Interior Archives_1(2013)_000pag_2-6 - RAMI Editorial Board
Interior Archives_1(2013)_000pag_2-6 - RAMI Editorial Board
Interior Archives_1(2013)_000pag_2-6 - RAMI Editorial Board
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
ROMANIAN ARCHIVES<br />
OF<br />
MICROBIOLOGY<br />
AND<br />
IMMUNOLOGY<br />
Founded by<br />
PROFESSOR ION CANTACUZINO<br />
VOLUME 72 - Issue 1<br />
January - March <strong>2013</strong><br />
Published quarterly<br />
by<br />
CANTACUZINO INSTITUTE BUCHAREST<br />
TOTAL PUBLISHING HOUSE
ROMANIAN ARCHIVes OF MICROBIOLOGY AND IMMUNOLOGY<br />
ROMANIAN ARCHIVES<br />
OF<br />
MICROBIOLOGY<br />
AND<br />
IMMUNOLOGY<br />
ISSN 1222-3891<br />
INDEXED IN MEDLINE<br />
CNCSIS Category B+<br />
Editor-in-Chief: Radu IORDĂCHEL<br />
Deputy Editor: Maria DAMIAN<br />
<strong>Editorial</strong> <strong>Board</strong>: Viorel ALEXANDRESCU, Antonios ANTONIADIS, Jean-Marc CAVAILLON,<br />
Ana CĂLUGĂRU, Cornelia CEIANU, Carmen CHIFIRIUC, Nicolae CORCIONIVOSCHI,<br />
Angel GALABOV, Steliana HUHULESCU, Luminiţa Smaranda IANCU, Anca ISRAIL,<br />
Emilia LUPULESCU, Roxana MOLDOVAN, Geza MOLNAR; Marian NEGUŢ, Adrian ONU,<br />
Hervé PELLOUX, Graţiela PÎRCĂLĂBIORU, Dorel Lucian RADU, Alexandru RAFILA,<br />
Aurora SĂLĂGEANU, Constantin SPÂNU, Demetrios SPANDIDOS, Dan STERIU,<br />
Cătălina-Suzana STÎNGU, Galina TSENEVA, Codruţa-Romaniţa USEIN, Hans WOLF,<br />
Imola ZIGONEANU<br />
<strong>Editorial</strong> Staff: Felicia RAPILAT, Monica TRĂISTARU<br />
TOTAL PUBLISHING HOUSE<br />
Subscription orders:<br />
Orders can be placed directly with the publisher:<br />
„Cantacuzino“ National Institute of Research-Development for Microbiology and Immunology<br />
C.P. 1-525, splaiul Independentei 103, 050096, Bucureºti, România<br />
Fax: (40.21)306.93.07<br />
e-mail: archives@cantacuzino.ro<br />
www.roami.ro<br />
Copyright<br />
©<br />
<strong>2013</strong> CANTACUZINO INsTITUTe Bucharest<br />
2
ROMANIAN ARCHIVes OF MICROBIOLOGY AND IMMUNOLOGY<br />
CONTeNTs / sUMAR<br />
MICROBIOLOGY / MICROBIOLOGIe<br />
5 UNDeRsTANDING THe MOLeCULAR TARGeTs FOR NeW THeRAPeUTICAL AGeNTs IN HePATITIs C INFeCTION /<br />
AGeNÞI TeRAPeUTICI CU ACÞIUNe DIReCTÃ ANTIVIRALÃ ÎN INFeCÞIA CU VIRUs HePATITIC C - NOI ÞINTe<br />
MOLeCULARe<br />
Codruþa Vagu, Camelia sultana, simona Ruþã<br />
PARAsITOLOGY / PARAZITOLOGIe<br />
25 GROWTH OF eNTAMOeBA INVADeNs IN seDIMeNTs WITH MeTABOLICALLY RePResseD<br />
BACTeRIA LeADs TO MULTICeLLULARITY AND ReDeFINITION OF THe AMOeBIC CeLL sYsTeM /<br />
seDIMeNTe CU BACTeRII AeROBe RePRIMATe MeTABOLIC eLUCIDeAZÃ LA EntamoEba invadEns<br />
sIsTeMUL MULTICeLULAR ŞI CICLUL De VIAÞÃ AMIBIAN<br />
Vladimir F. Niculescu<br />
49 TWO CAse RePORTs ON VIsCeRAL LeIsHMANIAsIs DIAGNOseD IN ROMANIA /<br />
DOUÃ RAPOARTe De CAZURI De LeIsHMANIOZÃ DIAGNOsTICATe ÎN ROMâNIA<br />
Marian Ghervan Gogoaşe, Irina Teodorescu, Carmen Preda, simona Claudia Ionescu<br />
MINIReVIeW<br />
63 ADeNYLATe CYCLAses INVOLVeMeNT IN PATHOGeNICITY, A MINIReVIeW /<br />
IMPLICAReA ADeNILAT CICLAZeLOR ÎN PATOGeNITATe, UN MINIReVIeW<br />
Adriana Costache, Nadia Bucurenci, Adrian Onu<br />
VOLUMe 72 IssUe 1 JANUARY - MARCH <strong>2013</strong><br />
3
INsTRUCTIONs TO AUTHORs<br />
Aims and Scope<br />
Romanian archives of microbiology and immunoloy, an international<br />
journal dedicated to original research work, publishes papers focusing<br />
on various aspects of microbiology and immunology. Romanian ar chives<br />
of microbiology and immunology is indexed in MeDLINe. The frequency<br />
of the Journal is currently four issues per year.<br />
Categories of manuscripts<br />
Full-length articles are full-length descriptions of original research (up to<br />
10 printed pages).<br />
Reviews are comprehensive appraisals of research in a field of current<br />
interest. All reviews are subject to the normal review process (up to 12<br />
printed pages).<br />
Rapid Communications are brief, definitive reports of highly significant<br />
and timely findings in the field (up to 5 printed pages).<br />
Submission of manuscripts<br />
Manuscripts and all attached files (tables and illustrations) should be submitted<br />
in electronic form to the editorial Office, e-mail address:<br />
archives@cantacuzino.ro or by regular mail (address: Redactia Revistei<br />
Romanian <strong>Archives</strong> of Microbiology and Immunology, spl. Indepen den -<br />
tei 103, sector 5, 050096, Bucuresti, Romania) on compact disk, preferrably<br />
accompanied by three copies of the manuscript, including tables<br />
and figures, printed on one side of A4 paper format, double-spaced, with<br />
2.5 margins.<br />
The preferred software is Microsoft Word. In order to speed up the<br />
process of review, manuscripts should be prepared very carefully.<br />
Cover letter<br />
each manuscript submitted to the Romanian <strong>Archives</strong> of Microbiology<br />
and Immunology must be accompanied by a Cover letter including an<br />
explicit statement by the corresponding author that:<br />
• the manuscript represents an original work, has not been previously<br />
published, and has not been submitted simultaneously for publication<br />
elsewhere.<br />
• the manuscript, as submitted, has been reviewed and approved by all<br />
named authors and that all authors concur with the submission and are<br />
responsible for its content.<br />
• the Cover letter should be signed by all the authors of a manuscript.<br />
<strong>Editorial</strong> review and acceptance<br />
All manuscripts are subject to editorial review by professional peer reviewers<br />
(at least two). The acceptance criteria for all manuscripts are<br />
based on quality and originality. The corresponding author of a manuscript<br />
is informed within 60 working days after submission that the paper<br />
is accepted for publication in the journal, needs revision or is rejected.<br />
Revised manuscripts should be resubmitted as soon as possible but not<br />
later than 14 days.<br />
Ethical considerations<br />
A paper describing any experimental work with humans should include<br />
a statement that the ethics Committee of the institution in which the work<br />
was done has approved it, and that the subjects gave informed consent<br />
to the work.<br />
experiments with animals should be done in accordance with the legal<br />
requirements of the relevant local or national authority. Procedures<br />
should be such that animals used in experiments do not suffer unnecessarily.<br />
Papers should include details of the procedures and anaesthetics<br />
used. The editors will not accept papers where the ethical aspects are, in<br />
their opinion, open to doubt.<br />
Preparation of manuscripts<br />
Manuscripts should be submitted in english. American or British spelling<br />
can be used provided that only one spelling style is consistently used<br />
throughout. Manuscripts must be typewritten on A4 format (210x297<br />
mm), with double spacing, margins of 25 mm, on one side only, consecutively<br />
numbered. Times New Roman font, 12-point size, is required.<br />
Text headings<br />
All headings in the text should be set over to the left hand margin, and<br />
text should begin on the next line. Type first level (sectional) headings<br />
all in capitals. second level headings should be typed in small (lower<br />
case) letters but with the first letter of each main word a capital. For third<br />
level headings, only the first letter of the first word should be a capital.<br />
Underline first and second level headings.<br />
FIRsT LeVeL TeXT HeADING<br />
second Level Text Heading<br />
Third level text heading<br />
Manuscripts should be divided into the following sections and order:<br />
