要 因 の 重 要 性 という新 たな 視 点 を 提 供 するものであり、 今 後 、 生 物 の 越冬 メカニズムを 理 解 する 上 でもこの 点 は 検 討 されるべき 課 題 であると 思 われる。高 温 下 でオートガミー 未 熟 期 が 延 長 するヨツヒメゾウリムシの新 規 突 然 変 異 体 の 分 離高 木 由 臣 , 小 森 理 絵 ( 奈 良 女 大 ・ 理 ・ 生 物 科 学 )A new type of temperature sensitive mutant of Paramecium tetraurelia that has longautogamy immaturity and short clonal life spanYoshiomi TAKAGI and Rie KOMORI(Department of Biological Science, Faculty of Science, Nara Women’s University)SUMMARYWe have isolated a new type of Paramecium tetraurelia mutant, named d4-312, that has a long immaturity perioduntil autogamy. As such a mutant, we previously isolated the stock d4-RK (Komori, R., et al., 2004). These two mutants

50 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年had some additional common features such as dependence of the occurrence of autogamy on the temperature, involvementof a single recessive gene, lower fission rate and shorter clonal life span. However, d4-312 was considered a newtype mutant distinguishable from d4-RK because of their different natures of temperature sensitivity. First, the temperatureat which they resembled the wild-type phenotype was low (19°C) in d4-312, although it was high (32°C) in d4-RK.Second, the clonal life span of d4-312 at 25°C was similar to that of the wild-type, but it was extremely shorter at 32°Cthan at 25°C, although it was similarly shorter at both temperatures in d4-RK. Third, the difference of the fission ratebetween the mutant and wild-type was greater at 32°C than at 25°C in d4-312, although it was similar at both temperaturesin d4-RK. The age at sexual maturation did not correlate, within species, to the maximum clonal life span as proposedamong species.[ 目 的 ] 「 生 物 の 時 間 は 体 重 の 1/4 乗 に 比 例 する(T=aW 1/4 )」というアロメトリー 式 がある。この 式は、 寿 命 T L 、 性 成 熟 までの 時 間 T M 、 心 臓 の 拍 動 周期 T P など 様 々な 時 間 に 適 用 できるので、 例 えば T L /T M = 一 定 、すなわち「 生 物 の 寿 命 は 性 成 熟 までの 時間 に 比 例 する」という 関 係 が 導 かれる。 実 際 この 関1) 2)係 は、 哺 乳 類 や 繊 毛 虫 類 で 大 まかに 成 立 することが 報 告 されている。 我 々が 先 に 分 離 したヨツヒメゾウリムシの 短 寿 命 突 然 変 異 株 d4-SL4(jumyo ホモ)ではオートガミー 未 熟 期 も 短 縮 していた 3) が、オートガミー 未 熟 期 延 長 突 然 変 異 株 d4-RK(rie ホモ)ではクローン 寿 命 が 短 縮 していた 4) 。しかしrie 遺 伝 子 が 寿 命 の 延 長 にも 関 わっている 可 能 性 を 否定 し 切 れなかったため、 再 度 オートガミー 未 熟 期 延長 型 の 突 然 変 異 株 を 分 離 し、クローン 寿 命 との 関 係を 調 べることを 目 的 とした。[ 材 料 と 方 法 ] 材 料 はヨツヒメゾウリムシの 51 株( 野 生 株 )と、 遺 伝 解 析 のためにマーカ ーとしてnd169 をホモにもつ d4N-527 株 (トリコシスト 放 出不 能 )を 用 いた。 突 然 変 異 剤 処 理 、オートガミー 誘導 、クローニングと 続 く 常 法 処 置 の 後 、9 回 ・18回 ・27 回 分 裂 齢 のオートガミー 率 が 25°C で 0%・0%・30% 以 下 という 条 件 を 充 たしたクローンを 選 別した。その 後 、d4N-527 株 との 接 合 と、それに 続 くオートガミーで 得 た 子 孫 について、マーカー 遺 伝 子で 1:1 分 離 を 示 したものについて 遺 伝 解 析 を 行 った。 培 養 はバクテリア 接 種 の WGP 浸 出 液 をエサとし、 異 なる 培 養 温 度 下 で、 各 10-15 クローンについて 単 離 培 養 法 で 分 裂 齢 を 進 め、 単 離 後 の 各 カ ルチャーが 定 常 期 になったときにオートガミー 率 ( 大核 崩 壊 像 を 示 す 細 胞 の 割 合 )を 調 べた。クローン 寿命 と 分 裂 速 度 を 調 べる 実 験 には、それぞれ 2 つのサブクローンからなる 30 クローンを 用 い、サブクローン 間 での 置 き 換 えを 許 しながら、 長 く 生 きたサブクローンでそのクローンを 代 表 させた。[ 結 果 と 考 察 ] 突 然 変 異 剤 処 理 をした 478 クローンのうち、 選 別 基 準 を 充 たした 1 株 (d4-312)を 得 た。一 旦 ストックとして 保 存 した 後 、 改 めて 100%オートガミーカルチャーをつくり、この 株 の 様 々な 特 徴 について 調 べた。その 結 果 以 下 の 5 点 について、 先 に分 離 した d4-RK 株 と 共 通 の 特 徴 を 示 した。(1) 野 生 株に 比 べオートガミー 誘 導 開 始 分 裂 齢 が 遅 く、その 後も 変 異 幅 の 大 きな 誘 導 率 を 示 した。(2) オートガミー誘 導 率 が 培 養 温 度 によって 大 きく 変 動 した。(3) 単 一の 劣 性 遺 伝 子 の 関 与 が 示 唆 された(rie-2 と 命 名 し、先 の rie を rie-1 と 改 めた)。(4) 短 いクローン 寿 命と、(5) 遅 い 分 裂 速 度 を 示 した。以 上 のような 共 通 性 にもかかわらず、rie-2 と rie-1とは 別 な 遺 伝 子 であると 結 論 したのは、d4-312 株 がd4-RK 株 とは 全 く 対 照 的 な 温 度 感 受 性 を 示 したことによる。 第 一 に、d4-RK 株 のオートガミー 誘 導 は 32°C で 促 進 されたのに 対 し、d4-312 株 では 32°C で 抑 制され 19°C で 促 進 された。 第 二 に、d4-RK 株 のクローン 寿 命 は 25°C でも 32°C でも 野 生 株 に 比 べ 同 程 度 に短 縮 したのに 対 し、d4-312 株 では 25°C で 野 生 株 並 みのクローン 寿 命 を 示 しながら 32°C では 著 しく 短 縮 した。 第 三 に、d4-RK 株 の 分 裂 速 度 は 25°C で 32°C より 低 下 したのに 対 し、d4-312 株 では 32°C で 25°C より 低 下 した。我 々はこれまで、クローン 寿 命 とオートガミー 未熟 期 の 長 さに 関 係 する 突 然 変 異 株 の 分 離 を 行 ってきたが、 今 回 3 つ 目 の 突 然 変 異 株 をこの 分 野 の 共 有 資産 として 提 供 することが 出 来 た。これら 3 株 のうち2 株 で、オートガミー 未 熟 期 の 延 長 とクローン 寿 命の 短 縮 という 共 通 の 特 徴 を 示 したことから、よく 知られている「 生 物 の 寿 命 は 性 成 熟 までの 時 間 に 比 例する」という 法 則 は、 種 間 の 関 係 として 理 解 すべきであって、 種 内 でのクローンでは 両 者 は 必 ずしもカ

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)51プリングしないことが 明 らかになった。[ 文 献 ]1) Cutler, R.G., (1978), In: Behnke, J.A., Finch, C.E., andMoment, G.B. (Eds.). The Biology of Aging. PlenumPress, New York, pp. 311-360.2) Smith-Sonneborn, J., (1981), Int. Rev. Cytol. 73, 319-354.3) Takagi, Y., Izumi, K., Kinoshita, H., Yamada, T., Kaji,K., and Tanabe, H., (1989), Genetics 123, 749-754.4) Komori, R., Harumoto, T., Fujisawa, H. and Takagi, Y.,(2004), Mech. Ageing Dev. 125, 603-613.ボウフラから 発 見 された 繊 毛 虫 テトラヒメナの 無 菌 培 養 について久 富 裕 子 , 岩 見 涼 子 , 松 田 涼 子 , 赤 川 裕 美 , 内 田 眞 砂 子 , 高 橋 忠 夫 ( 西 九 州 大 ・ 生 物 )On the axenic culture of the ciliate Tetrahymena sp. found in a dead mosquito larvaYuko HISATOMI, Ryoko IWAMI, Ryoko MATSUDA, Yumi AKAGAWA, Masako UCHIDA andTadao TAKAHASHI (Biol. Lab., Nishikyushu Univ.)SUMMARYWe succeeded in axenically culturing the ciliate Tetrahymena sp., which was found in a dead mosquito larva, usingPY medium (1% proteose peptone, 0.5% yeast extract containing antibiotics) at 23°C (Hisatomi et al., 2003). Under theculture conditions, the cells grew logarithmically and reached the stationary phase at day 9. At that time, the cell densitiesreached 174,000 cells/ml. However, from day 11, some of the cells gradually assumed a round shape and subsequentlyunderwent cytolysis. Therefore, the purpose of this work was to modify the culture method to prevent cytolysis.As a first step, the population growth was examined in the following four culture media: 1% proteose peptone (1%P),0.5% yeast extract (0.5%Y), 1% proteose peptone with 0.1% yeast extract (P with 0.1%Y), and 1% proteose peptonewith 0.01% yeast extract (P with 0.01%Y). In 1%P, P with 0.1%Y, and P with 0.01%Y, the cells grew logarithmicallyuntil day 7, and their cell densities reached 8,900 cells/ml, 28,000 cells/ml, and 18,000 cells/ml, respectively. In 0.5%Ythe cells grew continuously until day 21, but the cell density reached only 7,000 cells/ml. It is clear that further modificationof the culture method is required, because cytolysis occurred gradually from day 22 to day 24 in the first three media.[ 目 的 ] Tetrahymena pyriformisやT. thermophilaなどテトラヒメナ 属 の 多 くの 種 が 無 菌 的 に 培 養 できることが 知 られており、プロテオースペプトン(P)や 酵 母エキス(Y)を 用 いた 簡 便 な 培 地 から 完 全 合 成 培 地まで、 様 々な 培 地 が 提 案 されている 1,2,4 4,6,7,10) 。これらの 繊 毛 虫 は、 無 菌 培 養 できることで 細 胞 モデルとして 極 めて 有 用 な 生 物 となっている。しかし、 一方 、これまで 無 菌 化 されていなかった 繊 毛 虫 を 無 菌化 することで 新 しい 問 題 にアプローチできる 糸 口 を見 出 すことも 可 能 と 考 えられる。 我 々は1999 年 に 佐賀 市 近 郊 の 竹 薮 で 採 取 されたヒトスジシマカの 死 んだボウフラからテトラヒメナ 属 の1 種 を 発 見 した。この 繊 毛 虫 はバクテリアを 与 えただけでは 培 養 できないが、 鶏 肉 などの 生 肉 を 与 えることで 培 養 できることが 当 研 究 室 で 明 らかになった 5,8,9) 。さらに、 培 養液 中 の 定 常 期 にはシストを 形 成 した。 現 在 、シスト形 成 要 因 を 無 菌 的 に 培 養 できる 系 は 知 られていないので、 本 種 を 無 菌 培 養 しようと 考 えた。 昨 年 、 本 種をPY 培 地 (1%P+0.5%Y)で 無 菌 的 に 培 養 することに 成 功 したが、 定 常 期 に 達 した11 日 目 には 細 胞 がダメージを 受 けて 崩 壊 してしまった。そこでこの 細 胞崩 壊 を 防 ぐための 培 養 法 について 様 々な 検 討 を 行 っ

52 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年た。[ 材 料 と 方 法 ] ヒトスジシマカのボウフラの 死 体 から発 見 されたテトラヒメナの 保 存 株 はレタス 浸 出 液(0.5g/1000 m l)に 鶏 肉 (2g/1000ml)を 加 え、20±1℃ に 保 っ た。ま た、 無 菌 化 した 保 存 株 は1%P+0.5% Y 培 地 に 抗 生 物 質 を 加 え た も のに 植 え、23±1℃に 保 ち、10 日 ごとに 培 養 を 更 新 した。 実 験 では、100mlの 三 角 フラスコに30mlの 培 養 液 を 入 れ、テトラヒメナは 初 期 細 胞 密 度 が2cells/mlになるように無 菌 化 保 存 株 から 接 種 し、23±1℃に 保 った。その後 、 毎 日 、 一 定 量 の 細 胞 懸 濁 液 を 細 胞 計 算 板 に 移し、ブアン 氏 液 で 固 定 したのち、ズーム 式 実 体 顕 微鏡 の 下 で 数 取 器 を 用 いて 細 胞 数 を 計 数 した。[ 結 果 と 考 察 ] 本 種 はバクテリア、または 肉 エキスを加 えたレタス 浸 出 液 では 増 殖 しないが、 鶏 肉 片 を 加えたレタス 浸 出 液 で 増 殖 し、 定 常 期 には 約 2,000cells/mlに 達 する 5,8,9) 。この 繊 毛 虫 を、1% P+0.5%Y 培 地に 移 すと 無 菌 的 に 培 養 できることはすでに 報 告 した5) 。しかし、この 培 地 では 定 常 期 には174,000cells/mlに 達 するが、 培 養 11 日 目 には 細 胞 崩 壊 が 生 じ、 細 胞密 度 は 減 少 に 転 じた。そこでこの 細 胞 崩 壊 をできるだけ 遅 らせる、または 防 ぐことを 目 的 としてPとYの濃 度 や 比 率 を 変 えたときのテトラヒメナの 増 殖 について 調 べた。 第 一 段 階 としてPとYの 濃 度 を 低 下 させた0.5%P+0.25%Y 培 地 では、 培 養 7 日 目 まで、1%P + 0.5% Y 培 地 と 同 様 に 対 数 的 に 増 殖 し、 約20,000cells/mlに 達 した。この 場 合 、 細 胞 崩 壊 は17 日まで 遅 らせることができた。 次 にPとYの 比 を 変 え、1%P+0.1%Yおよび1%P+0.01%Yで 培 養 すると、これらでも 7 日 目 まで 対 数 的 に 増 殖 し、そ れ ぞ れ28,000cells/ml、18,000cells/mlに 達 し、その 後 定 常 期となった。そして 細 胞 崩 壊 は22 日 目 以 降 になるまで起 こらなかった。さらに1%Pのみで 培 養 した 場 合 、同 じく7 日 目 まで 対 数 的 に 増 殖 したが、8,900cells/mlと 前 者 に 比 べて 増 殖 が 低 下 した。しかし、 細 胞 崩 壊は 同 様 に24 日 目 以 降 と 遅 らせることができた。 一方 、0.5%Yのみでは21 日 まで 増 殖 しつづけたが、7000cells/mlにしかならなかった。これらのことから、さらにより 長 期 間 細 胞 崩 壊 を 起 こさない 安 定 した 培 地 について 現 在 も 検 討 している。そのように 安定 した 培 養 条 件 を 確 立 した 上 で、シスト 形 成 機 構 について 調 べる 予 定 である。[ 文 献 ]1) Bruns, P. J. et al. (1983) Genetics, 104, 257-2702) Cameron, I.L.(1973)Biology of Tetrahymena, Dowden,Hutchinson&Ross, Inc., Pensylvania, 199-226.3) Corliss, J. O. and Esser, S. C.(1974) Trans. Amer.Micros. Soc., 93, 578-593.4) Frankel, J. et al. (1976) Genetics, 83, 489-506.5) Hisatomi, Y. et al.(2004)Jpn. J. Protozool., 37, 62-63.6) Martindale, D.W. et al. (1982)Exp Cell Res., 140,227-236.7) Nanney, D. L. and McCoy, J. W. (1976) Trans.Amer. Micros. Soc., 95, 664-682.8) Takahashi, T. et al. (2002) Jpn. J. Protozool., 35, 35.9) Takahashi, T. et al. (2004) JEOLnews, 39, 16-19.10) 渡 辺 良 雄 , 斉 藤 実 (1968) 生 物 学 的 技 術 Ⅰ, 吉 岡 書店 .

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)53コルポーダにおけるシスト 形 成 誘 導 因 子 について:細 胞 間 相 互 作 用 および 古 い 培 養 液 中 に 含 まれる 成 分 の 検 討明 松 隆 彦 , 松 岡 達 臣 ( 高 知 大 ・ 理 ・ 生 物 科 学 )Encystment-inducing factors in Colpoda sp.: Cell-to-cell interaction and effect ofcomponents contained in exhausted mediumTakahiko AKEMATSU and Tatsuomi MATSUOKA (Inst. Biol, Fac. Sci., Kochi Univ.)SUMMARYCells of the ciliated protozoan Colpoda sp. gradually encyst in stationary phase culture. Candidates for encystmentinducingfactors could be as follows: (1) an increase in cell density; (2) molecules accumulated in exhausted medium; or(3) a decrease in encystment-suppressing elements contained in fresh culture medium (cereal infusion). We found that anincrease in cell density up to 3,000 cells/ml strongly induced encystment, and replacement of the living cells with polystyrenelatex particles (PLP) or glass particles also induced encystment. Cell-free exhausted medium also showed strongencystment-inducing activity, and boiling destroyed this activity. These results indicate that factors inducing encystmentof the cells during the stationary phase include cell-to-cell contact due to an increase in cell density, and molecules thatare unstable to heat which accumulate in exhausted medium.[ 序 論 ] 繊 毛 虫 コルポーダのシスト 化 は、Ca 2+ などの塩 濃 度 の 上 昇 ( 乾 燥 シグナル)によって 誘 導 され1,2) 、 外 液 に 存 在 するバクテリア 由 来 の 分 子 や 培 養 液( 麦 葉 浸 出 液 )に 含 まれるポルフィリン 化 合 物 により 抑 制 される 3,4) ことが 分 かっている。 一 方 、 個 体 群成 長 の 定 常 期 に 達 したコルポーダはCa 2+ によるシスト 化 誘 導 を 行 わなくてもシスト 形 成 が 起 きる。この場 合 、シスト 形 成 を 誘 導 する 因 子 として、1) 細 胞密 度 の 上 昇 、2) 培 養 液 中 への 誘 導 因 子 の 蓄 積 、3) 培 養 液 に 存 在 したシスト 化 抑 制 因 子 の 消 失 が 考えられる。 本 研 究 では、 上 述 した3つの 因 子 の 可 能性 を 検 討 し、 個 体 群 成 長 後 に 起 きるシスト 化 誘 導 因子 が 細 胞 密 度 上 昇 による 物 理 的 な 接 触 頻 度 の 上 昇 および 古 い 培 養 液 (Exhausted medium) 中 に 含 まれる熱 不 安 定 な 成 分 であることを 明 らかにした。[ 材 料 と 方 法 ] コルポーダ(Colpoda sp.)は、バクテリア(Enterobacter aerogenes)を 植 え 付 けた 麦 葉 浸 出液 (0.1%)で 培 養 した。 各 実 験 には 原 則 として 休 眠シストから 脱 シスト 誘 導 した 細 胞 を 用 いた。 細 胞 密度 のシスト 形 成 に 及 ぼす 影 響 やポリスチレンラテックス 粒 子 (PLP) 等 の 各 粒 子 の 影 響 を 調 べる 場 合は、 定 常 期 の 細 胞 を 含 む 懸 濁 液 (1ml)を 時 計 皿( 直 径 5cm)に 入 れて 観 察 を 行 った。 実 験 に 使 用 したExhausted mediumは、 脱 シスト 誘 導 から3 日 間 経過 した 培 養 液 (ほぼ100%のシスト 化 がおきたもの)を 濾 紙 で 濾 過 することによって 得 た(4℃で 保 存 )。個 体 群 成 長 およびシスト 形 成 の 観 察 は、 脱 シスト 誘導 から8 時 間 以 内 に 脱 シストした 細 胞 を、20mlの 各 テスト 溶 液 を 入 れたガ ラスシャ ーレ( 底 面 の 直 径4.5cm、 高 さ4cm)に 懸 濁 し、12 時 間 毎 の 細 胞 数 を計 測 した。[ 結 果 と 考 察 ] (1) 細 胞 密 度 の 効 果 :Tris 緩 衝 液(0.1mM Tris-HCl, pH 7.2) 中 に、 遠 心 (1,000 g,1min)により 集 めた 細 胞 を 異 なる 密 度 で 懸 濁 した 場合 、 低 密 度 (30 cells/ml)では、8 時 間 までにほとんどシスト 形 成 は 誘 導 されなかったが、 高 密 度 (3,000cells/ml)では 約 80%のシスト 形 成 が 誘 導 された。このようなシスト 誘 導 効 果 が 外 液 に 放 出 された 細 胞 由来 の 分 子 に 起 因 するか 否 かを 知 るために、 高 密 度 懸濁 液 ( 一 晩 懸 濁 )から 得 た 上 清 に 細 胞 を 低 密 度 で 懸濁 したシスト 誘 導 効 果 を 調 べた。しかし、この 上 清はシスト 誘 導 効 果 を 示 さなかった。 生 きた 細 胞 の 代わりにPLP( 直 径 25μm)やガラスビーズ( 直 径 45μm)の 高 密 度 懸 濁 液 中 でも 顕 著 なシスト 形 成 が 誘導 されたことから、 高 密 度 細 胞 懸 濁 液 中 では 細 胞 同士 の 物 理 的 接 触 がシスト 形 成 の 誘 導 に 関 与 している

54 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年と 考 えられる。(2)Exhausted medium 中 に 存 在 する 成 分 :Exhausted medium 中 に 脱 シストさせたコルポーダを懸 濁 すると、 速 やかにシスト 形 成 が 誘 導 され36 時 間以 内 にほぼ100%の 細 胞 はシスト 化 し、 細 胞 増 殖 はほとんど 起 こらなかった。( 新 鮮 な 麦 葉 浸 出 液 に 懸 濁した 場 合 は100%のシスト 化 に 要 する 時 間 は72 時間 )。 一 方 、 数 分 間 煮 沸 したExhausted mediumは 個体 数 の 増 加 は 同 様 に 抑 制 されたが、シスト 形 成 誘 導効 果 は 著 しく 抑 制 された(72 時 間 で 約 50%のシスト化 )。この 結 果 は、Exhausted medium 中 に 存 在 する熱 不 安 定 な 分 子 がシスト 形 成 の 誘 導 因 子 として 働 いていることを 示 している。(3) 培 養 液 に 存 在 したシスト 化 抑 制 因 子 の 消失 : 新 鮮 な 麦 葉 浸 出 液 ( 培 養 液 ) 中 の 成 分 (おそらくポルフィリン 化 合 物 )や 外 液 に 放 出 されたバクテリア 由 来 の 成 分 はシスト 化 を 抑 制 する 3,4) 。したがって、 定 常 期 以 降 の 培 養 液 中 ではこのような 抑 制 因 子の 濃 度 ( 密 度 )が 低 下 しているかも 知 れない。そこで、すでにシスト 形 成 抑 制 因 子 として 知 られている銅 クロロフィリンナトリウムを 定 常 期 の 細 胞 に 添 加してシスト 形 成 が 抑 制 されるかどうかを 調 べたが、抑 制 効 果 はみられなかった。また、 培 養 開 始 から3 日目 まで、 培 養 液 中 のバクテリア 密 度 はむしろ 上 昇 傾向 にあった。これらの 結 果 は、このような2つのシスト 化 抑 制 因 子 の 消 失 がシスト 形 成 を 誘 導 したのではないことを 示 唆 している。[ 文 献 ]1) Watoh, T. et al. (2003) Jpn.J.Protozool., 36, 105-111.2) Yamaoka, M. et al. (2004) Acta Protozool., 43, 93-98.3) Yamasaki, C. et al. (2004) Jpn. J.Protozool., 37, 111-117.4) Tsutsumi, S. et al. (2004) Jpn. J.Protozool., in press.ゾウリムシ(Paramecium caudatum)の 接 合 型 決 定 遺 伝 子 の 探 索佐 藤 千 尋 , 権 田 幸 祐 , 高 橋 三 保 子 ( 筑 波 大 ・ 生 命 環 境 科 学 研 究 科 )Screening of the gene controlling mating type in Paramecium caudatumChihiro SATOH, Kohsuke GONDA and Mihoko TAKAHASHI(Graduate School of Life and Environmental Sciences, Univ. of Tsukuba)SUMMARYIn Paramecium caudatum, when the Odd (O) mating-type and Even (E) mating-type cells are mixed together underappropriate condition, they make mating clumps that called mating reaction leading to conjugation. The genes controllingmating types were investigated by cross breeding analyses and proposed three gene hypotheses (Tsukii & Hiwatashi,1983). According to this hypothesis, co-dominant allele Mt at the Mt locus determines E mating type, and MA and MB atthe MA and MB loci determine O type. However, little is known about the substances controlled by three genes. Here, wereport two attempts for molecular identification of genes involved in mating types. One attempt is the cloning by complementationcloning method. First, we tried to find the proper restriction enzyme for preparation of sub-genomic library.When E 1 DNA digested with DraI was microinjected to E 3 macronucleus, only a few recipient cell lines expressed veryweak E 1 type. We are searching the better restriction enzyme to prepare the library. The other attempt is differential displaymethod for screening the genes involved in controlling mating types. Comparing the band patterns between matingreactive and non-reactive cells, several bands that expressed only in mating reactive cells were detected.[ 目 的 ] ゾウリムシ(Paramecium caudatum)の 接 合型 グループ(syngen)は 相 補 的 な 接 合 型 、Odd type( 以 下 O 型 )とEven type( 以 下 E 型 )から 成 る。 接 合活 性 を 現 すこれらの 細 胞 が 出 会 うと 凝 集 し( 交 配 反

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)55応 )、 接 合 が 誘 導 される。 各 々の 接 合 型 はsyngen 特異 的 な3つの 遺 伝 子 、Mt,MA,MBにより 決 められ、Mtが 接 合 型 をE 型 に 決 定 していることが 交 雑 実 験 により明 らかにされている (1) 。しかし、これらの 遺 伝 子 の実 体 はまだ 明 らかにされていない。 今 回 、2つの 方 法でこれら 接 合 型 決 定 に 関 わる 遺 伝 子 をクローニングすることを 目 指 した。1ゾウリムシでは 野 生 型 の 細胞 の 核 からDNAを 抽 出 し 変 異 体 の 核 にmicroinjectionするとその 変 異 体 の 形 質 が 野 生 型 に 戻 ること (2) 、 異なるsyngenに 属 するE 型 細 胞 間 で 大 核 の 核 質 移 植 を 行うとrecipientのcell lineで2つのsyngen 特 異 性 を 現 すもの(dual E type)が 高 率 で 出 現 すること (3) が 示 されている。これらの 事 実 を 利 用 し、syngenの 異 なるE 型 細胞 間 でのDNAの 移 植 を 行 い、Mtのクローニングを 試み た。2 接 合 活 性 の 強 さに 差 の あ る 細 胞 間 でのDifferential Displayを 行 い、 接 合 活 性 のある 細 胞 に 特異 的 に 発 現 する 遺 伝 子 の 探 索 を 試 みた。[ 材 料 と 方 法 ] 1 相 補 性 クローニングによるMtのクローニングの 試 み: E 1 ( 株 N93-079, 野 生 型 )を 大 量培 養 し、DNAを 抽 出 した。これを13 種 類 の 制 限 酵 素(BamHI、DraI、ScaI、HinfI、KpnI、HincII、XbaI、EcoRI、PstI、SacII、NotI、SmaI、ApaI)でそれぞれ切 断 し た も の を recipient で あ る E 3 ( 株16BKZs2,cnrB;tnd2)の 大 核 にmicroinjectionし、 接 合 型の 転 換 が 起 こるかどうかを 検 討 した。 接 合 型 の 判 定はinjection 後 のrecipient 細 胞 を 試 験 管 又 はキャピラリー 中 で15 回 分 裂 又 は6 回 分 裂 させた 後 、cell lineの細 胞 群 をおよそ4 等 分 し、 強 い 接 合 活 性 を 現 すテスター 細 胞 4 種 類 (E 1 ,O 1 ,E 3 ,O 3 )と 混 ぜ 合 わせ 交 配 反応 の 有 無 により 行 った。2Differential Display 法 による 接 合 型 決 定 遺 伝 子 スクリーニングの 試 み: 株 G3(O 3 )の 未 熟 期 ( 接 合 活 性無 し)、 対 数 増 殖 期 ( 接 合 活 性 無 し)、 初 期 定 常 期( 接 合 活 性 あり)にある 細 胞 からpoly(A) + RNAを 抽出 した。これをそれぞれ3 種 類 のanchorプライマーaagct(11)vで 逆 転 写 しcDNA poolを 調 製 した。これを逆 転 写 に 用 いたanchorプライマーとrandomプライマー(10mer)でPCRし、5%アクリルアミドゲル 電気 泳 動 を 行 った。SYBR GOLD による 染 色 後 、Molecular Imager FX(Bio Rad)でバンドの 検 出 を 行い、 接 合 活 性 の 有 無 によるバンドパターンの 比 較 を行 った。[ 結 果 と 考 察 ] 1 相 補 性 クローニングは、 制 限 酵 素 で切 断 した 野 生 型 DNAによるrecipientの 形 質 転 換 を 利 用した 方 法 である。 形 質 転 換 に 有 効 な 画 分 を 特 定 し、sub-genomic libraryを 作 製 し、 目 的 遺 伝 子 をクローニングする。そこでまず、Mtを 切 断 しない 制 限 酵 素の 選 択 を 行 った。 制 限 酵 素 で 切 断 したE 1 (Mt 1 /-, + cnrB /+ cnrB , + tnd2 /+ tnd2 )DNAをE 3 (Mt 3 /-, cnrB/cnrB, tnd2/tnd2)の大 核 に 注 入 した 場 合 ( 例 えばBamHI)、マーカー 形質 であるCNRとTNDが 完 全 に 治 癒 されたcell lineを 多く 得 ることができた。しかし、13 種 類 の 制 限 酵 素 のうち、 極 めて 弱 いがE 1 活 性 を 示 すrecipientが 得 られたものはBamHIとDraIのみであり、それぞれ51 cell line中 1 例 、27 cell line 中 5 例 であった。DNA 注 入 から 接 合型 の 判 定 までの 分 裂 回 数 を 約 15 回 と 約 6 回 で 比 較 したが、 形 質 転 換 の 強 さに 差 は 確 認 されなかった。 明 確な 形 質 転 換 が 確 認 されない 原 因 として、 接 合 型 の 発現 にはCNRやTNDよりも 多 くの 遺 伝 子 量 を 必 要 とすることが 示 唆 されており (3) 、 注 入 DNA 中 の 遺 伝 子 コピー 数 の 不 足 が 考 えられる。また、O 型 物 質 はE 型 物質 の 前 駆 物 質 であると 考 えられており (4) 、E 型 を 発 現する 為 には、syngen 特 異 性 を 有 するO 1 型 物 質 の 存 在が 必 要 であるか、O 型 物 質 とMt 遺 伝 子 産 物 とのバランスが 重 要 であることを 示 唆 していると 考 えられる。2 逆 転 写 に 用 いたanchorプライマーとrandomプライマーでcDNA poolをtemplateとするPCRを 行 ったところ、1レーンあたり 約 20 本 のバンドが 検 出 された。同 じプライマーの 組 み 合 わせでPCRした 接 合 活 性 の無 い 時 期 である 未 熟 期 と 対 数 増 殖 期 、 強 い 接 合 活 性を 現 す 初 期 定 常 期 のバンドパターンを 比 較 した。3 種類 のanchorプライマーと10 種 類 のrandomプライマーを 用 い、 合 計 30 通 りのPCRの 結 果 、 接 合 活 性 のある時 期 のみで 発 現 している 再 現 性 のあるバンドを7 個 得ることができた。 今 後 、これらのバンドからDNAを回 収 、クローニングし、 接 合 型 の 発 現 との 関 係 を 明らかにする。[ 文 献 ]1) Tsukii, Y. and Hiwatashi, K. (1983) Genetics, 104: 41-622) Haynes, W. Vaillant , B., Preston, R. Saimi, Y. andKung, C. (1998) Genetics, 149:947-9573) Hori, M. and Takahashi, M. (1994) Genet. Res., Camb.,63: 101-1074) Xu, X., Kumakura, M., Kaku, E. and Takahashi, M.(2001) J.Eukaryot. Microbiol., 48: 683-689

56 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年接 合 中 のプログラム 核 死 過 程 におけるミトコンドリアの 役 割小 林 孝 1,2 , 遠 藤 浩1 ( 1 金 沢 大 ・ 院 ・ 自 然 科 学 , 2 愛 知 医 大 ・ 分 医 研 )A role of mitochondria in programmed nuclear death during conjugationof Tetrahymena thermophilaTakashi KOBAYASHI 1,2 , Hiroshi ENDOH 1 ( 1 Div. of Life Sci., Grad. Sch. of Natural Sci. & Technol.,Kanazawa Univ., 2 Inst . Mol. Sci. Med., Aichi Med. Univ.)SUMMARYProtozoan ciliates, represented by Tetrahymena thermophila, have two morphologically and functionally differentnuclei in a single cytoplasm. One is a germinal micronucleus and the other is a somatic macronucleus. During conjugation,new macro- and micronuclei for the next generation are differentiated from a synkaryon (fertilized nucleus). Oncethe new macronucleus is differentiated, old parental macronucleus begins to degenerate. The nuclear degradation is sosimilar to that of the nucleus in apoptosis or programmed cell death (PCD) that this is called “programmed nuclear death(PND)”. The death process is divided into three stages, depending upon the degraded DNA sizes: 1) Initial generation ofhigh-molecular-weight DNA fragments (>30 kb), 2) oligonucleosome-sized ladder formation, 3) Eventual completedegradation of the DNA. Previously we identified caspase-like activities in PND. Here, we show association of mitochondriawith PND using two mitochondria specific dyes, DePsipher and MitoTracker. Mitochondria are incorporatedinto autophagosome together with the parental macronucleus prior to an entire resorption. In addition, we demonstratethat mitochondria retain a DNase activity similar to mammalian endonuclease G. Taking the mitochondrial DNase activityand the timing of the autophagosome formation into consideration, we presently conclude that the DNase activitymight play a role for the oligonucleosomal fragmentation during PND.[ 目 的 ] 繊 毛 虫 の 有 性 生 殖 ( 接 合 ) 過 程 中 の 核 退 化 過程 は、アポトーシス 様 の 特 徴 を 示 すことが 知 られている(プログラム 核 死 )。これまでに( 第 34, 35 回 大会 )、テトラヒメナの 旧 大 核 退 化 中 にカスパーゼ 様の 活 性 があること、 核 消 化 前 にミトコンドリアが 退化 核 と 共 に 自 食 胞 に 取 り 込 まれること、そのミトコンドリアが 膜 電 位 を 失 っていることを 示 した。しかしながら、ミトコンドリアの 核 退 化 過 程 での 機 能 については 不 明 であった。ミトコンドリアが 関 与 する時 期 は、 核 DNAの 分 解 時 期 と 一 致 することから、 今回 ミトコ ン ド リアの 細 胞 死 因 子 の 一 つであ るEndonuclease G (EndoG)のようなDNaseが 退 化 過 程 に関 与 している 可 能 性 を 検 証 した。[ 材 料 と 方 法 ] 栄 養 増 殖 期 のTetrahymena thermophila(CU428)を 細 胞 分 画 したミトコンドリアとそのポストフラクション 中 のDNase 活 性 を 見 た。 活 性 はplasmidDNAを 基 質 に50 mM MOPS (pH 6.5), 10 mM KClの 反応 液 中 で30°Cで1~2 時 間 の 条 件 で 行 った。 各 フラクション 中 のミトコンドリアの 量 をPCRで、またリソソームの 量 をAcid Phosphataseの 活 性 で 定 量 した。[ 結 果 と 考 察 ] ミトコンドリアの DNase 活 性 を 計 るためTetrahymena 細 胞 破 砕 液 を 遠 心 により 分 画 し、 以 下の5つの 分 画 を 用 意 した。 分 画 1:post-nuclear fraction、分 画 2:mitochondria fraction、 分 画 3: postmitochondriafraction 1、 分 画 4: post-mitochondria fraction2、 分 画 5,cytosol fraction。これらの 分 画 中 に 含 まれる、ミトコンドリアはPCR 法 によって 定 量 した 結果 、2 > 1, 3 > 4, 5の 順 で 多 く、リソソームはAcidPhosphatase 活 性 を 指 標 に 定 量 した 結 果 、3 > 4 > 1 > 2>5の 順 で 多 かった。 以 上 の 結 果 から、 分 画 2をミトコンドリア 分 画 、3をミトコンドリアとリソソームを含 む 分 画 、4をリソソームの 分 画 として 実 験 に 用 いた。まず 各 分 画 中 のDNase 活 性 をpH6.5とpH5.0の2つの条 件 下 で 検 討 した 結 果 、pH5.0の 条 件 下 では、 各 分 画ともにほとんどDNAの 分 解 活 性 を 示 さなかった。 一

