Καρδιολογική Γνώμη - Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο ...

92 Κ.Α. Δημόπουλοςκαμπύλη στο καταγραφικό κινείται προς τα κάτω με συνεχώςμικρότερη ταλάντωση και καταλήγει στην αρχική της μορφήκαι περίπου στο αρχικό επίπεδο της % διαπερατότητας. Ητυπική μέτρηση διαρκεί από 3 έως 6 min.Τα αιμοπετάλια στην κυψελίδα μπορεί να βρίσκονται μέσαστο πλάσμα (ex vivo δοκιμασία), οπότε έχουμε το πλάσμαπλούσιο σε αιμοπετάλια (Platelet Rich Plasma, PRP) χρησιμοποιώνταςσαν τυφλό δείγμα στο συσσωρευματόμετρο τοπλάσμα (Platelet Pour Plasma, PPP) ή να βρίσκονται μέσασε κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα (in vitro δοκιμασία), οπότεέχουμε τα πλυμένα αιμοπετάλια (washed platelets), χρησιμοποιώνταςσαν τυφλό δείγμα στο συσσωρευματόμετρο τορυθμιστικό διάλυμα. Τα πλυμένα αιμοπετάλια λαμβάνονταιαπό το PRP με κατάλληλες εκπλύσεις και φυγοκεντρήσεις,οπότε μπορεί να μελετηθεί με το φαινόμενο της συσσώρευσηςη άμεση επίδραση του PAF στα αιμοπετάλια, χωρίς τιςεπιδράσεις των άλλων συστατικών που υπάρχουν στο πλάσμα,με επαναλήψιμα αποτελέσματα. Η πλέον δόκιμη καιευαίσθητη πιστοποίηση του PAF περιλαμβάνει in vitro δοκιμασίαμε πλυμένα αιμοπετάλια κουνελιού.Μπορεί όμως να χρησιμοποιηθεί η εν λόγω δοκιμασίακαι για ποσοτικό προσδιορισμό του PAF ως εξής: γίνεται ηκαμπύλη του ύψους της συσσώρευσης σε συνάρτηση με γνωστέςσυγκεντρώσει PAF και λαμβάνεται μια σιγμοειδούςμορφής καμπύλη με ένα ευθύγραμμο τμήμα. Από το ύψοςτης συσσώρευσης του άγνωστης συγκέντρωσης δείγματος,εφόσον βρίσκεται μέσα στο ευθύγραμμο τμήμα είναι δυνατόννα υπολογιστεί η περιεκτικότητα του δείγματος σε PAF.Είναι δυνατόν ακόμα να προσδιοριστεί και η ικανότητα μιαςένωσης να αναστέλλει την προκαλούμενη από τον PAF συσσώρευση,αν προστεθεί στα αιμοπετάλια πρώτα η μελετώμενηένωση και στη συνέχεια ποσότητα PAF που προκαλείγνωστού ύψους συσσώρευση.Από το ύψος της εν λόγω συσσώρευσης σε σχέση με τηνγνωστού ύψους συσσώρευση που προκαλεί μόνος του οPAF, είναι δυνατόν να υπολογισθεί η % αναστολή που προκαλείη μελετώμενη ένωση. Η ποσότητα του μελετώμενουδείγματος για αναστολή κατά 50% της προκαλούμενης απότον PAF συσσώρευσης εκφράζεται ως IC 50 (half maximalInhibitory Concentration for 50% aggregation), ενώ η ποσότητατου μελετώμενου δείγματος που προκαλεί το 50%της μέγιστης αντιστρεπτής συσσώρευσης εκφράζεται ωςEC 50 (Equilibrium Concentration for 50% aggregation).Για να είναι όμως αξιόπιστα τα αποτελέσματα της βιολογικήςδοκιμασίας απαιτείται πολύ καλός χημικός διαχωρισμόςτου από τις άλλες ενώσεις με χρωματογραφικές μεθόδουςδηλαδή, να απομονωθεί και να καθαριστεί ο PAFαπό κάθε άλλη ένωση πριν τη βιολογική δοκιμασία της συσσώρευσης,για να μην τροποποιηθεί η δράση του στα αιμοπετάλιαλόγω της επίδρασης άλλων ενώσεων. Αυτό μπορείνα γίνει με μια απλή σχετικά χρωματογραφική μέθοδο (π.χ.χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας, TLC) αν δεν υπάρχουνπολλές σε ποσότητα άλλες ενώσεις (π.χ. εκχύλισμα PAF απόμικρό δείγμα κυτταροκαλλιέργειας) ή σε αντίθετη περίπτωσηαπαιτείται συνδυασμός πολλών και πολύπλοκων χρωματογραφικώνμεθόδων (π.