Title page, Abstract and key words, Introduction, Materials and Me thods,<br />
Results, Discussion, Acknowledgements, References, Tables, Figure Legends<br />
and Figures.<br />
1. Title page contains: title of the paper not longer than 80-100 characters,<br />
including spaces and punctuation; full name of the authors and<br />
their affiliation; the author responsible for correspondence will be<br />
marked by an asterisk, and his full address telephone/fax numbers, and<br />
e-mail address will be indicated.<br />
2. Abstract must not exceed 250 words and should reflect the content<br />
of the study. Following the abstract, a list of 3-10 keywords is essential<br />
for indexing purposes.<br />
3. Introduction containing a description of the problem under investigation<br />
and a brief survey of the existing literature on the subject.<br />
4. Materials and Methods provide sufficient detail to allow the work to<br />
be reproduced.<br />
5. Results. Results should be clear and concise.<br />
6. Discussion that enriches but does not repeat section 3 or 5.<br />
7. Acknowledgements (if applicable) containing acknowledgement of<br />
technical help and of financial material support.<br />
8. References should be numbered consecutively in the order in which<br />
they are first mentioned in the text. Identify references in text, tables,<br />
and legends by Arabic numerals in square brackets (e.g. [1], [2-6], etc.).<br />
Please note the following examples:<br />
Journals:<br />
Allain F, Vanpouille C, Carpentier M, Slomianny MC, Durieux S, Spik<br />
G. Interaction with glycosaminoglycans is required for cy clophilin B<br />
to trigger integrin-mediated adhesion of peripheral blood T lymphocytes<br />
to extracellular matrix. Proc Natl Acad sci U s A 2002. 99: 2714-<br />
2719.<br />
Books:<br />
Theofilopoulos AN. Immune complexes in autoimmunity. In: Bona CA,<br />
siminovitch KA, Zanetti M, Theofilopoulos AN (eds.) The Mole cular<br />
Pathology of Autoimmune Diseases. Harwood Academic Pu blishers,<br />
switzerland 1993, pp 229-244.<br />
9. Tables with suitable captions at the top and numbered with Arabic<br />
numerals should be collected at the end of the text on separate sheets<br />
(one page per Table). Footnotes to tables should be marked with a)<br />
b) c) etc and *, **, *** should be reserved for p values. each table<br />
must be understood independently of the text. All tables must be cited<br />
in the text.<br />
10. Figures (illustrations) Figures should be submitted on separate pages<br />
at the end of the article (new page for each complete figure). They<br />
should be numbered in the order of their appearance with Arabic numerals.<br />
Figures should be submitted as TIFF files at a pro per resolution<br />
as follows: Graphs at 800-1200 dpi; Photos at 400-800 DPI; Color<br />
300-400 DPI. Text in figures should be 8-10 point in size. each figure<br />
must have a separate legend. The legends should not appear under<br />
the figures, but be gathered in a separate section (Figure legends).<br />
Color figures can only be printed if the author is prepared to pay the<br />
cost incurred.<br />
11. Figure legends should be supplied at the end of the manuscript, double<br />
spaced, with relevant figure numbers, labeling symbol and explanation.<br />
Units of measurement, Symbols and abbreviations<br />
symbols for physical units should be those of the système Internationale<br />
(sI) Units.<br />
Alternative or non-sI units may be used, but these must be defined at<br />
their first occurrence in the text.<br />
Nomenclature of Microorganisms<br />
Binary names, consisting of a generic name and a specific epithet (e.g.,<br />
escherichia coli), must be used for all microorganisms.<br />
Genetic Nomenclature<br />
To facilitate accurate communication, it is important that standard ge -<br />
netic nomenclature be used whenever possible and that deviations or<br />
proposals for new naming systems be endorsed by an appropriate au -<br />
thoritative body.<br />
Proofs and reprints<br />
Ten reprints of each article and one copy of the journal will be supplied<br />
free of charge to the corresponding author.<br />
Romanian archives of microbiology and immunology<br />
4
UNDeRsTANDING THe MOLeCULAR TARGeTs<br />
FOR NeW THeRAPeUTICAL AGeNTs IN HePATITIs C INFeCTION<br />
Codruþa Vagu 1 , Camelia Sultana 1,2 , Simona Ruþã 1,2 *<br />
¹Carol davila University of medicine and Pharmacy, bucharest, Romania<br />
²Ştefan s. nicolau institute of virology, bucharest, Romania<br />
ABsTRACT<br />
Improved understanding of the HCV viral life cycle has led to the identification of numerous potential<br />
molecular targets for the development of new drugs. Direct acting antivirals –DAAs specifically target<br />
a viral encoded protein: the NS3-4A protease, involved in the posttranslational viral protein processing;<br />
the NS5B encoded viral polymerase, that conducts the nucleic acid replication and the NS5A encoded<br />
phosphoprotein, that participates in both replication and virus assembly. Host-targeted agents, both<br />
directed to the early steps of viral replication (receptors and coreceptors antagonists) or to the development<br />
of a functional viral replication complex (host cyclophilins) are also developed, to strengthen<br />
the antiviral efficacy of these drugs. The newly approved NS3-4A protease inhibitors (telaprevir and<br />
boceprevir), administered in combination with pegylated interferon and ribavirin for patients with<br />
HCV genotype 1 infection, determined a significant enhancement in the sustained virologic response<br />
rates (towards 66-75% in treatment-naive patients and 59-66% in treatment-experienced ones). Improved<br />
antiviral efficacy was shown in clinical trials by second generation protease inhibitors, while<br />
valuable alternatives are represented by nucleoside/nucleotide analogues and non-nucleoside inhibitors<br />
directed to the HCV RNA-dependent RNA polymerase, as well as by NS5A inhibitors (both direct<br />
acting or directed to the host cofactors). More recently, combinations of different drugs are tested as<br />
a potential cure for chronic hepatitis C.<br />
Keywords: HCV life cycle, HCV entry inhibitors, HCV protease inhibitors, HCV polymerase inhibitors, Ns5A inhibitors<br />
INTRODUCTION<br />
Hepatitis C virus (HCV) infection has rea -<br />
ched epidemic proportions, becoming a major<br />
global health issue. There are an estimated 170<br />
million chronic HCV carriers, comprising approximately<br />
3% of the global population [1] .<br />
Hepatitis C advances to a chronic state in up<br />
to 80% of people, which leads to liver cirrhosis<br />
in 20-40% of cases, with a significant risk of hepatic<br />
decompensation, hepatocellular carcinoma<br />
and need for liver transplantation in many countries.<br />
In the absence of active treatments, the<br />
number of patients with end-stage liver disease<br />
due to chronic HCV infection is expected to increase<br />
dramatically over the next decade [2].<br />
The understanding of each step of HCV life<br />
cycle can lead to the development of specifically<br />
targeted antiviral therapy for hepatitis C (STAT-<br />
C), a strategy that has the potential to be more<br />
effective than the combination of pegylated interferon<br />
alpha and ribavirin used until now.<br />
HCV is a member of the Hepacivirus genus,<br />
Flaviviridae family. It is a small-enveloped virus<br />
with a single-stranded positive-sense RNA<br />
genome of approximately 9.6 kb that encodes<br />
three structural (core, E1, E2) and seven nonstructural<br />
(p7, NS2–NS5B) proteins. Short untranslated<br />