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)57方 、 pH6.5では 全 ての 分 画 で DNAの 分 解 が 認 められ2> 1, 3 > 4 > 5の 順 で 強 かった。この 結 果 から、ミトコンドリアにはEndoGのような 中 性 付 近 でのDNase 活 性があることがわかった。次 に、このミトコンドリア 由 来 のDNase 活 性 の 特徴 を 調 べた 結 果 。EndoGは2 価 イオンを 要 求 性 するので、EDTA、EGTAを 反 応 液 加 えた 結 果 、 濃 度 依 存 的な 阻 害 が 見 られ、25 mMでは 完 全 に 阻 害 した。しかしながら、Mg 2+ 、Ca 2+ 、Mn 2+ でもまた 濃 度 依 存 的 に活 性 を 阻 害 した。これらの 結 果 から、2 価 イオンは 不要 のように 思 われるが、DNaseを 単 離 精 製 するなどして 再 度 検 証 する 必 要 があると 考 えられる。また、EndoGを 含 む 種 々のDNaseを 阻 害 するZn 2+ は、 低 濃 度で 効 果 的 に 活 性 を 阻 害 した。 次 に 至 適 pHをpH5.0 -8.0の 間 で 検 討 したところ、pH 6.0 - 7.0の 間 で 非 常 に活 性 が 強 く、これよりもアルカリ 側 では 活 性 が 弱く、 酸 性 側 ではあまり 活 性 がなかった。最 後 に、クロマチンDNAを 基 質 とし、in vitroでの核 退 化 を 再 現 した、 単 離 した 核 とミトコンドリアを反 応 液 中 でインキュベートすると、クロマチンDNAは 約 150-400 bp 程 度 の 大 きさに 分 解 された。この 大 きさはmono-、di-nucleosomeの 大 きさの 範 囲 に 相 当 する。 以 上 のことから、 中 性 から 弱 酸 性 の 条 件 下 ではミトコンドリア 由 来 のDNaseは 核 DNAの 分 解 に 関 与できる。 退 化 核 を 含 む 自 食 胞 の 酸 性 化 は、ミトコンドリアの 取 り 込 みが 観 察 される 時 期 よりも 後 なので、 核 DNAの 分 解 、 特 にladderの 形 成 時 に 関 与 している 可 能 性 が 示 された。これまでの 研 究 結 果 から 繊 毛 虫 のプログラム 核 死は、アポトーシスの 系 を 使 った、 細 胞 死 とは 異 なる進 化 を 遂 げた 発 生 現 象 であると 考 えられる。[ 文 献 ]Davis MC et al. (1992) Dev. Biol. 154: 419-432.Mpoke S and Wolfe J (1996) Exp. Cell. Res. 225: 357-365.Kobayashi T and Endoh H (2003) Cell Death Differ.10:634-640.ゾウリムシの 小 核 DNAにおける 非 コード 領 域 解 析 の 試 み神 居 志 寿 香 1 , 多 賀 郁 乃 2 , 見 上 一 幸1 ( 1 宮 城 教 育 大 学 EEC , 2 仙 台 白 百 合 学 園 高 等 学 校 )Analysis of non-coding regions in the micronuclear DNA of Paramecium caudatumShizuka KAMII 1 ,Ikuno TAGA 2 and Kazuyuki MIKAMI 1( 1 EEC Miyagi Univ. of Educ., 2 Sendai Shirayuri Gakuen high-school)SUMMARYParamecium caudatum exhibits nuclear dimorphism. Each cell contains a germ micronucleus and a somatic macronucleus.During the conjugation, micronuclei underwent meiosis, followed by reciprocal exchange of gametic nuclei andfertilization. The zygotic nucleus divided three times. Four of the division products differentiated into macronuclei. It isknown that chromosomal rearrangement occurs during the development by the caryonides, that is, the third cell cycleafter conjugation. We analyzed the upstream region of the pap gene to elucidate the structure of micronuclear chromosome.When the micronuclear DNA amplified by inverse-PCR with two primers, which was designed according to themacronuclear sequence of the pap gene, a 6.5-kbp fragment was obtained. This fragment contains two ORFs (0.7-kbpand 0.6-kbp), and non-coding regions (6.5-kbp in total). Consequently ORFs were not clustered close in the 6.5-kbpfragment, through six ORFs were concentrated in the 6.5-kbp downstream of the pap gene. In the non-coding regionsother than ORF like region CAAT boxes, GC boxes and TATA-like sequences were found.

58 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年[ 目 的 ] ゾウリムシ(Paramecium caudatum)は、 細胞 内 に 有 性 生 殖 に 関 わる 小 核 と、 細 胞 の 維 持 や 分 裂の 調 整 に 関 わる 大 核 の 2 核 を 持 っている。この 小 核と 大 核 は、 同 一 細 胞 内 に 存 在 しながら 全 く 異 なる 染色 体 構 造 をしている。 有 性 生 殖 である 接 合 において、 小 核 は 減 数 分 裂 の 後 、 受 精 核 を 形 成 し、その 受精 核 から 次 世 代 の 小 核 と 大 核 が 分 化 する。このとき、 大 核 になる 核 にのみ 染 色 体 の 編 集 が 起 こり、ポリゲノミックな 状 態 となる(Mikami, 1988)。この編 集 過 程 を 経 ることで、 大 核 遺 伝 子 は 活 発 な 転 写 を行 うようになる。この 編 集 は、 我 々が PH 染 色 体 と名 付 けた 染 色 体 のコード 領 域 において、 接 合 過 程 の核 分 化 後 からキャリオナイドクローンまでの 内 に 起こることが 分 かっている。また、 編 集 における DNA部 分 除 去 は、それぞれの 編 集 部 位 で 完 全 に 除 かれるわけではないため、 結 果 として 大 核 DNA の 多 様 性 の原 因 となっている。 現 在 、 多 くの 繊 毛 虫 で 行 われているゲノムプロジェクトは、 大 核 を 中 心 に 行 われ、小 核 に 関 してはあまり 進 んでいない。 本 研 究 では、小 核 の PH 染 色 体 の 一 部 について、 塩 基 配 列 の 決 定を 行 い、 非 コード 領 域 に 注 目 した 小 核 染 色 体 の 解 析を 目 的 とした。[ 方 法 ] 株 は、P. caudatum の Syngen3 に 属 する 野 生型 株 KK0007(E type)を 使 用 した。 小 核 の 単 離 にはフィルターと 遠 心 分 離 を 用 い(Takahashi and Mikami,2002 第 73 回 日 本 動 物 学 会 )、 精 製 した 小 核 DNA を制 限 酵 素 で 処 理 し、pap 遺 伝 子 上 流 域 を inverse-PCRで 増 幅 した。 得 られた 断 片 を pGEM-T easy vector でクローニングし、 塩 基 配 列 の 決 定 を 行 った。シークエンシングには ABI PRISM 310 Genetics Analyzer を使 用 し、 得 られた 塩 基 配 列 の 解 析 には GENETYX-MAC 遺 伝 情 報 処 理 ソフトウェア Ver.10 を 用 いた。[ 結 果 と 考 察 ] 小 核 DNA における PH 染 色 体 未 知 領域 を、pap 遺 伝 子 より 上 流 に 6.5 kbp の 塩 基 配 列 を 決定 することができた。この 塩 基 配 列 を 決 定 した 領 域では、ORF を 2 箇 所 確 認 できたが、 下 流 域 で 見 られたような ORF の 密 集 は 見 られなかった。さらに、GAPDH(Obara, Iwataki and Mikami, 2000)に 関 しても、その 近 傍 に ORF 密 集 域 が 見 られないことを 考 えると、 小 核 DNA における ORF の 密 集 はゾウリムシ染 色 体 において 必 ずしも 一 般 的 な 現 象 とはいえないことが 示 唆 される。今 回 塩 基 配 列 を 決 定 した 6.5 kbp( 図 1)の 非 コード 領 域 について 解 析 を 行 ったところ、プロモ-ター領 域 内 で 見 られる CAAT box や GC box に 似 た 塩 基 配列 を 持 つ 領 域 が 確 認 できた。さらに、 遺 伝 子 の 転 写に 関 わるとされる TATA 配 列 も 存 在 した。これらのことから、pap の ORF 密 集 域 の 上 流 には、それらの遺 伝 子 転 写 に 関 わる 調 整 領 域 が 存 在 していることが示 唆 される。しかし、 小 核 DNA でこのような CAATbox や GC box、TATA 配 列 の 間 に ORF が 確 認 できていないことから、 核 分 化 後 、 大 核 DNA となる 際 に 編集 され、その 領 域 に 遺 伝 子 コード 領 域 が 挿 入 されるのではないかと 考 えられる。[ 文 献 ]1) Mikami. K. (1988) Nuclear Dimorphism and Function.in Paramecium (ed Gortz, H.-D.) pp. 120-130,Springer-Verlag, Berlin2) Obara. S., Iwataki. Y., and Mikami. K. (2000) Identificationof a possible stem-cell-maintenance genehomologue in the unicellular eukaryote Paramecium

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)59caudatum. Proc. Japan Acad., 76, Ser. B3) Austerberry, C. F., Allis, C. D., and Yao, M. C. (1984)Specific DNA rearrangements in synchronously developingnuclei of Tettrahymena. Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 81: 7383-7387.Amoeba proteusの 収 縮 胞 における 水 集 積 機 構 の 解 析西 原 絵 里 , 新 免 輝 男 , 園 部 誠 司 ( 兵 庫 県 立 大 ・ 院 ・ 生 命 理 学 ・ 生 命 )Studies on water accumulation by contractile vacuole in Amoeba proteusEri NISHIHARA, Teruo SHIMMEN, and Seiji SONOBE (Grad. Sch. Life Sci., Univ. Hyogo)SUMMARYIn fresh water, the osmolality of the cytoplasm is higher than that of the extracellular medium, and water alwaysenters the cell along the osmotic gradient across the plasma membrane. The cell volume of protozoa is controlled bycontractile vacuoles (CV). However, the mechanism of collecting water into the CV is poorly understood. The presentstudy is aimed at elucidation of the mechanism of water accumulation by the CV in Amoeba proteus. CVs released fromcells were analyzed in vitro. When CVs were treated with a hypertonic medium, their volume quickly decreased. Thisresult suggests that the CV membrane is semi-permeable and that fluid is collected along the osmotic gradient in vivo.The water permeability of the CV membrane was calculated from the rate of osmotic volume change. The value washigh, suggesting that the CV membrane is equipped with water channels. To observe CV dynamics in vivo, living cellswere vitally stained with FM4-64. It strongly stained the plasma membrane and CV. Just after systole, the membrane ofthe CV was flattened. During diastole, a part of the flattened membrane expanded to a few vesicles and they fused witheach other before reformation of CV.[ 目 的 ] 収 縮 胞 は 淡 水 産 原 生 動 物 に 特 有 の 細 胞 小 器 官で、 細 胞 内 へ 流 入 した 水 を 集 積 し、 周 期 的 に 細 胞 外へ 排 出 することで 細 胞 内 の 浸 透 圧 を 調 節 していると考 えられている。この 収 縮 胞 内 への 水 の 集 積 機 構 を調 べるために、Amoeba proteusから 取 り 出 した 収 縮 胞を 用 いて 解 析 を 行 った。また、エンドサイトーシスのトレーサーであるFM4-64により 細 胞 を 生 体 染 色し、in vivoにおける 収 縮 胞 の 動 態 を 観 察 した。[ 材 料 と 方 法 ] 材 料 にはAmoeba proteusを 用 いた。Tetrahymenaを 餌 として 培 養 した。 実 験 には2 日 以 上飢 餓 状 態 にした 細 胞 を 用 いた。等 張 液 (5 mM EGTA、6 mM MgCl 2 、30 mMPIPES、67 mM KOH、100 mM sorbitol (pH7.0))(1)で20 分 間 処 理 した 細 胞 をスライドガラスとカバーガラスの 間 に 挟 み、 押 しつぶして 収 縮 胞 を 単 離 した(2)。この 収 縮 胞 周 辺 に 高 張 液 (5 mM EGTA、6 mMMgCl 2 、30 mM PIPES、67 mM KOH、500 mM sorbitol(pH7.0))を 灌 流 し、 続 いて、 等 張 液 を 灌 流 した。その 際 の 収 縮 胞 の 体 積 変 化 を 測 定 した。さらに、この結 果 より、 収 縮 胞 膜 の 水 透 過 係 数 を 求 めた。細 胞 内 での 収 縮 胞 の 動 態 を 観 察 するため、FM4-64で 生 体 染 色 を 行 い、 観 察 した(3)。10 μM FM4-64を含 む 培 地 中 で20 分 間 細 胞 を 処 理 し、 共 焦 点 顕 微 鏡 で観 察 した。さらに、 上 記 の 方 法 で 単 離 した 収 縮 胞 を用 いて、in vitroにおける 収 縮 胞 の 再 形 成 の 過 程 を 観察 した。[ 結 果 と 考 察 ] 収 縮 胞 内 への 水 集 積 機 構 を 調 べるために、 単 離 した 収 縮 胞 周 辺 の 外 液 の 浸 透 圧 を 変 化 させ、その 時 の 体 積 変 化 を 調 べた。 高 張 液 を 灌 流 すると、その 体 積 は 急 速 に 減 少 した。 続 いて、 等 張 液 を灌 流 すると、 膨 張 したが、もとの 体 積 には 戻 らず 破裂 した。このことから、 収 縮 胞 膜 が 半 透 性 であることが 考 えられた。Parameciumにおいて 収 縮 胞 内 の 無機 イオン 活 性 が 高 いことが 報 告 されている(4)。これ

60 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年らのことより、 浸 透 圧 差 を 利 用 した 収 縮 胞 内 への 水の 集 積 が 示 唆 される。さらに、 前 述 した 結 果 より、収 縮 胞 膜 の 水 透 過 係 数 を 求 めると、1.06 (μm/sec・OsM)であった。これは 赤 血 球 やカエル 卵 における 細胞 膜 の 水 透 過 係 数 に 近 い 値 であった(5)。これらの 細胞 膜 には 水 チャネルであるアクアポリンが 存 在 することが 知 られており、A. proteusの 収 縮 胞 の 膜 にもアクアポリンが 存 在 する 可 能 性 が 示 唆 される。エンドサイトーシスのトレーサーとして 知 られるFM4-64でAmoeba 細 胞 を 生 体 染 色 した。その 結 果 、 細胞 膜 と 収 縮 胞 に 強 い 蛍 光 が 確 認 できた。これを 利 用し、 細 胞 内 における 収 縮 胞 の 動 態 を 観 察 した。 明 視野 による 観 察 では、 収 縮 直 後 の 収 縮 胞 は 消 失 し、 確認 できない。また、 電 子 顕 微 鏡 を 用 いた 観 察 から、収 縮 胞 収 縮 直 後 の 細 胞 内 では 多 数 のベシクルの 存 在が 観 察 されている(6)。そのため、 収 縮 胞 の 収 縮 直 後では、 収 縮 胞 膜 が 破 れることで 多 数 のベシクルが 形成 され、それらが 融 合 し、 収 縮 胞 が 再 形 成 されると考 えられていた。しかし、FM4-64による 観 察 では、収 縮 胞 が 収 縮 した 直 後 、 膜 が 凝 縮 して1つの 塊 となって 存 在 していた。 続 いて、その 凝 縮 した 膜 から 小 胞が 形 成 された。これらの 小 胞 は 常 に 連 結 しており、顆 粒 質 が 流 動 している 場 合 でも 離 れなかった。また、その 形 態 変 化 は 約 1 分 という 短 時 間 で 起 こった。つまり、1つの 膜 が 形 状 を 変 えて 水 を 集 積 し、 細 胞 外へ 排 出 することがわかった。また、 等 張 液 中 に 単 離した 収 縮 胞 において、 融 合 に 似 た 現 象 が 観 察 された。このことから、 収 縮 胞 が 収 縮 した 直 後 に 出 現 する 小 胞 は、 膜 の 塊 が 何 らかの 要 因 により 区 切 られ、そこへ 水 が 集 積 し、 形 成 された 可 能 性 が 考 えられる。さらに、その 区 切 りがはずれることで、 小 胞 どうしが 融 合 し、 収 縮 胞 が 再 形 成 されることが 考 えられる。[ 文 献 ]1) Shimmen, T. and MacRobbie, E. A. C. (1987) PlantCell Physiol., 28: 1023-10372) Nishihara, E., Shimmen, T., and Sonobe, S. (2004) CellStruct. Funct., 29(4): 85-90.3) Heuser, J., Zhu, Q., and Clarke, M. (1993) J. Cell Biol.,1311-13274) Stock, C., Gronlien, H.K., Allen, R.D., and Naitoh, Y.(2001) J. Cell Sci., 2339-23485) Tazawa, M., and Shimmen, T. (1981) Regulation ofwater and ions. Kumazawa, K. Asakusashoten, TokyoJapan. p.p. 18-77.6) Mackanna, J.A. (1973) Science, 88-90ゾウリムシにおける 過 剰 収 縮 胞 の 形 成岩 本 政 明 ,Allen, Richard D., 内 藤 豊(ハワイ 大 ・パシフィックバイオメディカルリサーチセンター)Generation of extra contractile vacuole complex in ParameciumMasaaki IWAMOTO, Richard D. ALLEN and Yutaka NAITOH (Pacific Biomedical Research Center,University of Hawaii at Manoa)SUMMARYParamecium species normally have two contractile vacuole complexes (CVC) in a single cell. However, the numberof CVC per cell (N CVC ) increased when a hypoosmotic and/or a Ca 2+ -rich external condition. The CVCs of third and afterwere generated more remarkably in starved cells than in growing cells. The generation of extra CVCs was independentof a cell cycle progression, while the replication of CVCs occurs only when just before cell division. In the cytoplasm ofgrowing cells, there are two clear regions that are prohibited to generate extra CVC, and the replications occur in these

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)61two regions at the same time prior to cell division. In the cytoplasm of starved cells, on the other hand, these regionsmight be canceled, and then extra CVCs could spread along the dorsal axis. The N CVC is larger in the bigger individualsand in the bigger species.[ 目 的 ] 収 縮 胞 複 合 体 (contractile vacuole complexes;CVC)は、 原 生 生 物 に 見 られる 膜 系 オルガネラで、細 胞 内 浸 透 圧 調 節 器 官 と 考 え られている。Paramecium 属 の 繊 毛 虫 は、 一 般 に1 細 胞 中 に2 個 のCVCを 持 つが、 大 型 種 のP. multimicronucleatumでは3 個 以 上 の 過 剰 なCVCを 持 つ 細 胞 の 存 在 が 知 られている 1 。このような 細 胞 は、 細 胞 分 裂 時 におけるCVCの 複 製 や 分 配 のエラーによって 出 現 する 単 なるイレギュラーな 存 在 なのか、または、 細 胞 当 たりのCVC数 (N CVC )を 積 極 的 に 変 化 させるしくみがあるのだろうか。これらを 明 らかにするため、N CVC の 増 加 が見 られる 条 件 と、 過 剰 なCVC 形 成 の 規 則 性 について調 べた。[ 材 料 と 方 法 ] Paramecium multimicronucleatum、P.caudatumおよびP. tetraureliaは 無 菌 合 成 培 地 で 培 養 したものを 用 いた。 飢 餓 誘 導 するため、 対 数 増 殖 期 の細 胞 を 緩 衝 溶 液 (2 mmol l -1 KCl, 0.25 mmol l -1 CaCl 2 , 1mmol l -1 MOPS-KOH, pH7.0)で2 回 洗 浄 後 、 同 組 成溶 液 に 再 懸 濁 して 室 温 で12-18 時 間 放 置 した。 緩 衝 溶液 の 浸 透 圧 は、ソルビトールを 添 加 することで4-144mosmol l -1 に 調 節 した。CVC 特 異 的 抗 体 による 免 疫 染色 は、 細 胞 を3.5% (w/v) ホルムアルデヒドで30 分間 固 定 後 、-20°Cのアセトンで20 分 間 抽 出 し、SS-1mAb (anti-smooth spongiomes, IgM)で1 次 抗 体 処 理 した。SS-1はP. multimicronucleatumに 特 異 的 であるため、 他 種 のゾウリムシにはDS-1 mAb (anti-decoratedspongiomes, IgG) を1 次 抗 体 として 使 用 した。それぞれの1 次 抗 体 に 対 するFITC 標 識 2 次 抗 体 で 処 理 し、PBSで 洗 浄 後 、 落 射 式 蛍 光 顕 微 鏡 で 観 察 した。[ 結 果 と 考 察 ] 4 mosmol l -1 の 緩 衝 溶 液 に 順 応 したP.multimicronucleatumの 集 団 中 には、N CVC が1から7の細 胞 が 存 在 した。3 個 以 上 の 過 剰 なCVCを 持 つ 細 胞が 集 団 中 に 占 める 割 合 は、 外 液 の 浸 透 圧 が 低 い、およびCa 2+ 濃 度 が 高 い 場 合 に 有 意 に 増 加 した。また、収 縮 胞 (CV) 当 たりの 平 均 ラ ジ アルアーム 数(N RA )は、 増 殖 細 胞 における9.0±1.5から11.2±2.2へ増 加 した。CVCは 水 と 共 に 細 胞 内 Ca 2+ の 排 出 を 行 っていることが 知 られており 2 、N CVC とN RA が 増 加 することでより 広 い 細 胞 表 層 をカバーでき、 水 とCa 2+ の速 やかな 集 積 、 排 出 が 可 能 になると 考 えられる。通 常 、 細 胞 分 裂 直 前 のCVC 複 製 は、 既 存 の2 個 のCVCの 前 方 に1 個 ずつ2 個 同 時 に 行 われるのに 対し、 過 剰 CVCは 多 くの 場 合 1 個 ずつ 形 成 され、その場 所 は 既 存 CVCの 前 方 に 限 定 していなかった。また、 過 剰 CVCの 形 成 は 細 胞 分 裂 に 依 存 せず、 飢 餓 化やDNA 合 成 阻 害 剤 によって 分 裂 停 止 したG1 細 胞 でも見 られた。これらの 結 果 は、 細 胞 分 列 前 の 娘 CVCの複 製 と 過 剰 CVCの 形 成 が 異 なる 機 構 で 調 節 されていることを 示 唆 している。分 裂 間 期 に 行 われる 過 剰 CVCの 形 成 は 増 殖 細 胞 でも 見 られたが、 分 裂 停 止 した 飢 餓 細 胞 においてより顕 著 であった。 増 殖 細 胞 集 団 における 過 剰 CVC 保 有細 胞 の 割 合 は 約 10%で、その 多 くは3 個 のCVCを持 っていた。 一 方 、 低 浸 透 圧 下 の 飢 餓 細 胞 集 団 では、 過 剰 CVC 保 有 細 胞 は50%を 超 え、3-5 個 のCVCを 持 つものが 多 く 見 られた。 細 胞 内 におけるCVの 位置 は、 増 殖 細 胞 では 細 胞 前 半 ( 細 胞 相 対 長 の35%)と 後 半 (81%)に 分 布 のピークが 存 在 し、 細 胞 前 端(19% 付 近 より 前 方 )と 細 胞 中 央 (62% 付 近 )にCVの 存 在 しない 領 域 のあることが 分 かった。CVが 分 布しないこれらの 領 域 は、 細 胞 分 裂 前 に 複 製 される 娘CVCの 新 CVが 発 生 する 箇 所 と 一 致 した。したがって、 増 殖 細 胞 の 間 期 には、 娘 CVC 複 製 予 定 部 位 に 過剰 CVCの 形 成 を 阻 止 する 機 構 が 存 在 すると 予 想 される。 一 方 、 飢 餓 細 胞 では 増 殖 細 胞 に 見 られたCVの 形成 されない 領 域 に 新 たに 分 布 のピークが 出 現 し、CVは 細 胞 長 軸 に 沿 って 広 く 存 在 した。この 結 果 は、 増殖 細 胞 の 過 剰 CVC 形 成 を 抑 制 する 機 構 が 飢 餓 化 によって 無 効 になったことを 示 している。 飢 餓 細 胞 に形 成 された 過 剰 CVCは、 細 胞 分 裂 によって 娘 細 胞 に分 配 されることなく 細 胞 内 に 蓄 積 する。これらのことがN CVC の 増 加 が 飢 餓 細 胞 においてより 顕 著 であった 原 因 と 考 えられる。次 に、N CVC と 細 胞 長 の 関 係 を 調 べた。 分 裂 停 止 したP. multimicronucleatumではN CVC の 大 きい 細 胞 ほど大 型 であった。この 傾 向 は 種 間 のサイズ 差 においても 見 られ、 過 剰 CVC 保 有 細 胞 の 出 現 率 およびN CVC は最 大 種 のP. multimicronucleatumで 最 も 大 きく、 次 い

62 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年でP. caudutum、P. tetraureliaの 順 であった。この 結 果は、N CVC の 増 加 が 大 型 細 胞 の 広 い 細 胞 表 面 積 をカバーし、Ca 2+ など 細 胞 内 老 廃 物 の 速 やかな 排 出 を 可能 にするという 考 えを 支 持 している。[ 文 献 ]1) Wichterman, R. (1986) The Biology of Paramecium(2nd ed.): 1-592) Stock, C. et al. (2002) J. Cell Sci. 115: 2339-2348.Phytophthoraにおけるマスティゴネマタンパク 質 の 免 疫 細 胞 化 学 的 解 析1, 2,有 川 幹 彦 3 , エイドリアン・ハーダム 2 , 春 本 晃 江 1 3, 洲 崎 敏 伸( 1 奈 良 女 子 大 ・ 院 ・ 共 生 自 然 科 学 , 2 オーストラリア 国 立 大 ・ 生 物 科 学 研 究 所 ・ 植 物 細 胞 生 物学 グループ, 3 神 戸 大 ・ 理 ・ 生 物 )Immunocytochemical analysis of the mastigonemal protein in zoosporicplant pathogen PhytophthoraMikihiko ARIKAWA 1, 2, 3 , Adrienne HARDHAM 2 , Terue HARUMOTO 1 , Toshinobu SUZAKI 3( 1 Dept. Biol. Sci. Environ., Nara Women’s Univ., 2 Plant Cell Biol. Group, Res. Sch. Biol. Sci., AustralianNatl. Univ., 3 Dept. Biol., Fac. Sci., Kobe Univ.)SUMMARYThe stramenopiles are one of the main groups of eukaryotes and characterized as having hair-like appendages calledmastigonemes on the surface of their flagella. It has long been thought that the mastigonemes play an important role incell motility, especially in flagellar function. There is, however, currently almost no information on the proteins thatform the mastigonemes. Phytophthora and other Oomycetes which belong to the stramenopiles are known as notoriousplant pathogens which cause the worldwide devastation of plant diseases. For most species of Phytophthora, the motilebiflagellate zoospore is the main infective agent, which is responsible for rapid dissemination and initiation of infectionof potential host plants. In this study, as a first attempt to elucidate the function of mastigonemes in zoospore motility atthe molecular level, we have tried to produce monoclonal antibodies by immunization of isolated and purified flagella ofPhytophthora. Consequently, we successfully obtained antibodies against various kinds of zoosporic surface components.Immunofluorescent and immunoelectron microscopy using the mastigoneme-specific antibody showed that theantigenic protein scattered throughout the mastigonemes, not on the plasma membrane or inside the flagellum. Furthermore,the antigen was also found to be localized in a certain granular organelle in the cytoplasm.[ 目 的 ] ストラメ ノパイ ル 生 物 群 に 属 するPhytophthoraは、 幅 広 い 種 類 の 植 物 に 寄 生 して 壊 滅 的な 病 気 を 引 き 起 こすことで 知 られている 1) 。Phytophthoraの 感 染 手 段 は 遊 走 子 である。 遊 走 子 は2本 の 鞭 毛 を 持 っているため 長 い 距 離 を 泳 ぐことが 可能 であり、この 遊 走 子 の 運 動 性 こそがPhytophthoraの宿 主 間 の 素 早 い 拡 散 を 可 能 にしている。Phytophthoraやその 他 のOomycetesなどの 植 物 病 原 菌 の 遊 走 子 は、管 状 マスティゴネマと 呼 ばれる 小 毛 を 鞭 毛 表 面 に持 っており、 鞭 毛 の 機 能 と 遊 走 子 の 運 動 性 において重 要 な 働 きをしていると 考 えられている。しかしながら、 遊 走 子 の 運 動 性 が 病 気 感 染 の 確 立 と 拡 散 に 特に 重 要 であるにも 関 わらず、マスティゴネマの 構 成タンパク 質 やその 合 成 ・ 輸 送 の 機 構 、 細 胞 運 動 における 役 割 等 はほとんど 明 らかにされていない。そこで 本 研 究 では、 遊 走 子 の 鞭 毛 機 能 、 特 に 細 胞 の 推 進力 発 生 におけるマスティゴネマの 働 きを 分 子 レベルで 明 らかにすることを 目 的 とし、その 基 礎 研 究 とし

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)63て、マスティゴネマに 対 するモノクローナル 抗 体 の作 製 を 行 った。[ 方 法 ] 遊 走 子 嚢 を 形 成 したPhytophthora nicotianaeを 冷 たい 蒸 留 水 で 処 理 することにより、 遊 走 子 の 形成 ・ 放 出 を 誘 導 した。LiCl 存 在 下 で 遠 心 操 作 によって 集 めた 遊 走 子 に 微 小 管 安 定 化 溶 液 を 加 えて 懸 濁し、voltexによる 機 械 的 刺 激 で 遊 走 子 のシスト 化 を 誘導 して 鞭 毛 の 自 切 を 促 した。 軽 い 遠 心 によって 細 胞体 およびシストを 除 去 した 後 、 強 い 遠 心 によって 単離 鞭 毛 を 得 た。これらをマウスに 複 数 回 免 疫 し、 血清 の 抗 体 価 の 確 認 を 経 て、 脾 臓 細 胞 とミエローマ 細胞 の 融 合 を 行 った。ハイブリドーマを 増 殖 させて 得られた 培 養 上 清 を 使 用 抗 体 とし、 必 要 に 応 じて 硫 安沈 殿 により 濃 縮 した。[ 結 果 と 考 察 ] 本 研 究 では、Phytophthoraの 遊 走 子 をシスト 化 させることなく 集 め、これらの 遊 走 子 から鞭 毛 を 単 離 することにより、 高 密 度 で、 且 つ 他 の 細胞 小 器 官 をほとんど 含 まない 純 粋 な 単 離 鞭 毛 分 画 を得 た。 遊 走 子 そのものを 免 疫 する 場 合 よりも 高 確 率でマスティゴネマ 抗 体 を 得 ることを 狙 いとして、この 精 製 した 鞭 毛 を 抗 原 として 免 疫 を 行 った。その 結果 、 細 胞 膜 構 成 タンパク 質 や 収 縮 胞 構 成 タンパク質 、 鞭 毛 軸 糸 構 成 タンパク 質 に 対 する 抗 体 に 加 えて、マスティゴネマに 特 異 的 に 結 合 する 抗 体 を 複 数種 得 ることに 成 功 した。これらの 抗 マスティゴネマ抗 体 のうち 最 も 結 合 性 の 高 い 抗 体 を 用 いて、 細 胞 生化 学 的 および 細 胞 免 疫 学 的 解 析 を 行 った。ウェスタンブロット 解 析 の 結 果 、このマスティゴネマ 抗 体 は単 一 のタンパク 質 と 結 合 し、その 分 子 量 は 約 50 kDaであった。 蛍 光 抗 体 法 を 用 いて 抗 原 の 局 在 性 を 調 べた 結 果 、グルタルアルデヒドとホルムアルデヒドを含 む 固 定 液 で 固 定 した 細 胞 においては、 遊 走 子 が 持つ2 本 の 鞭 毛 のうち、 前 鞭 毛 の 表 面 に 存 在 するマスティゴネマにのみ 抗 体 が 結 合 し、ホルムアルデヒド単 独 で 固 定 した 細 胞 においては、 細 胞 質 内 に 斑 点 状の 蛍 光 が 数 多 く 観 察 され、 抗 原 タンパク 質 は 細 胞 質内 にも 存 在 することが 分 かった。 遊 走 子 嚢 を 抗 体 染色 した 場 合 も 同 様 に、 細 胞 質 内 に 斑 点 状 の 蛍 光 が 観察 されたことから、この 時 期 には 既 にマスティゴネマタンパク 質 が 合 成 されていることが 明 らかになった。 抗 原 タンパク 質 の 局 在 性 をより 詳 細 に 調 べるため、ネガティブ 染 色 法 と 免 疫 電 顕 法 を 組 み 合 わせた手 法 を 用 いて 観 察 を 行 った。その 結 果 、 二 次 抗 体(protein A)に 結 合 した 金 粒 子 は 前 鞭 毛 表 面 に 存 在するマスティゴネマ 上 に 認 められ、 抗 原 タンパク 質はマスティゴネマの 基 部 から 先 端 部 にかけて 一 様 に散 在 していることが 分 かった。 同 様 の 結 果 は、 免 疫電 顕 法 の 包 埋 前 染 色 法 によっても 得 られた。さらに、 包 埋 後 染 色 法 による 観 察 の 結 果 、 抗 原 は 細 胞 膜上 や 鞭 毛 内 部 には 存 在 せず、 細 胞 質 中 のある 顆 粒 状構 造 の 内 部 に 局 在 していた。この 観 察 結 果 は、ホルムアルデヒド 単 独 で 固 定 した 細 胞 における 蛍 光 抗 体法 による 観 察 結 果 と 一 致 した。これらの 観 察 結 果 によって、 今 回 得 られた 抗 体 は 分 子 量 約 50 kDaのマスティゴネマ 構 成 タンパク 質 に 特 異 的 に 結 合 する 抗 体であり、 今 後 、マスティゴネマの 構 造 と 機 能 を 分 子レベルで 追 及 するうえで 非 常 に 有 用 であることが 示された。[ 文 献 ]1) Erwin, D. C. and Ribeiro, O. K. (1996) Phytophthoradiseases worldwide. APS Press, St. Paul, Minn.