χ. χρωματογραφία στήλης και μετάχρωματογραφία υψηλής απόδοσης - HPLC). Έχουν κυκλοφορήσειδιάφορα kit προσδιορισμού του PAF, ακριβά αλλάχωρίς αποδεκτά αποτελέσματα. Εμείς έχουμε αναπτύξει μιαμέθοδο προσδιορισμού του PAF 21 που περιλαμβάνει παραλαβήτου PAF με κατάλληλη για κάθε βιολογικό δείγμα εκχύλιση,καθαρισμό με χρωματογραφία στήλης, μετά με χρωματογραφίαυψηλής απόδοσης - HPLC και τέλος in vitro δοκιμασίασε πλυμένα αιμοπετάλια κουνελιού. Η μέθοδος αυτήθεωρείται η πλέον δόκιμη, αλλά είναι χρονοβόρα και απαιτείεξειδικευμένο προσωπικό.ΣυμπεράσματαΟ κεντρικός ρόλος του PAF στην φλεγμονή και σε πολλέςπαθοφυσιολογικές καταστάσεις κάνουν την έρευνά του όλοκαι περισσότερο ενδιαφέρουσα όχι μόνο στους βιοχημικούςκαι στους βιολόγους αλλά και στους ιατρούς.Βιβλιογραφία1. Hanahan DJ, Lipid Chemistry. John Wiley & Sons, 1960.2. Hokin LE, Hokin MR. Effects of acetylcholine on the turnover of phosphorylunits in individual phospholipids of pancreas slices and brain cortexslices. BBA - Biochimica et Biophysica Acta 1955; 18(C):102-110.3. Michell RH. Inositol phospholipids and cell surface receptor function.Biochimica et Biophysica Acta 1975; 415(1):81-147.4. Barbaro JF, Zvaifler NJ. Antigen induced histamine release from plateletsof rabbits producing homologous PCA antibody. Proc Soc ExpBiol Med 1966; 122(4):1245-1247.5. Henson PM. Release of vasoactive amines from rabbit platelets inducedby sensitized mononuclear leukocytes and antigen. J Exp Med1970; 131(2):287-306.6. Benveniste J, Henson PM, Cochrane CG. Leukocyte-dependent histaminerelease from rabbit platelets. The role of IgE, basophils, and aplatelet-activating factor. J Exp Med 1972; 136(6):1356-1377.7. Siraganian R, Posler AG. Destruction of rabbit platelets in the allergicresponse of sensitized leukocytes. II. Evidence for basophil involvement.Journal of Immunology 1971; 106(5):1252-1259.8. Henson PM, Pinckard RN. Basophil-derived platelet-activating factor(PAF) as an in vivo mediator of acute allergic reactions: Demonstrationof specific desensitization of platelets to PAF during IgE-induced anaphylaxisin the rabbit. Journal of Immunology 1977; 119(6):2179-2184.9. Pinckard RN, Halonen M, Palmer JD. Intravascular aggregation andpulmonary sequestration of platelets during IgE-induced systemic anaphylaxisin the rabbit: Abrogation of lethal anaphylactic shock by plateletdepletion. Journal of Immunology 1977; 119(6):2185-2193.10. Demopoulos CA, Pinckard RN, Hanahan DJ. Platelet-activating factor.Evidence for 1-O-alkyl-2-acetyl-sn-glyceryl-3-phosphorylcholine asthe active component (a new class of lipid chemical mediators). JBiol Chem 1979; 254(19):9355-8.11. McManus LM, Hanahan DJ, Demopoulos CA, et al. Pathobiology ofthe intravenous infusion of acetyl glyceryl ether phosphorylcholine(AGEPC), a synthetic platelet-activating factor (PAF), in the rabbit.Journal of Immunology 1980; 124(6):2919-2924.12. Halonen M, Palmer JD, Lohman IC. Respiratory and circulatory alterationsinduced by acetyl glyceryl ether phosphorylcholine, a mediatorof IgE anaphylaxis in the rabbit. Am Rev Respir Dis 1980; 122(6):915-924.13. Pinckard RN, McManus LM, Orourke RA, et al. Intravascular and Car-