regions (UTRs) at each end of the<br />
genome (3’UTR and 5’UTR) are required for<br />
replication of the genome [3].<br />
A series of recent developments allowed a<br />
better insight into the life cycle of HCV [4]:<br />
1. HCV RNA replication has been studied<br />
with the use of subgenomic/ genomic HCV<br />
replicons (full lengths or region of HCV RNA<br />
*Corresponding author: simona Ruþã, Ştefan s Nicolau Institute of Virology, 285, sos. Mihai Bravu, 030304, Bucharest, Romania,<br />
Telephone/fax: +40213242590, e-mail: simona@simonaruta.ro<br />
5
VAGU et al.<br />
molecule, that replicates autonomously from a<br />
single origin of replication) in human hepatoma<br />
cell line Huh7 [5];<br />
2. Infectious HCV particles have been produced<br />
in cell culture using recombinant systems<br />
[6];<br />
3. Large quantities of HCV-like particles<br />
have been yielded in insect cells with the use of<br />
modified baculovirus system [7];<br />
4. Small animal models, consisting of genetically<br />
humanised mice, support at least partially<br />
HCV replication [8, 9].<br />
VIRAL ENTRY AND POTENTIAL INHIBITORS<br />
HCV replication cycle began with viral attachment,<br />
followed by cell entry using initially<br />
a clathrin-mediated endocytosis mechanism and<br />
further fusion between the viral envelope and<br />
the endosomal membrane and uncoating of the<br />
HCV RNA genome. HCV envelope glycoproteins<br />
(E1 and E2) bind to a complex of receptors<br />
and coreceptors, that includes, but is not limited<br />
to: the CD81 tetraspanin, tight junction proteins<br />
claudin-1 and occludin, intercellular adhesion<br />
molecules like the dendritic cell-specific DC-<br />
SIGN/CD209 or the liver/lymph node-specific<br />
L-SIGN/CD209L and glycosaminoglycans [5,<br />
6]. Of note, several molecules involved in the<br />
lipoproteins cholesterol uptake are essential for<br />
this phase: scavenger receptor B type I (the principal<br />
High Density Lipoprotein receptor), lowdensity<br />
lipoprotein receptor, and the most<br />
recently identified - Niemann-Pick C1-like 1 receptor<br />
(NPC1L1) - expressed only on human<br />
and primate hepatocytes, that was suggested to<br />
participate in the removal of virion-associated<br />
cholesterol, generating conformational change<br />
to facilitate viral entry [10].<br />
This link between the cholesterol metabolism<br />
and HCV life cycle suggests potential antiviral<br />
therapies directed to early steps of viral<br />
replication:<br />
An NPC1L1 antagonist called ezetimibe,<br />
that is FDA approved as a selective cholesterol<br />
absorption inhibitor, was proven to inhibit all<br />
HCV genotypes cell entry in vitro and to defer<br />
HCV genotype 1b infection in mice with human<br />
liver grafts [8].<br />
A small molecule, provisionally named ITX<br />
5061, initially developed for inflammatory diseases,<br />
due to its action as a p38 MAP kinase inhibitor,<br />
and later associated to elevation of HDL<br />
levels in mice and human plasma, is studied in<br />
phase 1 clinical trials as an inhibitor of HCV<br />
replication at post-binding level. This compound<br />
targets the scavenger receptor BI and competes<br />
for HDL-mediated lipid transfer [11]. Using an<br />
in vitro system, ITX 5061 has proven to have<br />
additive or synergistic inhibitory antiviral acti -<br />
vity directed in combination with interferon-α,<br />
ribavirin, and HCV protease and polymerase inhibitors<br />
[12].<br />
Inhibitions of host cell factors involved in<br />
this early stage of viral replication is a promising<br />
therapeutic option, that has been already proven<br />
to be effective in the case of HIV infection, with<br />
the use of maraviroc, an antagonist of the CCR5<br />
beta-chemokine coreceptor, used by macro -<br />
phage tropic HIV strains. In the case of HCV, it<br />
can be an extremely valuable choice for prevention<br />
of graft reinfection in patients with liver<br />
transplant.<br />
VIRAL REPLICATION AND DIRECT-ACTING<br />
ANTIVIRALS (DAA)<br />
The logarithmic growth phase consists of :<br />
1. direct translation of the positive-strand<br />
genomic RNA, that serves as messenger RNA,<br />
containing a single open reading frame (ORF)<br />
with synthesis of a single polyprotein of ≈3,000<br />
amino acids, the precursor of all HCV structural<br />
and nonstructural proteins. This step is initiated<br />
by the binding of the viral internal ribosome<br />
entry site (IRES) to the host ribosomal subunits<br />
[13];<br />
2. post-translation processing of the large<br />
precursor polyprotein conducted by both cellular<br />
peptidases (signal peptidase and signal peptidepeptidase),<br />
and viral proteases encoded by the<br />
nonstructural proteins. NS2 is a zinc-dependent<br />
metalloprotease that cleaves the site between<br />
NS2 and NS3, while NS3/4A is a se rine-protease<br />
that catalyzes nonstructural HCV polyprotein<br />
cleavage dowstream of NS3 [14, 15].<br />
3. nucleic acid replication conducted by the<br />
viral polymerase (NS5B), an RNA-dependent<br />
6
Understanding the molecular targets for new therapeutical agents in hepatitis C infection<br />
RNA polymerase (RdRp), a highly error-prone<br />
enzyme, that can introduce multiple mutations<br />
(with a rate of approximately 10 -3 per nucleotide<br />
per generation). Together with the high replication<br />
rate of HCV (10 10 to 10 12 virions per day,<br />
with a predicted viral half-life of 2 to 3 hours)<br />
[16], this explains the pronounced viral variabi -<br />
lity, accounting for the existence of at least 6<br />
major HCV genotypes (that differ by about 30%<br />
in their nucleotide and amino acid sequences)<br />
and a series of viral quasispecies. From this<br />
highly heterogenous viral population, the individual<br />
immune response selects escape mutants<br />
that persist in the host and account for the high<br />
rate of chronic HCV infections, while the direct<br />
acting antiviral drugs select resistant viral strains<br />
that explain the need for combination therapies.<br />
The final phase of the viral replicationcalled<br />
plateau - is initiated by the interaction of<br />
the core protein with HCV RNA genome, that<br />
determines a switch from replication to packaging.<br />
Virus particles are produced in the intracellular<br />
membranes derived from the endoplasmic<br />
reticulum or the Golgi compartment, and the<br />
newly produced virions are released by the secretory<br />
pathways of the host cell [17]. A major<br />
protein involved in both replication and virus assembly<br />
is the RNA-binding phosphoprotein encoded<br />
by the virus NS5A gene. Although this<br />
protein has no enzymatic activity, it exerts its<br />
role in the formation of the viral replication<br />
complex, possibly by recruiting a specific kinase<br />
(phosphatidylinositol 4-kinase, subtype IIIα-<br />
PI4KIIIα), to replication sites, stimulating its kinase<br />
activity, and generating local production of<br />
phosphatidylinositol phosphates [18, 19]. This,<br />
in turn, can recruit cellular factors, such as host<br />
cyclophilins A and B, imposing a trans to cis isomerization<br />
necessary for HCV replication.<br />
HCV RNA replication leads to rearrangements<br />
of intracellular membranes that are supposed to<br />
serve as scaffolds for the viral replication complex<br />
[19], forming a structure called the membranous<br />
web, rich in sterols [20].<br />
NS3/4A PROTEASE INHIBITORS (PIS)<br />
Approved Protease inhibitors. In 2011,<br />
two orally administered drugs, Telaprevir (developed<br />