64 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年テトラヒメナ 繊 毛 運 動 のエネルギー 供 給 機 構 の 解 明1.ATP 再 生 産 系 における 軸 糸 アデニル 酸 キナーゼの 局 在増 山 悦 子 1 , 中 村 健 一 1 2, 石 田 秀 樹( 1 県 立 広 島 女 子 大 ・ 生 活 ・ 健 康 科 学 , 2 島 根 大 ・ 生 資 ・ 生 物 科 学 )Elucidation of the energy-supplying mechanism for ciliary motility in TetrahymenaI. Localization of axonemal adenylate kinase in the ATP-regenerating systemEtsuko MASUYAMA 1 , Ken-ichi NAKAMURA 1 and Hideki ISHIDA 2( 1 Dept. of Health Sci., Hiroshima Pref. Women’s Univ., 2 Dept. Biol. Sci., Fac. Life and EnvironmentalSci., Shimane Univ.)SUMMARYThe function of adenylate kinase, which has been detected in Tetrahymena pyriformis cilia, is to potentiate the utilizationof ATP for motility. This study has shown, by low ionic strength dialysis (1 mM Tris and 0.1 mM EDTA buffer,pH 8.0), that adenylate kinases associated with ciliary axonemes differ in solubility. Adenylate kinases were solubilizedtogether with other axonemal components such as outer- and inner-arm dyneins, radial spokes and the two central-pairmicrotubules, and were further separated into 16 S and 4 S fractions by sucrose density gradient centrifugation. By native-gelelectrophoresis, followed by SDS-PAGE analysis, the active band of the 16 S fraction was found to consist of sixpolypeptides and that of the 4 S fraction of a few bands above 21 kDa. Insoluble axoneme components also possessedadenylate kinase activity. Furthermore, affinity-purified polyclonal antibody against adenylate kinase from chicken muscle(MW 21) was cross-reacted with the 21-kDa band from the insoluble axonemal proteins on immunoblots. Immunoelectronmicroscopy of the insoluble axoneme component suggested that immunogold-labelled adenylate kinase islocated at the inner side of the outer doublet microtubules. These data suggest that the three types of adenylate kinasesare located beside the axonemal proteins that require ATP.[ 目 的 ] 真 核 細 胞 の 繊 毛 や 鞭 毛 の 運 動 はATPを 加 水 分解 して 得 たエネルギーを 機 械 的 な 滑 りに 変 換 することにより 引 き 起 こされる。ATPは 繊 毛 や 鞭 毛 の 根 元に 位 置 するミトコンドリアで 産 生 されるが、ミトコンドリアよりかけ 離 れた 長 い 軸 糸 に 沿 って 存 在 するダイニン 腕 にATP 濃 度 を 常 に 供 給 するためには、 分解 産 物 の ADPをATPに 転 換 する 酵 素 であるアデニル酸 キナーゼ(AK)などを 利 用 した 供 給 システムがダイニン 腕 近 傍 に 必 須 であると 考 えられる。 筋 肉 アデニル 酸 キナーゼが 可 溶 化 した 三 量 体 で 存 在 することとは 異 なり、Tetrahymena 繊 毛 アデニル 酸 キナーゼは軸 糸 に 強 く 結 合 した 状 態 で 複 合 体 として 存 在 することを 報 告 した 1) 。その 局 在 について 不 明 であったが、2004 年 Chlamydomonas 変 異 株 を 用 いた 研 究 により、アデニル 酸 キナーゼは 外 腕 ダイニンと、 軸 糸 上に 結 合 しているOda5pタンパク 質 と 会 合 している 2)こと、 中 心 小 管 鞘 を 構 成 するタンパク 質 Cpc1(Mr;205 kDa)はアデニル 酸 キナーゼをコードしていること 3) などが 報 告 され、 ATP 供 給 の 必 要 な 場 所 に、それぞれに 適 した 複 雑 な 構 造 を 形 作 っていることが 推察 される。本 研 究 では、Tetrahymena 繊 毛 軸 糸 に 結 合 しているアデニル 酸 キナーゼの 特 徴 や 軸 糸 上 の 局 在 を 明 らかにする 目 的 で、ショ 糖 密 度 勾 配 遠 心 による 分 離 精 製や 筋 肉 アデニル 酸 キナーゼの 抗 体 を 用 いた 免 疫 電 子顕 微 鏡 による 解 析 を 試 みることにした。[ 方 法 ] Tetrahymena pyriformis strain GLを 大 量 培 養 して 集 め、10 mM dibucaineで 繊 毛 を 単 離 した。 繊 毛 を0.25% NP-40を 含 むHEPES 緩 衝 液 ( HMEDK 溶 液 、pH7.4 )で 除 膜 して 得 た 軸 糸 を0.6 M NaCl 緩 衝 液 で30 分 間抽 出 し、さらにその 沈 殿 を 低 イオン 強 度 のTE 緩 衝 液(1mM Tris/HCl, 0.1mM EDTA, 0.1mM PMSF, pH8.0)に 対 して 一 晩 透 析 した。その 上 清 を5-25%ショ糖 密 度 勾 配 遠 心 (45,000rpm,16hr)し 分 取 した。 透 析

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)65後 の 軸 糸 は 電 子 顕 微 鏡 試 料 に 供 した。 電 子 顕 微 鏡 試料 作 成 は、 抗 原 性 をできるだけ 保 持 するため1%パラホルムアルデヒドを 含 むTE 緩 衝 液 で 軸 糸 を 固定 、 包 埋 した。 超 薄 切 片 を 作 成 後 、ブロッキング、一 次 抗 体 ( 精 製 AK 抗 体 ) 反 応 、 金 コロイド 二 次 抗 体の 順 で 反 応 させ、 電 子 染 色 を 行 った。 筋 肉 AKに 対 する 抗 体 はウサギに 免 疫 感 作 して 作 成 し、アフィニティー 精 製 した。 Native-gel 電 気 泳 動 、SDS-PAGE、イムノブロットは 通 常 の 方 法 で 行 った。[ 結 果 および 考 察 ] Tetrahymena 繊 毛 のAK 活 性 の95%は 軸 糸 に 存 在 し、0.6M NaClを 含 むHMEDK 緩 衝液 での 抽 出 操 作 で 外 腕 ダイニン 等 の 除 去 された 軸 糸は、 高 いAK 活 性 を 保 持 されたままであることから、AKは 外 腕 ダイニンと 強 く 結 合 していないと 考 えられる。さらに 低 イオン 強 度 のTE 緩 衝 液 で 一 晩 透 析した 上 清 、 沈 殿 共 にAK 活 性 を 保 持 していた。 透 析した 後 の 軸 糸 ( 沈 殿 )を 電 子 顕 微 鏡 で 観 察 すると、外 腕 、 内 腕 、スポーク、 中 心 小 管 、 中 心 小 管 鞘 などの 構 造 体 タンパク 質 が 溶 出 されて、9 対 の 周 辺 微 小 管が 残 っているのが 観 察 された。さらに、 上 清 を5-20%のショ 糖 密 度 勾 配 遠 心 分 離 法 で 分 画 すると、4Sと16SにAK 活 性 が 検 出 され、Native-gel 電 気 泳 動でともに1 本 の 活 性 バンドを 検 出 した。さらにNativegel電 気 泳 動 を 一 次 元 目 にし、 二 次 元 目 に12.5%ゲル濃 度 のSDS-PAGEを 行 ったところ、16S 由 来 の AKバンドからは、6 本 以 上 のペプチドバンドが 検 出 された。4S 由 来 のAKバンドは、21kDaを 含 んだペプチドから 構 成 されていた。16S 由 来 AKバンドは、複 雑 な 高 分 子 構 成 ポリペプチド 鎖 からなることから、Chlamydomonas 鞭 毛 軸 糸 の 中 心 小 管 鞘 を 構 成 する6 本 のペプチド 鎖 のうち205kDa のcpc1(AK 活 性 は未 測 定 ) 3) に 類 似 していると 考 えられる。 Tetrahymena繊 毛 においても、 複 雑 な 構 成 ポリペプチドを 有する16S AKは 中 心 小 管 鞘 である 可 能 性 がもたれる。9 対 の 周 辺 小 管 のどの 部 位 にAKを 持 つタンパク 質が 局 在 しているのかを 検 討 するために、ニワトリ 筋肉 由 来 のAKのポリクロナル 抗 体 を 作 成 し、アフィニティー 精 製 の 後 、 周 辺 小 管 のみの 軸 糸 に 反 応 させた。SDS‐PAGE、ウェスタンブロットによる 解 析 により、 筋 肉 由 来 のAKバンド(21 kDa)を 認 識 する21kDaのバンドが 透 析 後 の 軸 糸 にあることが 確 かめられた。 免 疫 電 子 顕 微 鏡 による 観 察 では、 周 辺 小 管 の主 に 内 腕 付 近 にAK 抗 体 に 結 合 させた 金 コロイドの 粒子 がいくつか 反 応 している 像 が 得 られた。 軸 糸 に 強固 に 結 合 しているAKは 内 腕 ダイニンATPaseへのATP供 給 に 働 いているとも 推 察 される。 現 在 、モータータンパク 質 ダイニンへのATP 供 給 経 路 を 明 らかにするため16S、4Sを 構 成 する AKや 周 辺 小 管 結 合 AKの精 製 を 試 みている。[ 文 献 ]1) Nakamura, K. et.al. (1999) Comp. Biochem. Physiol.124, 195-1992) Wirschell M. et.al. (2004) Mol. Biol. Cell, 15, 2729-27413) Zhang H. and Mitchell D. R. (2004) J. Cell Sci. 117,4179-4188テトラヒメナの 大 核 における 分 裂 特 異 的 球 状 クロマチン遠 藤 政 城 , 菅 井 俊 郎 ( 茨 城 大 ・ 理 ・ 自 然 機 能 )A macronuclear division specific globular chromatin in TetrahymenaMasaki ENDO and Toshiro SUGAI (Dept. Mate. Biol. Sci., Fac. Sci., Ibaraki Univ.)SUMMARYIn Tetrahymena cell, there are two kinds of nuclei, the macronucleus (MAC) and the micronucleus (MIC). MACdivides amitotically and MIC divides mitotically. In the interphase MAC, there are diffused chromatin and numerous

66 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年condensed heterochromatin called chromatin body while loosely condensed chromatin aggregate of various size appearsin the dividing MAC. We observed large globular chromatin of similar size in the dividing MAC in living cell and studiedconditions for inducing clear globular chromatin; culturing cells in a medium containing EDTA and inducing celldivision in Tris buffer containing benomyl, a microtubular drug, were effective. The globular chromatin appeared at MICdivision and disappeared just after moving of the MIC from cell surface to the MAC in separated daughter cell. We comparedT. thermophila and T. pyriformis and found the MAC of the former had clear globular chromatin. At first cell divisionof exconjugant when no MAC division occur, globular chromatin appeared in the MACs, indicating appearance ofthe globular chromatin is related to cell division, not to MAC division itself. It seemed that the globular chromatin is theunit of DNA distribution during division as it's numer seemed to be halved before and after division.[ 目 的 ] T.thermophilaの 細 胞 は、 大 核 と 小 核 という2種 類 の 核 を 持 つ。 細 胞 分 裂 の 際 、 小 核 は 有 糸 分 裂 を行 い 大 核 は 無 糸 分 裂 を 行 う。 大 核 内 には、ほどけたクロマチンと 無 数 のchromatin bodyと 呼 ばれるヘテロクロマチ ンが 存 在 する。 分 裂 中 の 大 核 内 にはchromatin bodyより 大 きなクロマチンの 塊 が 出 現 することが 知 られている。このクロマチンの 塊 の 大 きさは 均 一 では 無 く、 数 種 類 ある1)。 大 核 の 染 色 体(DNA 分 子 )は45×(200~300) 本 ある。しかしchromatin body やこの 塊 との 関 係 は 不 明 である。我 々は 生 細 胞 で、 分 裂 中 の 大 核 内 に 均 一 な 大 きさの 球 状 のクロマチンを 観 察 した。 現 在 では 否 定 されているが、 大 核 内 にはsubnucleiが 存 在 するという 仮説 があり、ここで 推 定 されたsubnucleiの 数 と 今 回 観察 された 球 状 クロマチンの 数 に 大 差 はない。 球 状 クロマチンの 数 が 大 核 染 色 体 数 よりも 少 ないことから、 球 状 クロマチンは 多 数 の 大 核 染 色 体 を 含 むはずであり、 分 裂 の 際 の 分 配 単 位 である 可 能 性 が 考 えられる。 今 まで 染 色 体 よりも 高 次 の 分 配 単 位 は 知 られていない。そこで 球 状 クロマチンを 明 確 に 観 察 できる 条 件 を 検 討 し、 出 現 時 期 等 について 調 べた。[ 材 料 と 方 法 ] Tetrahymena thermophila B 株 およびT. pyriformis W. を 使 用 した。T 培 地 で 培 養 した 対 数 増殖 期 の 細 胞 をTris+Benomylに 移 し、 後 者 はそのまま、 前 者 では 接 合 型 の 異 なる 細 胞 を 混 合 して 分 裂 を誘 導 した。また 接 合 では、 細 胞 を 軽 い 飢 餓 状 態 にしてから 異 なる 交 配 型 の 細 胞 を 混 合 し 接 合 を 誘 導 した。 観 察 には 主 に 位 相 差 を 用 い、DNAは 1) Hoechst33342で 染 色 し 蛍 光 顕 微 鏡 で 観 察 した。[ 結 果 と 考 察 ] (1) 明 確 な 球 状 クロマチンの 出 現条 件 の 検 討 : 種 々の 条 件 を 検 討 した 結 果 、 培 地 の 種類 、EDTAやbenomyl の 添 加 などが 有 効 であった。T培 地 で 培 養 後 、0.1% EDTA と benomy を ふ く む10mMTris 中 で 分 裂 させるた 場 合 が 最 適 であった。Seyfertは 細 胞 を 固 定 し 広 げてクロマチンの 大 きさを測 定 し、 様 々なサイズがあると 報 告 しているが 2) 、これは 球 状 クロマチンを 破 壊 した 可 能 性 がある。(2)T.pyriformisとT.thermophilaの 比 較 。T.pyriformisではクロマチンが 塊 状 となるだけで 球 状 クロマチンは 出 現 しない。T.thermophilaでは 明 確 な 球 状 クロマチンが 出 現 したので、 実 験 にはT.thermophilaを 使 った。(3) 球 状 クロマチンの 出 現 と 消 失 時 期 :スピンドル 状 の 小 核 が 大 核 から 離 れるときに 球 状 クロマチンが 徐 々に 現 れ、 小 核 が 分 裂 後 期 (anaphase B)の 時 に明 確 になる。また 消 失 するのは、 細 胞 分 裂 完 了 後 細胞 表 層 に 付 着 していた 小 核 が 大 核 に 戻 る 時 期 より 少し 後 である。(4) 接 合 完 了 体 の 新 大 核 分 配 時 に 出 現 する 球 状 クロマチン。 細 胞 分 裂 はするが 大 核 分 裂 をしないときでも 球 状 クロマチンは 出 現 した。この 場 合 、 球 状 クロマチンの 数 は 少 なくほぼ 一 定 であった。 球 状 クロマチンは 核 分 裂 で 誘 導 されるのではなく、 細 胞 分 裂と 関 連 している 可 能 性 がある。(5) 固 定 細 胞 での 観 察 方 法 の 検 討 、 核 当 たりの 球状 クロマチンの 数 とDNAの 測 定 のために、 球 状 クロマチンの 構 造 を 壊 さず、かつ 数 えられる 程 度 に 広 げる 為 に、 低 調 処 理 や 細 胞 の 広 げ 方 、spermidine, Mg な3)どの 効 果 を 検 討 中 である。大 核 分 裂 前 後 で 球 状 クロマチンの 数 は 半 減 しているように 見 える。また 各 々の 球 状 クロマチンが 分 裂することはなく、 単 に 娘 大 核 へと 分 配 されている。DNAの 分 配 単 位 は 染 色 体 であり、 染 色 体 よりも 高 次の 分 配 単 位 は 知 られていない。 球 状 クロマチンはDNA 分 配 の 単 位 なのかもしれない。またその 分 配 の機 構 には 微 小 管 と 相 互 作 用 する 4) 転 写 伸 長 因 子 138k蛋 白 が 関 与 しているのかもしれない。

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)67[ 文 献 ]1) Mpoke, S. S. and Wolfe, J. (1997) J. Histochem. Cytochem., 45:675-6832) Seyfert, H. M. (1979) J. Protozool., 26.:66-743) Sone, T. et al. (2002) Arch. Histol. Cytol., 65:445-4554) Fujiu, K.and Numata, O. (2004) BBRC, 315:196-203ゾウリムシにおける 接 合 後 の 生 殖 核 の 決 定 と 退 化 について高 法 子 , 見 上 一 幸 ( 宮 城 教 育 大 学 ・ EEC)Determination and degeneration of a germinal micronucleusin exconjugants of Paramecium caudatumNoriko TAKA and Kazuyuki MIKAMI (EEC, Miyagi University of Education)SUMMARYIn Paramecium caudatum each cell has a germinal micronucleus. Artificially produced bi-micronucleate cells didnot reduce to a uni-micronucleate state, at least for some fissions. However, there are four presumptive micronuclei in anexconjugant and only one of them divides at the first post-conjugational fission. There must be an exconjugant-specificreduction mechanism for the nuclear division. It is generally accepted that four of the eight postzygotic micronucleiderived from a synkaryon appear as micronuclei, and then three of them degenerate by the first post-conjugational fission.However, we obtained contradictory evidence by immunofluorescence using an anti-α-tubulin antibody and DAPIstaining. Most of the four micronuclei remained even after the first post-conjugational fission, regardless of nutritionalcondition or stock difference. Artificial removal of the dividing micronucleus at anaphase of the first post-conjugationalfission showed that the remaining micronuclei had the ability to divide at the following fissions, because each cell of theresulting clones had a micronucleus. In some clones, however, the micronuclei sometimes seemed to be degenerativebecause the clones produced some amicronucleate cells and were composed of both micronucleate and amicronucleatecells. To determine at what time the micronucleus is committed to divide, a micronucleus was transplanted from a vegetativeG1 cell into an exconjugant. It was shown that the selective decision for nuclear division occurs between about 10h and 24 h after the critical stage of macro- and micronuclear differentiation.[ 目 的 ] ゾウリムシ(Paramecium caudatum)は、 同一 細 胞 内 に 栄 養 核 ( 大 核 )の 他 に 1 つの 生 殖 核 ( 小核 )を 持 つ。 小 核 は、 有 性 生 殖 ( 接 合 ) 時 には 大 核の 支 配 の 下 に 新 大 核 と 新 小 核 を 形 成 する。 生 殖 核 の決 定 が 起 こり、1 小 核 が 分 裂 している 接 合 後 第 1 回 目の 細 胞 分 裂 時 には、 従 来 の 考 えでは、すでに 他 の 3小 核 は 退 化 ・ 消 失 してしまっていると 考 えられてきた(Maupas,1889; Klitzke,1914)。し か し、 抗 α-tubulin 抗 体 を 用 いた 染 色 により 従 来 の 考 え 方 を 覆し、 退 化 すべき 3 核 は 第 1 回 細 胞 分 裂 以 後 も 細 胞 内に 残 っていることが 明 らかになった(Kurokawa et al.,1998, 日 本 動 物 学 会 )。それでは、これら 4 小 核 の中 から 生 殖 核 として 残 るための 核 の 決 定 と 退 化 は、どのように 起 こっているのだろうか。 栄 養 期 の 細 胞を 顕 微 手 術 により 2 小 核 体 にしたとき、 少 なくとも数 分 裂 の 間 、2 小 核 はともに 分 裂 し 2 小 核 状 態 が 維 持されることが 分 かっている(Araki and Mikami, 未 発表 )。 本 研 究 では、 顕 微 手 術 と 形 態 観 察 により、 生殖 核 の 決 定 と 退 化 について 解 析 を 行 った。[ 方 法 ] 株 は、P. caudatum の Syngen3 の 16B001sⅡB5(O) と KC1A01(E) を 使 用 した。 接 合 完 了 細 胞 に 残 る

68 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年小 核 の 観 察 には、DAPI 染 色 (1 µg/ml)と 抗 α-tubulin抗 体 による 間 接 蛍 光 抗 体 法 を 用 いた(Ishida et al.,1999)。さらに、 顕 微 技 術 により、 小 核 の 除 去 と 移植 を 行 った。[ 結 果 ] 抗 α-tubulin 抗 体 による 間 接 蛍 光 抗 体 法 で 調 べる 限 り、 分 裂 しない 残 りの 小 核 は 接 合 後 第 2 分 裂 時まで 残 っていることが 分 かった。その 後 の 小 核 の 退化 消 失 は、しばらく 飢 餓 状 態 においた 細 胞 よりも 富栄 養 条 件 下 の 方 が、やや 早 くなる 傾 向 が 認 められた。また、 接 合 後 の 第 1 回 細 胞 分 裂 時 に、 分 裂 中 の1 小 核 を 除 去 すると、 飢 餓 状 態 においた 細 胞 では 他の 小 核 は 退 化 せずに 残 り、 子 孫 は 有 小 核 クローンとなることが 明 らかになった。ただし、そのクローンは 増 殖 が 途 中 で 止 まるものも 多 く、 一 旦 退 化 の 方 向に 向 かった 核 には、その 何 らかの 影 響 が 残 っている可 能 性 が 示 唆 された。つぎに、 接 合 完 了 細 胞 ( 核 分 化 決 定 期 後 約 10 時間 )に 移 植 された 栄 養 期 (G1)の 小 核 は、 小 核 として 細 胞 内 に 残 りにくいことが 分 かった。また、 核 分化 決 定 期 から 24 時 間 後 に 核 移 植 を 行 った 場 合 、 移 植小 核 は 残 っており、 細 胞 を caryonide clones に 分 けると、 移 植 された 小 核 をもつ 細 胞 と、もとあった 小 核をもつ 細 胞 が 共 に 残 っていた。このことから、 生 殖核 として 残 る 1 小 核 の 決 定 は 接 合 後 24 時 間 ではすでに 起 こっていたということが 示 唆 される。[ 考 察 ] 接 合 完 了 細 胞 内 の 4 つの 新 しい 小 核 は、 等 価であると 考 えられている(Mikami, 1982)。しかしその 後 の 接 合 後 第 1 回 目 の 細 胞 分 裂 時 には、この 4小 核 の 中 から 1 核 が 分 裂 し 小 核 として 生 き 残 る。 栄養 期 の 細 胞 には、このように 厳 密 な 1 小 核 選 択 機 構はない。 一 方 で、 接 合 完 了 細 胞 で 分 裂 しない 残 りの3 小 核 はいずれ 退 化 する。このように、 接 合 完 了 細胞 には 小 核 に 対 する 決 定 と 退 化 という 独 立 した 2 つの 機 構 が 存 在 すると 考 えられる。それらの 機 構 は、細 胞 内 でいつ、どのように 起 こっているのだろうか。 接 合 完 了 細 胞 に 栄 養 期 の 小 核 を 移 植 すると、 移植 された 核 は 接 合 完 了 細 胞 にある 4 小 核 と 同 様 に、選 択 を 受 けていることが 分 かった。さらに、 核 分 化決 定 期 から 24 時 間 後 に 核 移 植 を 行 った 細 胞 を 培 養 すると、もとあった 小 核 と 移 植 した 小 核 をもつ 細 胞 が含 まれていた。これは、 生 殖 核 として 残 る 1 小 核 の決 定 が、 栄 養 期 の 核 を 移 植 した 時 期 ( 核 分 化 決 定 期後 24 時 間 )より 前 に、すでに 起 こっていた 結 果 であると 考 えている。[ 文 献 ]Ishida, M., Nakajima, Y., Kurokawa, K. and Mikami, K.1999 Zool. Sci., 16: 915-926.Klitzke, M. 1914 Arch. Protistenk., 33: 1-20.Maupas, E. 1889 Archs. Zool. Exp. Gen., (2) 7: 149-517.Mikami, K. 1982 J. Cell Sci., 56: 453-460.ゾウリムシの 栄 養 期 における 小 核 の 役 割 について武 田 さと 子 , 見 上 一 幸 ( 宮 城 教 育 大 学 ・EEC)Function of the micronucleus at vegetative phase of Paramecium caudatumSatoko TAKEDA and Kazuyuki MIKAMI (EEC, Miyagi Univ. of Edu.)SUMMARYIn Paramecium caudatum, removal of the micronucleus causes some abnormal symptoms: structural changes of oralapparatus, decline in food vacuole formation and increase of inter-fission time, so it appears likely that the micronucleushas a specific function in stomatogenesis. To investigate whether the micronucleus is involved in forming the new oralapparatus at cell division, the length of cell cycle was compared between “proter” and “opisthe” after elimination of themicronucleus. At cell division, the new oral apparatus is formed at the opisthe and the existent one stays with the proter.Delay in the occurrence of fission appeared about three cell cycles after micronucleus removal. But the length of the two

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)69to three cell cycles after micronucleus removal was no different between proters and opisthes. This means that the micronucleuswas not directly involved in stomatogenesis. In the next experiment, the cells were starved after micronucleusremoval so that the time of fission was postponed. The starvation treatment delayed the fissions of both micronucleateand amicronucleate cells, but the delay was more conspicuous in amicronucleates and appeared one to two cellcycles after micronucleus removal. Appearance of the amicronucleate-specific abnormality depends not on the times ofcell division but on the elapsed time after micronucleus removal.[ 目 的 と 背 景 ] これまでの 研 究 では、ゾウリムシの 小核 を 除 去 すると 口 部 形 態 の 異 常 、 食 胞 形 成 能 の 低下 、 分 裂 速 度 の 低 下 といった 異 常 が 現 れることが 明らかになっている。また、 別 な 細 胞 から 小 核 を 移 植することによって、 異 常 から 回 復 することもわかっている(Mikami, 1979; Fujishima and Watanabe,1981)。これらのことより、 小 核 は 口 部 形 成 に 対 して 何 らかの 機 能 をはたしているとされてきた。本 研 究 は、もし 小 核 が 口 部 形 態 形 成 に 直 接 的 に 関わっているとすれば、その 異 常 は 分 裂 時 の 新 しい 口部 の 形 成 過 程 で 現 れると 仮 定 し、 実 験 を 行 なった。小 核 は 栄 養 期 の 細 胞 分 裂 時 の 口 部 形 成 やその 形 成 回数 と 関 わりがあるのか。また、 小 核 除 去 手 術 後 に 現れる 口 部 の 形 態 異 常 の 進 行 は 分 裂 回 数 に 依 存 するか、それとも 絶 対 時 間 に 依 存 するのか。これらを 検証 する 目 的 で 本 研 究 を 行 なった。[ 材 料 と 方 法 ] 株 は16BK2 08(cnrB /cnrB,tnd 2 /tnd 2 )を 使 用 した。 培 養 は25℃の 恒 温 室 で、 新 鮮 なレタスジュースとバクテリア(Klebsiella pneumoniae)による 二 員 培 養 (Hiwatashi,1967)を 行 なった。はじめに、 通 常 の 栄 養 条 件 で 無 小 核 細 胞 の 分 裂 速度 を 測 定 した。 顕 微 鏡 下 手 術 によって 小 核 を 除 去 した 細 胞 と、 何 も 手 術 をしていない 細 胞 を 用 意 し、エサを 入 れたデプレッションスライドで 単 離 して 培 養した。 一 定 時 間 ごとに 継 続 観 察 し、 分 裂 の 度 に 細 胞を 単 離 することによって 手 術 後 から2 回 分 の 分 裂 速度 の 測 定 を 行 なった。次 に、 飢 餓 処 理 により 分 裂 を 抑 制 した 細 胞 の 分 裂速 度 を 測 定 した。 与 えるエサの 量 を 二 日 間 制 限 してできるだけ 分 裂 を 抑 制 した 細 胞 を 用 意 し、 有 小 核 細胞 と 無 小 核 細 胞 とで 処 理 後 に 通 常 の 培 養 条 件 に 戻 してから 分 裂 速 度 の 比 較 を 行 なった。 飢 餓 処 理 は、 一日 に 一 回 、15 分 だけエサの 入 った 培 養 液 に 移 し、 残りの 時 間 はDryl 氏 液 に 移 すことにより 行 なった。[ 結 果 と 考 察 ] ゾウリムシでは 細 胞 分 裂 に 際 し、 新 しい 口 部 の 原 基 は 既 存 の 口 部 装 置 の 下 方 にできる。そのため、 細 胞 前 方 の 娘 細 胞 (proter)は 既 存 の 口 部 を維 持 し、 後 方 の 娘 細 胞 (opisthe)は 新 しく 形 成 された 口 部 装 置 を 持 つことになる。もし、 小 核 が 細 胞 分裂 時 の 新 しい 口 部 の 形 成 に 直 接 的 に 関 わっているならば、 無 小 核 細 胞 では 形 成 の 際 に 何 らかの 異 常 が 生じると 仮 定 でき、それはopistheに 現 れることになる。また、その 口 部 形 態 の 異 常 は 結 果 として 分 裂 速度 の 低 下 として 示 されると 考 えられる。つまり、 手術 後 に 単 離 した 無 小 核 細 胞 のうち、もともとの 口 部を 維 持 していく 細 胞 に 比 べて、 手 術 後 に 新 口 部 形 成を1 回 もしくは2 回 行 なった 細 胞 で 分 裂 速 度 がより低 下 すると 仮 定 し、 手 術 後 の2 回 の 細 胞 分 裂 に 関 して 細 胞 周 期 の 測 定 を 行 なった。この 際 、 有 小 核 細 胞には 何 も 手 術 を 施 さず、コントロールとした。実 験 の 結 果 、 口 部 形 成 回 数 を 重 ねた 細 胞 ほど 分 裂速 度 が 遅 くなるという 傾 向 は 見 られなかった。それとは 逆 に 古 い 口 部 を 維 持 してきた 細 胞 の 分 裂 速 度 のほうがより 遅 くなっていたものもあった。これらのことから 新 しい 口 部 の 形 成 と 分 裂 速 度 の 低 下 とは 直接 的 な 関 連 がないといえる。すなわち、 分 裂 速 度 の低 下 の 進 行 は 既 存 の 口 部 を 持 つものにも 等 しく 現 れることが 実 証 できた。 結 局 、 小 核 は 新 旧 に 関 係 なく、 口 部 装 置 の 維 持 に 関 係 していると 考 えられる。小 核 除 去 後 、 細 胞 に 変 化 が 現 れるのは 通 常 2~3分 裂 後 である。つまり 異 常 が 現 れるまでに 時 間 がかかり、 一 定 の 遅 延 期 間 がある。そこで、この 異 常 が現 れるまでの 時 間 は 分 裂 回 数 に 依 存 するのか、それとも 絶 対 時 間 に 依 存 するのかを 検 証 するために、 有小 核 細 胞 と 無 小 核 細 胞 を 一 定 時 間 飢 餓 状 態 において分 裂 を 抑 制 してから、 通 常 の 栄 養 培 養 液 に 移 し 分 裂速 度 を 測 定 した。 有 小 核 細 胞 の 分 裂 率 は 通 常 の 回 数までにすぐ 回 復 したが、 無 小 核 細 胞 では 分 裂 しない細 胞 や、 分 裂 速 度 が 低 下 した 細 胞 があった。この 分裂 速 度 の 低 下 は 除 去 手 術 後 の 第 一 回 細 胞 分 裂 後 、すなわち 第 二 細 胞 周 期 に 現 れた。 通 常 、 飢 餓 に 置 かない 場 合 では、 二 分 裂 後 、すなわち 第 三 細 胞 周 期 に 現れることを 考 えると、 細 胞 分 裂 に 依 存 していないことが 分 かった。 言 い 換 えると、 分 裂 速 度 の 低 下 の 進

70 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年行 は 分 裂 の 回 数 ではなく、 手 術 後 の 絶 対 時 間 に 依 存することが 示 された。以 上 の 実 験 から、 小 核 は 細 胞 分 裂 時 の 口 部 新 形 成には 直 接 は 関 わっていないといえる。そして、 小 核除 去 後 、 貧 栄 養 条 件 下 に 置 くことによって 分 裂 を 遅らせた 場 合 も、 一 定 時 間 後 には 無 小 核 細 胞 では 有 小核 細 胞 と 比 べるとより 早 い 時 期 に 分 裂 の 遅 れが 現 れたことから、 分 裂 速 度 の 低 下 の 進 行 は 分 裂 回 数 ( 口部 形 成 の 回 数 )に 依 存 するのではなく、 除 去 手 術 後の 絶 対 時 間 に 依 存 するのではないかと 考 えられる。[ 文 献 ]Fujishima, M. and Watanabe, T. (1981) Exp. Cell Res.132, 47-56.Hiwatashi, K. (1967) Genetics 58: 373-386Mikami, K. (1979) Exp. Zool. 208, 121-128.Wichterman, R. (1986) The Biology of Paramecium.,Second Edition, Plenum Press原 生 生 物 繊 毛 虫 類 の 分 類 体 系 — 近 年 における 分 類 体 系 の 変 遷 と 現 状 —三 好 孝 和 1 , 島 野 智 之 1 , 高 橋 忠 夫2 ( 1 東 北 農 研 , 2 西 九 州 大 ・ 生 物 )Classification systems of phylum Ciliophora– Review of changing systems in recent years –Norikazu MIYOSHI 1 , Satoshi SHIMANO 1 , Tadao TAKAHASHI 2( 1 Natl. Agr. Res. Cent. Tohoku Reg., 2 Biol. Lab., Nishikyushu Univ.)SUMMARYThe ciliated protozoa are widely distributed in nature. To classify these ciliates, various classification systems havebeen proposed so far. Of these, three main systems were compared between each other in this work. 1) A classificationsystem based on the oral morphological criteria was systematically constructed by Corliss (1979). In present time, thissystem is often used for identification of ciliates. However, this concept becomes to be hardly adopted in classification.2) The system based on the ultrastructural morphology on the somatic kinetids was established by Small and Lynn (1981,1985). This system, however, contained some questionable taxa, because the classification criteria more biased towardthe characters of somatic kinetids. The system, thereafter, has been modified by some additional ultrastructural and molecularinformation. As a result, in this system the phylum Ciliophora consisted of two subphyla; Postciliodesmatophoraand Intramacronucleata. 3) Lynn (2003) established a new classification system based on the molecular information,especially SSrRNA gene sequences. This system includes two “riboclasses”, which is a new concept taxon based on themolecular information. However, this system includes severe problems, that is, it is a chimeric system without reasonableexplanations. From these analyses, we concluded that Lynn and Small’s system (2000), which seems to be more accomplishedsystem than others, should be adopted for a practical use at the present time.[ 目 的 ] 繊 毛 虫 類 は、 地 球 上 の 至 る 所 に 広 く 分 布 し、現 在 までに 約 8,000 種 が 記 載 されているが 8) 、その 種数 は 潜 在 的 な 現 存 種 の2 割 に 満 たないと 推 測 されている 2) 。 一 方 、 繊 毛 虫 類 の 高 次 分 類 体 系 は 現 在 までに様 々なものが 提 唱 されているが、それらのうち、 主要 な3つの 体 系 について、それぞれの 概 念 と 欠 点 について 比 較 検 証 し、 現 時 点 ではどの 体 系 に 従 うのがもっとも 妥 当 なのかを 検 討 した。[ 結 果 と 考 察 ] 1) 口 部 構 造 (oral structure)を 基 準 形質 とした 分 類 体 系 : 繊 毛 虫 類 の 口 部 構 造 の 共 通 的 な形 質 に 着 目 した 高 次 分 類 体 系 は1887 年 にBütschliによって 創 設 された。その 後 、 新 たな 形 態 形 質 情 報 の蓄 積 により、1 門 3 綱 7 目 から 構 成 される 体 系 が 提 唱 さ

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)71れた 1) 。 現 時 点 においても、このシステムは 繊 毛 虫を 同 定 する 際 によく 用 いられているが、 体 系 学 的 価値 としては、その 役 割 をすでに 終 えたと 考 えて 良 いだろう。2) 繊 毛 基 部 構 造 (somatic kinetid structure)を 基 準 形質 とした 分 類 体 系 : 繊 毛 虫 の 繊 毛 基 部 の 微 細 構 造が 明 確 になったことにより「 口 部 構 造 は 淘 汰 圧 による変 異 が 大 きく、 共 通 的 な 分 類 形 質 の 指 標 としては 信 頼性 に 欠 けるので、 繊 毛 基 部 構 造 を 基 準 形 質 とすべきである 10) 」という 考 えが 台 頭 し、それによって3 亜 門(Postciliodesmatophora 亜 門 ,Rhabdophora 亜 門 ,Cyrtophora 亜 門 )からなる 新 しい 体 系 が 提 唱 された 5,11 )。しかし、この 体 系 では 繊 毛 基 部 構 造 という 新 しい分 類 形 質 を 重 視 しすぎたために、 口 部 構 造 や 大 核 の 類似 性 が 軽 視 され、その 結 果 、それらに 類 似 性 を 持 つものが 別 の 分 類 群 に 属 する 一 方 、 外 見 上 全 く 違 ったものが 同 一 分 類 群 に 属 してしまうという 矛 盾 が 生 じ、この体 系 の 整 合 性 について 再 検 討 が 行 われた。その 結 果 、Postciliodesmatophora 亜 門 はSpirotrichea 綱 の 一 部 を 除けば、 形 態 分 類 と 分 子 分 類 がほぼ 一 致 する 単 系 統 的 な分 類 群 であることが 明 らかにされた 3, 4) 。一 方 、その 他 の 繊 毛 虫 類 は 分 裂 中 の 大 核 内 に 微 小管 が 生 じるという 共 通 する 特 徴 をもつことが 発 見 され、それらはIntramacronucreata 亜 門 としてまとめられた。すなわちここに、2 亜 門 から 構 成 される 新 しい体 系 が 構 築 された 6, 9) 。3) 分 子 生 物 学 的 情 報 を 基 準 形 質 とした 分 類 体 系 :上 記 の 分 類 体 系 において、Intramacronucreata 亜 門 内に 置 かれている 所 属 不 明 の4つの 目 やPlagiopylea 綱 に属 する 繊 毛 虫 は、 繊 毛 基 部 構 造 に 関 して、 他 の 分 類群 との 明 確 な 共 通 点 がないが、 嫌 気 的 環 境 下 に 生 息しているという 生 態 学 的 な 共 通 点 やSSrRNA 遺 伝 子 に共 通 点 を 持 つことから、Lynn(2003)は 繊 毛 基 部 構造 の 形 態 学 的 な 特 徴 に 関 する 違 いを 無 視 し、Riboclassという 新 しい 概 念 の 綱 を 創 設 し、 体 系 も1 門2 亜 門 11 綱 への 再 編 が 提 案 された 7) 。しかし、それら11 綱 のうち6 綱 に 関 しては 形 態 分 類 と 分 子 分 類 が 強 く支 持 しているものの、3 綱 は 形 態 分 類 のみで、2 綱 は分 子 分 類 のみでしか 支 持 されていなかった。以 上 のことから、Lynn(2003)の 報 告 は、 体 系 学的 な 視 点 から 見 れば、 尊 重 すべきであるものの、 分子 分 類 と 形 質 分 類 の 双 方 を 適 切 な 理 由 が 不 明 であるままに 結 合 させているため、 今 後 、 体 系 が 大 きく 変化 する 危 険 性 が 高 い。したがって、 現 時 点 での 実 用的 な 分 類 には、 完 成 度 の 高 いLynn and Small(2000)に 基 づくのが 良 いと 考 えられる。 今 後 は 情 報 の 蓄 積を 見 守 った 上 で、Riboclass 等 の 分 子 分 類 体 系 を 分 類の 実 用 面 に 生 かしていくのが 良 いのではないかと 思われる。[ 文 献 ]1) Corliss, J. O. (1979) The Ciliated Protozoa (2nd ed.),Pergamon, New York.2) Foissner, W. (1997) 10th International Congress ofProtozoology (ICOP-X), pp. 86.3) Hattenlauchmidt, B., et al. (1996) J. Euk. Microbiol.,43: 225-230.4) Hirt, R. P. et al. (1995) Mol. Phylogen. Evol., 4: 77-87.5) Lynn, D. H. (1981) Biol. Rev., 56: 243-292.6) Lynn, D. H. (1996) J. Euk. Microbiol. 43: 253-260.7) Lynn, D. H. (2003) Europ. J. Protistol., 39: 356-364.8) Lynn, D. H. and Corliss, J. O. (1991) Ciliophora., In:Microscopic anatomy of invertebrates. Vol. 1. Protozoa.,Wiley-Liss, New York, pp. 333-467.9) Lynn, D. H. and Small, E. B. (2000) Ciliophora., In: AnIllustrated Guide to the Protozoa (2nd ed.), Society ofProtozoologists, Lawrence, Kansas, pp. 371-656.10) Small, E. B. and Lynn, D. H. (1981) Biosystems, 14:387-401.11) Small, E. B. and Lynn, D. H. (1985) Ciliophora., In:An Illustrated Guide to the Protozoa, Society of Protozoologists,Lawrence, Kansas, pp. 393-575.

72 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年オパリナ 類 の 分 子 系 統 解 析 II:オパリナはクロムアルベオラータ 大 分 類 群 の早 期 に 出 現 した 祖 先 的 生 物 かもしれない西 あかね( 金 沢 大 ・ 院 自 然 ・ 生 命 科 学 )Opalinids as an ancestral chromalveolate inferred from alpha-, beta-tubulin genesand 18S rDNA sequenceAkane NISHI (Div. of Life Sci., Grad. Sch. of Natural Sci. and Technol.,Kanazawa Univ.)SUMMARYOpalinids are enigmatic endosymbionts principally found in the large intestine of anuran amphibians. They are multinucleateand uniformly covered with numerous flagella (or cilia). Their appearance is somewhat similar to that of ciliates,so that opalinids were initially classified in ciliates. However, based on their monomorphic nuclei, absence of aciliate-like life cycle characterized by conjugation, and an interkinetal fission mode, opalinids were subsequently transferredinto the zooflagellates. Currently, opalinids are favored to be placed in the Class Opalinea, within the heterokontof the Kingdom Chromista, based on the ultrastructural characteristics of the flagellar base called transitional helixshared with the proteromonads. However, the question of their classification has not been fully resolved, because of thepossession of a double-stranded ciliary necklace shared with ciliates, and lack of molecular information. Here, we showtheir phylogenetic position inferred from 18S rDNA and alpha-, beta-tubulin gene sequences. The 18S rDNA analysisgave the opalinids an ancestral position in heterokonts, together with the proteromonad flagellates, as suggested by theprevious morphological studies. In contrast, alpha-, beta-tubulin gene analyses suggest an affiliation of opalinids to alveolates,not to heterokonts. Taking account of a few characters dispersed in the large taxon “Chromalveolata”, the presentresults may reflect an early branching of opalinids from ancestral chromalveolates.[ 目 的 ] オパリナ 類 は、 主 に 無 尾 両 生 類 の 直 腸 に 寄 生する 多 核 性 の 原 生 動 物 であり、 核 の 個 数 と 細 胞 の 横断 面 の 形 状 によって1 科 4 属 に 分 類 される。オパリナ 類 の 体 表 は、 一 様 に 多 数 の 繊 毛 で 覆 われており、外 見 上 は 繊 毛 虫 のように 見 えることから、 発 見 当 初は 細 胞 口 を 持 たない 原 始 的 な 繊 毛 虫 として 分 類 されていた。しかしオパリナ 類 は、 一 般 的 な 繊 毛 虫 のように 核 が 分 化 しておらず、 有 性 生 殖 過 程 においても接 合 ではなく 異 形 配 偶 子 の 融 合 を 行 うなどといった理 由 から、その 後 動 物 性 鞭 毛 虫 の 一 種 として 分 類 されたり、 独 立 した1つの 門 として 扱 われるなどし、その 系 統 的 位 置 については 発 見 以 来 様 々な 議 論 がなされてきた (Corliss, J. O. 1955)。 現 在 ではオパリナ 類は、 鞭 毛 基 部 のtransitional helixと 呼 ばれる 超 微 細 構造 等 によって、クロミスタ 界 のヘテロコントにプロテロモナス 類 と 最 も 近 縁 な 種 である1つの 綱 として分 類 するのが 主 流 な 見 解 となっている (Cavalier-Smith, T. 1993)。しかし、オパリナ 類 はヘテロコントの 共 有 形 質 であるマスチゴネマを 持 たず、 鞭 毛 基 部の 構 造 においても、 繊 毛 ネックレスと 呼 ばれる 構 造が 繊 毛 虫 と 共 通 していることから (C. F. Bardele1981)、その 分 子 系 統 的 位 置 が 確 定 したとは 言 えない。オパリナ 類 はヘテロコントとアルベオラータ 両方 の 特 徴 を 持 っており、 形 態 的 特 徴 からのみではその 系 統 的 位 置 の 判 断 が 難 しいため、 分 子 系 統 的 研 究が 急 務 である。[ 材 料 と 方 法 ] オパリナ 類 はカエルの 直 腸 内 という 環境 にいるため、その 分 子 系 統 を 調 べようとした 際 、DNAを 抽 出 するときの 他 の 生 物 のコンタミが 一 番 の問 題 となってくる。そこで、 他 の 生 物 のコンタミがないようにマイクロピペットで 単 離 ・ 洗 浄 したオパリナ 類 の 細 胞 10 個 体 より 抽 出 したDNAを 用 いてPCRを 行 い、18S rDNAとalpha-tubulin、beta-tubulinについて 分 子 系 統 樹 を 作 成 した。[ 結 果 と 考 察 ] 解 析 の 結 果 、18S rDNAでは、オパリナ 類 はヘテロコントのクレードにおいてプロテロモ

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)73ナスと 最 も 近 い 位 置 に 分 岐 し、 形 態 的 特 徴 による 現在 の 分 類 と 一 致 した 結 果 になった。ただし、この 系統 樹 においてプロトオパリナとプロテロモナスの 枝が 他 の 生 物 より 長 くなっており、long-branch attractionによって引 き 寄 せられた 可 能 性 も 考 えられる。また、プロトオパリナ、プロテロモナスを 含 むクレードがヘテロコントのクレードの 中 で 最 も 祖 先 的 な 位置 で 分 岐 していた。 一 方 、alpha-tubulin、beta-tubulinの 解 析 においては、 両 方 の 系 統 樹 で、オパリナ 類 は現 在 分 類 されているヘテロコントではなくアルベオラータ 内 に 分 岐 した。アルベオラータ 内 での 分 岐は、alpha-tubulin では 繊 毛 虫 のクレード に、betatubulinでは繊 毛 虫 かアピコンプレクサのクレードに分 岐 した。しかし、alpha-tubulinの 系 統 樹 ではヘテロコントの 配 列 があまりに 少 なく、beta-tubulinの 系 統樹 では 繊 毛 虫 が 単 系 統 にならないため、これらの 系統 樹 におけるアルベオラータ 内 でのオパリナ 類 の 分岐 は、はっきりとはわからなかった。今 回 の 解 析 の 結 果 、18S rDNAではオパリナ 類 がヘテロコントであり、プロテロモナスと 近 縁 であるという 現 在 の 分 類 が 支 持 される 結 果 が 得 られた 一 方 、alpha-tubulin、beta-tubulinの 解 析 においては、オパリナ 類 がアルベオラータである 可 能 性 が 示 唆 された。18S rDNAの 系 統 樹 において、オパリナ 類 とプロテロモナスがヘテロコントの 祖 先 的 な 位 置 に 分 岐 したことと、rDNAとtubulin 遺 伝 子 解 析 による 系 統 的 位 置 の違 いに 加 え、オパリナ 類 がヘテロコント、アルベオラータ 両 方 の 特 徴 を 持 つことをあわせて 考 慮 すると、オパリナ 類 はクロムアルベオラータ 大 分 類 群 の中 で 早 期 に 分 岐 し、 寄 生 による 特 殊 化 が 著 しく 進 んだ 生 物 であるのかもしれない。[ 文 献 ]Bardele, C. F. (1981) Functional and phylogenetic aspectsof the ciliary membrane: a comparative freeze-fracturestudy. BioSystems 14:403-421Cavalier-Smith, T. (1993) Kingdom protozoa and its 18phyla. Microbiol. Rev., 57: 953-994 Corliss, J. O.(1955) The opalinid infusorians: Flagellates or ciliates?J. Protozool., 2: 107-114異 なる 環 境 下 に 生 息 する 土 壌 有 殻 アメーバ(II)— 有 殻 アメーバの 畑 土 壌 からの 分 離 法 の 検 討 とバイオマスの 推 定 —島 野 智 之 1 , 三 好 孝 和 1 , 橋 本 知 義 2 3, 高 橋 忠 夫 ( 1 東 北 農 研 , 2 九 州 沖 縄 農 研 , 3 西 九 州 大 ・ 生 物 )Comparison of soil testate amoeba communities under the various environments (II).– Improvement of treatment condition to estimate soil testate amoeba fauna –Satoshi SHIMANO 1 , Norikazu MIYOSHI 1 , Tomoyoshi HASHIMOTO 2 , Tadao TAKAHASHI 3( 1 Natl. Agr. Res. Cent. Tohoku Reg., 2 Natl. Agr. Res. Cent. Kyushu Okinawa Reg.,3 Biol. Lab., Nishikyusyu Univ.)SUMMARYThis study was aimed to improve direct or viable counting methods to evaluate testate amoebae communities inupland soils with slurry application (the 0, 60, 150 or 300 t/ha). The direct counting method: Soil samples were dispersedby stirring to isolate testate amoebae. Then samples on membrane filters were stained by the EQPS method andexamined with a microscope or a confocal laser scanning microscope. The viable counting method: Three gram of soilsamples were inoculated on 1.5% agar plates poured by water, MNAS (Modified Neff’s Amoeba Saline) 6) or KCMt 5)with or without Enterobacter aerogenes. Viable counts of testate amoebae were determined after 50 days incubation at20°C. Although the active forms of testate amoebae were not detected in the 0 and 60 t/ha plots by the direct countingmethod, they existed 43 and 69 active cells/g wet soil in the 150 and 300 t/ha plots, respectively. The shapes of stainedcells were enough clear to identify testate amoebae communities. Viable counts increased with slurry application levels.

74 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年The identified species number and viable counts with KCMt media were significantly higher than those with other media.These results suggest that these counting methods would be valuable tools to examine dynamics of testate amoebaein soil.[ 目 的 ] 土 壌 環 境 中 には、 数 多 くの 原 生 動 物 が 生 息 している。その 中 でも、 土 壌 有 殻 アメーバは、 土 壌 繊毛 虫 とともに、 生 物 学 的 指 標 として 最 も 有 効 な 分 類群 であることが 示 唆 されている 4) 。 本 研 究 では、 土 壌有 殻 アメーバ 相 の 比 較 検 討 手 法 を 開 発 するために、単 純 な 土 壌 環 境 として 畑 土 壌 を 材 料 として 計 数 法 の検 討 を 行 った。[ 材 料 と 方 法 ] 九 州 沖 縄 農 業 研 究 センター 内 に 設 置 された 家 畜 スラリー 長 期 連 用 畑 圃 場 (1985 年 開 始 :スラリー 投 入 量 0 t, 60 t, 150 t, 300 t/haの4 試 験 区 )、 表層 クロボク 層 、0~20 cmから 採 取 した 土 壌 を 撹 拌し、5 mmメッシュを 通 過 させ 土 壌 試 料 とした。直 接 計 数 法7), 著 者土 壌 より 最 も 抽 出 効 率 が 高 かったスターラー 法ら、 未 発 表 ) 1),を 用 いて 分 離 抽 出 3) を 行 い、セルロース・メンブレン・フィ ルター 上 に 回 収 した 後 、EQPS(Edaphic Quantitative Protargol Stain) 法 に 従 い 染 色を 行 った 2) 。その 後 、 電 子 顕 微 鏡 用 包 埋 剤 Spurrにて透 徹 化 を 行 い、プレパラートを 作 成 し、 光 学 顕 微 鏡下 で 計 数 した。II. 培 養 法(1) 各 試 験 区 の 土 壌 試 料 3gを1.5% 素 寒 天 (9cmシャーレ)の 上 に 静 置 し、 蒸 留 水 5mlを 加 え、 湿 度 をほぼ100%に 保 ったタッパウエアに 入 れ、20±1℃で 平 面 培養 した。50 日 間 培 養 したシャーレ 内 の 土 壌 懸 濁 液 を十 分 に 攪 拌 した 後 、100µl を5 回 、ランダムに 試 料 を採 取 し、 蒸 着 スライ ド(( 株 ) 東 新 理 興 )を 用 いて、 合 計 500µlを 全 て 検 鏡 後 、100µlあたりの 平 均 個体 数 を 算 出 した。(2) 好 気 ・ 嫌 気 環 境 条 件 の 検 討 : 50ml ファルコ ンチューブ 内 に 各 試 験 区 の 土 壌 試 料 5gと 蒸 留 水 10mlを加 え、 好 気 環 境 は 同 チューブの 蓋 に 穴 を 開 け、 通 気性 のあるメンブレンでシールした。 嫌 気 環 境 は 同チューブ 内 を 窒 素 ガスに 置 換 した。これらはタッパウエアにて、20±1℃で 培 養 し、 培 養 50 日 後 、 同 様 に計 数 ・ 同 定 を 行 った。(3)300t 区 の 土 壌 試 料 を(1)と 同 様 の 方 法 で、バクテリア(Ea: Enterobacter aerogenes) 添 加 区 : 素 寒 天 、MNAS(Modified Neff’s Amoeba Saline) 6) 培 地 、およびバクテリア 未 添 加 区 : 素 寒 天 、MNAS、 活 性炭 、KCMt 5) の 計 6 種 類 の 平 面 培 地 上 に 接 種 し、50 日間 培 養 後 、 同 様 に 計 数 ・ 同 定 を 行 った。[ 結 果 および 考 察 ]I. 直 接 計 数 法スラリー 投 入 量 の 異 なる 試 験 区 のうち、150t 区(43 個 体 : 細 胞 質 を 含 む 生 細 胞 /1g 湿 土 )と300t 区(69 個 体 )でしか、 有 殻 アメーバの 出 現 頻 度 が 低 いため、 計 数 出 来 なかった。また、メンブレンフィルターに 回 収 、EQPS 法 を 用 いることにより、 有 殻 アメーバの 殻 の 構 造 が 染 色 され、 光 学 顕 微 鏡 やレーザー 共 焦 点 顕 微 鏡 ( 励 起 光 :633nm/HeNe)での 明 瞭な 観 察 像 が 得 られた。この 方 法 で 同 時 にメンブレン上 に 採 取 される 繊 毛 虫 も、 本 来 のEQPS 法 の 目 的 通り、 染 色 ・ 同 定 が 可 能 になることから、この2つの 原生 動 物 分 類 群 による 生 物 学 的 指 標 、および 生 態 学 研究 に 有 用 であることが 明 らかとなった。培 養 法(1) 培 養 法 による 計 数 では、スラリー 投 入 量 と 有 殻 アメーバの 種 数 、および 個 体 数 は 平 行 して 有 意 に 増 加した。 直 接 検 鏡 法 では 計 数 できなかった 出 現 頻 度 でも、 培 養 による 個 体 数 の 増 加 のためバイオマス 測 定が 可 能 であった。(2) 成 長 率 はチューブでの 培 養 よりも 平 面 培 地 で 有 意に 高 くなった。これはアメーバの 高 酸 素 要 求 性 によるものだと 考 察 される 5) 。また、 好 気 、 嫌 気 環 境 区間 の 比 較 では、 好 気 環 境 区 の 種 数 および 個 体 数 は 若干 多 いものの、 双 方 に 有 意 な 差 は 見 られなかった。(3) 種 数 および 個 体 数 はKCMt 培 地 が 他 の5 処 理 区 に 比べ、 有 意 に 高 い 値 を 示 した( 図 )。本 研 究 では 単 純 系 としての 有 機 管 理 畑 圃 場 を 用 いたが。 今 後 は、 多 様 な 環 境 の 土 壌 調 査 への 応 用 および 計 数 条 件 の 検 討 が 必 要 であり、 総 合 的 な 手 法 としての 確 立 が 重 要 である。[ 文 献 ]1) Aoki, S. (2003) J. Microbiol. Methods., 55: 791-795.2) Acosta-Mercado, D. and Lynn, D. H (2003) J. Microbiol.Methods., 53: 365-375.3) Coûteaux, M-M. (1967) Rev. Ecol. Biol. Sol., 4: 593-596.

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)754) Foissner, W. (1999) Agric. Ecosyst. Environ., 74: 95-112.5) 石 井 圭 一 (1999) アメーバ 図 鑑 , 堀 上 英 紀 ・ 木 原 章編 , 金 原 出 版 , 東 京 , 253pp.6) Page, F. C (1989) A new key to freshwater and soilGymnamoebae, with instructions for culture. CCAPand FBA, Cumbria, Ambleside, 122pp.7) 島 野 智 之 ・ 盛 下 勇 (2004) 原 生 動 物 学 雑 誌 , 37: 68-69.家 畜 スラリーを 投 与 した 畑 における 繊 毛 虫 の 種 組 成 と 個 体 数 についてⅡ. 年 次 間 差 と 季 節 間 差河 知 圭 介 1 , 久 富 裕 子 1 , 橋 本 知 義 2 , 島 野 智 之 3 , 三 好 孝 和 3 1, 高 橋 忠 夫( 1 西 九 州 大 ・ 生 物 、 2 九 州 沖 縄 農 業 研 究 センター、 3 東 北 農 業 研 究 センター)Species Composition of Soil Ciliates and their Population Size in the Upland Soilswith Slurry Application. II. Seasonal and Yearly Change.Keisuke KAWACHI 1 , Yuko HISATOMI 1 , Tomoyoshi HASHIMOTO 2 , Satoshi SHIMANO 3 , NorikazuMIYOSHI 3 and Tadao TAKAHASHI 1( 1 Bio. Lab. Nishikyushu Univ., 2 NARC Kyushu-Okinawa Reg., 3 NARC Tohoku Reg.)SUMMARYWe have already reported that the biomass of soil ciliates can be estimated by using the modified MPN method(MPN-SIPSE: Most Probable Number with Species Identification and their Population Size Estimation) (Takahashi etal., 2003). In this work, we attempted to examine the ciliate fauna and their biomass relative to seasonal and yearlychanges by using the MPN-SIPSE method. From analyzing the soil samples, which were collected from the upland field

76 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年with slurry application of NARC Kyushu-Okinawa Reg. Miyakonojo Branch in August 2003 and 2004, it was found thatthe population size of soil ciliates significantly increased with increase of the applied slurry volume in both soil samples.Further, the water content of soil samples also indicated significant positive correlation with the applied slurry volume.In May and August in 2004, the population size of soil ciliates and their biomass in soil obtained from a 60t/ha slurryappliedfield were greater than those of other soils collected from 0, 150, and 300t/ha slurry-applied fields. These resultsindicate that the MPN-SIPSE method might be more suitable than the MPN method to estimate the population size ofsoil ciliates and their biomass.[ 目 的 ] 土 壌 繊 毛 虫 による 環 境 評 価 基 準 は 今 日 まで 確立 していない。そこで、そのような 基 準 の 作 成 を 目的 として 土 壌 微 生 物 のバイオマス 推 定 によく 利 用 されているMPN 法 を 改 良 した 改 良 MPN 法 (MPN-SIPE法 )によって、 土 壌 繊 毛 虫 相 とそのバイオマスについて 調 べている 6) 。 我 々は2003 年 8 月 に 都 城 市 九 州 沖縄 農 業 研 究 センターにある 家 畜 スラリーが 長 期 間 連用 されている 畑 の 土 壌 繊 毛 虫 相 とそれらの 個 体 数 についてMPN-SIPSE 法 を 用 いて 調 査 したが、 今 回 は2004 年 の5 月 と8 月 に 同 じ 畑 から 得 られた 土 壌 サンプルについて 同 じ 方 法 で 調 べることによって、それらの 年 次 間 差 と 季 節 間 差 を 検 討 した。[ 材 料 と 方 法 ] 土 壌 サンプルを 採 取 した 畑 における 家畜 スラリー 投 与 量 は 年 間 1ha 当 り60t、150t、300tの3区 画 であった。 採 取 した 土 壌 は5mmのふるいにかけて 室 温 (23℃)で 保 存 した。 土 壌 試 料 1gを50mlディスポ 遠 心 管 に 移 し、これらにバクテリアを 含 むレタス 浸 出 液 9mlを 加 えたものを10 倍 希 釈 液 とし、 土 壌 分散 装 置 を 用 いて 分 散 処 理 行 った。その 後 、10 倍 希 釈系 列 で10 5 倍 希 釈 液 まで 作 製 した。それらの 土 壌 懸 濁液 を3 穴 凹 スライドの 各 ウェルに6 反 復 で0.7mlずつ 分注 して23±1℃に 保 った。その 後 、 毎 日 2 週 間 、 繊 毛 虫の 出 現 を 記 録 するとともに 出 現 した 繊 毛 虫 は 全 て1 個体 ずつ1%メチルセルロースに 移 して 運 動 を 抑 制 し、光 学 顕 微 鏡 に 取 り 付 けた3CCDカメラにてパソコンにそれらの 動 画 を 取 り 込 み、 外 部 形 態 、 遊 泳 方 法 などの 特 徴 に 基 づいて 種 の 同 定 を 行 った。 土 壌 繊 毛 虫の 個 体 数 は 繊 毛 虫 が 発 見 されたウェル 数 に 基 づくデータセットから 統 計 的 手 法 で 推 定 した。バイオマスは 個 々の 繊 毛 虫 の 体 長 、 体 幅 を 測 定 し、その 平 均値 を 乗 じたものをその 種 の1 個 体 当 りのバイオマス任 意 単 位 (U)と 定 義 し、 出 現 した 各 種 のバイオマスはそれらの1 個 体 当 りバイオマスに 個 体 数 を 乗 じることで 求 めた。[ 結 果 ・ 考 察 ]1. 年 次 間 差 :2003 年 8 月 の 調 査 ではバイオマスを調 べていないので 種 組 成 と 個 体 数 で 比 較 する。2003年 8 月 では0t 区 で18 種 、 総 個 体 数 は 乾 燥 土 壌 1g 当 り5.3×10 4 個 体 、60t 区 で24 種 、6.0×10 4 個 体 、150t 区 で31種 、13.2×10 4 個 体 、300t 区 で 39 種 、12.2×10 4 個 体 であった。これに 対 して2004 年 8 月 では60t 区 で6 種 、10.3×10 4 個 体 、150t 区 で9 種 、3.2×10 4 個 体 、300t 区 で12 種 、10.2×10 4 個 体 であった。0t 区 では 検 出 されなかった。このように2004 年 の 出 現 種 数 は 前 年 に 比 べて 非 常 に 少 なかったが 総 個 体 数 には 大 きな 違 いは 見られなかった。2003 年 の 土 壌 含 水 率 は 0t 区 で 31.8%、60t 区 で35.1%、150t 区 で35.1%、300t 区 で36.8%であった。 一方 、2004 年 の も のではそれぞれ23.6%、24.0%、25.5%、27.0%とやや 少 ない 傾 向 があり、これが 種 数の 減 少 と 関 連 している 可 能 性 も 考 えられた。2. 季 節 間 差 :2004 年 5 月 のサンプルでは0t 区 で7種 、2.0×10 4 個 体 、60t 区 で12 種 、12.9×10 4 個 体 、50t 区で10 種 、5.6×10 4 個 体 、300t 区 で12 種 、6.3×10 4 個 体 であった。 総 バイオマスで 見 ると2004 年 5 月 では0t 区 で3.1×10 7 U、60t 区 で 17.6×10 7 U、150t 区 で 3.9×10 7 U、300t 区 で4.2×10 7 U。 一 方 、2004 年 8 月 ではそれぞれ0U、8.5×10 7 U、2.5×10 7 U、7.9×10 7 U で あ っ た。こ のように0t 区 を 除 けば 季 節 間 での 総 個 体 数 とバイオマスの 差 はほとんど 無 く、 総 個 体 数 と 総 バイオマスもほぼ 並 行 関 係 にあるように 見 えた。しかし、 個 々の繊 毛 虫 の 個 体 数 とバイオマスの 比 較 では、 比 較 的 大型 の 繊 毛 虫 が 個 体 数 は 少 なくても、 大 きなバイオマスを 示 すケースがしばしば 見 られた。このようにMPN-SIPSE 法 は 従 来 のMPN 法 では 得 られなかった 種 組 成 や 総 個 体 数 だけでなく 総 バイオマスや 個 々の 種 のバイオマス 推 定 にも 有 効 であることが 示 され、 年 次 間 差 や 季 節 間 差 を 鋭 敏 に 検 出 できることが 分 った。[ 文 献 ]1) 土 壌 微 生 物 学 会 編 (1981) 新 編 土 壌 微 生 物 実 験法 、 養 賢 堂 、 東 京

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)772) Fenchel, T. (1987) Ecology of protozoa, Springer-Verlag, New York.3) Fiossner, W. (1987) Soil protozoa, Prog. Protistol., 2,69-2124) Lee, J. J., Leedale, G. F. and Bradbery, P. (2000) Anillustrated guide to the protozoa, 2nd ed., Allen Press,Lawrence.5) 高 橋 忠 夫 (2000) 土 の 原 生 動 物 ., 第 1 章 , pp.5-54, 博友 社 .6) 高 橋 忠 夫 他 (2003)Jpn. J. Protozool., 36, 18-19中 海 における 原 生 動 物 の 分 布石 田 秀 樹 1 , 石 橋 将 行 1 , 中 原 広 和 1 2, 増 山 悦 子( 1 島 根 大 ・ 生 物 ・ 生 物 , 2 広 島 女 子 大 学 ・ 健 康 科 学 )Investigation of the protozoan distribution in the Nakaumi LakeHideki ISHIDA 1 , Masayuki ISHIBASHI 1 , Hirokazu NAKAHARA 1 and Etsuko MASUYAMA 2( 1 Department of Biological Science, Faculty of Life and Environmental Science, Shimane University,2 Department of Health Science, Hiroshima Prefectural Women's University)SUMMARYProtozoa were observed from 2002 to 2003 in relation to salinity, water temperature, pH, COD etc. in NakaumiLake. This lake, a typical brackish water lake, is known to have a large change in salt concentration through the year.It has become clear from our research in recent years that various protozoans exist in Nakaumi Lake. However, hardlyanything is known about composition or density of species in this habitat. Therefore, 12 stations were set up to checkfactors which influence protozoan species composition. Inflow of seawater from the Sea of Japan into Nakaumi Lakechanges sharply according to season. It is also known that the amount of inflow from the upstream Shinji Lake dependson rainfall etc. It was found that distributions of Cinetochilum sp., Helicostoma sp., and Mesodinium sp. positively correlatedto salt concentration, and those of Euplotes eurystomus and Halteria grandinella negatively correlated to salt concentration.Moreover, Chlamydomonas reinhardtii and Cinetochilum sp. negatively correlated with water temperature,while Gymnodinium paradoxum, Mastigina sp., and Ochromonas sp. showed positive correlation to water temperature.[ 目 的 ] 汽 水 に 生 息 する 自 由 遊 泳 型 の 微 小 動 物 は, 汽水 環 境 に 適 応 した 様 々な 種 が 生 息 している 事 が 知 られている。これらの 微 小 動 物 は 微 小 動 物 以 外 の 多 様な 生 物 とともに 汽 水 域 特 有 の 生 態 系 構 造 を 形 成 していると 考 えられている。 汽 水 域 における 特 徴 的 な 生態 系 構 造 や 食 物 連 鎖 について, 植 物 プランクトン-二 枚 貝 - 鳥 類 (または 人 間 による 漁 獲 )の 関 係 については 詳 しい 研 究 が 行 われている。しかし, 低 次 消費 者 同 士 である, 原 生 動 物 ・ 動 物 プランクトン・ 二枚 貝 やその 他 のベントスの 関 係 についての 知 見 はほとんどない。この 原 因 として, 微 小 動 物 特 に 原 生 動物 の 生 息 分 布 調 査 がほとんど 行 われていないことがあげられる。したがって, 原 生 動 物 の 分 布 調 査 は 生態 系 ピラミッドの 最 底 辺 を 明 らかにする 鍵 となると考 えられる。中 海 は 代 表 的 汽 水 湖 であるが, 年 間 を 通 じて 塩 分濃 度 が 大 きく 変 化 し, 生 物 相 の 季 節 的 な 変 動 が 大 きいこと 知 られている。 近 年 の 我 々の 研 究 から, 中 海には 多 様 な 原 生 動 物 が 生 息 することが 明 らかになってきた。しかし, 原 生 動 物 に 関 する 調 査 は 過 去 には

78 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年ほとんどおこなわれておらず, 種 組 成 やその 生 息 密度 などについての 知 見 はほとんど 無 い。そこで, 中海 に 生 息 し 生 態 ピラミッドの 底 辺 の 一 角 を 支 える 原生 動 物 の, 種 組 成 , 生 息 環 境 を 左 右 する 要 因 について 明 らかにすることを 目 的 として, 定 点 を 設 定 して継 続 的 な 調 査 を 行 った。[ 材 料 と 方 法 ] まず, 中 海 に 12 箇 所 の 調 査 地 点 を 設定 した。 調 査 地 点 は, 流 入 河 川 の 状 況 , 調 査 地 点 間の 距 離 , 湖 岸 の 構 造 や 形 状 , 周 囲 からの 人 為 的 な 影響 などを 考 慮 しながら,おおよそ 付 近 の 環 境 を 代 表すると 思 われる 場 所 を 選 定 した。 最 も 上 流 側 に 位 置する 地 点 を St.1 とし, 本 庄 工 区 と 呼 ばれる 本 流 から外 れる 水 域 についても 調 査 地 点 に 加 えた。 調 査 は,すべての 調 査 地 点 で, 毎 月 一 回 行 い(データ 欠 損 あり), 原 生 動 物 の 個 体 数 ・ 種 数 に 影 響 をおよぼす 可能 性 が 考 えられる 水 温 ・ 塩 分 濃 度 ,pH, 濁 度 ,DOについて 現 地 で 測 定 を 行 った。また, 同 時 に 採 水 を行 い, 採 取 した 湖 水 は 直 ちに 実 験 室 に 持 ち 帰 り, 原生 動 物 の 同 定 を 行 った。 採 水 した 湖 水 の 一 部 を 用 いてCOD, 窒 素 塩 ,リン 酸 塩 の 測 定 をおこなった。[ 結 果 と 考 察 ] 今 回 の 調 査 では, 鞭 毛 虫 43 種 , 肉 質虫 17 種 , 繊 毛 虫 101 種 の 合 計 161 種 が 確 認 され, 以下 のことが 明 らかになった。 水 質 の 変 化 に 明 確 に 呼応 する 種 は 非 常 に 少 なく, 多 くの 種 では 水 質 データとの 有 意 な 相 関 は 見 られなかった。その 中 で, 水 温 ・塩 分 濃 度 についてはそれぞれの 値 と 正 または 負 の 相関 の 見 られる 種 が 数 種 確 認 された。 一 方 ,pH・COD・ 窒 素 塩 ・リン 酸 塩 については, 有 意 な 相 関 を示 す 種 は 無 かった。pH・COD・ 窒 素 塩 ・リン 酸塩 は 比 較 的 変 動 の 幅 が 小 さいため, 変 動 幅 が 個 体 数等 に 影 響 を 及 ぼすことのない 範 囲 内 に 収 まっているものと 思 われる。水 温 に 有 意 に 負 の 相 関 を 示 す 種 として Chlamydomonasreinhardtii,Cinetochilum sp., 水 温 に 正 の 相関 を 示 す 種 として Gymnodinium paradoxum,Mastiginasp.,Ochromonas sp., 水 温 に 関 係 なく 出 現 する種 として Amphisiella sp.,Euplotes eurystomus,Helicostomasp.が 認 められた。また, 塩 分 濃 度 に 正 の 相関 を 示 す 種 として Cinetochilum sp.,Helicostoma sp.,Mesodinium sp.があげられ, 塩 分 濃 度 に 負 の 相 関 を 示す 種 として Euplotes eurystomus,Halteria grandinellaがあげられた。 中 海 は 季 節 によって 日 本 海 からの 海水 の 流 入 量 が 大 幅 に 変 わること, 上 流 の 宍 道 湖 からの 流 入 量 が 降 雨 などで 大 きく 変 化 することが 知 られており, 水 温 ( 季 節 ) と 塩 分 濃 度 の 間 にも 関 連 性 があることを 考 えると, 水 温 や 塩 分 濃 度 などの 単 一 の 環境 要 因 のみを 取 り 上 げて 生 息 環 境 を 特 定 する 環 境 因子 とすることは 難 しいと 考 えられる。水 温 と 個 体 数 の 関 係 についてみると, 水 温 が 低 下する 冬 季 のみならず, 水 温 の 上 昇 する 夏 季 にも 原 生動 物 の 種 数 ・ 個 体 数 が 減 少 することがあった。また,繊 毛 虫 と 鞭 毛 虫 の 間 で 種 数 ・ 個 体 数 に 負 の 相 関 が 見 られる 場 合 があり, 捕 食 ・ 非 捕 食 の 関 係 を 予 測 させた。また, 夏 季 の 種 数 ・ 個 体 数 の 減 少 については, 原 生 動物 以 外 の 捕 食 者 からの 捕 食 による 可 能 性 が 考 えられた。 捕 食 者 としては 二 枚 貝 を 含 むベントスがその 候補 として 考 えられるため, 現 在 研 究 を 行 っている。2 年 間 にわたる 調 査 の 結 果 , 原 生 動 物 の 生 息 場 所を 左 右 する 環 境 因 子 を 決 定 するためには,さらに 複数 年 にわたる 調 査 が 必 要 と 考 えられる。また, 調 査頻 度 についても 月 一 回 ではなく, 調 査 頻 度 を 上 げることも 必 要 と 考 えられる。このためには, 今 後 は 多人 数 による 調 査 が 必 要 になると 考 えられるため, 多数 の 調 査 者 の 参 加 を 可 能 とするような, 水 質 や 種 同定 のための 画 像 を 含 めたデータベースなどを 整 備 していく 必 要 がある。