by Vertex Pharmaceuticals) and Boceprevir<br />
(developed by Schering Plough/Merck) were approved<br />
by both US Food and Drug Administration<br />
(FDA) and European Medicines Agency<br />
(EMA) for the treatment of HCV genotype 1 infection,<br />
in combination with pegylated interferon<br />
and ribavirin (PegIFN-RBV). The need for<br />
triple therapy derives from the early studies<br />
proving that monotherapy with both protease inhibitors<br />
promoted a rapid selection of drug-resistant<br />
viral strains preexisting at baseline in all<br />
HCV-infected patients [21, 22]. Both PIs are linear<br />
peptidomimetic ketoamide that act through<br />
covalent reversible binding of the serine active<br />
site of the NS3 protease, thus inhibiting the proteolytic<br />
cleavage of the viral precursor polypeptide<br />
in functional viral proteins [15]. Apart from<br />
their direct action on the viral replication cycle,<br />
the protease inhibitors can act by restoring the<br />
host innate response, as the HCV protease<br />
NS3/4A blocks IRF3 (a key transcriptional regulator<br />
of the IFN-response) and retinoid-inducible<br />
gene (RIG1-a growth regulator), leading<br />
to a reduction in the expression of IFN- signaling<br />
genes [23, 24].<br />
Triple therapy is now the standard of care<br />
for patients infected with HCV genotype 1, as it<br />
increases the overall rate of therapeutical success<br />
both in previously naive patients and in<br />
former partial responders, relapsers and previously<br />
null responders [25, 26, 27] (Table 1).<br />
Telaprevir (Incivek/Incivo TM ) is administered<br />
orally (750 mg, two 375-mg tablets, taken 3<br />
times a day) for 12 weeks in combination with<br />
PegIFN-RBV. Treatment is continued with dual<br />
therapy (PegIFN-RBV) for an additional period<br />
of 12 weeks if HCV-RNA levels at weeks 4 and<br />
12 are undetectable or for an aditional period of<br />
36 weeks if HCV RNA is detectable (1000<br />
IU/mL or less) at Weeks 4 and/or 12 [33]. Boceprevir<br />
(Victrelis TM ) is administered orally (800<br />
mg three times per day with food) in triple combination<br />
therapy for 24-44 weeks only after a 4<br />
weeks lead-in phase with PegIFN-RBV alone.<br />
The aim of the lead- in phase is to reduce viral<br />
replication and further emergence of resistant<br />
variants; it also allows identification of patients<br />
with a rapid virological response (RVR: undetectable<br />
HCV RNA after 4 weeks of treatment),<br />
7
VAGU et al.<br />
c<br />
Table 1. Phase 3 trials with triple therapy: PIs (telaprevir or boceprevir)<br />
combined with peginterferon alfa-2a and ribavirin (PegIFN-RBV)<br />
Clinical study Patients/no. Duration of treatment Aim and Results<br />
ADVANCE<br />
(telaprevir-TVR)<br />
[28]<br />
ILLUMINATE<br />
(telaprevir)<br />
[29]<br />
REALISE<br />
(telaprevir)<br />
[30]<br />
SPRINT 2<br />
(boceprevir)<br />
[31]<br />
RESPOND-2<br />
(boceprevir)<br />
[32]<br />
treatment-naïve<br />
1088<br />
treatment-naïve<br />
540<br />
prior treatment<br />
failures<br />
633<br />
treatment naive,<br />
1097<br />
treatment failures,<br />
403<br />
9 or 12 wks of triple therapy,<br />
then 12 or 36 wks PegIFN-RBV<br />
alone<br />
RGT:-triple therapy for 12 wks,<br />
then 12 or 24 wks of PegIFN-<br />
RBV alone<br />
triple therapy for 12 wks,<br />
followed by PegIFN-RBV alone<br />
for 36 wks.<br />
Lead-in period (4 wks PegIFN-<br />
RBV), then triple therapy 24/44<br />
wks<br />
Lead-in period (4 wks PegIFN-<br />
RBV), then triple therapy 32/ 44<br />
wks<br />
79% SVR rate after 12 weeks of<br />
triple therapy vs 46% for<br />
PegIFN- RBV alone<br />
92% SVR rate in patients with<br />
eRVR treated for 24 wks vs 88%<br />
in those treated for 48 wks<br />
SVR rates for prior relapsers:<br />
86% vs 22%; for prior partial<br />
responders: 59% vs 15% and for<br />
prior null responders: 32% vs 5%<br />
63–66% SVR rates vs 38% in the<br />
control group<br />
59-66% SVR rates in prior partial<br />
responders and relapsers vs. 21%<br />
in the control group<br />
a) eRVR (extended rapid virologic response) - undetectable HCV RNA levels at wks 4 and 12;<br />
b) RGT - Response-guided therapy<br />
who have high chances of achieving sustained<br />
virological response (SVR) without protease inhibitors<br />
addition [22, 34]. Futility rules (indicating<br />
the need for treatment discontinuation if<br />
viral load remains detectable, at 4 and 12 weeks)<br />
have been established for both available protease<br />
inhibitors [33, 34].<br />
For patients infected with HCV genotypes<br />
2 or 3, the standard of care remains treatment<br />
with pegylated interferon alfa plus ribavirin, that<br />
achieves important sustained virological response<br />
rates (80% vs less than 60% in those with HCV<br />
genotype 1 infection), with a shorter duration of<br />
therapy (24 vs 48 weeks) [35].<br />
Other investigational first generation protease<br />
inhibitors are in advanced phases of clinical<br />
trials. The aim is to obtain drugs with<br />
superior efficacy and more favourable pharmacokinetic<br />
parameters in order to allow once or<br />
twice daily administration and a shortened duration<br />
of therapy. All these first generation PIs<br />
exhibit class-cross resistance, with emergence<br />
of drug resistant mutation in all cases of virologic<br />
breakthrough. Second-generation protease<br />
inhibitors, mostly non-covalent inhibitors of the<br />
NS3/4A, are under development. They exibit<br />
pan-genotypic activity and have different mutational<br />
profiles and higher barriers to resistance<br />
than first-generation PIs (Table 2).<br />
NS5B POLYMERASE INHIBITORS<br />
The NS5B encoded RNA-dependent RNA<br />
polymerase (RdRP) is similar in structure to the<br />
HIV reverse transcriptase, with the catalytic domain<br />
containing 531 residues folded in the conformation<br />
of a right hand with fingers and<br />
fingertips and separate domains forming the<br />
palm and thumb [45]. Accordingly, the polymerase<br />
inhibitors are designed following the<br />
model of the two active classes of HIV reverse<br />
transcriptase inhibitors:<br />
Nucleos(t)ide analogues compete with cellular<br />
nucleos(t)ides, acting as chain terminators<br />
and stopping the viral RNA elongation, giving<br />
rise to less replication-fit variants. Due to the<br />
highly conserved nature of the viral polymerase,<br />
these compounds are expected to be active<br />
across all HCV genotypes and subtypes. Although<br />
their antiviral efficacy is lower than that<br />
of protease inhibitors, they have a high barrier<br />
to resistance. These compounds have advanced<br />
to phase II trials (Table 3).<br />
Non-nucleos(t)ide inhibitors act via allosteric<br />
inhibition of the NS5B RdRP catalytic<br />
site, inducing conformational changes in the enzyme<br />
and reducing its activity. The presence of<br />
at least four different sites to which a non-nucleoside<br />
molecule could bind and cause inhibition<br />
(vs a single one in HIV RT), allow the<br />
8
Understanding the molecular targets for new therapeutical agents in hepatitis C infection<br />
Name/<br />
Manufacturer<br />
Simeprevir (TMC435)<br />
Tibotec Pharmaceutical<br />
[36]<br />
BI<strong>2013</strong>35/<br />
Boehringer Ingelheim<br />
Pharma<br />
[37]<br />
Asunaprevir<br />
(BMS 650032)/<br />
Bristol-Myers Squibb<br />
[38]<br />
Danoprevir<br />
(ITMN191/RG7227)/<br />
Roche<br />
[39, 40]<br />
Vaniprevir (MK-7009)/<br />
Merck & Co.<br />
[41]<br />
MK-5172/<br />
Merck & Co.<br />
[42]<br />
ABT-450/ritonavir<br />
Abbott and Enanta<br />