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)79ミドリゾウリムシにおける 共 生 藻 の 形 態 変 化山 口 純 , 高 橋 利 幸 , 細 谷 浩 史 , 小 阪 敏 和 ( 広 島 大 ・ 院 理 ・ 生 物 科 学 )Morphological variation of the symbiotic algae in Paramecium bursariaJun YAMAGUCHI, Toshiyuki TAKAHASHI, Hiroshi HOSOYA and Toshikazu KOSAKA(Department of Biological Science, Graduate School of Science, Hiroshima University)SUMMARYParamecium bursaria has hundreds of symbiotic algae in its cytoplasm, and is often used for the study of symbiosis.In the light, P. bursaria exchanges metabolic products with its symbiotic algae (mutualism). However, in the dark, thesymbiotic algae come to depend completely on the paramecium for their nutrition. To see how the morphology of thesymbiotic algae is affected by light, P. bursaria was cultivated in continuous darkness (DD), continuous light (LL) oralternating light/dark (LD)conditions. In this study, four stocks of P. bursaria syngen 1, KN-1(mating type I), BWK-16 (II), KN-21 (III) and BWK-4 (IV) were used. After cultivating the four stocks for one week under DD conditions, thestocks were transfered to LL conditions. Morphological variations of symbiotic algae were observed using a microscopeand compared in LD, DD and LL conditions over time. The size and fluorescence intensity of the symbiotic algae ofstock BWK-4 were measured using a flow cytometer. In DD conditions, the size and fluorescence intensity of the symbioticalgae decreased markedly when compared with those of the symbiotic algae in LD conditions. When the parameciacultured in DD conditions were transferred to LL conditions, the symbiotic algae recovered their fluorescence intensityand size again within one week.[ 目 的 ] 繊 毛 虫 ミドリゾウリムシは、 細 胞 質 内 に 数 百の 共 生 藻 をもっており、 共 生 のモデル 生 物 として 研究 されている。ミドリゾウリムシと 共 生 藻 は 光 がある 条 件 下 では 相 互 に 代 謝 産 物 のやり 取 りをして 両 者が 利 益 を 得 る 相 利 共 生 を 行 っている。しかし、 全 暗条 件 下 で 培 養 を 行 うと、 共 生 藻 は 宿 主 のミドリゾウリムシに 栄 養 を 依 存 して 生 活 するようになる。 本 研究 では 全 暗 条 件 (DD)でミドリゾウリムシを 培 養し、 明 暗 条 件 (LD)の 時 と 共 生 藻 の 形 態 を 比 較 して、 共 生 関 係 の 変 化 による 違 いを 調 べた。[ 材 料 と 方 法 ] ミドリゾウリムシParamecium bursariasyngen 1、KN-1(I)、BWK-16(II)、KN-21(III)、BWK-4(IV)の4 株 を 使 った。 温 度 は25°C、 光 条 件 は 明 暗 サイクル(LD12)で 培 養 している。 培 養 液 は、0.1% 液 体カロリーメイトにバクテリアKlebsiella pneumoniaeを接 種 して 使 用 した。4 株 の 初 期 密 度 を50cells/100mlとし、DDで 一 週 間 培 養 後 、 全 明 条 件 (LL)にしてその 間の 共 生 藻 の 形 態 変 化 を、 一 日 置 きに 光 学 顕 微 鏡 で 観察 し、 比 較 を 行 った。さらに、BWK-4 株 をフローサイトメーターで 共 生 藻 20,000 細 胞 を 実 験 に 供 し、 細胞 当 たりのサイズとクロロフィルの 蛍 光 強 度 を 定 量的 に 測 定 した。[ 結 果 と 考 察 ] ミドリゾウリムシは 通 常 LDサイクルで 培 養 しているが、 光 を 遮 断 したDDだと 共 生 藻 のサイズ、 色 調 、 密 度 に 著 しい 変 化 がみられた。 一 週 間DDで 培 養 した 共 生 藻 数 は、 暗 闇 に 置 く 前 のLDで 培養 した 共 生 藻 と 比 較 して、 約 半 数 まで 減 少 していることがわかった。 色 彩 は 濃 緑 色 から 薄 緑 色 になり、LD 時 では 細 胞 の 長 径 が6.2~12.3 µmであったのに 対し、 光 を 遮 断 したDDでは3.1~9.2 µmとサイズに 著 しい 減 少 傾 向 がみられた。 全 暗 条 件 では 上 述 のような形 態 変 化 が 生 じるが、 共 生 藻 は 栄 養 を 完 全 に 宿 主 に依 存 することで 分 裂 を 維 持 し、 低 い 割 合 ながら 増 殖していることが 光 学 顕 微 鏡 による 観 察 からわかった。サイズが 減 少 し 薄 緑 色 になった 共 生 藻 は、 再 びLLにすると 約 一 週 間 でLD 時 の 状 態 に 回 復 した。さらに、 定 量 的 な 結 果 を 得 るためにLD、DD、LL 時 の共 生 藻 20,000 細 胞 を、フローサイトメーターを 用 いてサイズと 蛍 光 強 度 を 測 定 した。その 結 果 、 共 生 藻はDDにおいて、サイズと 蛍 光 強 度 の 両 方 が 著 しく 減少 する 事 がわかった。また、LLにして 約 一 週 間 でサイズと 蛍 光 強 度 は、LD 時 とほぼ 同 程 度 に 回 復 した。

80 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年ミドリゾウリムシを 用 いたアクリルアミド 毒 性 の 評 価 とその 毒 性メカニズムに 関 する 研 究高 橋 利 幸 1,2 , 吉 井 昌 信 2 , 小 阪 敏 和 1 1, 細 谷 浩 史( 1 広 島 大 ・ 院 理 ・ 生 物 科 学 , 2 ( 株 )タイムアソシエイツ)Biotoxicity of acrylamide on the ciliate Paramecium bursariaToshiyuki TAKAHASHI 1,2 ,Masanobu YOSHII 2 ,Toshikazu KOSOKA 1 and Hiroshi HOSOYA 1( 1 Department of Biological Science, Graduate School of Science, Hiroshima University,2 Time Associates Inc.)SUMMARYMonomeric but not polymeric form of acrylamide induces toxicity like carcinogenic or neurotoxic effects. Recentstudies revealed that high acrylamide concentrations were found in starch-containing foods cooked at high temperatures(Press Release, WHO, 2002). However, the mechanisms of acrylamide toxicity to living organisms including humanhave not been well elucidated. We have introduced a convenient bioassay system using a green paramecium, Parameciumbursaria, possessing several hundreds of endosymbiotic algae to evaluate acrylamide toxicity of various kind ofenvironmental chemicals. Using this system, acrylamide toxicity has been evaluated on the P. bursaria (Takahashi et al.,2004 (Toxicol. in Vitro 19, 99-105)). It has been also reported that a herbicide paraquat, which is known as a generatorof reactive oxygen species (ROS), can produce alga-free paramecia. In this study, a production of ROS was investigatedto elucidate mechanisms of the toxicity of acrylamide on the ciliate P. bursaria.[ 目 的 ] 糖 質 の 豊 富 な 食 品 を 高 温 で 加 熱 処 理 すると 食品 中 に 発 ガン 性 物 質 アクリルアミド(AA)が 生 成 されることが 報 告 された(WHO, 2002)。このことは、 我 々が 日 常 の 食 生 活 を 通 してAAを 取 り 込 む 危 険性 が 高 いことを 示 しており 大 きな 社 会 問 題 となっている。 従 って、AAの 毒 性 の 作 用 機 序 の 解 明 とその 毒性 を 抑 制 する 物 質 の 探 索 は 緊 急 の 課 題 である。 既に、 我 々の 研 究 室 では、ミドリゾウリムシ( Parameciumbursaria )に 対 するAAの 効 果 を 調 べており、AA 処 理 したミドリゾウリムシでは、ミドリゾウリムシの 致 死 や 増 殖 阻 害 さらに 細 胞 内 共 生 藻 数 の 減 少 が観 察 されることを 報 告 した(Takahashi et al.,2005)。ミドリゾウリムシの 細 胞 内 共 生 藻 数 の 減 少は、 除 草 剤 パラコートでも 起 こり(Hosoya et al.,1995)、パラコートは 活 性 酸 素 発 生 剤 としても 知 られている。 本 研 究 では、AAの 毒 性 がパラコートの 毒性 と 類 似 していることに 着 目 し、AAによる 活 性 酸 素生 成 の 有 無 を 検 討 したのでその 結 果 を 報 告 する。[ 材 料 と 方 法 ] 実 験 にはP. bursaria、MB-1 株 およびBWK-4 株 を 用 いた。AAを 含 む 培 養 液 ( 濃 度 :0~1250 mg/L)に 対 数 増 殖 期 のミドリゾウリムシを 加 え細 胞 密 度 20 cells/mlで 培 養 した。ミドリゾウリムシをAA 存 在 下 で23±1℃、 全 明 条 件 ( 照 度 1500 lux)または 全 暗 条 件 下 で5 日 間 培 養 し 増 殖 を 比 較 した。AAによる 活 性 酸 素 の 生 成 の 有 無 を 明 らかにするために、AAと 同 時 に 活 性 酸 素 捕 捉 剤 (ニトロブルーテトラゾリウム;NBT)を10 時 間 処 理 し、 活 性 酸 素 によるNBTの 還 元 を 分 光 光 度 計 を 用 いて 定 量 化 した。[ 結 果 と 考 察 ] 活 性 酸 素 発 生 剤 であるパラコートやメチレンブルーは 光 依 存 的 な 毒 性 の 助 長 ( 光 増 感 作用 )を 示 すことが 知 られている。AAにおける 光 増 感作 用 の 有 無 を 調 べるために、AA 処 理 を 全 明 または 全暗 条 件 下 で 行 い 効 果 の 差 を 観 察 した。その 結 果 、AAによるミドリゾウリムシの 増 殖 阻 害 や 細 胞 内 共 生 藻数 の 減 少 の 割 合 は 全 暗 条 件 下 に 比 べ 全 明 条 件 下 で 処理 したときの 方 が 効 果 が 大 きいことから、AAはパラコートと 同 様 に 光 増 感 作 用 を 示 すことが 明 らかとなった。また、AAによる 活 性 酸 素 の 生 成 を 証 明 するために、AA 処 理 後 のNBTの 還 元 を 調 べたところ、AA 処 理 したものでは 未 処 理 のものと 比 べNBT 還 元 産

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)81物 の 顕 著 な 増 加 が 示 された。これらの 実 験 結 果 から、AA は 生 体 内 で 代 謝 される 過 程 で 活 性 酸 素 を 産生 することが 示 唆 された。活 性 酸 素 は、 細 胞 内 の 酸 化 還 元 調 節 を 通 しタンパク 質 の 翻 訳 後 修 飾 に 関 与 する。AA により 生 じる 神経 疾 患 や 発 ガンと 活 性 酸 素 との 関 連 は 不 明 であるが、AA 由 来 の 活 性 酸 素 による 細 胞 内 酸 化 還 元 状 態 の変 動 は 種 々の 疾 病 の 要 因 となり 得 ると 考 えられる。[ 文 献 ]1) Press Release WHO / 32, 26 April 2002.2) Hosoya et al. (1995) Zool. Sci 12, 807-10.3) Takahashi et al. (2005) Toxicol. in Vitro 19, 99-105.ミドリゾウリムシと 共 生 藻 の 共 生 に 関 与 する 遺 伝 子 の 探 索金 子 裕 代 , 前 田 奈 津 子 , 小 坂 敏 和 , 細 谷 浩 史 ( 広 島 大 ・ 院 理 ・ 生 物 科 学 )Search for symbiosis-related genes of symbiotic algae from Paramecium bursariaHiroyo KANEKO, Nachuko MAEDA, Toshikazu KOSAKA and Hiroshi HOSOYA(Department of Biological Science, Faculty of Science, Hiroshima University)SUMMARYParamecium bursaria harbors several hundreds endosymbiotic algae in its cytoplasm. To investigate the symbioticassociation of P.bursaria with its symbiotic algae, we made both aposymbiotic cell strains of P.bursaria and the clonedstrains of symbiotic algae isolated from P.bursaria. We have revealed that some of the cloned strains of symbiotic algaehave infective activities into aposymbiotic P.bursaria, but the others are non-infective for aposymbiotic P.bursaria. Inthis study, we tried to search for possible symbiosis-related genes of symbiotic algae from P.bursaria by comparing thegenetic differences between the infective and the non-infective algal strains. We have obtained three genes expressingmore highly in an infective algal strain (SA-4b) and one gene expressing more highly in a non-infective algal strain (SA-4a).[ 目 的 ]ミドリゾウリムシの 細 胞 質 には 数 百 のクロレラ 様 の 緑 藻 ( 共 生 藻 )が 共 生 している。 現 在 までに、この 共 生 メカニズムの 解 明 のため、 共 生 藻 を 除去 したミドリゾウリムシの 作 製 1,2、ミドリゾウリムシ 由 来 の 共 生 藻 の 単 離 .クローン 化 、さらに、これらを 用 いた 再 共 生 の 実 験 系 を 確 立 している3。また、クローン 化 共 生 藻 と 自 由 生 活 性 のクロレラのそれぞれ 複 数 株 について 共 生 藻 除 去 ミドリゾウリムシへの 再 共 生 を 試 みたところ、クローン 化 共 生 藻 と自 由 生 活 性 のクロレラの 両 者 で 再 共 生 可 能 な 株 と 不可 能 な 株 が 存 在 することが 分 かっている。 本 研 究 では、ミドリゾウリムシと 共 生 藻 の 共 生 メカニズムの解 明 を 目 的 とし、ディファレンシャル・ディスプレイ 法 により 再 共 生 可 能 な 株 (SA-4b 株 )と 不 可 能 な 株(SA-4a 株 )の 両 者 で 発 現 量 に 差 のある 遺 伝 子 の 同 定を 試 みた。[ 材 料 と 方 法 ] 本 研 究 には、ミドリゾウリムシのBS-4株 (syngen 1, mating type II,1994 年 に 愛 媛 県 別 子 山村 で 採 集 )から 単 離 ・クローン 化 された 共 生 藻 、SA-4a 株 とSA-4b 株 の2 株 を 用 いた。これら2 株 のミドリゾウリムシ 由 来 の 共 生 藻 株 を 実 験 的 に 作 製 した 共 生 藻除 去 ミドリゾウリムシ(KSKw-103 株 )に 経 口 摂 取 させたところ、SA-4b 株 はミドリゾウリムシと 再 共 生 するが、SA-4a 株 は 再 共 生 しないことがすでに 分 かっている。SA-4a 株 とSA-4b 株 からフェノール/SDS 法 により 全RNAを 抽 出 した。アンカープライマーを 用 いて 全RNAからpoly(A)-mRNAを 選 択 的 に 逆 転 写 し、 合 成 されたcDNAと60 種 類 の 任 意 プライマーを 用 い、ディ

82 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年ファレンシャル・ディスプレイ 法 (D. D 法 )4により 両 株 の 発 現 遺 伝 子 を 比 較 した。D. D 法 により 得 られた 両 株 で 発 現 量 に 差 のあったcDNA 断 片 をもとに 作 製 したプローブでノザンブロットにより 両 株 で 発 現 量 に 差 のある 遺 伝 子 であるのかの 確 認 を 行 った。発 現 量 に 差 があることが 確 認 されたcDNA 断 片 の 塩基 配 列 を 明 らかにし、さらに5'RACEにより 全 長 配 列を 決 定 した。ホモロジー 検 索 はDDBJ/EMBL/GenBankデータベースのFASTAプログラムで 行 った。[ 結 果 と 考 察 ] D. D 法 により60 種 類 の 任 意 プライマーを 用 いて 再 共 生 可 能 株 (SA-4b 株 )と 再 共 生 不 可 能 株(SA-4a 株 )の 発 現 遺 伝 子 を 比 較 したところ、SA-4a株 で 特 異 的 に 検 出 されたは15 個 、SA-4b 株 で 特 異 的 に検 出 されたものは21 個 であった。D. D 法 で 得 られたcDNA 断 片 をプローブとして 用い、ノザン 解 析 による 発 現 量 の 再 確 認 を 行 った。 現在 までに36 個 のうち16 個 のcDNA 断 片 について 解 析 を行 い、そのうちの5 個 で 再 現 性 のある 結 果 が 得 られた。 今 回 はそれら5 個 のうち、SA-4b 株 でSA-4a 株 よりも 発 現 量 が 多 いcDNA 断 片 、OPC12-4b-3とOPD14-4b-1について 示 した。 2 個 のcDNA 断 片 、OPC12-4b-3(325 bp)とOPD14-4b-1(471 bp)、の 塩 基 配 列 を 決 定した。OPC12-4b-3については、さらに5'RACEを 行 い全 長 配 列 (2441 bp)を 決 定 した。DDBJ/EMBL/GenBankデータベースのFASTAプログラムでホモロジー 検 索 を 行 ったがこれまでのところ 相 同 性 の 高 い配 列 は 存 在 しなかった。今 後 、OPC12-4b-3 以 外 のノザン 解 析 で 再 共 生 可 能株 と 再 共 生 不 可 能 株 で 発 現 量 に 差 の 生 じた 遺 伝 子 についても 全 長 配 列 を 決 定 し、 再 度 ホモロジー 検 索 を行 う 予 定 である。また、ノザン 解 析 を 行 っていない残 りの20 個 のcDNA 断 片 について 同 様 の 解 析 を 行 う 予定 である。さらに、ノザン 解 析 により 再 現 性 の 得 られた5 個 の 遺 伝 子 については、 他 の 共 生 可 能 な 株 と 不可 能 な 株 でも 発 現 量 の 比 較 を 行 う 予 定 である。[ 文 献 ]1) Hosoya H, Kimura K, Matsuda S, Kitamura M, TakahashiT, Kosaka T (1995) Zool Sci 12: 807-810.2) Tanaka M, Murata-Hori M, Kadono T, Yamada T,Kawano T, Kosaka T, Hosoya H (2002) Acta Protozool41: 255-261.3) Nishihara N, Horiike S, Takahashi T, Kosaka T, ShigenakaY, Hosoya H (1998) Protoplasma 203: 91-99.4) Liang P and Pardee A.B (1992) Science 257: 967-971.ミドリゾウリムシと 細 胞 内 共 生 藻 間 における 共 生 関 与 遺 伝 子 の 探 索前 田 奈 津 子 , 金 子 裕 代 , 小 阪 敏 和 , 細 谷 浩 史 ( 広 島 大 ・ 院 理 ・ 生 物 科 学 )Symbiosis-related genes of endosymbiotic algae of Paramecium bursaria syngen 1N. MAEDA, H. KANEKO, T. KOSAKA, H. HOSOYA(Biol. Inst., Grad. Sch. of Sci., Hiroshima Univ.)SUMMARYThe green paramecium Paramecium bursaria has several hundreds of endosymbiotic algae in its cytoplasm. But it isnot clarified how this symbiotic association can be established and maintained. To elucidate the mechanism of symbiosis,we had removed these endosymbiotic algae from paramecium using the herbicide paraquat and symbiotic algae-freestrains were prepared (Hosoya et al. 1995, Tanaka et al. 2002). Using several clones of symbiotic algae isolated fromgreen paramecia, we have already established the conditions to let them re-infect into symbiotic algae-free paramecia(Nishihara et al. 1998). Interestingly, these cloned symbiotic algae contained two kinds of strains, infective or noninfectivefor algae-free paramecia, respectively. Here we compared DNA patterns developed in the infective and non-

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)83infective strains of cloned algae using a differential display and northern blot method. As a result, four cDNA fragments,which show different patterns of expression in the infective and the non-infective clones, were obtained.[ 目 的 ] 繊 毛 虫 ミドリゾウリムシ(Paramecium bursaria)は、その細 胞 質 中 に 多 数 の 共 生 藻 が 共 生 している。 当 研 究 室 では、ミドリゾウリムシにおける 共生 メカニズムの 解 明 を 目 的 として、これまでに 共 生藻 除 去 ミドリゾウリムシの 作 製 1,2 や、 共 生 藻 の 単離 ・クローン 化 、 共 生 藻 除 去 ミドリゾウリムシへクローン 化 藻 類 を 再 感 染 させる 系 の 確 立 等 3 を 行 ってきた。 自 由 生 活 性 のクロレラがミドリゾウリムシに 共生 するという 過 去 の 報 告 があるので、 共 生 藻 除 去 ミドリゾウリムシにクローン 化 した 共 生 藻 及 び 自 由 生活 性 のクロレラの 複 数 株 を 経 口 接 種 させると、それらの 中 に 再 感 染 可 能 な 株 と 不 可 能 な 株 の2 種 類 あることが 分 かった。そこでこの 成 果 をもとに、 共 生 藻とクロレラの 発 現 遺 伝 子 をディファレンシャル・ディスプレイ 法 (D・D 法 )により 比 較 した。その 結果 、 感 染 能 の 有 無 に 関 係 なく、 発 現 遺 伝 子 のバンドパターンによりA~Fまでの12グループに 分 かれることが 分 かった。そこで 本 研 究 では、このグループ 分けにおいて 感 染 能 を 持 つ 株 と 持 たない 株 の 両 方 を 含むグループDに 焦 点 を 絞 り、D・D 法 及 びノザン 解 析法 を 用 いて 両 株 の 発 現 遺 伝 子 を 比 較 、 解 析 する・ アとにより 共 生 に 関 与 する 因 子 の 探 索 を 行 った。[ 材 料 と 方 法 ] 共 生 藻 は、グループDに 含 まれるSA-4a 株 とSA-4b 株 の2 株 を 用 いた。これらを 大 量 培 養 した 後 、フェノール/SDS 法 を 用 いてトータルRNAを 抽出 した。トータルRNAはDNase I 処 理 してからアンカープライマーでpoly(A)-mRNAを 選 択 的 に 逆 転 写し、その 後 60 個 の 任 意 プライマーをそれぞれ 用 いてPCRで 増 幅 した。 得 られたPCR 産 物 をアクリルアミドゲルで 電 気 泳 動 し、SA-4a 株 とSA-4b 株 で 差 の 見 られたバンドをゲルから 切 り 出 した。D・D 法 はその 過程 にPCRを 用 いるため、 本 来 の 遺 伝 子 の 発 現 量 を 定量 的 に 反 映 していない 可 能 性 があるので、そこから抽 出 したcDNA 断 片 からプローブを 作 製 し、ノザンブロッティングを 行 った。ノザンブロッティングで 発現 量 に 差 の 見 られたcDNAはシークエンスを 行 い、FASTA 検 索 を 行 った。さらに、そのうちの 一 つ、cDNA 断 片 OPC-12 4b-1については、5’RACEを 行 って遺 伝 子 の 全 長 を 得 た。[ 結 果 と 考 察 ] D・D 法 を 用 いてSA-4a 株 とSA-4b 株 でcDNA 断 片 のバンドの 有 無 を 比 較 した 結 果 、 差 のあるcDNA 断 片 が 計 36 個 得 られた。36 個 のうち、20 個 の 断片 のサブクローニングに 成 功 した。このうち、16 個のcDNA 断 片 についてはノザンブロット 解 析 が 終 了し、5 個 の 断 片 (OPC-12 4b-1, OPC-12 4b-2, OPC-124b-3, OPC-17 4a-8, OPD-14 4b-1)でSA-4a 株 とSA-4b株 での 発 現 量 に 差 が 見 られることが 分 かった。 再 感染 不 可 能 なSA-4a 株 で 発 現 量 が 多 かった 断 片 はOPC-17 4a-8で、その 他 が 再 感 染 可 能 なSA-4b 株 で 発 現 量 の多 かった 断 片 である。その 後 、シークエンスを 行 って 断 片 の 塩 基 配 列 を 決 定 し、FASTAプログラムで 相同 性 検 索 を 行 ったが、どの 断 片 も 相 同 性 の 高 い 遺 伝子 が 見 つからなかった。しかし、OPC-12 4b-1とOPC-12 4b-2は、その 配 列 が 一 致 したため、その 後 OPC-124b-1のみ 解 析 を 進 めた。ノザンブロットの 結 果 、OPC-12 4b-1の 全 長 は、 約 3kbであることが 分 かったが、 得 られている 断 片 は 約 700bpであったので、 引 き続 いて5’RACEを 行 った。その 結 果 、 完 全 長 の 遺 伝 子OPC-12 4b-1が 得 られた。シークエンスを 行 い、3kbのうち 約 2.5kbの 塩 基 配 列 を 決 定 した。 再 びFASTA 検索 にかけたが、 有 意 に 相 同 性 のある 遺 伝 子 は 見 つからなかった。 今 後 、 塩 基 配 列 の 解 析 を 進 めて 全 塩 基配 列 を 決 定 し、SA-4a 株 ・SA-4b 株 以 外 の 共 生 藻 株 においても 再 感 染 可 能 、 不 可 能 な 株 の 間 でこの 遺 伝 子の 発 現 量 に 差 があるのか、 検 討 を 行 いたいと 考 えている。[ 文 献 ]1. Hosoya H. et al., (1995) Zool. Sci. 12, 807-810.2. Tanaka M. et al., (2002) Acta Protozool. 41, 255-261.3. Nishihara N. et al., (1998) Protoplasma 203, 91-99.

84 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年ミドリゾウリムシ 細 胞 内 共 生 藻 の 系 統保 科 亮 , 鎌 戸 伸 一 郎 , 今 村 信 孝 ( 立 命 大 ・ 理 工 ・ 化 生 工 )Phylogeny of symbiotic algae of Paramecium bursariaRyo HOSHINA, Shin-ichiro KAMAKO and Nobutaka IMAMURA(Sci. and Eng., Dept. Biosci. and Bioeng., Ritsumeikan Univ.)SUMMARYWe have made progress on the study of phylogeny of paramecian symbionts based on the 5’ half ribosomal DNAoperon. All symbiotic algae we used (6 Japanese, 1 Chinese, 2 American and 1 German samples) belong to Chlorellasensu stricto (Huss et al. 1999 [3]) based on the 18S rDNA phylogeny. An analysis based on internal transcribed spacer 2unveiled two phylogenetic groups J-C-A (Japanese, Chinese and American) and German, which suggests the event ofalgal symbiosis have occurred more than one time.[ 目 的 ] ミドリゾウリムシの 共 生 藻 は, それがホストであるミドリゾウリムシのオルガネラではないことが 古 くから 認 知 され, その 形 態 や 生 理 特 性 , 成 分 分 析などからクロレラ Chlorella (Trebouxiophyceae,Chlorophyta)に 近 縁 であることが 示 唆 されてきたが,クロレラ 自 体 の 形 態 が 単 純 で 分 類 体 系 もあやふやであることから, DNA, 特 にリボゾームRNA 遺 伝 子 に 基づく 分 子 系 統 解 析 が 待 たれていた。 本 研 究 では, 日本 , 中 国 , アメリカ, ドイツ 産 の 共 生 藻 について, リボゾ ームRNA のスモールサ ブ ユ ニット 遺 伝 子 (18SrDNA), および 真 のクロレラにおける 系 統 解 析 に 最 適な 分 子 種 として 提 示 されているInternal transcribedspacer 2 (ITS 2; [1])を 用 いて 分 析 をおこなう。[ 材 料 と 方 法 ] 系 統 解 析 にはミドリゾウリムシ 株 [ 日本 産 ; Ok1, So13, F36, KM2, Dd1, Bnd1, 中 国 産 ; Cs2, ドイツ 産 ; PB-SW1] およびアメリカ 産 共 生 藻 単 離 株(NC64A Syngen 2-3)を 用 いた。ユニバーサルプライマー, または 緑 色 藻 にspecificなプライマーを 用 いてPCRをおこない, 18S rDNAおよびITS 領 域 を 得 た。 近隣 結 合 (NJ) 法 を 用 い, 18S rDNA, ITS2それぞれに 基 づく 系 統 樹 を 構 築 した。[ 結 果 と 考 察 ] 共 生 藻 株 からDNA 増 幅 をおこなったアメリカ 産 Syngen 2-3ではITS2 領 域 内 にわずかな 多 型が 見 られた。これはゲノム 中 にリボゾーマルオペロンが 複 数 存 在 するためと 考 えられ, 変 化 しやすいITS領 域 におけるこのような 細 胞 内 多 型 はこれまでも 多数 の 報 告 がある。 一 方 ミドリゾウリムシから 得 られた 共 生 藻 DNAは 日 本 産 , ドイツ 産 とも 単 一 であり, 日本 産 のものは 単 離 した 共 生 藻 での 報 告 [1] [2]と 一 致 した。これらの 結 果 は1ミドリゾウリムシ 細 胞 内 に 共 生している 藻 類 はクローンであることを 強 く 示 唆 している。 中 国 産 ではITS1 領 域 内 にわずかな 多 型 が 見 られたが, これもSyngen 2-3のケース 同 様 , 1 共 生 藻 のゲノム 内 多 型 である 可 能 性 が 高 く, ミドリゾウリムシ 細胞 内 における 共 生 藻 のクローン 化 を 否 定 するものではない。全 ての 共 生 藻 の18S rDNA 中 にはイントロンの 挿 入が 確 認 された。 中 国 産 とアメリカ 産 は, すでに 報 告 している 日 本 産 共 生 藻 のもの[2]と 同 じ3ヶ 所 にほぼ 同様 の 配 列 がみられた。 一 方 ドイツ 産 のものではイントロンは1つしか 認 められず, 挿 入 位 置 , 配 列 とも 大 きく 異 なった。18S rDNAのエクソン 領 域 は 日 本 - 中国 -アメリカ 産 のもので 完 全 に 一 致 し, ドイツ 産 のものではいくらか 異 なる。18S rDNAに 基 づく 系 統 樹 では, 日 本 - 中 国 -アメリカ 産 , ドイツ 産 ともに 真 のクロレラ 属 [3]のC. vulgarisグループのクレードに入 った(ブーツストラップ100%)。このクレード 内 における 遺 伝 的 距 離 はわずかで, グルーピングや 分 岐 順 などを 推 測 するのが 困 難であるため, 真 のクロレラ 属 の 系 統 解 析 に 最 適 な 分 子種 として 提 示 された[1] ITS2を 用 いた 系 統 樹 を 構 築 した 結 果 , 日 本 - 中 国 -アメリカ 産 とドイツ 産 共 生 藻 の系 統 が 異 なることをはっきり 示 すことができた。これはミドリゾウリムシの 形 成 , すなわち 藻 類 を 細 胞 内

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)85に 共 生 させるといった 進 化 上 のイベントが 複 数 回あったことを 示 すものと 考 えられる。ITS2では 他Chlorella 属 藻 類 との 関 係 や 分 岐 順 を 示 すには 至 っていない。これはITS2の 変 異 が 大 きすぎるためで, すなわち, 18S rDNAよりも 変 異 が 早 くITS2よりも 遅 い 分子 種 の 選 択 , およびより 多 くの 共 生 藻 やChlorella 属 藻類 を 加 えて 解 析 をおこなうことが 今 後 の 課 題 である。[ 文 献 ][1] Hoshina, R., Kamako, S-i. and Imamura, N. (2004)Plant Biol., 6: 447-453.[2] Hoshina, R., Kamako, S-i. and Imamura, N. (2004)AIP Conf. Proc., 716: 203-206.[3] Huss, V. A. R., Frank, C., Hartmann, E. C., Hirmer,M., Kloboucek, A., Seidel, B. M., Wenzeler, P., andKessler, E. (1999) J. Phycol., 35: 587-598.ミドリゾウリムシの 共 生 クロレラ 再 感 染 にクロレラの 培 養 期 間 が及 ぼす 影 響 について後 藤 宗 範 , 渡 辺 彊 ( 東 北 大 ・ 生 命 科 学 ・ 生 命 機 能 )Influence of cultivation period of symbiotic Chlorella on reinfection inParamecium bursariaMunenori GOTO and Tsuyoshi WATANABE(Dept. Dev. Biol&Neuro. Sci., Biol. Inst. Tohoku Univ.)SUMMARYSymbiotic algae-free Paramecium bursaria can be re-infected with isolated algae through ingestion via cytopharynx.It is believed that cell cycle of algae play some roles in the host-algae recognition. In the present work, we re-examinedwhether cell cycle and culture age of algae affect on the re-infection phenomena of P. bursaria. We cultivated algae for 2weeks under 16h light (L)-8h dark (D) condition and obtained semi-synchronized algae (CA1). In 6 weeks culture underthe same condition, however, growth of algae was asynchronous (CA2). When CA1 and CA2 algae were ingested byaposymbiotic paramecia, rate of algae-retaining paramecia and number of retaining algae per paramecia was significantlymuch when determined at 12 and 24 hours after infection. This suggests that the culture age influence on the reestablishmentof paramecia-algae relationship. When algae of CA1 and CA2 were prepared at the start and the end of L-period and ingested in paramecia, infection rate was not significantly different, indicating that reassociation of algae toparamecia was not influenced by cell cycle of algae.[ 目 的 ] ミドリゾウリムシParamecium bursariaは 通常 、 細 胞 内 に 数 百 個 の 共 生 藻 (クロレラの 一 種 )を持 って 生 活 している( 緑 色 細 胞 )。この 共 生 藻 は 実験 室 内 で 種 々の 手 法 で 取 り 除 くことができ、 共 生 藻を 取 り 除 かれた 細 胞 ( 白 色 細 胞 )は 通 常 時 と 同 じように 培 養 することができる。 白 色 細 胞 に 外 部 から 共生 藻 を 加 えるとこれを 細 胞 口 経 由 で 取 り 込 み、 取 り込 まれた 共 生 藻 の 一 部 は 宿 主 の 消 化 過 程 を 免 れて 増殖 し、やがてもとの 共 生 関 係 を 構 築 する( 共 生 藻 の再 感 染 )。再 感 染 の 際 、 共 生 藻 はまず 通 常 のエサと 同 じようにゾウリムシの 食 胞 に 数 個 取 り 込 まれた 後 、 取 り 込まれた 共 生 藻 の 一 部 が 宿 主 の 消 化 過 程 を 免 れて 一 つ一 つ 宿 主 由 来 の 単 層 膜 (perialgal vacuole)に 包 まれ、やがて 増 殖 し 元 の 共 生 関 係 を 構 築 されると 考 えられているが、このときにゾウリムシが 食 胞 内 の 共

86 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年生 藻 を 餌 と 区 別 する 機 構 や、 共 生 藻 の 一 部 のみが 生き 残 ることができる 理 由 などはほとんど 明 らかになっていない。クロレラの 種 によって 再 感 染 能 力 を持 つものと 持 たないものがおり、そこには 細 胞 壁 の構 成 成 分 の 違 いが 存 在 することがわかっている(1,2)が 決 定 的 な 要 因 とは 結 論 付 けられていない。緑 色 細 胞 内 の 共 生 藻 は 宿 主 から 取 り 出 し 培 養 することができる。また 単 離 培 養 した 共 生 藻 を 白 色 細 胞に 再 感 染 させることもできる。 共 生 藻 はクロレラの一 種 と 考 えられているが、クロレラを 明 暗 サイクル条 件 下 で 培 養 するとその 細 胞 周 期 が 同 調 すること、またクロレラの 細 胞 周 期 において 細 胞 壁 の 構 成 成 分が 量 的 に 変 化 することが 知 られている(3)。そこで我 々は 緑 色 細 胞 から 取 り 出 した 共 生 藻 を 明 暗 サイクル 下 で 培 養 し 細 胞 周 期 を 同 調 させ、それぞれの 時 期の 共 生 藻 を 再 感 染 させた 際 の 違 いを 見 ることを 目 的として 実 験 を 行 った。[ 材 料 と 方 法 ] Paramecium bursariaのGr3を 共 生 藻 供与 株 、Miw2-1wを 共 生 藻 受 容 株 とした。Gr3の 細 胞 をSDSで 溶 解 し 共 生 藻 を 単 離 後 、まずCA 培 地 を 含 む2%(w/v) 寒 天 培 地 上 で 培 養 した。 数 週 間 後 コロニーを 拾 って 別 の 培 地 に 蒔 き、これを4 回 繰 り 返 した。 得 られた 共 生 藻 を 液 体 CA 培 地 に 移 し、16h/8hの明 暗 サイクル 下 で 培 養 した。2~3 週 間 ごとに 一 部 を別 の 液 体 培 地 に 移 し 培 養 を 行 った。培 養 を 開 始 してから2 週 間 後 と6 週 間 後 における 共生 藻 の1 日 の 細 胞 数 、 細 胞 の 大 きさの 変 化 を 調 べた。さらにそれぞれの 時 期 の 共 生 藻 をMiw2-1w 株 に 与え、 取 り 込 んだ 共 生 藻 の 生 き 残 りの 様 子 、 再 感 染 率の 違 いを 調 べた。[ 結 果 と 考 察 ] 液 体 CA 培 地 を 用 いて 培 養 した 共 生 藻は、 培 地 に 移 してから2 週 間 後 の 段 階 では 細 胞 数 の 増加 、 細 胞 の 体 積 の 変 動 に 周 期 性 が 認 められ、 細 胞 周期 が 同 調 していることが 確 認 された。しかし6 週 間 後では 細 胞 数 の 増 加 、 細 胞 の 体 積 の 変 動 とも2 週 間 後 のものほどはっきりした 周 期 性 は 認 められなかった。また6 週 間 後 の 共 生 藻 の 方 が2 週 間 後 のものより 全 体的 に 細 胞 が 大 きかった。そこで 培 養 後 2 週 間 の 共 生 藻(CA1)と6 週 間 の 共 生 藻 (CA2)を 用 い 再 感 染 実 験を 行 ったところ、CA1の 方 がとり 込 み 後 消 化 されずに 残 る 数 、 最 終 的 に 感 染 が 成 立 するゾウリムシの 割合 がともに 多 かった。この 結 果 から、 培 養 期 間 の 短い 共 生 藻 の 方 が 白 色 細 胞 への 感 染 能 力 が 高 いことが示 された。またCA1を 用 いた 再 感 染 実 験 では、 明 期開 始 直 後 の 共 生 藻 、 明 期 終 了 直 前 の 共 生 藻 共 に 白 色細 胞 に 対 して 高 い 感 染 率 を 示 した。 明 期 開 始 直 後 に行 った 実 験 で 再 感 染 実 験 後 12 時 間 から24 時 間 の 間 にゾウリムシ1 細 胞 あたりの 共 生 藻 数 が 増 加 したのに 対し、 明 期 終 了 直 前 に 行 った 実 験 では12 時 間 から24 時間 のあいだで 共 生 藻 数 の 増 加 は 見 られなかった。 両実 験 で24 時 間 後 にゾウリムシ1 細 胞 あたりに 含 まれる共 生 藻 数 の 数 に 統 計 的 有 意 差 は 見 られなかった。 以前 、クロレラは 分 裂 直 後 の 娘 細 胞 の 方 が 感 染 しやすいという 結 果 が 報 告 されているが(4)、 今 回 の 結 果 は共 生 藻 の 細 胞 周 期 が 感 染 率 に 直 接 的 な 影 響 を 与 えないことを 示 唆 している。[ 文 献 ]1. Takeda,H. (1995) Phytochemistry 40:457-4592. Takeda,H., Sekiguchi,T., Nunokawa,S. and Usuki,I.(1998) Europ. J. Protistol. 34:133-1373. Takeda,H. and Hirokawa,T. (1978) Plant & CellPhysiol. 19:591-5984. Reisser,W., Radunz,A. and Wiessner,W. (1982)Cytobios. 33: 39-50

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)87ミドリゾウリムシの 共 生 クロレラが 宿 主 食 胞 から 脱 出 するしくみについて児 玉 有 紀 , 藤 島 政 博 ( 山 口 大 ・ 院 理 工 ・ 生 物 科 学 )The mechanism of escape of symbiotic Chlorella sp. from the hostParamecium digestive vacuolesYuuki KODAMA and Masahiro FUJISHIMA(Biol. Inst., Grad. Sch. of Sci. and Engeneering, Yamaguchi Univ.)SUMMARYIn Paramecium bursaria, each symbiotic alga is enclosed in a perialgal vacuole derived from the host digestive vacuole(DV), which protects the alga from lysosomal fusion. Algae-free cells can be easily reinfected with algae isolatedfrom algae-bearing cells by ingestion into DVs. By pulse label for 1.5 min and chase, we showed that an alga can successfullyescape from the host's DV after acidosomal and lysosomal fusion with the vacuole has occurred, in order toproduce endosymbiosis. When symbiotic Chlorella sp. isolated from P. bursaria were ingested into the DVs, each algalcell was pinched off into the cytoplasm and enclosed within the DV membrane, irrespective of whether the ingested cellswere living or had been killed by boiling. However, this phenomenon was not observed when labeled yeast S. cerevisiae,India ink or latex spheres were ingested into the DVs. This suggests that a contact between the DV membrane of P. bursariaand the cell walls of the algae may participate in this phenomenon. Effects of various temperatures, pHs, and enzymeson abilities for escaping from the DV and for maintenance in the alga-free cell was examined.[ 目 的 ] ミドリゾウリムシはParamecium 属 の 中 では 唯一 クロレラ (Chlorella sp.) を 細 胞 内 共 生 させる 能 力 を持 っている。シンビオティック 細 胞 から 共 生 藻 を 単離 し、 予 め 共 生 藻 を 除 去 したアポシンビオティック細 胞 と 混 合 すると、クロレラは 食 胞 を 経 由 して 宿 主ライソソームが 融 合 しないPV 膜 に 包 まれて 再 感 染 することができる。このようにミドリゾウリムシとクロレラは 動 物 細 胞 と 藻 類 との 細 胞 内 共 生 の 感 染 初 期過 程 で 何 が 行 われるのかを 解 明 するのに 適 した 材 料であるが、どのようにしてクロレラが 消 化 を 免 れて細 胞 内 共 生 を 開 始 するのかについてはほとんど 分かっていない。そこで、 我 々は 宿 主 食 胞 に 取 り 込 まれるクロレラの 数 と 時 間 を 制 限 し、その 運 命 を 追 跡するパルスラベルとチェイスの 方 法 によって、 細 胞内 共 生 に 成 功 した 共 生 藻 の 大 部 分 が、ライソソーム融 合 後 の 食 胞 から 食 胞 膜 の 細 胞 質 側 へのくびれによって 細 胞 質 に 脱 出 した 緑 色 のクロレラであることを 明 らかにした (Kodama and Fujishima, Protoplasma,2005, in press)。この 研 究 では、どのようにして 共 生 藻 が 宿 主 細 胞質 に 脱 出 するかを 調 べるために、ボイルした 共 生藻 、 墨 汁 、ラテックスビーズ、S. cerevisiaeを 与 えた時 の 食 胞 でもこのような 現 象 が 見 られるかについて調 べた。さらに、 共 生 藻 が 持 つこの 能 力 に 対 する 糖 分 解 酵素 、 蛋 白 質 分 解 酵 素 、 熱 、pHの 影 響 を 調 べた。[ 材 料 と 方 法 ] 共 生 藻 を 持 たないアポシンビオティック 細 胞 (OS1w) に、 墨 汁 やSaccharomyces cerevisiaeやラテックスビーズ、 共 生 藻 を 一 定 条 件 で 与 え、1.5 分間 のパルスラベル 後 に 手 回 し 遠 心 機 または 直 径 15mmのナイロンメッシュで 洗 浄 し、 外 液 に 残 ったこれらを 除 去 した。その 後 、 細 胞 を 数 時 間 毎 に4% (w/v) パラホルムアルデヒドで 固 定 し、 宿 主 食 胞 から 細 胞 質への 脱 出 が 起 きるかを 観 察 した。また、ゾウリムシ(P. caudatum) においても、パルスラベルを3 分 間 行い、その 後 同 様 の 方 法 で 食 胞 の 観 察 を 行 った。さらに、シンビオティック 細 胞 (OS1g 株 ) から 共 生藻 を 単 離 し、 各 種 酵 素 (α-マンノシダーゼ [220 µg/ml,30°C]、β-ガラクトシダーゼ [220 µg/ml, 30°C]、 β-グルコシダーゼ [230 µg/ml, 30°C]、プロテナーゼK [3mg/ml, 30°C]、リティケース [1.5 mg/ml, 25°C]、リパーゼPN [3 mg/ml, 30°C]で1または6 h 処 理 )、 各 種熱 、 各 種 pHで 処 理 した 後 、ドリル 氏 液 で 洗 浄 し、 上記 の 方 法 と 同 様 にアポシンビオティック 細 胞 に 与え、これらの 処 理 が 宿 主 食 胞 からの 脱 出 及 び 感 染 率

88 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年に 与 える 影 響 を 調 べた。[ 結 果 と 考 察 ] ミドリゾウリムシに 墨 汁 、ラテックスビーズ、ボイルした 酵 母 菌 を 与 えた 場 合 には 宿 主 食胞 からの 脱 出 は 見 られなかったが、10 分 間 ボイルした 共 生 藻 や 生 きた 酵 母 菌 には 食 胞 脱 出 能 力 が 存 在 した。Suzaki et al. (2003) は、 酵 母 菌 をアポシンビオティック 細 胞 に 与 えると1 週 間 から10 日 程 度 宿 主 細胞 質 に 維 持 されたと 報 告 している。このことは、10分 間 熱 処 理 した 共 生 藻 や 生 きた 酵 母 菌 に 存 在 する 物質 が、 食 胞 からの 脱 出 と 細 胞 内 共 生 の 成 立 に 必 要 であることを 示 している。また、ミドリゾウリムシに 墨 汁 やラテックスビーズを 与 えた 場 合 は24 時 間 以 内 に 全 てが 排 泄 されるのに 対 して、ボイルした 共 生 藻 や 酵 母 菌 を 与 えた 場 合は72 時 間 後 までは 宿 主 細 胞 質 に 残 っており、96 時 間後 に 全 てが 消 化 または 排 出 された。また、 同 様 の 現象 がゾウリムシにおいても 観 察 されたことから、ミドリゾウリムシとゾウリムシには 餌 になるものとならないものを 識 別 する 能 力 があると 考 えられた。さらに 共 生 藻 が 持 つ 食 胞 からの 脱 出 に 関 わる 物 質の 探 索 のため、シンビオティック 細 胞 (OS1g 株 ) から単 離 した 共 生 藻 を 各 種 酵 素 、 熱 、pHで 処 理 したときの 影 響 を 調 べた。その 結 果 、コントロールの 無 処 理と 比 較 してα-マンノシダーゼで6 時 間 処 理 した 場 合 約15%、β-グルコシダーゼで6 時 間 処 理 した 場 合 約 30%感 染 率 が 低 下 することが 明 らかになった。プロテナーゼKやリパーゼPNで 処 理 した 場 合 は 感 染 率 の 低下 が 見 られなかったので、Reisser et al. (1982)と 同 様に 細 胞 壁 表 面 の 糖 が 細 胞 内 共 生 成 立 のために 必 要 である 可 能 性 が 示 唆 された。[ 文 献 ]1) Kodama, Y. and Fujishima, M. Protoplasma (in press).2) Reisser, W., Radunz, A. and Wiessner, W. (1982)Cytobios 33, 39-50.3) Suzaki, T., Omura, G. and Görtz, H-D. (2003) Jpn. J.Protozool. 36(1), 17-18.クロレラ、 大 腸 菌 、テトラヒメナから 成 るマイクロコズムにおけるクロレラ-テトラヒメナの 細 胞 内 共 生 関 係 の 形 成 過 程佐 野 明 子 1 , 松 岡 秀 哲 2 , 中 島 敏 幸2 ( 1 愛 媛 大 ・ 院 理 工 , 2 愛 媛 大 ・ 理 )Ecological process of producing endosymbiotic relation between Chlorella vulgarisand Tetrahymena thermophila in microcosm composed of C. vulgaris, E. coli, andT. thermophilaAkiko SANO 1 , Hideaki MATSUOKA 2 , Toshiyuki NAKAJIMA 2( 1 Grad. Sch. Sci.and Eng. Ehime Univ., 2 Fac. Sci., Ehime Univ.)SUMMARYA microcosm composed of three species, including algae (Chlorella vulgaris), bacteria (Escherichia coli), and protozoa(Tetrahymena thermophila, containing two different mating type), was fabricated to investigate an ecological processproducing the evolution of endosymbiotic relation between algal and protozoan cells. The microcosm, containing 250 mlculture medium in a glass-bottle, was cultured over 1,200 days under 12h-light/12h-dark condition at 30°C. T. thermophilacells containing algal cells within the vacuoles (TC cells, hereafter) were observed from the beginning of microcosmculture, whose frequency was maintained around 50% in the T. thermophila population until about 100th day.However, the TC cells increased in the frequency in the population, which reached about 90% until about 260th day, andmaintained the frequency during the experimental period. Measurements of dynamical changes in other components of

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)89the microcosm revealed that photosynthetic activity of the algal population began to decline after 60th day, and bacterialactivity of decomposing the detritus of dead cells began to increase after that. These indicate that the concentration ofDO (dissolved oxygen) in the microcosm decreased at the late phase of the microcosm culture. These results and otherdata suggest the possibility that TC cells increased in frequency due to an adaptive advantage of obtaining oxygen fromintracellular algae in a low DO environment.[ 目 的 ] 細 胞 内 共 生 は 生 物 が 環 境 に 適 応 し 進 化 していくための 有 力 な 手 段 であると 考 えられている 1) 。しかし、 異 種 の 生 物 同 士 が 出 会 い、 細 胞 内 共 生 という 密接 な 関 係 を 築 き 上 げるまでの 生 態 学 的 な 過 程 は 未 だ解 明 されていない。 自 然 生 態 系 において、 生 物 が 長い 世 代 をかけて 進 化 する 過 程 を 追 跡 することは 現 実的 に 不 可 能 だが、 世 代 時 間 の 短 い 微 生 物 が 構 成 する実 験 群 集 を 用 いることにより 有 効 な 実 験 モデルを 構築 することができる 2) 。 本 研 究 では、クロレラ、 大 腸菌 、テトラヒメナから 成 るCETマイクロコズムを 作成 し 約 1200 日 以 上 にわたって 培 養 したところ、 細 胞内 にクロレラを 取 り 込 みこれを 生 きたまま 保 持 したテトラヒメナ( 以 下 、C-テトラ)の 出 現 が 確 認 された。このマイクロコズムを 細 胞 内 共 生 関 係 の 成 立 する 初 期 過 程 を 解 析 するための 実 験 モデルとして 用い、 細 胞 内 共 生 の 成 立 に 影 響 を 及 ぼす 生 態 学 的 要 因の 解 明 を 試 みた。[ 材 料 と 方 法 ] クロレラ(Chlorella vulgaris), 大 腸 菌(Escherichia coli ME7767 (F - )), テ トラヒ メ ナ(Tetrahymena thermophila CU427 (mating type Ⅶ)、CU438 (mating type Ⅳ))の3 種 を 無 機 塩 培 地 に 接 種 し、温 度 30°C、 照 度 3000 lux( 明 12 h、 暗 12 h)の 条 件 で静 置 培 養 した。この 系 (CETマイクロコズム)において、 特 にクロレラフリーの 正 常 テトラヒメナ ( 以下 、N-テトラ)とC-テトラの 挙 動 及 びその 他 の 構 成個 体 群 の 動 態 との 関 係 を 解 析 した。[ 結 果 と 考 察 ] CETマイクロコズムの 培 養 開 始 後 1 日目 にはすでにC-テトラの 出 現 が 確 認 された。テトラヒメナ 個 体 群 中 のC-テトラの 割 合 は、 培 養 日 数 が 約100 日 目 までは50%を 中 心 に 変 動 した。その 後 C-テトラの 割 合 は 増 加 し、 約 200 日 目 以 降 は 約 85%の 高 い 割合 で 安 定 した。また、テトラヒメナの 全 個 体 数 は 培養 開 始 後 約 100 日 目 まで 増 加 したが、その 後 やや 減 少し 約 200 日 以 降 は 定 常 状 態 を 保 った。 一 方 、 他 の 構 成種 は 以 下 の 挙 動 を 示 した。 培 養 液 中 のクロレラの 生細 胞 数 は 培 養 開 始 後 約 60 日 目 まで 増 加 したが、その後 死 細 胞 数 の 増 加 に 伴 って 生 細 胞 数 が 減 少 し、 約 200日 以 降 は 死 細 胞 数 が 生 細 胞 数 を 上 回 った 状 態 で 安 定した。 大 腸 菌 の 生 菌 数 は 培 養 開 始 後 約 100 日 目 までは低 密 度 だった が、その 後 大 幅 に 増 加 し 約 200 日 目 以降 は 高 密 度 で 安 定 した。 以 上 の 結 果 から、 約 200 日目 以 降 は、クロレラの 生 細 胞 数 が 減 少 し 死 細 胞 数 が増 加 したことによって、クロレラの 光 合 成 量 が 減 少し 酸 素 の 供 給 量 が 低 下 したと 考 えられる。また 大 腸菌 の 増 殖 活 性 が 増 大 したことによって、 大 腸 菌 の 呼吸 量 が 増 加 し 酸 素 の 消 費 量 が 増 加 したと 考 えられる。このことから、 約 200 日 目 以 降 のマイクロコズム内 の 溶 存 酸 素 濃 度 は 低 濃 度 であったと 考 えられる。約 200 日 目 以 降 にC-テトラの 割 合 が 増 加 したことについて、C-テトラが 細 胞 内 のクロレラから 酸 素 の 供 給を 得 ることができ、 貧 酸 素 下 においてN-テトラよりも 適 応 的 に 有 利 であったため 増 加 した 可 能 性 が 考 えられる。そこで、クロレラの 光 合 成 活 性 がC-テトラの 割 合 に 及 ぼす 影 響 を 調 べるために、 培 養 開 始 後 449日 目 のCETマイクロコズムを24 時 間 光 照 射 下 に 移 した。その 結 果 、C-テトラの 割 合 は 約 20% 減 少 した。クロレラの 生 細 胞 数 は 約 3 倍 に 増 加 したことから、クロレラの 光 合 成 量 が 増 加 しマイクロコズム 内 の 溶 存酸 素 濃 度 が 上 昇 したと 考 えられる。これによって、貧 酸 素 条 件 におけるN-テトラ 対 するC-テトラの 有 利性 がなくなりC-テトラの 割 合 が 減 少 した 可 能 性 が 考えられる。また、 溶 存 酸 素 濃 度 が 充 分 (もしくは 高濃 度 )である 時 に 細 胞 内 にクロレラをもつことがテトラヒメナにとってコストになっている 可 能 性 も 考えられる。また、 培 養 開 始 後 462 日 目 のCETマイクロコズムを 新 たな 無 機 塩 培 地 に 植 え 継 ぐと、C-テトラは 培 養 初 期 から 約 80%の 割 合 で 出 現 した。このことは、 長 期 間 培 養 したことによってテトラヒメナがクロレラをより 保 持 しやすい 形 質 を 獲 得 した 可 能 性 を示 唆 している。 以 上 の 結 果 から、 細 胞 内 共 生 体 の 初期 の 出 現 に 関 しては 摂 食 時 にエサと 共 に 共 生 者 を 取りこんだことがきっかけであると 考 えられるが、 共生 体 の 割 合 が 増 加 するメカニズムについては 生 態 系の 生 物 群 集 動 態 や 物 質 循 環 と 密 接 な 関 係 があることが 示 唆 された。また、 共 生 者 保 持 率 の 増 大 や 共 生 体の 適 応 度 の 増 大 などの 進 化 的 な 要 因 が 深 く 関 係 して

90 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年いる 可 能 性 が 示 唆 された。[ 文 献 ]1) Lynn Margulis & Dorion Sagan. (1997) MICROCSMS.University of California Press2) 中 島 敏 幸 、 稲 森 悠 平 、 遠 藤 銀 朗 、 川 端 善 一 郎 、 栗原 康 . (1998) Microbes and Environments. Vol. 13,No.4 : 217-233核 内 共 生 細 菌 ホロスポラオブツサの 先 端 領 域 特 異 的 モノクローナル 抗 体 とゾウリムシアクチン 特 異 的 モノクローナル 抗 体 によるホロスポラオブツサ 感 染 過 程 の 解 析岩 谷 綱 一 1 , 仲 慶 晃 1 , 中 村 欽 光 1 , 道 羅 英 夫 2 , 堀 学 1 ,B. Franz LANG 3 ,GertraudBURGER 3 , 藤 島 政 博1 ( 1 山 口 大 ・ 理 ・ 生 物 , 2 静 岡 大 ・ 遺 伝 子 実 験 施 設 , 3 Universitéde Montréal, Départment de Biochimie, Canadian Institute for Advanced Research)Investigation of Infection Process of Holospora obtusa with Monoclonal AntibodiesSpecific for Special Tip of the Bacterium and for Actin of the HostParamecium caudatumKoichi IWATANI 1 , Yoshiaki NAKA 1 , Yoshimitsu NAKAMURA 1 , Hideo DOHRA 2 , Manabu HORI 1 ,B. Franz LANG 3 , Gertraud BURGER 3 , Masahiro FUJISHIMA 1( 1 Biol. Inst., Fac. Sci., Yamaguchi Univ. 2 Insti. Genet. Res. & Biotech., Shizuoka Univ. 3 Université deMontréal, Départment de Biochimie, Canadian Institute for Advanced Research)SUMMARYThe endosymbiotic bacterium Holospora obtusa infects the macronucleus of the ciliate Paramacium caudatum. Thisbacterium enters into the target nucleus with a tip of the periplasmic region first, but never with the other tip, suggestingthat this special tip may have an important function for infection. In order to clarify the substances in the special tip, amonoclonal antibody against the tip was developed, and the antigen of 89k was purified from 2D-SDS-PAGE gel of thebacteria. After determination of the partial amino acid sequence of the 89k protein, a gene coding the protein was clonedfrom the bacterial genome using oligonucleotides against the amino acid sequence of 89k protein as proves. The ORF ofthe protein encoded 750 amino acids and possessed two actin-binding motifs at the N-terminal. Indirect immunofluorescencemicroscopy with an anti-P. caudatum actin antibody and anti-89 k antibody labeled the bacteria escaped from thehost digestive vacuoles into the cytoplasm. The anti-89k antibody also labeled several dots on the macronuclear envelopeif the nuclei were infected with the bacteria. Transmission electron microscopy showed fibrous materials around the tipin infection. Correlation between the 89k protein and the host actin was discussed.[ 目 的 ] ゾウリムシの 大 核 内 共 生 細 菌 ホロスポラオブツサ(オブツサ)の 感 染 型 は 細 胞 質 領 域 とペリプラズム 領 域 で 二 分 された 細 胞 であり、 透 過 型 電 子 顕 微 鏡(TEM)でペリプラズム 領 域 の 先 端 に 電 子 密 度 の 低 い特 殊 な 末 端 領 域 (Tip)が 観 察 される。 感 染 型 はTipを 先頭 にして 大 核 に 感 染 するため、Tipが 感 染 で 重 要 な 役割 を 演 じていると 予 測 される。 一 方 、リステリア 等の 細 胞 内 寄 生 細 菌 はアクチンテールを 誘 導 して 宿 主

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)91細 胞 質 内 を 移 動 する。 宿 主 細 胞 質 のオブツサ 周 囲 にも 同 様 な 構 造 が 報 告 されているが、アクチンの 存 在は 証 明 されていない。 我 々は、 感 染 過 程 でのTipと 宿主 アクチンの 関 与 を 明 らかにするため、 特 殊 な 末 端特 異 的 モノクローナル 抗 体 ( 抗 89k)とゾウリムシアクチン 特 異 的 モノクローナル 抗 体 ( 抗 PA)を 作 成 し、 間接 蛍 光 抗 体 法 とTEMで 感 染 過 程 を 調 べ、 特 殊 な 末 端物 質 の 遺 伝 子 をクローニングし 機 能 を 推 測 した。[ 材 料 と 方 法 ] Tipには60-90kDaの 物 質 の 存 在 が 明 らかにされていた 為 ( 福 井 ら、 未 発 表 )、 感 染 型 のSDS-PAGEの60-90kDaのゲル 抽 出 物 を 抗 89kの 抗 原 として、 抗 PAはマウスアクチンと 相 同 性 の 低 い 部 分 の11アミノ 酸 にBSAを 結 合 させた 合 成 ペプチドを 抗 原 として、それぞれモノクローナル 抗 体 産 生 ハイブリドーマを 作 成 した。Tip 抗 原 (89k)は、 抗 89kで、 特 定した 感 染 型 の 二 次 元 電 気 泳 動 ゲル 上 の 抗 原 スポットをゲル 抽 出 して 部 分 アミノ 酸 配 列 を 決 定 して 塩 基 配列 を 推 定 した。この 塩 基 配 列 から 設 計 したプライマーで89k 遺 伝 子 の 一 部 をゲノムDNAからPCRで 増 幅し、89kの 全 アミノ 酸 配 列 を 推 定 し、 相 同 性 検 索 した。 感 染 過 程 の89kの 動 態 は、オブツサを 感 染 させたゾウリムシを 一 定 時 間 後 にNP-40で 処 理 し、 固 定 して一 次 抗 体 の 抗 89k、 二 次 抗 体 の 蛍 光 標 識 抗 マウスIgGで 処 理 後 、 観 察 した。 大 核 侵 入 時 の89kの 動 態 は、 感染 後 のゾウリムシを、 一 定 時 間 後 に 固 定 し、ホモジナイズして 大 核 を 露 出 させ、 同 様 に 処 理 して 観 察 した。また、 感 染 後 のゾウリムシを、 抗 PAでpre-stainする 場 合 はメタノール 固 定 後 、 金 コロイド 標 識 抗 マウスIgAIgMIgGを 二 次 抗 体 として 使 用 し、 一 般 染 色の 場 合 はアルデヒド 混 液 と1%オスミウム 酸 で 二 重 固定 し、いずれもスパー 樹 脂 に 包 埋 し、 薄 切 後 、TEMで 観 察 した。[ 結 果 と 考 察 ] 89k 遺 伝 子 は2253 bp、GT 含 量 は32.5%であり、 細 胞 内 共 生 細 菌 や 寄 生 細 菌 に 共 通 するATrichであった。89kは、 動 物 と 植 物 細 胞 中 では 核 に 存在 する 可 能 性 が 示 され、 相 同 性 検 索 では 細 胞 骨 格 関連 蛋 白 質 が20% 前 後 の 相 同 性 を 示 し、N 末 端 に2 箇 所のアクチン 結 合 モチーフの 可 能 性 が 示 唆 された。ゾウリムシに 感 染 した 全 オブツサの89k 反 応 部 位 は 間 接蛍 光 抗 体 法 で 次 ぎの4つに 分 類 できた。:(A)Tip、(B)Tipとペリプラズム 領 域 、(C)ペリプラズム 領 域 のTipに 近 い 部 分 、および(D)ペリプラズム 領 域 中 央 部 から細 胞 質 領 域 に 近 い 部 分 。A、B、CおよびDは、 感 染15 分 には7.5、8.4、1.4 および 0.1%、 感 染 30 分 には4.3、8.0、2.0および1.0%、 感 染 60 分 には3.5、5.2、4.7および 1.7%、 感 染 24 時 間 には0.1、0.2、0.0 および0.1%であった。89kは 感 染 中 に 一 部 の 菌 体 でTipに 表出 され、 感 染 後 の 時 間 と 共 に 細 胞 質 領 域 側 に 移 動 すると 考 えられた。 大 核 侵 入 中 のオブツサでは、 感 染15、30および60 分 でそれぞれ71、65および46%が89kの 蛍 光 を 大 核 膜 との 接 点 付 近 に 現 わした。 従 って、89kは 大 核 侵 入 中 の 菌 体 と 大 核 膜 との 接 点 付 近 に 表 出し、 菌 体 の 大 核 内 侵 入 に 従 い 菌 体 の 後 方 に 移 動 すると 考 えられた。TEMでは、 食 胞 脱 出 時 のオブツサには、 食 胞 周 囲 に 一 部 ゾウリムシアクチン 陽 性 の 雲 状構 造 が 見 られ、Tipでは 菌 体 から 直 接 、 繊 維 状 構 造 が形 成 されていた。 大 核 侵 入 時 にもTipに 繊 維 状 構 造 が見 られたが、 雲 状 構 造 は 見 られなかった。 繊 維 状 構造 は 直 径 約 10nmであったことから、アクチン 繊 維 か中 間 径 繊 維 と 考 えられた。 以 上 の 結 果 から、89kは、オブツサが 宿 主 に 取 り 込 まれてから 菌 体 表 面 に 表 出し、アクチン 結 合 モチーフでアクチン 繊 維 の 形 成 に関 与 し、 菌 体 が 大 核 内 に 侵 入 する 際 には 大 核 膜 との接 点 に 位 置 して 菌 体 を 核 内 に 移 動 させるのではないかと 考 えられた。[ 文 献 ]1) Fujishima, M. & Fujita, M. (1985) J. Cell Sci., 76: 179-187.2) Görtz, H. D. & Wiemann, M. (1989) Europ. J. Protistol.,24:101-109.3) Gouin, G., et al., (1999) J. Cell Sci., 112:1697-1708.

92 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年小 核 特 異 的 共 生 細 菌 Holospora elegans は、 宿 主 Paramecium caudatum のストレス 応 答 遺 伝 子 の 発 現 を 不 可 逆 的 に 促 進 する堀 学 , 藤 井 貴 美 子 , 藤 島 政 博 ( 山 口 大 ・ 理 ・ 生 物 科 学 )Micronucleus-specific bacterium Holospora elegans enhances stress geneexpressions of the host Paramecium caudatum ireversivelyManabu HORI, Kimiko FUJII and Masahiro FUJISHIMA(Dept. of Biosci., Fac. of Sci., Yamaguchi Univ.)SUMMARYThe bacterium Holospora elegans is a micronuclear-specific symbiont of the ciliate Paramecium caudatum. H.elegans-bearing paramecia could survive well compared with Holospora-free paramecia under the heat shock condition.And symbiont-bearing paramecia expressed high levels of hsp60 and hsp70 mRNA even at 25°C. To determine whetherinfection with H. elegans confers heat shock resistance on its host, we had prepared aposymbiotic paramecia that removedthe symbiont with penicillin. However, aposymbiotic paramecia could survive at 37°C and also express highlevels of hsp60 and hsp70 mRNA at 25°C. Furthermore, in order to determine whether unknown substance originatedfrom H. elegans is in a micronucleus, we had established amicronucleate cell that removed a micronucleus from aposymbioticcell by microsurgery. Surprisingly, amicronucleate cells still expressed high levels of hsp60 and hsp70 mRNA assame as aposymbiotic cells. These results suggest that the host Paramecium was made to transform the heat-toleranceireversivly by H. elegans.[ 背 景 ] 大 核 特 異 的 共 生 細 菌 Holospora obtusaを 維 持しているゾウリムシは、 維 持 していないゾウリムシに 比 べて、 様 々なストレスに 対 して 耐 性 を 示 すことがわかっている。 又 、 共 生 細 菌 を 維 持 しているゾウリムシでは、ストレス 応 答 タンパク 質 であるhsp60やhsp70 遺 伝 子 が、 過 剰 に 発 現 していることから、ストレス 耐 性 との 因 果 関 係 が 示 唆 される。 更 に、 人 為 的感 染 実 験 から、hsp60, 70 遺 伝 子 の 過 剰 発 現 は、 共 生細 菌 の 感 染 直 後 から 起 こり、 共 生 細 菌 の 除 去 によって、 正 常 のレベルに 戻 る 可 逆 的 な 変 化 であることもわかっている。ところが 最 近 、 我 々は、 小 核 特 異 的 な 共 生 細 菌 であるH. elegansをペニシリンによって 除 去 したゾウリムシにも、 共 生 細 菌 を 維 持 しているゾウリムシと 同様 の 熱 抵 抗 性 が 維 持 されていることを 見 つけた。このことは、H. elegansが、 小 核 内 で 宿 主 ゾウリムシの形 質 を 変 化 させるだけでなく、 共 生 細 菌 が 存 在 しなくなっても、その 影 響 が 維 持 され 続 けること( 形 質転 換 )を 意 味 している。そこで、 我 々は、この 形 質 転 換 の 仕 組 みを 調 べることを 目 的 に 本 研 究 を 行 っている。[ 結 果 と 考 察 ] 大 核 特 異 的 共 生 細 菌 H. obtusa、 及 び、小 核 特 異 的 共 生 細 菌 H. elagansとH. undulataを 用 いて、 共 生 細 菌 を 維 持 したゾウリムシと 維 持 しないゾウリムシ、 共 生 細 菌 をペニシリンによって 除 去 したゾウリムシの 熱 抵 抗 性 を 比 較 した。その 結 果 、 小 核特 異 的 共 生 細 菌 のどちらを 維 持 していたゾウリムシも、 薬 剤 で 共 生 細 菌 を 除 去 した 後 でも、 共 生 細 菌 を維 持 しているゾウリムシと 維 持 していないゾウリムシの 中 間 くらいの 熱 抵 抗 性 を 示 すことがわかった。更 に、 前 述 の3つの 状 態 にあるゾウリムシのストレス 応 答 遺 伝 子 (hsp60, hsp70) の 発 現 量 について、Competitive PCRによって 調 べたところ、 熱 抵 抗 性 の結 果 を 裏 付 けるように、 小 核 特 異 的 共 生 細 菌 を 薬 剤で 除 去 したゾウリムシでも、 宿 主 のhsp60, 70 遺 伝 子が、 高 発 現 していた。この 結 果 は、 小 核 特 異 的 共 生細 菌 由 来 、 或 いは、 細 菌 が 小 核 に 感 染 したことによって、 何 らかの 因 子 が 宿 主 のストレス 応 答 遺 伝 子の 発 現 に 不 可 逆 的 な 変 化 を 引 き 起 こしたことを 示 唆している。そこで、 宿 主 の 遺 伝 子 発 現 を 促 進 している 因 子が、 小 核 に 存 在 しているのかどうかを 確 かめるために、 薬 剤 でH. elegansを 除 去 したゾウリムシの 小 核 を

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)93一 部 の 大 核 核 質 とともに 除 去 した。その 結 果 、 得 られた 無 小 核 の 細 胞 は、 熱 抵 抗 性 も、hsp60, 70 遺 伝 子の 過 剰 発 現 も、 小 核 を 除 去 する 前 のゾウリムシと 差異 が 認 められなかった。このことは、 小 核 特 異 的 共生 細 菌 が 感 染 すると、 宿 主 大 核 に 作 用 し、 大 核 の 遺伝 子 発 現 調 節 系 を 改 変 してしまうということを 示 唆している。では、 何 が、 宿 主 の 遺 伝 子 発 現 を 不 可 逆 的 に 促 進しているのかを 調 べるために、H. elegans の 感 染 している 小 核 核 質 と H. elegans のゲノム DNA を 共 生 細 菌を 維 持 していないゾウリムシの 大 核 に 注 射 して、その 影 響 を 調 べた。その 結 果 、 小 核 核 質 を 注 射 したゾウリムシでは、hsp60, 70 遺 伝 子 の 発 現 に 大 きな 変 化はなかったが、H. elegans のゲノム DNA を 注 射 したゾウリムシでは、hsp60, 70の 遺 伝 子 発 現 量 に 増 加 が見 られた。以 上 の 結 果 から、 小 核 特 異 的 共 生 細 菌 にのみ 見 られる、 一 度 、 共 生 細 菌 が 感 染 したゾウリムシでは、不 可 逆 的 にストレス 応 答 遺 伝 子 の 過 剰 発 現 し 続 けるという 現 象 は、 以 下 のような 仮 説 が 考 えられる。 小核 から 共 生 細 菌 のゲノム DNA、 或 いは、その 断 片が、 何 らかの 経 路 で 大 核 に 移 行 し、テロメアが 付 加されて 維 持 されている。しかし、この DNA は、ゾウリムシにとっては、 異 物 であるため、ストレス 応 答が 誘 導 され 続 けている。そして、その 結 果 、 過 剰 なストレス 応 答 遺 伝 子 群 が、 様 々なストレスに 対 して、 素 早 く 対 応 できたために、ストレス 耐 性 として検 出 されたのではないかと 考 えられる。[ 文 献 ]Hori, M. and Fujishima, M. (2003) J. Eukaryot. Microbiol.,Vol. 50, No. 4, pp. 293–298.繊 毛 虫 ブレファリズマの II 型 細 胞 で 接 合 誘 導 時 に 発 現 する 遺 伝 子 の 単 離田 中 悠 里 1 , 杉 浦 真 由 美 2 2, 春 本 晃 江( 1 奈 良 女 子 大 ・ 院 ・ 生 物 科 学 , 2 奈 良 女 子 大 ・ 院 ・ 共 生 自 然 科 学 )Cloning of the genes specifically expressed during the induction of conjugation inmating type II cells of Blepharisma japonicumYuri TANAKA 1 , Mayumi SUGIURA 2 and Terue HARUMOTO 2 ( 1 Division of Biological Science,Guraduate School of Human Culture, Nara Women's University, 2 Department of Biological Scienceand Enviroment, Graduate School of Human Culture, Nara Women's University)SUMMARYConjugation of Blepharisma japonicum is induced by interaction between complementary mating-type cells I and II.Both mating-type cells which received complementary gamones undergo morphological changes and start to unite. It wasreported that protein synthesis drastically increased during this time, and this protein synthesis was indispensable for theformation of conjugating pairs. However, it is still unknown the genes expressed specifically in the induction of conjugation.To identify genes involved in these processes, we isolated genes expressed specifically in conjugation-induced typeII cells by a cDNA subtraction method. To induce mating-pairs, we treated type II cells for 4 hours with cell-free fluid oftype I cells containing gamone 1, then purified polyA + RNA. PolyA + RNA was subjected to cDNA synthesis, and thecDNA was subtracted between such treated cells and untreated cells.We have done subtraction twice and obtained 8products. We sequenced some of them. Homology search revealed that the two of these fragments showed significanthomology to CDK family (Cdc2 and Cdk2). Northern hybridization demonstrated that the transcription occurred specificallyduring the induction of conjugation. We also found that the transcript already appeared 2 hours after gamone 1treatment.