[43]<br />
ACH-1625<br />
[44]<br />
Table 2. Second-generation of protease inhibitors<br />
Activity<br />
Multiple genotypes<br />
(except genotype 3)<br />
Clinical trial<br />
phase<br />
III (ongoing)<br />
Previous results<br />
SVR rates: 85% for relapsers, 75% for<br />
partial responders and 51% for null<br />
responders in IIb trials<br />
Multiple genotypes III (ongoing) SVR rates: 71-83% in treatment-naïve<br />
and 28-41% in treatment-experienced<br />
patients<br />
Genotypes 1 and 4 IIa/IIb High EVR and SVR (80%) rates after<br />
48 wks of treatment with triple therapy<br />
irrespective of IL28B genotype<br />
Genotypes 1, 4 and 6 IIb SVR rates: 67- 93% in genotype 1 and<br />
100% in genotype 4, treatment-naive,<br />
non-cirrhotic adults. Better antiviral<br />
activity if boosted with ritonavir.<br />
Genotypes 1 and 2 IIb 74-85% response at wk 12 vs 67-84% at<br />
week 4 in treatment naïve patients<br />
All genotypes, except<br />
genotype 3<br />
II<br />
Viral load reduction with 4-5 log 10 in<br />
patients infected with either genotype 1<br />
or 3. Active against most variants<br />
resistant to first-generation protease<br />
inhibitors<br />
Genotype 1 IIa Complete early virological response at<br />
wk 12 in 92% treatment-naive,<br />
genotype 1 infected patients after<br />
3 days of monotherapy, followed by<br />
12 weeks of triple therapy then SOC<br />
alone for week 48 wks<br />
All genotypes, except<br />
genotype 3<br />
IIa<br />
Rapid viral response in 75-81% patients<br />
with triple therapy vs 20% in those<br />
receiving SOC only<br />
a) SVR - sustained virologic response; b) EVR - early virologic response, c) SOC - standard of care- pegylated<br />
interferon plus ribavirin<br />
design of drugs without cross-resistance. These<br />
compounds have a lower antiviral activity, a low<br />
barrier to resistance and are active only against<br />
HCV genotypes 1a and 1b. Therefore, their use<br />
could be limited to combination with other<br />
DAAs (Table 4).<br />
POTENTIAL INHIBITORS OF VIRUS ASSEMBLY<br />
NS5A Inhibitors. Daclatasvir (BMS<br />
790052), an NS5A replication complex inhibitor,<br />
active on genotypes 1 and 4, is currently<br />
in phase 3 clinical trial in combination with<br />
SOC. The drug may be administered once-daily<br />
and determines a rapid decline in HCV viral<br />
load [55].<br />
Phase 1b studies for NS5A nucleotide inhibitors,<br />
such as PPI 461 (with pan- genotypes<br />
activity) and GSK2336805 (active on genotypes<br />
1a, 1b, 2a and 4), are also ongoing [56].<br />
Cyclophilin analogues. Host cyclophilins<br />
are important factors involved in protein folding.<br />
Cyclophilin inhibitors block the interaction<br />
of cyclophilins with HCV NS5A, thus preventing<br />
the development of a functional viral replication<br />
complex. Alisporivir (Debio-025) is a<br />
non-immunosuppressive cyclosporin analog,<br />
that has important antiviral activity in both HCV<br />
monoinfected and HIV/HCV coinfected patients.<br />
After 28 days of administion, combined<br />
9
VAGU et al.<br />
Table 3. Nucleotide Polymerase Inhibitors-NPI<br />
Name/ Manufacturer<br />
R7128/<br />
Roche & Pharmasset<br />
[46]<br />
Mericitabine<br />
(RG7128)/ Gilead<br />
[47]<br />
PSI-7977/ Pharmasset,<br />
Inc, Sofosbuvir<br />
[48]<br />
Activity<br />
Clinical trial<br />
phase<br />
Previous results<br />
Multiple genotypes IIb 88% of treatment naïve patients infected with<br />
genotype 2 or 3 and 90% of nonresponders<br />
RVR<br />
All genotypes IIb High rates of RVR and cEVR in treatmentnaive<br />
patients with genotype 1 or 4 HCV<br />
infection<br />
Genotypes 1, 2, 3 IIb SVR in 98% treatment naïve patients infected<br />
with genotype 1. A pilot study showed high<br />
rates of SVR also in those with genotypes 2 or<br />
3<br />
INX-08189/BMS-<br />
986094/<br />
Bristol-Myers Squibb<br />
[49]<br />
Genotypes 1, 2, 3 IIb The phase IIb trial was suspended in August,<br />
2012, after a case of heart failure<br />
a) RVR - rapid virologic response; b) cEVR - complete early virologic response, c) SVR - sustained virologic<br />
response; d) SOC- standard of care- pegylated interferon plus ribavirin<br />
with PegIFN-alpha2a, it determined significant<br />
viral load reduction in patients infected with<br />
genotypes 1, 3 and 4 [57].<br />
FUTURE DIRECTIONS<br />
Combinations of Direct Acting Antivirals<br />
with Different Mechanisms of Action.<br />
By analogy with the HAART (highly active<br />
antiretroviral therapy) regimens available for<br />
HIV infection, that associate drugs from different<br />
classes, combinations of potent DAAs with<br />
divergent mechanism of actions are tested in<br />
chronically HCV infected patients. Drugs with<br />
different mechanisms of action will be an attractive<br />
strategy for hepatitis C. Due to the fact that<br />
HCV replication occurs entirely intracytoplasmic<br />
and is limited to hepatocytes, without any<br />
extracellular reservoirs (unlike the proviral DNA<br />
Name/<br />
Manufacturer<br />
BI207127/<br />
Boehringer Ingelheim<br />
[50]<br />
Filibuvir/ Pfizer<br />
[51]<br />
ABT 072/Abbott<br />
[52]<br />
ANA598 (Setrobuvir)/<br />
Anadys<br />
[53]<br />
ABT 333/<br />
Abbott<br />
[52]<br />
GS9190/<br />
Gilead<br />
[54]<br />
10<br />
Activity<br />
Table 4. Results of clinical trials of NNPI<br />
Clinical<br />
trial phase<br />
Previous<br />
results<br />
Genotype 1 IIa EVR rates of 92.3% in treatment naive and of<br />
20% in treatment experienced patients<br />
Genotype 1 IIb Response rates of 60-70% at week 48, but 20-<br />
50% relapsed by week 60<br />
Genotype 1 IIa EVR in 70% cases after 12 wks of triple<br />
therapy<br />
Genotype 1 IIb EVR in 73% cases after 12 wks of triple<br />
therapy<br />
Genotype 1 IIa EVR in 75% cases after 12 wks of triple<br />
therapy<br />
Genotype 1 IIb Increased EVR rates, but no increase in SVR<br />
rate compared to SOC alone after 24-48 wks of<br />
triple therapy<br />
a) EVR - early virologic response; b) SVR - sustained virologic response; c) SOC - standard of care- pegylated<br />
interferon plus ribavirin
Understanding the molecular targets for new therapeutical agents in hepatitis C infection<br />
Table 5. Current DAA w combination therapies with or without PEG-IFN/RBV in clinical development<br />
COMBINATION/<br />
Manufacturer<br />
NS3 Protease Inhibitor<br />
(Danoprevir/ritonavir-boosted)+<br />
NS5B Nucleoside Inhibitor<br />
(RG7128)/<br />
Hoffmann-LaRoche/ Genentech<br />
[60]<br />
RBV or PegIFN-<br />
RBV<br />
No<br />
DAAs alone<br />
Patients<br />
Treatment Naïve<br />
+ Experienced<br />
Comments<br />
HCV RNA decreased with<br />
5.1 log10 in treatmentnaive<br />
patients and with<br />
4·9 log10 in previous null<br />
responders<br />
NS3 Protease Inhibitor (Telaprevir)+<br />
NS5B Non-Nucleoside Inhibitor<br />
(VX-222)/<br />
Vertex Pharmaceuticals<br />
[61]<br />
NS3 Protease Inhibitor<br />
(BMS-650032)+<br />
NS5A Inhibitor (BMS-790052)/<br />
Bristol-Myers Squibb<br />
[62]<br />
NS3 Protease Inhibitor<br />
(BI <strong>2013</strong>35) +<br />
NS5B Non-Nucleoside. Inhibitor<br />
(BI207127)/ Boehringer Ingelheim<br />
[63]<br />
NS3 Protease Inhibitor<br />
(ABT-450/r) +<br />
NS5B Non-Nucleoside Inhibitor<br />
(ABT072)/<br />
Abbot Laboratories<br />
[64]<br />
NS5B Nucleoside Inhibitors<br />
(PSI-7977 + PSI-938) / Pharmasset<br />
[65]<br />
Association with<br />
PegIFN/RBV<br />
Both DAAs alone<br />
and associated with<br />
PegIFN/RBV<br />
Association with<br />
RBV<br />
Association with<br />
RBV<br />
Treatment Naive<br />
Prior nullresponders<br />
Treatment Naive<br />
Treatment Naive<br />