94 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年[ 目 的 ] 繊 毛 虫 ブレファリズマの 接 合 は、 適 度 な 飢 餓状 態 におかれたI 型 細 胞 が 分 泌 するガモン1によって開 始 される。このガモン1を 受 け 取 ったII 型 細 胞 では、ガモン2の 合 成 と 分 泌 、 細 胞 形 態 の 変 化 、 細 胞 間の 接 着 といった 現 象 が 引 き 起 こされる。この 時 新 たなタンパク 質 の 合 成 が 開 始 され、このタンパク 質 合成 が 接 合 対 の 形 成 に 不 可 欠 であることがすでに 報 告されている 1),2) 。しかし、どのような 遺 伝 子 が 発 現し、 接 合 誘 導 機 構 とどのように 関 連 しているのかについてはまだ 情 報 が 得 られていない。接 合 の 引 き 金 因 子 であるガモン1の 刺 激 により、II型 細 胞 内 で 活 性 化 され 細 胞 を 接 合 に 導 く 遺 伝 子 の 同定 が、 接 合 誘 導 機 構 を 解 明 する 上 で 重 要 であると 考え、 本 研 究 ではcDNAサブトラクション 法 を 用 いて、ブレファリズマのII 型 細 胞 がガモン1による 接 合 誘 導時 に 特 異 的 に 発 現 する 遺 伝 子 の 単 離 を 行 った。また、ノーザンハイブリダイゼーション 法 を 用 いて 候補 遺 伝 子 の 発 現 の 確 認 を 行 った。[ 材 料 と 方 法 ] 細 胞 はBlepharisma japonicumのR48 株( 接 合 型 II 型 )を 用 いた。 初 期 定 常 期 の 細 胞 を 生 理的 塩 類 溶 液 であるSMB 中 に 一 晩 置 いて 飢 餓 状 態 にし、その 後 二 つに 分 けた。 一 方 にのみ、ガモン1の含 まれるI 型 細 胞 の 細 胞 外 液 (10 3 U/ml)を 加 えて 接合 を 誘 導 させ、Testerとした。もう 一 方 をDriverとして、SMB 中 でそのまま 置 き、4 時 間 後 それぞれの 細 胞を 回 収 してpolyA + RNAを 精 製 した。PCR select cDNA subtraction kit(Clontech)を 用 いて サ ブトラクショ ンを 行 った。 精 製 したTesterとDriverそれぞれのpolyA + RNAから 合 成 したcDNAを 制限 酵 素 (Rsa I) 処 理 した 後 、TesterのcDNAを 二 つに分 け、それぞれに 異 なるアダプター 配 列 をライゲーションした。 二 段 階 のハイブリダイゼーション 操 作により、Testerに 特 異 的 な 配 列 同 士 が 別 々のアダプターを1つずつもつ2 本 鎖 を 形 成 すると 期 待 されるので、この 分 子 の 末 端 を2 本 鎖 に 伸 長 し、PCRで 両 端 に別 々のアダプターをもった 分 子 だけを 選 択 的 に 増 幅した。 得 られたバンドを 切 り 出 してクローニングし、シークエンスを 行 った。サブトラクションによって 得 られた 候 補 遺 伝 子 の発 現 を 確 認 するために、サブトラクションから 得 られた 各 配 列 で 作 製 したプローブを 用 い、TesterとDriverの 両 細 胞 からtotal RNAを 抽 出 してノーザンハイブリダイゼーションを 行 った。また、ガモン1を 含む 細 胞 外 液 で 未 処 理 、2 時 間 処 理 、4 時 間 処 理 を 行 った 各 細 胞 のtotal RNAを 抽 出 してノーザンハイブリダイゼーションを 行 い、 遺 伝 子 の 発 現 パターンの 検 出を 試 みた。[ 結 果 と 考 察 ] 2 回 のサブトラクションの 結 果 、8つの遺 伝 子 断 片 を 得 た(Product A, B, C, D, E, F, G, H)。それらの 断 片 のうち5つ(A, B, C, F, H)のシークエンスを 行 い、 以 下 の 結 果 が 得 られた。Product A(432 bp)は、 様 々な 生 物 のCDKファミリー(Cdc2, Cdk2)との 相 同 性 が 示 された。ProductB(249 bp)は、Product Aの 配 列 の 一 部 と 完 全 に 一 致した。Product C (140 bp)は、 大 部 分 に3 塩 基 の 繰 り返 し 配 列 が 存 在 し、 相 同 性 のある 遺 伝 子 は 見 つからなかった。Product F (564 bp)は、169アミノ 酸 残 基のORFをもっていたが、 相 同 性 の 高 い 遺 伝 子 はみられ ず、 新 規 のタンパク 質 であ ると 示 唆 された。Product H のバンドには、 芳 香 族 アミノ 酸 の 合 成 経 路に 関 わる 酵 素 として 知 られている4-hydroxyphenylpyruvatedioxygenase (4-HPPD)と 相 同 性 のある 配 列(258 bp)、そして 部 分 的 にCyclin dependent kinaseregulatory subunit (Cks) と 相 同 性 のあ る 配 列 (227bp)の 二 つのPCR 産 物 が 含 まれていた。ノーザンハイブリダイゼーションを 用 いた 解 析 により、Product Aの 転 写 産 物 が 接 合 誘 導 時 に 特 異 的 に発 現 していることが 確 認 された。また、ガモン1 処理 をしてから2 時 間 後 にすでにこの 遺 伝 子 が 転 写 されていることが 示 された。今 後 、この 遺 伝 子 が 接 合 誘 導 時 にどのように 関わっているのか、その 機 能 を 調 べるとともに、 他 の候 補 遺 伝 子 についてもノーザンハイブリダイゼーションを 行 い 発 現 を 調 べる 必 要 がある。[ 文 献 ]1) 春 本 晃 江 , 杉 浦 真 由 美 (2003)ブレファリズマの接 合 . 原 生 動 物 学 雑 誌 , 36(2), 147-172.2) Miyake, A. (1981) Cell Interaction by Gamones inBlepharisma. Sexual Interactions in Eukaryotic Microbes,pp. 95-129.

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)95ミトコンドリアプラスミドを 使 ったゾウリムシ 形 質 転 換 系 の 開 発天 野 太 郎 1 , 矢 崎 和 盛 2 , 西 川 義 尚 1 , 月 井 雄 二2 ( 1 東 海 大 ・ 工 , 2 法 政 大 ・ 自 然 科 学 センター)Development of a transformation system with mitochondrial plasmidsfor Paramecium caudatumTaro AMANO 1 , Kazumori YAZAKI 2 , Yoshihisa NISHIKAWA 1 and Yuuji TSUKII 2( 1 Sch. of Eng., Tokai Univ., 2 Sci. Res. Ctr., Hosei Univ.)SUMMARYMitochondrial plasmids found in Paramecium caudatum in 1994 have been so far studied for their structure, but theirphysiological functions are still unknown. To clarify this, we attempted to introduce isolated plasmid DNA into plasmidfreerecipient cells. Cells were treated with ice-cold calcium chloride and the plasmid DNA. After the treatment, cellswere cultured for about three weeks, and then DNA was isolated from the cells to conduct PCR using primers constructedfrom known sequences of the plasmid (type Ia). As a result, plasmid-specific sequences were amplified from theisolated DNAs in 7/61 samples, indicating that plasmid DNA was introduced into the recipients. Furthermore, plasmidspecificsequences were detected in cells which were cultured for three months after the treatment, suggesting that importedplasmids can multiply within the recipient cells. Fractionation of the cells suggests that the imported plasmids arepresent in the cytoplasm (outside of mitochondria).[ 目 的 ] 従 来 ミトコンドリアプラスミド(mt-p)は、 植 物 、 菌 類 では 報 告 されていたが、 動 物 細 胞 としては 初 めて 繊 毛 虫 ゾウリムシ(P. caudatum)で 発見 された。ゾウリムシの mt-p は、ミトコンドリアDNA と 相 同 性 が 無 く、プラスミドを 持 つ 株 と 持 たない 株 がいる。また、 電 子 顕 微 鏡 による 解 析 やプラスミド type Ia での 全 塩 基 配 列 の 決 定 などの 様 々な 構 造解 析 が 行 われてきたが、これまでに 生 理 学 的 機 能 は明 らかにされていない。 今 回 生 理 学 的 機 能 を 明 らかにすることを 目 的 として、プラスミドを 持 たない 株にプラスミドを 導 入 する 系 の 開 発 を 試 みた。[ 材 料 と 方 法 ] (1)プラスミドの 導 入 : donor には、ゾウリムシ mt-p の type Ia を 持 つ 野 生 株 Sh42、recipient には、プラスミドを 持 たない 野 生 株 Cy 2 を使 用 した。 定 常 期 の recipient の 細 胞 を 遠 心 し、 集 めた 細 胞 (0.5 ml) に、30 mM CaCl 2 を 約 2 ml 加 えて 30分 0℃で 懸 濁 させた。 再 度 遠 心 し、 上 澄 みを 捨 て、Sh42 株 から 抽 出 した mt-p(1.0 ml、 約 0.16 ~ 0.21µg)を 加 え、30 分 0℃で 懸 濁 し、その 後 培 養 液 を 加え、 室 温 で 2 ~ 3 週 間 培 養 した。(2) 導 入 プラスミドの 検 出 : 高 橋 ら(2001)が 決 定したプラスミドの 全 塩 基 配 列 からプライマーを 作 成し、mt-p を 検 出 するための 分 子 マーカーとして 利 用した。プラスミド 導 入 後 (1 ヶ 月 以 内 )、ミトコンドリアから DNA を 回 収 し、 上 記 のプライマーでプラスミドの 有 無 を 確 認 した。さらに PCR で 陽 性 となった 細 胞 群 を 2 ~ 3 ヶ 月 培 養 した 後 、クローンを 単 離した。(3) 導 入 プラスミドの 所 在 の 確 認 : 陽 性 のクローンを、 大 量 培 養 し、ミトコンドリア 内 とその 他 (ミトコンドリア 以 外 )の DNA に 分 け、DNA の 確 認 、PCR を 行 った。さらに 単 離 した 細 胞 を、 月 井 の 方 法により、 核 ( 大 、 小 核 )の 沈 澱 と 混 合 物 ( 核 以 外 の細 胞 質 )の 各 々から DNA を 抽 出 し、PCR を 行 った。[ 結 果 及 び 考 察 ] (1) 導 入 プラスミドの 検 出 : 塩 化カルシウムと mt-p で 処 理 し、 細 胞 群 を 2 ~ 3 週 間 培養 した 後 、 細 胞 全 体 から 抽 出 した DNA を 鋳 型 として PCR を 行 ったところ 7/61 サンプルにおいて 増 幅 が確 認 できた。(2) 導 入 プラスミドの 増 幅 :(1)で PCR 陽 性 の細 胞 群 から 細 胞 を 3 ヶ 月 以 上 培 養 した 後 の 細 胞 群 から 576 クローンを 作 成 し、PCR を 行 った 結 果 、4/576陽 性 クローンを 得 た。

96原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年(3)プラスミドの 所 在 :この 導 入 体 の 何 処 に mt-pが 存 在 しているのかを 確 かめるため、ミトコンドリアとその 他 (ミトコンドリア 以 外 )の 分 画 から DNAを 抽 出 し、アガロース 電 気 泳 動 したが、いずれの 分画 からもプラスミドのバンドは 確 認 できなかった。しかし、PCR を 行 ったところ、その 他 (ミトコンドリア 以 外 )の 分 画 から 抽 出 した DNA においてのみ 増幅 が 確 認 できた。 次 に、 同 じ 細 胞 を 核 ( 大 、 小 核 )とその 他 ( 核 以 外 の 細 胞 質 )の 各 々から 抽 出 したDNA を 鋳 型 として PCR を 行 ったところ、 核 分 画 からは 増 幅 は 起 きず、その 他 ( 核 以 外 の 細 胞 質 )の 方からのみ 増 幅 が 確 認 された。これらのことから、 導入 されたプラスミドは、 核 およびミトコンドリアいずれでも 無 く、 細 胞 質 内 で 維 持 、 複 製 されていることが 示 唆 される。また、mt-p の 複 製 については、ミトコンドリアを構 成 しているタンパク 質 はリボソ−ムで 作 られてからミトコンドリアに 輸 送 される。この 輸 送 過 程 において mt-p が、 複 製 に 必 要 なタンパク 質 を 使 っている 可能 性 が 考 えられる。 今 後 は mt-p の 複 製 過 程 および 細胞 内 での 動 態 を 明 らかにするとともに、mt-p 導 入 体をスクリーニングする 手 法 を 開 発 して、mt-p をベクターとして 利 用 する 形 質 転 換 系 を 目 指 す。[ 文 献 ]矢 崎 和 盛 研 究 報 告 集 京 都 臨 床 医 学 総 合 研 究 所 , p1-8 (2001)Tsukii. Y. Eup. J. Protistol., 32, 165-169 (1996)Tsukii, Y., Endoh, H. and Yazaki, K. Jpn. J. Genet., 69,685-696 (1994)繊 毛 虫 Tetrahymena thermophila における 非 ミトコンドリアcitrate synthase 遺 伝 子 とその 偽 遺 伝 子 の 構 造 解 析< 大 核 から 小 核 への RNA を 介 した 遺 伝 情 報 の 逆 流 >向 敦 史 ( 金 沢 大 学 ・ 院 自 然 ・ 生 命 科 学 )A reverse flow of genetic information from the somatic Mac to germinal mic suggestedby the presence of a processed pseudogene of a glyoxysomal citrate synthasegene in Tetrahymena thermophilaAtsushi MUKAI (Div. Life Sci., Grad. Sch. Natural Sci. and Technol., Kanazawa Univ.)SUMMARYTwo glyoxysomal citrate synthase genes, a functional gene and a pseudogene, were identified in Tetrahymena thermophila.Phylogenetic analysis revealed that this gene was directly derived from bacteria such as green sulfur bacteria orproteobacteria via lateral gene transfer (LGT). On the other hand, the pseudogene was characterized by the loss of introns.The absence of the introns indicates a duplication from the functional counterpart via mRNA intermediate. Thediscovery of a processed pseudogene suggests that genetic information reversely moves from the macronucleus to micronucleusmediated by reverse transcription. Because of the low fidelity of reverse transcriptase, this direction of geneflow may facilitate acceleration of the evolutionary rate of protein-coding genes in ciliates by accumulating mutationsinto the micronuclear gene via homologous recombination.

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)97[ 目 的 ] クエン 酸 合 成 酵 素 (CS) はミトコンドリアのTCA cycle において、acetyl-CoA とオキサロ 酢 酸 からクエン 酸 を 合 成 する 酵 素 として 働 いている。 一 方 、菌 類 ではペルオキシソーム、 植 物 ではグリオキシソームに 存 在 する glyoxylate cycle においても、CS が働 いていることも 知 られている。 前 回 Tetrahymenathermophila から 得 られた CS 遺 伝 子 (tgCS) の 配 列は、すでに 報 告 のあるミトコンドリアのものとは 低い 相 同 性 しか 示 さず、バクテリアの CS と 高 い 相 同性 を 示 した。このことから、この 遺 伝 子 はバクテリアから 遺 伝 子 水 平 伝 播 (LGT) によって 獲 得 したものだと 考 えられる。 今 回 、この tgCS 遺 伝 子 や、その 偽遺 伝 子 の 解 析 を 進 め、T. thermophila の 進 化 の 過 程 を探 ることを 目 的 とした。[ 材 料 と 方 法 ] T. thermophila (CU813 and CU428) を 用いた。この 株 は P. J. Brouns (Cornell Univ.) から 頂 いた。Sepasol-RNA super (Nakarai Tesque) により totalRNA を 抽 出 し、3', 5' R'ACE RT-PCR を SMARTcDNA synthesis kit (Clonetch) を 用 い、 遺 伝 子 の cDNA全 長 を 得 た。また、inverse PCR によって、genomicの 配 列 と pseudo gene の 部 分 配 列 を 得 た。 系 統 樹 の 作成 は PHYLIP package の PROTPARS program (MP),PROML program (ML) を 用 いた。Bootstrap の 計 算は、 同 package の SEQBOOT program により 計 算 した。Southern blot analysis は EcoRI- 完 全 分 解 totalDNA を 10 mg 用 い、tgCS の 部 分 配 列 を[a-(32)P]dTTP でラベルし Probe とし、low-stringency conditionで Hybridization を 行 った。Northern blot analysis においても 同 probe を 用 いた。[ 結 果 と 考 察 ] 今 回 得 られた cDNA 配 列 の 全 長 から 推定 されるアミノ 酸 配 列 を 解 析 したところ、N 末 端 にperoxisome targeting signal (PTS-2) の 配 列 がみつかった。このことから、この 配 列 が glyoxylate cycle で 働くクエン 酸 合 成 酵 素 をコードしている 遺 伝 子 であると 考 えられ、tgCS と 名 付 けた。また、この 配 列 の 系統 解 析 の 結 果 、 大 多 数 の 真 核 生 物 由 来 の 配 列 は 高 いbootstrap 値 で 単 系 統 であることが 示 された。しかし、tgCS は、このクレードには 含 まれず、 少 数 の 真核 生 物 のものとともに proteobacteria や green sulfurbacteria と 高 い bootstrap 値 で 単 一 クレードを 形 成 した。さらに、Southern blot の 結 果 から、 近 縁 の 繊 毛 虫には T. malaccensis を 除 き、この 配 列 に 相 同 性 のあるものが 存 在 しないことが 示 唆 された。これらのことから、tgCS 配 列 はバクテリアの 遺 伝 子 が 遺 伝 子 水 平伝 播 (LGT) によって 移 行 してきたものと 考 えられる。こ の LGT の 過 程 について(Recent LGT) と(Ancient LGT and multiple loss) の2つのモデルをたてた。一 方 、inverse PCR によって、genomic の tgCS 配 列とともに、この 遺 伝 子 の pseudogene の 部 分 配 列 が 得られた。 配 列 解 析 をおこなった 結 果 、こ のpseudogene の 配 列 から intron が 除 かれていることが判 明 した。このことから、この 配 列 が processed pseudogeneであると 考 えられた。processed pseudogene はmRNA を 介 した 逆 転 写 によってできる cDNA が 生 殖系 列 のゲノムに 入 り 込 むことで 形 成 される。 逆 転 写酵 素 の 活 性 は、T. thermophila やスタイロニキア、ゾウリムシにおいて、すでに 報 告 がなされている。さらに、この processed pseudogene の 存 在 により、T.thermophila における 大 核 から 小 核 への 遺 伝 情 報 の 逆流 が 示 唆 される。以 前 から、 繊 毛 虫 の 遺 伝 子 を 用 い 系 統 樹 を 作 成 すると 系 統 関 係 を 反 映 しない 結 果 となることが 度 々 報告 されており、 繊 毛 虫 の 遺 伝 子 の 進 化 速 度 が 大 きいということが 指 摘 されてきた。この 進 化 速 度 が 加 速されるメカニズムの 説 明 として、 逆 転 写 酵 素 と 遺 伝情 報 の 逆 流 が 関 与 しているというモデルが 提 唱 されている。つまり processed pseudogene の 存 在 は、このモデルを 支 持 する 証 拠 と 考 えることができる。[ 文 献 ]Mukai, A. and Endoh, H. (2004) J Mol Evol., 58: 540-49.Nugent, JM. and Palmer, JD. (1991) Cell., 66: 473-81.Endoh, H. (1994) Jpn. J. Protozool., 27: 55.

98 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年ゾウリムシのミニミニゲノムプロジェクト:高 度 にパッケージされた 大 核 DNA 構 造木 村 直 美 ( 金 沢 大 ・ 院 自 然 ・ 生 命 科 学 )Highly clustered gene organization in the Paramecium caudatum somaticmacronuclear genomeNaomi KIMURA (Department of Biology, Faculty of Science, Kanazawa University)SUMMARYEach cell of Paramecium caudatum has a somatic macronucleus and a germinal micronucleus. Ploidy of the macronucleusis approximately 3,400n (Soldo et al., 1981) and assure all gene expression. So far, only 25 genes in P. caudatumhave been registered in database (NCBI). To expect the overall structure of the P. caudatum somatic genome, I randomlycloned 6 fragments of the macronuclear DNA ranging from 6 to 10 kb, and sequenced totally ~50 kb. Sequenceanalysis revealed at least 24 known and potential protein-coding genes, suggesting highly cluster gene organization.Most of the the genes were arranged in the same direction beside one gene, and intergenic regions are short (42-1212 bp).All of introns identified in this study are also short, as expected previously. This pilot genome analysis suggests that P.caudatum retains the highest coding density (78%) on chromosomes among eukaryotes including P. tetraurelia (74%)and budding yeast (70%). This clustered organization must be the result of adaptation for achieving an extremely highcopy number (3,400 copies) in the macronucleus.[ 目 的 ] 繊 毛 虫 ゾウリムシは 形 態 ・ 機 能 共 にことなる2 種 類 の 核 ( 大 核 と 小 核 )を 持 っている。 大 核 は、 細胞 の 増 殖 や 維 持 のための 転 写 をおこなう 特 化 した 高度 倍 数 性 の 核 で、 各 遺 伝 子 が 平 均 3400 コピーあると報 告 されている 1) 。 一 方 、 小 核 は 接 合 開 始 後 まもなく減 数 分 裂 を 行 い、 受 精 核 形 成 を 経 て 次 の 世 代 の 新 大核 と 新 小 核 を 形 成 する。 古 くから 様 々な 研 究 に 用 いられているゾウリムシであるが、 小 核 と 大 核 のゲノム 構 造 は、ほとんど 明 らかになっていない。 一 方 、ゾウリムシの 近 縁 種 であるヒメゾウリムシでは、 大核 ゲノムの74% がコードされた 領 域 ( 遺 伝 子 領 域 )で、 少 なくとも30,000 遺 伝 子 あることが 報 告 されている 2) 。 本 研 究 の 目 的 は、 大 核 DNA 断 片 のクローニング・ 塩 基 配 列 の 決 定 ・ 解 析 から 得 られた 情 報 をもとに、ゾウリムシの 大 核 ゲノム 構 造 を 明 らかにすることである。[ 材 料 と 方 法 ] ゾ ウリムシ(Paramecium caudatum)syngen3 に 属 する 野 生 型 株 KNZ 2( 接 合 型 E)を 使用 し、 培 養 は、25±1°C でおこなった。ゾウリムシの大 核 ゲノム 構 造 を 明 らかにするため、 細 胞 からトータル DNA を 抽 出 し、1トータル DNA を 制 限 酵 素(AluI)で 切 断 した 約 300 bp の 断 片 2トータルDNA を 制 限 酵 素 (BamHI, PstI)で 切 断 した 約 6-10kb の 領 域 、この2つの DNA を 回 収 し、ランダムにクローニングした。それぞれ(1 32 クローン 26 クローン)の 塩 基 配 列 を 決 定 し、 解 析 を 行 った。[ 結 果 と 考 察 ] ゾウリムシの 大 核 ゲノム 構 造 を 明 らかにするために、DNA 塩 基 配 列 の 解 析 を 試 みた。はじめに、 制 限 酵 素 (AluI) 処 理 をおこなったトータルDNA をランダムにクローニングした。 相 同 性 検 索(GenomeNet, Blast) を 行 った 結 果 から、クローン 化 した32のうち24クローンで、 予 想 遺 伝 子 コード 領 域 がみつかった。これは 非 常 に 高 い 確 率 で、 単 純 に 考 えると 大 核 DNA の75%がコード 領 域 である 可 能 性 が 示唆 された。このことは、 遺 伝 子 が 高 密 度 でコードされていることを 示 唆 している。そこで、この 可 能 性を 検 証 するため、より 長 い DNA 配 列 を 解 析 し、 複 数の 遺 伝 子 が 密 にコードされているのかを 検 証 した。約 6-10kb の DNA をランダムにクローニングし、このうち6クローン( 合 計 約 50 Kb)の 塩 基 配 列 を 決 定した。すると、それぞれの DNA 断 片 には、 平 均 約 4個 の 予 想 遺 伝 子 コード 領 域 があり、 各 遺 伝 子 間 の 領

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)99域 は、42bp ~1212bp だった。このことから、ゾウリムシの 大 核 DNA には、 高 密 度 に 遺 伝 子 が 並 んでいることが 明 らかになった。 通 常 、 真 核 生 物 では、 遺 伝子 がゲノム 中 に 散 在 し、 原 核 生 物 では、 密 であるという 特 徴 から 考 えると、ゾウリムシは、どちらかというと 原 核 生 物 に 近 い 遺 伝 子 の 配 置 をしているということがわかった。 今 回 明 らかにした DNA 配 列 は、約 50 K でこの DNA 配 列 中 に 予 想 遺 伝 子 コード 領 域と 考 えられる 箇 所 は 少 なくとも24 箇 所 だった。さらに、この 予 想 遺 伝 子 コード 領 域 は、 今 回 明 らかにした DNA 配 列 ( 約 50 Kb)の78.2%であった。これは、 遺 伝 子 密 度 が 高 いと 報 告 されている 真 核 生 物(ヒメゾウリムシや yeast)よりも 高 い 結 果 であった。また、 約 50 K の DNA 配 列 の G + C content は30.6%で、コード 領 域 では34.4%、 非 コード 領 域 では26.8%をいう 解 析 結 果 も 得 られた。 加 えて、24の 予 想遺 伝 子 領 域 のうち3つの 遺 伝 子 についてイントロンである 箇 所 が 明 らかになり、それらの 平 均 値 は、24.3nt だった。ゲノムサイズ/ 遺 伝 子 数 で 計 算 する 遺 伝子 密 度 ( 遺 伝 子 が 高 密 度 にコードされているほど 小さい 値 )は、2.08と 言 う 結 果 になった。この 値 は、遺 伝 子 が 密 にコードされていることが 知 られているyeast( 遺 伝 子 密 度 :2.09)と 同 じくらいであった。また、 近 年 Zagulski らによって 解 析 された 近 縁 種 であるヒメゾウリムシとは、 非 常 に 似 たゲノム 構 造 をしていることが 明 らかになった 2) 。ゾウリムシの 大 核 DNA に 遺 伝 子 が 高 密 度 にパッケージされているということは、おそらく 小 核 DNAから 大 核 DNA へ 再 配 列 した 結 果 であると 考 えられ、小 核 ゲノム 中 には 遺 伝 子 が 散 在 しているか、 密 なコード 領 域 と 長 い 非 コード 領 域 があるという 可 能 性が 推 測 できる。さらに、ゾウリムシは、 進 化 の 過 程で、 単 純 に DNA 量 を 増 加 させたのではなく、 大 核 当たりの 遺 伝 子 コピー 数 を 増 加 させるために 遺 伝 子 領域 が 高 密 度 になるという 適 応 進 化 があったのではないかと 推 察 できる。[ 文 献 ]1) Soldo, A. T., Brichson, S.A., Larin, F. (1981)J.Protozool. 28: 377-383.2) Zagulski et al. (2004) Current Biol. 14: 1397-1404.ゾウリムシ 大 核 ゲノムへの 改 造 Tc1 トランスポゾンの 転 移中 山 早 苗 ( 金 沢 大 ・ 院 自 然 ・ 生 命 科 学 )Transposition of artificial Tc1 transposon into macronuclear genome in ParameciumSanae NAKAYAMA (Div. of Life Sci., Grad. Sch. of Natural Sci. and Technol., Kanazawa Univ.)SUMMARYIn the ciliate, Paramecium tetraurelia, thousands of internal eliminated sequences (TA-IESs) are excised from thegerm-line micronuclear DNA during macronuclear differentiation. Based on the resemblance of TA-IES end sequencesto Tc1 transposon termini, it has been proposed that TA-IESs might have degenerately evolved from Tc1 family transposons.To know the mechanism of the transposon invasion into macronuclear genome and evolutionally into the micronucleargenome, using a Tetrahymena metallothionein gene (MTT1) UTR as a promoter, I constructed an artificial Tc1transposon which can move within the genome of Paramecium. After plasmids carrying the artificial Tc1 transposonwas microinjected into the macronucleus of P. caudatum, the injected cell were treated with CdCl 2 , expression of theTc1A transposase was confirmed by RT-PCR, indicating that the MTT1 promoter is functional in P. caudatum. Althoughnot so efficient, successful amplification of the introduced transposon suggests that transposition into the macronuclergenome did occur. The ultimate aim of this study is to make a reproduction of an evolutionary process in labora-

100 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年tory from invasion and fixation of transposons. The first step of this study has been cleared by the success of the artificialtransposon.[ 目 的 ] 繊 毛 虫 は 一 つの 細 胞 質 中 に 2 種 類 の 核 、 小 核( 生 殖 核 ) と 大 核 ( 栄 養 核 ) をもつ。 有 性 生 殖 である接 合 では、 次 世 代 の 大 核 は 小 核 から 分 化 ( 核 分 化 )する。 大 核 分 化 では 大 規 模 な DNA の 再 編 成 が 行 われ、 機 能 的 な 大 核 ゲノムが 再 構 成 される。このときに 除 去 されてしまう 小 核 特 異 的 配 列 を、 総 称 して 内部 除 去 配 列 (IES: Internal eliminated sequences) とよぶ。ヒメゾウリムシの IES (TA-IES) はその 構 造 的 特徴 から、かつて 小 核 ゲノムに 侵 入 した Tc1 ファミリーのトランスポゾンが 退 化 した DNA 配 列 であると 考 えられている (1)。 私 は、トランスポゾンの 侵入 は 小 核 よりも 大 核 の 方 が 起 こりやすいのではないかと 考 えた。トランスポゾンは 先 ず 大 核 に 侵 入 してコピーを 増 やした 後 、やがて 小 核 に 転 移 したのではないだろうか。そこで、 私 は 線 虫 由 来 の Tc1 トランスポゾン (2) をゾウリムシ 大 核 内 で 強 制 的 に 転 移 させ、IES の 進 化 の 再 現 を 図 ることを 試 みた。[ 材 料 と 方 法 ] 重 金 属 イオンの 存 在 下 で 発 現 するテトラヒメナのメタロチオネイン 遺 伝 子 のプロモーター(2) を 用 いて、ゾ ウリムシの 大 核 内 で 転 移 酵 素(Tc1A transposase) を 発 現 する 改 造 Tc1 トランスポゾンを 構 築 した。メタロチオネイン 遺 伝 子 の 5’ 領 域2.5 kb (プロモーターを 含 む) と 3’ 領 域 0.3 kb (ポリA 付 加 シグナルを 含 む) をそれぞれ Tc1A gene の 上下 流 に 挿 入 し、ストップコドン TAA を 繊 毛 虫 のストップコドン TGA に 置 き 換 えた。さらに、インジェクションしたプラスミドがゾウリムシの 大 核 内 で 維持 されるように、ベクターにテロメア 配 列 を 挿 入 した。 制 限 酵 素 処 理 によって 両 末 端 にテロメア 配 列 を持 つ 線 状 プラスミドとし、ゾウリムシの 大 核 にマイクロインジェクションした。プラスミドの 存 在 は 3細 胞 を 鋳 型 とした PCR によって 確 認 した。Tc1Agene の 発 現 は、 細 胞 を 0.5 µg/ml 塩 化 カドミウムで 処理 して 誘 導 し、 発 現 の 確 認 は RT-PCR 法 を 用 いて行 った。 改 造 Tc1 トランスポゾンの 転 移 の 確 認 は、PCR 法 とゲノミックサザンハイブリダイゼーションを 用 いて 行 った。[ 結 果 と 考 察 ] ゾウリムシの 大 核 内 での Tc1A gene の発 現 が、RT-PCR 法 によって 確 認 された。このことから、テトラヒメナのメタロチオネインプロモーターがゾウリムシでも 有 効 であることが 確 認 された。また、PCR 法 とゲノミックサザンハイブリダイゼーションによって、 改 造 Tc1 トランスポゾンのゲノムへの 転 移 が 示 唆 された。しかし、 直 接 的 な 証 拠は 得 られなかった。トランスポゾンの 転 移 は、ほぼランダムに 行 われるため、ゲノムへの 転 移 を 確 認 するには、 増 幅 した 上 で 検 出 する 方 法 が 必 要 である。その 一 つの 方 法 として、 現 在 はインバース PCR 法 による 挿 入 サイトの 検 出 を 検 討 している。一 方 で、 細 胞 分 裂 が 進 むうちにプラスミドの 検 出が 困 難 になった。このことから、ゾウリムシの 大 核内 で、インジェクションしたプラスミドが 維 持 されていないことが 明 らかになった。この 結 果 は 他 の 繊毛 虫 の 報 告 と 異 なっている。 強 制 的 に 高 効 率 な 改 造トランスポゾンの 転 移 を 行 うには、 高 コピーのトランスポゾンの 存 在 と、 高 効 率 な 転 移 酵 素 の 発 現 が 必須 である。 今 後 は 大 核 内 でのプラスミドの 高 コピーの 維 持 と、Tc1A 転 移 酵 素 の 高 い 発 現 量 の 条 件 についての 改 善 が 必 要 である。現 在 考 えられている IES の 除 去 システムの ScanRNA theory (4) と IES のトランスポゾン 起 源 説 には 矛盾 がある。 改 造 トランスポゾンの 動 向 を 追 うことで、この 矛 盾 を 解 く 糸 口 がみつかるのではないかと期 待 している。[ 文 献 ]1) Klobutcher, LA. and Herrick, G. (1997) Nucleic AcidsRes. and Mol. Biol. 56: 1-62.2) Vos, JC., Van Luenen, HGAM. and Plasterk, RHA.(1993) Genes & Dev. 7: 1244-1253.3) Shang, Y. et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(6): 3734-3739.4) Mochizuki, K. et al. (2002) Cell 110 (6): 689-699.