82-93% SVR rates after<br />
12 weeks of treatment<br />
(depending on the DAAs<br />
doses)<br />
cEVR achieved in 5/11<br />
patients treated with DAA<br />
combination and in 9/10<br />
patients treated with DAA<br />
and pegIFN/RBV<br />
100% RVR in patients<br />
treated with the highest<br />
doses<br />
EVR in 91% of patients<br />
with IL28B CC genotype,<br />
82% had undetectable<br />
HCV RNA after 36 weeks<br />
DAAs alone Treatment Naive Safe and well tolerated<br />
over 714 days<br />
a) SVR - sustained virologic response; b) cEVR - complete early virologic response, c) RVR- rapid virologic response<br />
integrated in PBMCs for HIV or the cccDNA integrated<br />
in hepatocytes for HBV), it seems possible<br />
that chronic hepatitis C will become the<br />
first chronic infection to be cured. Based on the<br />
estimated total body viral burden of 10 11 virions<br />
and on the proposed model of 2 phases of viral<br />
clearance (with a sharp decline of 3.5 log 10 in<br />
the first 36 hours, followed by clearance of free<br />
virions and subsequent loss of infected hepatocytes)<br />
it was proposed that triple therapy with<br />
DAAs will conduct to HCV eradication in 8-12<br />
weeks [58]. Future treatment directions [59]<br />
focus on:<br />
Quadruple therapy, based on the addition<br />
of two DAA agents from different classes to<br />
PegIFN-RBV, that may prove to be particularly<br />
useful for HCV relapsers and partial/null responders.<br />
Interferon-free combinations, based on<br />
the use of two DAAs with a high barrier to resistance,<br />
with or without RBV, that will probably<br />
be reserved for patients with intolerance or<br />
with contraindications to IFN/RBV or for those<br />
with very low response rates (decompensated<br />
cirrhosis, recurrence following solid organ<br />
transplantation, null-responders). It seems probable<br />
that RBV will still be required, due to its<br />
antiviral activity, and its contribution to the virologic<br />
success, both in terms of acquiring and<br />
maintaining the sustained response and lower<br />
the relapse rate. An overview of current trials is<br />
given in Table 5.<br />
CONCLUSIONS<br />
Intimate knowledge of the HCV life cycle<br />
allowed the development of a series of novel<br />
11
VAGU et al.<br />
anti-HCV agents (both direct-acting antivirals-<br />
DAAs and agents that target host-specific molecules),<br />
with the aim of augmenting the efficacy<br />
of SOC therapy. Although triple therapy with a<br />
protease inhibitor and PEG-IFN/RBV will likely<br />
remain the standard of care for patients with<br />
genotype 1 chronic HCV infection, several second<br />
generation protease inhibitors and NS5A<br />
inhibitors are in advanced phases of clincal studies,<br />
with very promising results. Meanwhile,<br />
combinations of DAAs with or without IFN and<br />
RBV are being tested as alternatives, with<br />
watchfulness towards the potential development<br />
of multidrug resistance.<br />
ACKNOWLEDGEMENTS<br />
SULTANA CAMELIA was supported by<br />
the Sectoral Operational Programme Human<br />
Resources Development (SOP HRD), financed<br />
from the European Social Fund and by the Romanian<br />
Government under the contract number<br />
POSDRU/89/1.5/S/64109.<br />
REFERENCES<br />
1. National Institutes of Health Consensus Development<br />
Conference Statement: Management of hepatitis C.<br />
Gastroenterology 2002. 123(6): 2082-2099.<br />
2. Deuffic-Burban S, Poynard T, Sulkowski MS, Wong<br />
JB. Estimating the future health burden of chronic hepatitis<br />
C and human immunodeficiency virus infections<br />
in the United States. J Viral Hepat 2007.14:107-115.<br />
3. Choo QL, Richman KH, Han JH, Berger K, Lee C,<br />
Dong C, Gallegos C, Coit D, Medina-Selby R, Barr<br />
PJ. Genetic organization and diversity of the hepatitis<br />
C virus. Proc Natl Acad Sci USA 1991. 88:2451-2455.<br />
4. Rice CM. New insights into HCV replication: potential<br />
antiviral targets. Top Antivir Med 2011.19:117–120.<br />
5. Blight KJ, McKeating JA, Rice CM. Highly permissive<br />
cell lines for subgenomic and genomic hepatitis C<br />
virus RNA replication. J Virol 2002.76:13001-13014.<br />
6. Wakita T, Pietschmann T, Kato T, Date T, Miyamoto<br />
M, Zhao Z, Murthy K. Production of infectious he -<br />
patitis C virus in tissue culture from a cloned viral<br />
genome. Nat Med 2005.11:791-796.<br />
7. Yu X, Qiao M, Atanasov I, Hu Z, Kato T, Liang TJ,<br />
Zhou ZH. Cryo-electron microscopy and three-dimensional<br />
reconstructions of hepatitis C virus particles. Virology<br />
2007. 367:126-34.<br />
8. Dorner M, Horwitz JA, Robbins JB, Barry WT,<br />
Feng Q, Mu K. A genetically humanized mouse model<br />
for hepatitis C virus infection. Nature 2011. 474:208-<br />
211.<br />
9. Washburn ML, Bility MT, Zhang L, Kovalev GI,<br />
Buntzman A, Frelinger JA, Barry W, Ploss A, Rice<br />
CM, Su L. A humanized mouse model to study hepatitis<br />
C virus infection, immune response, and liver disease.<br />
Gastroenterology 2011. 140:1334-1344.<br />
10. Sainz B Jr, Barretto N, Martin DN, Hiraga N, Imamura<br />
M, Hussain S, Marsh KA, Yu X, Chayama<br />
K, Alrefai WA, Uprichard SL. Identification of the<br />
Niemann-Pick C1-like 1 cholesterol absorption receptor<br />
as a new hepatitis C virus entry factor. Nat Med<br />
2012. 18(2):281-285.<br />
11. Syder AJ, Lee H, Zeisel MB, Grove J, Soulier E,<br />
Macdonald J, Chow S, Chang J, Baumert TF,<br />
McKeating JA, McKelvy J, Wong-Staal F. Small<br />
molecule scavenger receptor BI antagonists are potent<br />
HCV entry inhibitors. J Hepatol 2011. 54(1):48-55.<br />
12. Zhu H, Wong-Staal F, Lee H, Syder A, McKelvy J,<br />
Schooley RT, Wyles DL. Evaluation of ITX 5061, a<br />
Scavenger Receptor B1 Antagonist: Resistance Selection<br />
and Activity in Combination With Other Hepatitis<br />
C Virus. Antivirals J Infect Dis 2012. 205(4): 656-662.<br />
13. Otto GA, Puglisi JD. The pathway of HCV IRESmediated<br />
translation initiation. Cell 2004. 119:369–<br />
380.<br />
14. Lorenz IC, Marcotrigiano J, Dentzer TG, Rice<br />
CM. Structure of the catalytic domain of the hepatitis<br />
C virus NS2-3 protease. Nature 2006. 442:831–835.<br />
15. Bartenschlager R, Lohmann V, Wilkinson T,<br />
Koch JO. Complex formation between the NS3 serine-type<br />
proteinase of the hepatitis C virus and NS4A<br />
and its importance for polyprotein maturation. J Virol<br />
1995. 69:7519–7528.<br />
16. Neumann AU, Lam NP, Dahari H, Gretch DR,<br />
Wiley TE, Layden TJ, Perelson AS. Hepatitis C viral<br />
dynamics in vivo and the antiviral efficacy of interferon-alpha<br />
therapy, Science 1998. 282(5386):103-<br />
107.<br />
17. Vauloup-Fellous C, Pene V, Garaud-Aunis J,<br />
Harper F, Bardin S, Suire Y. Signal peptide peptidase-catalyzed<br />
cleavage of hepatitis C virus core protein<br />
is dispensable for virus budding but destabilizes<br />
the viral capsid. J Biol Chem 2006. 281:27679–27692<br />
18. Gao M, Nettles RE, Belema M, Snyder LB, Nguyen<br />
VN, Fridell RA, Serrano-Wu MH, Langley DR,<br />
Sun JH, O’Boyle DR. Chemical genetics strategy<br />
identifies an HCV NS5A inhibitor with a potent clinical<br />
effect. Nature 2010. 465: 96–100.<br />
19. Moradpour D, Penin F, Rice CM Replication of hepatitis<br />
C virus. Nat Rev Microbiol 2007. 5: 453–463.<br />
20. Reiss S, Rebhan I, Backes I, Romero-Brey I, Erfl<br />
H, Matula P, Kaderali L, Poenisch M, Blankenburg<br />
H, et al. Recruitment and activation of a lipid kinase<br />
by hepatitis C virus NS5A is essential for<br />
integrity of the membranous replication compartment.<br />
Cell Host & Microbe 2011. 9(1):32-45.<br />
21. Sarrazin C, Kieffer TL, Bartels D, Hanzelka B,<br />
Muh U, Welker M. Dynamic hepatitis C virus genotypic<br />
and phenotypic changes in patients treated with<br />
the protease inhibitor telaprevir. Gastroenterology<br />
2007.132:1767–1777.<br />
22. Susser S, Welsch C, Wang Y, Zettler M, Domingues<br />
FS, Karey U, Hughes E, Ralston R. Characterization<br />
of resistance to the protease inhibitor boceprevir in<br />
hepatitis C virus-infected patients. Hepatology 2009.<br />
12
Understanding the molecular targets for new therapeutical agents in hepatitis C infection<br />
50:1709–1718.<br />
23. Gale MJr, Korth MJ, Katze MG. Repression of the<br />
PKR protein kinase by the hepatitis C virus NS5A protein:<br />
a potential mechanism of interferon resistance.<br />
Clinical and Diagnostic Virology 1998. 10 (2-3):157–<br />
162.<br />
24. Johnson C, Owen D, and Gale MJr. Functional and<br />
therapeutic analysis of hepatitis C virus NS3/4A protease<br />
control of antiviral immune defense. Journal of<br />
Biological Chemistry 2007. 282 (14): 10792–10803.<br />
25. Pearlman L. Protease inhibitors for the treatment of<br />
chronic hepatitis C genotype-1 infection: the new standard<br />
of care–review. The Lancet Infectious Diseases<br />
2012. 12(9):717-728.<br />
26. Bacon BR, Gordon SC, Lawitz E, Marcellin P. Boceprevir<br />
for previously treated chronic HCV genotype<br />
1 infection. N Engl J Med 2011. 364:1207-1217.<br />
27. Zeuzem S, Andreone P, Pol S, Lawitz E. Telaprevir<br />
for retreatment of HCV infection. N Engl J Med 2011.<br />
364:2417-2428.<br />
28. Jacobson IM, McHutchison JG, Dusheiko G.<br />
Telaprevir for previously untreated chronic hepatitis<br />
C virus infection. N Engl J Med 2011. 364:2405-<br />
2416.<br />
29. Sherman KE, Flamm SL, Afdhal NH, Nelson DR,<br />
Sulkowski MS, Everson GT. Response-guided<br />
telaprevir combination treatment for hepatitis C virus<br />
infection. N Engl J Med 2011. 365: 1014-1024.<br />
30. Foster GR, Zeuzem S, Andreone P, Pol S, Lawitz<br />
EJ, Diago M, Roberts S. et al Subanalyses of the<br />
telaprevir lead-in arm in the REALIZE study: response<br />
at week 4 is not a substitute for prior null response<br />
categorization. J Hepatol 2011. 54, S3-S4.<br />
31. Poordad F, McCone J. Jr, Bacon BR, Bruno S,<br />
Manns MP, Sulkowski MS. Boceprevir for untreated<br />
chronic HCV genotype 1 infection. N Engl J Med<br />
2011. 364:1195–1206<br />
32. Bacon BR, Gordon SC, Lawitz E. HCV RESPOND-<br />
2 final results: high sustained virologic response<br />
among genotype 1 previous nonresponders and relapsers<br />
to peginterferon/ribavirin when re-treated with<br />
boceprevir plus pegintron (peginterferon alfa-2b)/ribavirin.<br />
Hepatology 2010. 52: 430A.<br />
33. US Food and Drug Administration. Approval of Incivek<br />
(telaprevir), a direct acting antiviral drug (DAA)<br />
to treat hepatitis C (HCV). Available from:<br />
http://www.fda.gov/ForConsumers/ByAudience/For-<br />
PatientAdvocates/ucm256328.htm<br />
34. US Food and Drug Administration. Approval of Victrelis<br />
(boceprevir), a direct acting antiviral drug<br />
(DAA) to treat hepatitis C virus (HCV). Available<br />
from: http://www.fda.gov/ForConsumers/ByAudience/ForPatientAdvocates/<br />
ucm255413.htm<br />
35. Zeuzem S, Berg T, Moeller B, Hinrichsen H, Mauss<br />
S, Wedemeyer H, Sarrazin C, et al. Expert opinion<br />
on the treatment of patients with chronic hepatitis C.<br />
J Viral Hepat 2009. 16(2): 75–90.<br />
36. Marcellin P, Reesink H, Berg T, Cramp M, Flisiak<br />
R, Van Vlierberghe H, Verloes R, Lenz O, Peeters<br />
M, Sekar V, De Smedt G. Antiviral activity and<br />
safety of TMC435 combined with peginterferon a-2a<br />
and ribavirin in patients with genotype-1 hepatitis C<br />
infection who failed previous IFN-based therapy. J<br />
Hepatol 2009. 50: S 385<br />
37. Sulkowski MS, Bouliere M, Bronowicki J-P,<br />
Streinu-Cercel A, Preotescu L, Asselah T, et al.<br />
SILEN-C2: sustained virologic response (SVR) and<br />
safety of BI<strong>2013</strong>35 combined with peginterferon alfa-<br />
2a and ribavirin (P/R) in chronic HCV genotype-1 patients<br />
with non-response to P/R J Hepatol 2011, 54: S30<br />
38. Bronowicki J-P, Pol S, Thuluvath P. Asunaprevir<br />
(ASV; BMS-650032), an NS3 protease inhibitor, in<br />
combination with peginterferon and ribavirin in treatment-naive<br />
patients with genotype 1 chronic hepatitis<br />
C infection). J Hepatol 2011. 54: S472.<br />
39. Everson G, Cooper C, Hézode C, Shiffman ML,<br />
Yoshida E, Beltran-Jaramillo T, Ferenci P. Rapid<br />
and sustained achievement of undetectable HCV RNA<br />
during treatment with ritonavir-boosted danoprevir/<br />
Peg-IFNα-2A/RBV in HCV genotype 1 or 4 patients:<br />
DAUPHINE week 12 interim analysis. The EASL International<br />
Liver Congress 2012, Barcelona April 18-<br />
22, 2012<br />
40. Gane E, Rouzier R, Stedman C, Wiercinska-Drapalo<br />
E, Horban A, Chang L, Zhang Y. Ritonavir<br />
boosting of low dose RG7227/ITMN-191, HCV<br />
NS3/4A protease inhibitor, results in robust reduction<br />
in HCV RNA at lower exposures than provided by unboosted<br />
regimens. J Hepatol 2010. 52: S16-S17<br />
41. Manns M, Lee A. Sustained viral response (SVR)<br />
rates in genotype 1 treatment-naïve patients with<br />
chronic hepatitis C (CHC) infection treated with vaniprevir<br />
(MK-7009), a NS3/4a protease inhibitor, in<br />
combination with pegylated interferon alfa-2a and ribavirin<br />
for 28 days. http://www.natap.org/2010/<br />
AASLD/AASLD_24.htm<br />
42. S. Ludmerer, N. Liverton, J. McCauleya. Discovery<br />
of MK-5172 a next generation HCV NS3/4a protease<br />
inhibitor: raising the bar of this important class of molecules,<br />
International Conference on Viral Hepatitis<br />
2012, New York, March 26-27, 2012. Abstract 79328.<br />
43. Lawitz E, Gaultier I, Poordad F, Cohen DE,<br />
Menon R, Larsen LM. 1220 ABT-450/ritonavir<br />
(ABT-450/R) combined with pegylated interferon<br />
alpha-2A and ribavirin (SOC) after 3-day monotherapy<br />
in Genotype 1 HCV-infected treatment-naive subjects:<br />
12-week interim efficacy and safety results. J<br />
Hepatol 2011. 54: S482.<br />
44. Lalezari J, Hazan L, Kankam M, Lawitz E. High<br />
rapid virologic response (RVR) with ACH-1625 daily<br />
dosing plus pegIFN-Alpha 2A/RBV in a 28-day phase<br />
2A trial. 62nd Annual Meeting of the American Association<br />
for the Study of Liver Diseases. San Francisco,<br />
Nov 6-9, 2011. Abstract 1341.<br />
45. Bressanelli S, Tomei L, Roussel A, Incitti I, Vitale<br />
RL, Mathieu M, De Francesco R, Rey FA. Crystal<br />
structure of the RNA-dependent RNA polymerase of<br />
hepatitis C virus, PNAS 1999. 96 (23): 13034–13039.<br />
46. Gane EJ, Rodriguez-Torres M, Nelson DR. Antiviral<br />
activity of the HCV nucleoside polymerase inhibitor<br />
R7128 in HCV genotype 2 and 3 prior<br />
non-responders: interim results of R7128 1500mg<br />
BID with PEG-IFN and ribavirin for 28 days. Hepatology<br />
2008. 48: ALB10.<br />
13
VAGU et al.<br />
47. Jensen DM, Wedemeyer H, Herring RW, Ferenci<br />
P, Ma MM, Zeuzem S, Rodriguez-Torres M, et al.<br />
High rates of early viral response, promising safety<br />
profile and lack resistance-related breakthrough in<br />
HCV GT1/4 patients treated with RG7128 plus<br />
pegIFN alfa-2a (40KD)/RBV: planned week 12 interim<br />
analysis from the PROPEL study. 61st Annual<br />
Meeting of the American Association for the Study of<br />
Liver Diseases. Boston, October 29 - November 2,<br />
2010, Abstract 81.<br />
48. Lawitz E, Lalezari JP, Hassanein T, et al. Oncedaily<br />