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)101SH 基 修 飾 試 薬 によるカルケシウムスパズモネーム 収 縮 阻 害 とその 阻 害 200 kDa タンパク 質Fang, Jie, 中 島 淳 , 板 橋 岳 志 , 浅 井 博 ( 早 稲 田 大 ・ 院 理 工 )Contraction deficiency of Carchesium polypinum by SH-modifying reagentand its 200 kDa proteinJie FANG, Jyun NAKAYAMA, Takeshi ITABASHI and Hiroshi ASAI(Dept. Life Sci. Grad. Sch. Sci. Eng. Waseda Univ.)SUMMARYIt has been thought for a long time that the chemical modification of cysteine amino acid residues in Vorticellidaespasmonemes does not cause any loss in Ca 2+ -driven contractility. One of the reasons is that spasmin, which belongs toone of the calmodulin superfamilies, and is the most important protein in contractile spasmonemes, does not contain anycysteine residues. Another reason is that nobody, including us, has used glycerinated Carchesium sp. for contractilityexperiments. It is well known that an old stalk of Carchesium sp. is easily and naturally deteriorated and loses its contractility.We have recently succeeded in collecting many young colonies of C. polypinum and cultivating them in thepresence of Chlamydomonas reinhardtii and bacteria as food. We have tried to modify the young stalks of glycerinatedC. polypinum using DAM (N-7-dimethyl-amino-4-methyl-coumarinyl-maleimide) as a fluorescent cysteine-group modifyingreagent. We discovered that the contractility was significantly reduced even in young stalks of C. polypinum.The spasmoneme in a stalk of C. polypinum was fluorescently labeled. On the other hand, the spasmoneme in a stalk ofVorticella sp. was not fluorescently labeled. A 200 kDa protein extracted from Carchesium spasmonemes was alsofluorescently labeled. These results mean that both the novel 200 kDa protein and spasmin, as a Ca 2+ -binding protein,play important roles for spasmoneme contraction. In another experiment, a novel 50 kDa protein in the spasmoneme ofVorticella sp. was found to be important for its contraction. It is thus suggested that the 200 kDa protein in Carchesiumspasmonemes is evolutionarily a tetrameric form of the 50 kDa protein in Vorticella spasmonemes.[ 目 的 ] ツリガネムシの 柄 (ストーク)の 内 部 には、スパズモネームと 呼 ばれるカルシウムイオ(Ca 2+ )励 起 収 縮 性 繊 維 の 束 が 存 在 する。ツリガネムシには、 一 本 の 柄 のみを 持 つ 孤 立 形 (Vorticella sp.)と、枝 分 かれ 形 (Carchesium sp. と Zoothamnium sp.)の三 種 ある。ところで、1958 年 の Hoffmann-Berling による 研 究 以 来 、スパズモネームの Ca 2+ 励 起 収 縮 には、SH(システイン)アミノ 酸 残 基 は 重 要 でない、と 考 えられていた。 我 々や Amos らも 孤 立 形 ツリガネムシ(Vorticella sp.)や 枝 分 かれツリガネムシの 一 種 である Zoothamnium sp. のグリセリンモデルを 用 いて 同 様 の 結 果 を 得 ている。しかし、 他 の 種 の枝 分 かれツリガネムシの Carchesium sp. についての結 果 の 確 認 は 誰 もされてこなかった。その 理 由 は、枝 分 かれの 多 い 古 いカルケシウムは、 自 然 に 変 性 しやすくグリセリンモデルは 不 適 と 考 えられたからである。 最 近 、クラミドモナスの 共 存 下 で Carchesiumpolypinum を 安 定 長 期 的 の 培 養 する 方 法 を 確 立 した(1)。そこで、 若 い 数 個 の 枝 分 かれストークのみから成 るグリセリンモデルを 多 量 に 採 集 することに 成 功した。 念 のために、 若 いカルケシウムのグリセリンモデルを 用 いてスパズモネームの SH アミノ 酸 残 基の 化 学 修 飾 を 試 みたところ、Ca 2+ 励 起 収 縮 性 の 喪 失が 起 きた。 本 論 文 は、 偶 然 のこの 研 究 成 果 をまとめたものである。[ 材 料 と 方 法 ] 蛍 光 性 のSH 残 基 修 飾 試 薬 として、 和光 純 薬 製 の N-7-dimethyl-amino-4-methyl-coumarinylmaleimide(DACM) を 用 いた。Carchesium polypinumの 培 養 は、 餌 としてのバクテリアとクラミドモナスの 共 存 下 で 行 われた。Vorticella sp. の 培 養 は、 餌 としてのバクテリアの 存 在 下 で 行 われた。 比 較 的 虫 体 の

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)103繊 毛 虫 Spirostomum ambiguum のセントリン 様 タンパク 質 の 分 布高 橋 暢 朗 1 , 石 田 秀 樹 1 2, 増 山 悦 子( 1 島 根 大 ・ 生 物 資 源 科 ・ 生 物 科 学 , 2 広 島 女 子 大 学 ・ 健 康 科 学 科 )Distribution of centrin-like proteins in the ciliate Spirostomum ambiguumNoburo TAKAHASHI 1 , Hideki ISHIDA 1 and Etsuko MASUYAMA 2 ( 1 Dep. Biol. Sci., Fac. Life andEnviron. Sci., Shimane Univ., 2 Dep. Health Sci., Hiroshima Pref. Women's Univ.)SUMMARYThe large heterotrichous ciliate Spirostomum is known for its remarkable rapid cell contraction that is triggered byexternal stimuli, and the cytoskeleton-based motile systems of contraction and subsequent re-elongation have been studiedin order to understand its underlying molecular machineries. The myoneme in the cortex is thought to generate theforce for the Ca 2+ -dependent contraction, and may be similar to the spasmoneme in the stalk of Vorticella. In Vorticella,an antibody to centrin 1 has been reported to recognize the spasmoneme. In view of these facts, we have examined thepossible existence of centrin in Spirostomum using immunohistological and immunobiochemical techniques. The specimensof Spirostomum were electrophoresed and blotted, and the antibody to centrin 1 specifically stained a single bandof 18 kDa in an extract of Spirostomum. When frozen thin sections of Spirostomum were stained with anti-centrin 1,fluorescent signal or deposits of tetramethylbenzidine (TMB) substrate were detected at the cell cortex. These resultssuggest that a centrin 1-like protein may exist in the cortex of Spirostomum. Further studies with electron microscopy areneeded to understand the precise localization of the centrin 1-like protein in Spirostomum.[ 目 的 ] 繊 毛 虫 Spirostomum は 外 部 からの 様 々な 刺 激に 対 して 非 常 に 速 い 収 縮 を 示 す。この 収 縮 運 動 は 細胞 皮 層 に 存 在 する myoneme によるものであると 考 えられている。Myoneme による Spirostomum の 収 縮 はアクチン-ミオシン 系 とは 異 なる 運 動 系 で、 収 縮 にATP を 必 要 とせず 収 縮 には 細 胞 内 の Ca 2+ 濃 度 が 関 係していると 考 えられている。この 収 縮 はツリガネムシの 柄 の 収 縮 と 類 似 のものであると 考 えられている。ツリガネムシの 柄 にはスパスミンと 呼 ばれるCa 2+ 結 合 タンパク 質 が 存 在 しており、Carchesiumpolypinum のスパスミンから 精 製 した 抗 体 と Spirostomumは 交 差 反 応 を 示 す(Ochiai et al., 1988)。 近年 、スパスミンと 同 様 に Ca 2+ 結 合 能 を 持 ち、 種 々の真 核 生 物 に 広 く 存 在 するセントリンの 一 次 構 造 が、スパスミンの 一 次 構 造 と 類 似 していることが 明 らかになった(Itabashi et al., 2003)。 以 上 より myonemeはセントリンやスパスミンに 類 似 したタンパク 質 である 可 能 性 が 高 いと 考 えられる。そこで 抗 セントリン 抗 体 を 用 いて、イムノブロット 法 、 免 疫 組 織 染 色法 により Spirostomum における Ca 2+ 結 合 タンパク 質の 検 出 を 試 みた。[ 材 料 と 方 法 ] 実 験 動 物 には 多 膜 綱 、 異 毛 目 に 属 する Spirostomum ambiguum を 用 いた。 細 胞 の 凍 結 切 片を 作 製 し、 抗 体 染 色 を 行 った。 酵 素 抗 体 染 色 は 内 因性 ペルオキシダーゼ 失 活 処 理 を 行 い、 次 に 正 常 ヤギ血 清 でブロッキングを 行 い、1 次 抗 体 を 反 応 させた。 次 にビオチン 化 2 次 抗 体 を 反 応 させ、アビジン-ビオチン 複 合 体 を 反 応 させた。テトラメチルベンジジンで 発 色 させ、 封 入 後 観 察 した。 蛍 光 抗 体 染色 は 抗 ウサギ IgG ヤギ 抗 体 でブロッキングを 行 い、1 次 抗 体 を 反 応 させた。 次 に 2 次 抗 体 (FITC 標 識 抗 ウサギ IgG) を 反 応 させ、 封 入 し 観 察 をした。SDS-PAGE は Laemmli 法 に 従 って 行 った。 分 離 ゲルは 8%または 10 ~ 20%グラディエントゲルを 用 いた。イムノブロッティングは 泳 動 の 終 わったゲルを PVDF 膜にトランスファーした 後 、ブロッキングを 行 い、1次 抗 体 、2 次 抗 体 (HRP 標 識 抗 ウサギ IgG) 反 応 を行 った。DAB で 発 色 させた 後 、 反 応 を 停 止 させた。1 次 抗 体 としてヒト centrin1 の C 末 端 合 成 ペプチドに対 するポリクローナルウサギ IgG と 脊 椎 動 物 骨 格 筋アクチンの C 末 端 11 残 基 合 成 ペプチドに 対 するポリクローナルウサギ IgG を 使 用 した。

104 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年[ 結 果 と 考 察 ] 抗 アクチン 抗 体 に 対 するイムノブロットでは 抗 アクチン 抗 体 と 交 差 したタンパク 質 は 分 子量 約 40.5 k のバンドのみであった。これは 骨 格 筋 アクチンの 平 均 的 な 分 子 量 42 k よりも 低 い 分 子 量 である。Tetrahymena など 一 部 の 原 生 動 物 のアクチンは 高等 動 物 の 骨 格 筋 アクチンとは 異 なる 性 質 を 示 し、アミノ 酸 配 列 の 相 同 性 も 低 いことが 知 られている。また Spirostomum のアクチン 様 タンパク 質 はテトラヒメ ナアクチ ン 抗 体 とも 反 応 性 が 異 なっておりSpirostomum は Tetrahymena とも 異 なった 独 自 のアクチンを 持 つと 考 えられる。 抗 アクチン 抗 体 による 細胞 染 色 では 繊 毛 列 部 分 を 含 む 細 胞 皮 層 部 、 波 動 膜 、大 核 の 周 囲 に 染 色 が 見 られた。 特 に 繊 毛 列 部 分 における 点 在 する 分 布 パターンから Spirostomum のアクチン 様 タンパク 質 は 繊 毛 基 部 とその 周 囲 に 分 布 していると 考 えられる。抗 セントリン 抗 体 に 対 するイムノブロットでは、抗 セントリン 抗 体 と 交 差 するバンドは 約 18 k のバンドのみであった。 一 般 的 なセントリンの 分 子 量 は 約20 k であり、Spirostomum のセントリン 様 タンパク 質はこれよりも 分 子 量 が 低 い。 抗 セントリン 抗 体 による 細 胞 染 色 では 抗 アクチン 抗 体 で 染 色 される 膜 表 層直 下 より 内 部 、つまり myoneme が 存 在 している 部 位である 細 胞 皮 層 部 に 染 色 が 見 られた。セントリンがCa 2+ 結 合 性 タンパク 質 であり、セントリン、スパスミン、myoneme の 類 似 性 を 考 えると 抗 セントリン 抗体 は myoneme を 検 出 している 可 能 性 が 考 えられる。しかし、 凍 結 切 片 では myoneme 束 が 明 確 な 構 造 として 確 認 できないため myoneme が 染 色 されているかは不 明 であり、 免 疫 電 子 顕 微 鏡 法 を 用 いてより 高 分 解能 でのセントリン 抗 体 結 合 タンパク 質 の 局 在 を 調 べる 必 要 がある。[ 文 献 ]1) T. Ochiai, M. Kato, T. Ogawa and H. Asai Expericntia44 (1988).2) T. Itabashi, K. Mikami and H. Asai Research in Microbiology154 (2003), 361-367.国 内 温 水 環 境 における 病 原 性 Naegleria 属 アメーバの 実 態八 木 田 健 司 1 , 下 河 原 理 江 子 1 , 朝 倉 登 喜 子 1 , 泉 山 信 司 1 , 黒 木 俊 郎 2 1, 遠 藤 卓 郎( 1 国 立 感 染 症 研 究 所 寄 生 動 物 部 , 2 神 奈 川 県 衛 生 研 究 所 微 生 物 部 )The occurrence of pathogenic Naegleria amoebae in thermal waters in JapanKenji YAGITA 1 , Rieko SHIMOGAWARA 1 , Tokiko ASAKURA 1 , Shinji IZUMIYAMA 1 , ToshiroKUROKO 2 and Takuro ENDO 1 ( 1 Dept. of Parasitol., Natl. Inst. of Infect. Dis., 2 Dept. of Microbiol.,Kanagawa Inst. of Public Health)A survey to document the presence of pathogenic Naegleria species was conducted for the thermal waters of 25prefectural areas in Japan. A tota1 of 1,173 samples were collected from hot springs, public spas and thermal dischargefrom those sources or industry. Test plates were incubated at 42°C for up to 3 days to isolate thermophilic Naegleriaspecies. Amoeba isolates were morphologically identified to genus level. Naegleria isolates were further characterizedgenetically by means of PCR/RFLP and DNA sequence analysis of Internal Transcribed Spacer (ITS) regions of ribosomalDNA. Amoebae were isolated from 357 (30.4%) of the total samples. Naegleria positive samples represented14.7% of the total samples. N. lovaniensis, a non-pathogenic species, was recovered from 20 out of 25 areas. AlthoughN. fowleri, a human pathogen, was not isolated from any samples tested, N. australiensis, experimentally fatal pathogento mice, was recovered from 10 areas, mostly isolated from thermal discharge samples with high level of bacteria. The

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)105prevalence of these amoeba was correlated with a concentration of residual chlorine of the samples. As the results ofpathogenicity test on N. australiensis strains, six of 16 strains killed the intracerebrally infected mice. Other 3 strainslimited to cause some types of abnormal behavior of the intracerebrally infected mice.[ 目 的 ] 高 温 耐 性 の Naegleria 属 アメーバにはヒト 感染 性 の 知 られる N. fowleri の 他 、 実 験 的 に 動 物 感 染 の成 立 する N. ausutlariensis、N. italica および N. philipinensisがある。 前 年 度 に 引 続 き、 国 内 温 水 環 境 ( 温泉 ・ 公 衆 浴 場 等 )におけるこれらのアメーバ 類 の 実態 調 査 を 行 い、N. ausutlariensis が 全 国 的 に 分 布 生 息すること 等 の 新 たな 疫 学 的 知 見 を 得 た。 動 物 感 染 実験 の 結 果 を 合 わせて、 実 態 調 査 の 結 果 を 報 告 する。[ 材 料 および 方 法 ] 調 査 地 域 は 全 国 25 地 域 ( 都 道 府県 単 位 )とし、 温 泉 原 水 、 浴 槽 水 、 温 排 水 等 を 試 料として 採 取 した。 試 料 採 取 時 に 残 留 塩 素 濃 度 等 浴 槽水 の 衛 星 管 理 に 関 する 聞 き 取 りを 行 った。アメーバ分 離 には 大 腸 菌 塗 布 寒 天 培 地 を 用 い、42°C 培 養 で 高温 耐 性 アメーバを 選 択 分 離 した。Naegleria 属 アメーバは 形 態 学 的 に 同 定 、 単 離 した 後 、18S rRNA の ITS領 域 のシークエンスで 詳 細 に 同 定 を 行 った。また 分離 株 の 病 原 性 の 試 験 では、ddy マウスへの 実 験 的 感染 ( 脳 内 接 種 、 経 鼻 接 種 )を 行 い、 致 死 性 、 行 動 異常 等 の 所 見 から 病 原 性 を 評 価 した。[ 結 果 および 考 察 ] 施 設 総 数 のべ 631、 試 料 総 数1,173 を 検 査 し 3,167 株 のアメーバを 分 離 、 同 定 した。 何 らかのアメーバが 検 出 された 試 料 数 は 357(30.4%)、ネグレリア 陽 性 試 料 数 は 173(14.7%)であった。 得 られた Naegleria 属 の 種 類 別 検 出 結 果 をみると、これまでと 同 様 、 非 病 原 性 種 の 代 表 である N.lovaniensis が 20 地 域 146 試 料 より 検 出 され、 優 占 種として 国 内 に 広 範 に 分 布 していた。 一 方 、ヒト 病 原性 の 明 らかな N. fowleri は、 本 年 度 も 検 出 されなかったが、 実 験 的 病 原 性 が 知 られる N. australiensis に 関しては、10 地 域 26 試 料 より 検 出 され、 全 国 的 に 広がっていることが 示 唆 された。また N. australiensisと 同 様 の 病 原 性 を 示 す N. italica および N. philippinensis(その近 縁 種 も 含 む)が 各 々 2 地 域 3 試 料 より分 離 された。 浴 槽 の 種 類 によるアメーバの 検 出 率は、 薬 湯 等 で 最 も 高 く(52.4%)、その 他 内 湯 等 が25 ~ 37%であった。また 塩 素 管 理 が 一 般 的 ではないかけ 流 し 浴 槽 の 方 が、 塩 素 管 理 の 普 及 している 循 環式 浴 槽 よりもアメーバ 検 出 率 が 高 いという 実 態 が 明らかとなった。Naegleria 属 に 限 定 しても 薬 湯 の 検 出率 は 26.2%と 最 も 高 く、N. australiensis は 4.8%であった。N. australiensis は 薬 湯 や 温 排 水 といった 特 に 細 菌汚 染 度 の 高 い 試 料 より 高 率 に 検 出 される 傾 向 が 見 られた。 今 回 の 調 査 では、レジオネラ 汚 染 防 止 を 目 的に 多 数 の 循 環 式 浴 槽 において 0.2 mg/L の 残 留 塩 素 管理 が 行 われていたが、 残 留 塩 素 0.2 mg/L 以 上 の 試 料ではアメーバ 検 出 率 は 大 きく 低 下 することが 明 らかとなった。Naegleria 属 の 病 原 性 試 験 の 結 果 は、N.australiensis に 関 しては 16 株 (10 地 域 より) 中 6 株(6 地 域 )が 脳 注 マウスに 対 する 致 死 的 病 原 性 を 示 したが、 経 鼻 感 染 および 皮 内 感 染 では 異 常 は 認 められなかった。また 他 の 3 株 は 持 続 的 な 行 動 異 常 のみを呈 する 病 原 性 が 脳 注 感 染 マウスでみ られた。N.philippinensis は 1 株 を 試 験 し、 脳 注 感 染 のマウスにおいて 致 死 的 病 原 性 が 見 られたものの、N. australiensisと 同 様 、 経 鼻 感 染 では 異 常 は 認 められなかった。N. ausutlariensis では 2 つの 株 を 試 験 したが、 何 ら 病 原 性 は 認 められなかった。温 泉 や 公 衆 浴 場 等 の 温 水 環 境 は、N. australiensis をはじめとする 病 原 性 アメーバ 類 に 汚 染 される 可 能 性があり、その 防 止 には 残 留 塩 素 濃 度 管 理 が 大 きく 関与 しているものと 考 えられた。

106 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年繊 毛 虫 の 放 出 体 (エクストルソーム)の 初 期 進 化三 宅 章 雄Early evolution of extrusomes in ciliatesAkio MIYAKESUMMARYPigment granules (pigmentocysts) are spherical, morphologically-simple extrusomes. They are widely distributedamong the two groups of primitive ciliates, heterotrichs and karyorelictids and carry out chemical defense against predatorsby means of the toxic pigments which they contain. Cortical granules are morphologically similar to pigment granulesand are widely present in heterotrichs. Some of them were found to carry out the chemical defense by means ofcolorless toxins. Based on these recent findings (Miyake, A., Jpn. J. Protozool., 35: 97-11, 2002) and previously knownstudies (Rosati, G. & Modeo, L., J. Eukaryot. Microbiol., 50: 383-402, 2003) on extrusomes, it was assumed that extrusomesin ciliates started as toxin-containing cortical granules and evolved as organelles of predator-prey interaction.[ 目 的 と 方 法 ] 各 種 の 放 出 体 の 繊 毛 虫 における 分 布や、 放 出 体 の 機 能 についての 新 しい 知 見 に 基 づき、繊 毛 虫 の 放 出 体 の 初 期 進 化 について 考 察 した。[ 考 察 ] ムコシストタイプの 放 出 体 は、 典 型 的 なムコシストのほか、 表 層 顆 粒 (cortical granules) や 色 素 顆粒 ( 色 素 を 持 った 表 層 顆 粒 )などを 含 み、 構 造 は 比較 的 簡 単 で、 繊 毛 虫 に 広 く 分 布 する。 一 方 、もっと複 雑 な 構 造 をもつ 特 殊 な 放 出 体 は 繊 毛 虫 の 特 定 のグループに 限 って 見 られる 傾 向 がある(1)。また、原 始 的 な 繊 毛 虫 とみなされる 原 始 大 核 類 と 異 毛 類 で最 も 普 通 な 放 出 体 は 表 層 顆 粒 と 色 素 顆 粒 で、ムコシストタイプのものである。そこで、 繊 毛 虫 の 放 出 体で 最 も 原 始 的 なものはムコシストタイプのもの、 特に 表 層 顆 粒 ではないかと 考 えられる。以 上 は 放 出 体 の 形 態 のみを 考 慮 した 考 察 であるが、さらに 放 出 体 の 機 能 を 考 慮 すればどうなるであろうか。トキシシスト( 毒 胞 )やハプトシストが 捕食 のための 攻 撃 の 機 能 をもつことは 古 くから 知 られていたが、 最 近 、トリコシスト、 表 層 顆 粒 および 色素 顆 粒 が 捕 食 者 に 対 する 防 御 の 機 能 をもつことが 明らかになった(2)。 色 素 顆 粒 は 異 毛 類 にしばしば見 られ、 原 始 大 核 類 には 一 層 広 く 見 られ、その 中 に含 まれる 色 素 に 強 い 毒 性 があり、これにより 化 学 的防 御 を 行 う(2)。 異 毛 類 ではクリマコストマムやスピロストマムなど 色 のないものも 多 いが、これらは 無 色 の 表 層 顆 粒 をもち、その 中 に 含 まれる 無 色 の毒 性 物 質 により 化 学 的 防 御 を 行 う(2)。これら 二 つの 機 能 、すなわち、1) 捕 食 者 の 獲 物に 対 する 攻 撃 、2) 捕 食 者 に 対 する 防 御 、のほか 色素 顆 粒 が 繊 毛 虫 の 光 に 対 する 反 応 における 光 受 容 の機 能 をもつことが 実 証 されている(2)が、 光 受 容機 能 をもつ 色 素 顆 粒 は 同 時 にまた 捕 食 者 に 対 する 化学 的 防 御 の 機 能 ももっている(2)。これらの 結 果を 一 般 化 し、 繊 毛 虫 の 放 出 体 は 攻 撃 か 防 御 あるいはその 両 方 の 機 能 をもった 細 胞 小 器 官 であるという 作業 仮 説 を 立 てると、 繊 毛 虫 の 放 出 体 は 捕 食 者 と 被 食者 の 間 の 相 互 作 用 を 行 うための 細 胞 小 器 官 として 進化 して 来 たという 統 一 的 な 見 解 が 得 られる。上 述 のように、 異 毛 類 の 表 層 顆 粒 は、 色 素 の 有 無に 関 わらず 捕 食 者 に 対 する 化 学 的 防 御 の 機 能 をもち、 最 も 原 始 的 な 繊 毛 虫 とされる 原 始 大 核 類 と 異 毛類 において 広 く 見 られ、 捕 食 者 に 対 する 化 学 的 防 御の 細 胞 小 器 官 として 機 能 している。これを 繊 毛 虫 のエクストロルソームの 原 始 的 な 状 態 とみなせば、 繊毛 虫 の 放 出 体 は、 最 初 は 表 層 顆 粒 のようなもので、その 中 に 含 まれる 毒 性 物 質 によって 捕 食 者 に 対 する化 学 的 防 御 を 行 っていたもので、この 機 能 を 維 持 したまま 各 種 の 放 出 体 を 作 り 出 して 来 たのではないかと 考 えられる。その 一 例 として、 光 受 容 の 機 能 をもった 色 素 顆 粒ができた 過 程 について 考 察 する。ここでは、 現 在 知られている 色 素 顆 粒 の 毒 性 色 素 はすべて 光 動 力 学 的作 用 (photodynamic action) をもっていることに 着 目

Jpn. J. Protozool. Vol. 38, No. 1. (2005)107する。このような 色 素 を 含 む 系 に 光 があたると 光 酸化 が 起 こり、 色 素 顆 粒 をもった 繊 毛 虫 はしばしば 強い 光 によって 殺 される。これは、 光 があたると 何 か障 害 が 起 こることを 示 しているが、これが 刺 激 となって 細 胞 に 繊 毛 運 動 の 逆 転 が 起 こると、 細 胞 はステップアップの 光 驚 動 反 応 を 行 うこととなり、キネシスによって 細 胞 は 暗 所 へ 移 動 することになるであろう。もしこれがその 繊 毛 虫 の 生 活 にとって 適 応 的であれば、たまたまこのような 色 素 が 表 層 顆 粒 に 含まれるようになると、その 状 態 は 維 持 されたであろう。たとえば、 原 始 大 核 類 は 殆 ど 全 て 海 底 の 砂 粒 間に 住 むから、 光 を 避 ける 反 応 は 適 応 的 なはずである。すなわち、 表 層 顆 粒 が 毒 性 の 光 動 力 学 的 色 素 をもつことによって、 化 学 的 防 御 と 光 受 容 機 能 をもった 色 素 顆 粒 ができたのであろうと 考 えられる。[ 文 献 ]1) Rosati, G. and Modeo, L. (2003) J. Eukaryot. Microbiol.,50: 383-402.2) Miyake, A. (2002) Jpn. J. Protozool., 35: 97-117.Teranympha 属 の 共 生 鞭 毛 虫 と 宿 主 シロアリ 数 種 の 系 統 比 較近 藤 武 司 , 北 出 理 ( 茨 城 大 ・ 理 )Comparison of phylogenies between symbiotic flagellate genusTeranympha and host termitesTakeshi KONDO and Osamu KITADE (Faculty of Science, Ibaraki University)We examined SSUrRNA gene sequences of symbiotic flagellates of the genus Teranympha derived from four Reticulitermestermite species distributed in and around the Japan Archipelago. The inferred phylogenetic tree usingneighbor-joining method was comprised of three monophyletic groups supported with more than 80% bootstrap probabilities.For the most parts, the tree topology was consistent with both the phylogeny of host termites inferred from mitochondrialgenes and a paleogeological hypothesis of the formation process of the Japan Archipelago, suggesting the cospeciationbetween host termites and Teranympha symbionts. However, clones of Teranympha obtained from R. speratusof the Aichi population and those from R. kanmonensis were separately included in different clusters. If such cloneswere not artifacts, possible causes of the results might be lateral transfers of flagellates or lineage sorting among allelesof the SSUrRNA gene.[ 目 的 ] 下 等 シロアリと 原 生 生 物 の 共 生 関 係 はよく 知られる 共 生 の 例 である。シロアリは 捕 食 した 木 材 の分 解 を 原 生 生 物 に 依 存 し、 原 生 生 物 は 木 材 の 供 給 と生 息 環 境 をシロアリに 依 存 している。シロアリ 腸 内原 生 生 物 はトリコモナス 目 ・ 超 鞭 毛 虫 目 ・オキシモナス 目 に 分 類 される 鞭 毛 虫 であり、 前 2 目 は 副 基 体類 と 呼 ばれる。 超 鞭 毛 虫 目 とオキシモナス 目 のほとんどはシロアリ 腸 内 のみに 生 息 する。シロアリと 共生 原 生 生 物 は 非 常 に 強 い 共 生 関 係 にあり、 宿 主 間 の水 平 感 染 は 生 じにくいと 考 えられるため、 両 者 は 一致 した 系 統 の 分 化 を 起 こしている 可 能 性 がある。 本研 究 では 日 本 周 辺 に 生 息 する Reticulitermes 属 (ヤマトシロアリ 属 ) とその 共 生 原 生 生 物 で 超 鞭 毛 虫 目 に 属する Teranympha 属 の 系 統 樹 を 比 較 する 事 により 共 種分 化 の 可 能 性 を 検 討 した。[ 材 料 と 方 法 ] ヤマトシロアリ 属 のシロアリは 茨 城県 ・ 愛 知 県 ・ 山 口 県 ・ソウル(ヤマトシロアリ R.

108 原 生 動 物 学 雑 誌 第 38 巻 第 1 号 2005 年speratus)、 石 垣 島 ・ 西 表 島 (ヤエヤマシロアリ R.yaeyamanus)、 台 湾 (キ アシシロアリ R. flaviceps)、ラオス(R.sp.)で 採 集 した。 東 アジアに 分布 する 本 属 の 種 は Teranympha 属 を 1 種 消 化 管 に 保 有する。シロアリの 腸 内 容 物 を 0.45% 生 理 食 塩 中 で 切開 し、 内 容 物 中 から Teranympha 属 の 鞭 毛 虫 のみを 7-15 個 体 釣 り 出 し DNA 抽 出 を 行 った。 抽 出 した DNAを 鋳 型 として SSU rRNA 遺 伝 子 領 域 を PCR 法 で 増 幅し、クローニング・ 塩 基 配 列 の 決 定 を 行 った。 得 られた 配 列 は ClustalW を 用 いてアラインメントの 後 、PAUP * ver.4.0 により HKY85 モデルで 置 換 率 を 補 正し、 近 隣 接 合 法 で 系 統 樹 を 推 定 した。シロアリのミトコンドリア 遺 伝 子 (16SrRNA 遺 伝 子 と COⅡ 遺 伝子 ) の 配 列 に 基 づく 系 統 解 析 の 結 果 は 北 出 の 未 発 表データを 使 用 した。[ 結 果 と 考 察 ] Teranympha 属 の SSUrRNA 遺 伝 子 の 配列 は 同 じ 超 鞭 毛 虫 目 Eucomonymphidae 科 で あ るEucomonympha 属 と 90% 以 上 の 相 同 性 を 示 した。 系統 解 析 の 結 果 、 本 属 のクローンは 大 きく 3 つの 単 系統 群 に 分 かれた。1つ 目 は 茨 城 ・ 愛 知 ・ 韓 国 で 採 集されたヤマトシロアリに 由 来 するクローンの 群 、2つ 目 は 石 垣 島 ・ 西 表 島 のヤエヤマシロアリ、 愛 知 のヤマトシロアリ、 山 口 のカンモンシロアリ、 台 湾 霧社 のキアシシロアリ 由 来 のクローンで 形 成 される群 、3つ 目 はラオスの 種 と 山 口 のカンモンシロアリ由 来 のクローンで 形 成 される 群 である。2、3 番 目 の群 は1つの 大 きな 単 系 統 群 を 形 成 する。これらの 群は 80% 以 上 の 高 いブートストラップ 値 で 支 持 された。また、 台 湾 のキアシシロアリ、ラオスの R. sp.、山 口 + 韓 国 のヤマトシロアリの 各 個 体 群 に 由 来 するクローンはそれぞれ 単 系 統 群 を 形 成 した。 愛 知 のヤマトシロアリ 由 来 のクローンと 山 口 のカンモンシロアリ 由 来 のクローンでは 同 じ 宿 主 個 体 に 由 来 するにもかかわらず 系 統 的 に 大 きく 離 れた 群 に 含 まれるものがあった。今 回 推 定 された 系 統 樹 の 分 岐 パターンはいくつかのクローンを 除 けば 宿 主 シロアリの 系 統 樹 の 樹 形 と一 致 した。このことはヤ マトシロアリ 属 とTeranympha 属 の 共 生 鞭 毛 虫 が 共 種 分 化 をしている 可能 性 を 支 持 する。 系 統 樹 は 宿 主 ・ 鞭 毛 虫 系 統 ともに分 布 域 が 旧 北 区 と 東 洋 区 の 境 界 線 であるトカラ 海 峡で 大 きく 2 つに 分 かれる。ただし、 山 口 県 に 生 息 するカンモンシロアリは 中 国 大 陸 南 部 からの 移 入 種 であると 考 えられており、 宿 主 ・ 鞭 毛 虫 ともにトカラ海 峡 以 南 の 群 に 含 まれた。カンモンシロアリや 愛 知のヤマトシロアリに 由 来 する Teranympha 属 のクローンは 系 統 的 に 離 れた 複 数 の 群 に 含 まれ、とくに 愛 知のものはトカラ 海 峡 以 北 ・ 以 南 両 方 の 群 に 見 られた。このような 結 果 に 対 する 説 明 としては、シロアリ 間 で 原 生 生 物 の 水 平 感 染 が 行 われた 可 能 性 が 考 えられる。あるいは Teranympha 属 が 単 為 生 殖 のみを 行うため、 祖 先 的 な 多 型 を 引 き 継 ぐ lineage sorting の 影響 を 強 く 受 けているのかもしれない。[ 文 献 ]1) Yamin, M. A. (1979) Sociobiology. 4, 1-119.