PSI-7977 plus Peg/RBV in treatment-naïve patients<br />
with HCV GT1: robust end of treatment<br />
response rates are sustained post-treatment. Hepatology<br />
2011. 54 (suppl 1):225.<br />
49. U.S. National Institutes of Health. ClinicalTrial.gov,<br />
Phase 2b study of BMS-986094 and daclatasvir, with<br />
or without ribavirin for the treatment of patients with<br />
chronic hepatitis C, available from http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01629732<br />
50. Larrey D, Levin J, Lohse A, de Ledinghen V, Trepo<br />
C, Gerlach T. 4 week therapy with the non-nucleosidic<br />
polymerase inhibitor BI 207127 in combination<br />
with peginterferon alfa2A and ribavirin in treatment<br />
naïve and treatment experienced chronic HCV GT1<br />
patients. Journal of Hepatology 2010. 52 (suppl 1):<br />
S466<br />
51. Jacobson IM, Pockros PJ, Lalezari J, Lawitz E,<br />
Rodriguez-Torres M, et al. Virologic response rates<br />
following 4 weeks of filibuvir in combination with pegylated<br />
interferon alfa-2a and ribavirin in chronically<br />
infected HCV genotype 1 patients. J Hepatol 2010. 52<br />
(suppl 1): S465<br />
52. Middleton T, He Y, Beyer J. Factors affecting HCV<br />
viral load response to the non-nucleoside polymerase<br />
inhibitors ABT-072 and ABT-033. J Hepatol 2011, 54<br />
(suppl 1): S483-S484.<br />
53. National AIDS Treatment Advocacy Project Organisation<br />
(NATAP). ANA-598 HCV non-nuke Phase 2b<br />
study preliminary data results, 2011. Available from:<br />
http://www.natap.org/2011/HCV/101411_01.htm.<br />
54. U.S. National Institutes of Health-ClinicalTrial.gov.<br />
Efficacy and safety study of GS-9256 and GS-9190<br />
Alone and in Combination With Ribavirin for 28 Days<br />
in Patients With Chronic Hepatitis C Virus Infection.<br />
Available from: http://clinicaltrials.gov/ct2/show/<br />
NCT01072695<br />
55. Nettles R, Chien C, Chung E, Persson A, Gao M,<br />
Belema M. BMS-790052 is a first-in-class potent hepatitis<br />
C virus (HCV) NS5A inhibitor for patients with<br />
chronic HCV infection: Results from a proof-of-concept<br />
study. Hepatology 2008. 48(suppl): LB12–LB12.<br />
56. Lalezari JP, Agarwal K, Dusheiko G. Dose-ranging<br />
trial of PPI- 461, a potent new pan-genotypic HCV<br />
NS5A inhibitor, in patients with HCV genotype-1 infection.<br />
Hepatology 2011. 54:400A.<br />
57. Flisiak R, Feinman SV, Jablkowski M. The cyclophilin<br />
inhibitor Debio 025 combined with PEG-<br />
IFN alpha2a significantly reduces viral load in<br />
treatment naive hepatitis C patients. Hepatology 2009.<br />
49:1460-1468.<br />
58. Ohara E, Hiraga N, Imamura M, et al. Elimination<br />
of hepatitis C virus by short term NS3-4A and NS5B<br />
inhibitor combination therapy in human hepatocyte<br />
chimeric mice. J Hepatol 2011. 54: 872–878.<br />
59. Zeuzem S, Buggisch P, Agarwal K. Dual, triple, and<br />
quadruple combination treatment with a protease inhibitor<br />
(GS-9256) and a polymerase inhibitor (GS-<br />
9190) alone and in combination with ribavirin (RBV)<br />
or PegIFN/RBV for up to 28 days in treatment-naive,<br />
genotype 1 HCV subjects. The 61st Annual Meeting<br />
of the American Association for the Study of Liver<br />
Diseases. Boston, October 29 - November 2, 2010,<br />
Abstract LB-1.<br />
60. Gane EJ, Roberts SK, Stedman CA. Oral combination<br />
therapy with a nucleoside polymerase inhibitor<br />
(RG7128) and danoprevir for chronic hepatitis C<br />
genotype 1 infection (INFORM-1): a randomised,<br />
double-blind, placebo-controlled, dose- escalation<br />
trial. Lancet 2010. 376:1467-1475.<br />
61. Nelson DR, Gane EJ, Jacobson IM, Di Bisceglie<br />
AM, Alves K, Koziel MJ. VX-222/Telaprevir in combination<br />
with peginterferon-alfa-2a and ribavirin intreatment-naive<br />
genotype 1 HCV patients treated for<br />
12 weeks: Zenith study, SVR 12 interim analyses. Hepatology<br />
2011. 54:1442.<br />
62. Lok AS, Gardiner DF, Lawitz E. Combination therapy<br />
with BMS-790052 and BMS-650032 alone or<br />
with PEGIFN/RBV results in undetectable HCV RNA<br />
through 12 weeks of therapy in HCV genotype 1 null<br />
responders. Hepatology 2010. 52:877A.<br />
63. Zeuzem S, Asselah T, Angus PW. Strong antiviral<br />
activity and safety of IFN-sparing treatment with the<br />
protease inhibitor BI <strong>2013</strong>35, the HCV polymerase inhibitor<br />
BI 207127 and ribavirin in patients with<br />
chronic hepatitis C. Hepatology 2010, 52:876A.<br />
64. Lawitz E, Poordad F, Kowdley KV. A 12-week interferon-free<br />
regimen of ABT-450/r, ABT-072, and<br />
ribavirin was well tolerated and achieved sustained virologic<br />
response in 91% treatment-naïve HCV IL28B-<br />
CC genotype-1-infected subjects. EASL International<br />
Liver Congress 2012, Barcelona April 18-22, 2012.<br />
Abstract 13.<br />
65. Lawitz E, Rodriguez-Torres M, Denning J. Once<br />
daily dual nucleotide combination of PSI-938 and PSI-<br />
7977 provides 94% HCV RNA
AGeNÞI TeRAPeUTICI CU ACÞIUNe DIReCTÃ ANTIVIRALÃ<br />
ÎN INFeCÞIA CU VIRUs HePATITIC C - NOI ÞINTe MOLeCULARe<br />
Codruþa Vagu 1 , Camelia Sultana 1,2 , Simona Ruþã 1,2 *<br />
¹Universitatea de medicinã şi Farmacie Carol davila, bucureşti, România<br />
² institutul de virusologie Ştefan s. nicolau, bucureşti, România<br />
ReZUMAT<br />
Inţelegerea mecanismelor care stau la baza replicării virusului hepatitic C (VHC) au condus la identificarea<br />
unor noi ţinte moleculare şi la dezvoltarea unor compuşi terapeutici cu acţiune directă antivirală<br />
(direct acting antivirals - DAA), aflaţi în studii clinice de fază avansată. Aceştia acţionează<br />
direct asupra proteinelor VHC: proteaza NS3-4A (implicată în prelucrarea post-traducere a proteinelor<br />
virale), NS5B (ARN-polimeraza ARN-dependentă ce catalizează replicarea genomului viral) şi NS5A<br />
(cu rol atât în formarea complexului replicativ, cât şi în asamblarea virală). Sunt în studiu, de asemenea,<br />
agenţi terapeutici care țintesc proteine ale gazdei implicate fie în fazele timpurii ale replicării virale<br />
(inhibitori ai receptorilor sau coreceptorilor), fie în momentul formării complexului replicativ (inhibitorii<br />
ciclofilinelor).<br />
Recent au fost aprobaţi şi introduşi în practică 2 inhibitori de protează NS3-4A (telaprevir şi boceprevir),<br />
administraţi în asociere cu interferonul pegylat şi ribavirina pentru tratarea pacienţilor infectaţi<br />
cu genotipul 1 al VHC. Tripla combinaţie determină o creştere semnificativă a ratei de răspuns virusologic<br />
susţinut (66-75% în cazul pacienţilor anterior naivi terapeutic şi 59-66% în cazul celor cu eşec<br />
terapeutic anterior).<br />
Ultimele studii clinice raportează alternative valoroase de creştere a eficienţei terapeutice utilizând:<br />
inhibitorii de protează de generaţia a doua, inhibitorii ARN - polimerazei NS5B (analogii nucleozidici<br />
şi non-nucleozidici) şi inhibitorii NS5A.<br />
O nouă direcţie de cercetare este reprezentată de evaluarea eficienţei combinaţiilor de agenţi antivirali<br />
din diferite clase terapeutice, cu scopul de a limita apariţia variantelor virale rezistente şi de a eradica<br />
infecţia VHC.<br />
Cuvinte cheie: ciclu replicativ VHC, inhibitori ai internalizãrii VHC, inhibitori de proteazã Ns3-4A, inhibitori de<br />
polimerazã Ns5B, inhibitorii Ns5A<br />
INTRODUCERE<br />
Infecţia cronică cu virusul hepatitei C<br />
(VHC) afectează 170 milioane de persoane<br />
(apro ximativ 3% din populaţia globului), devenind<br />
o importantă problemă de sănătate publică[1].<br />
80% dintre pacienţii infectaţi vor<br />
dezvolta hepatită C cronică, urmată, în 20-40%<br />
din cazuri de evoluţie spre ciroză, decompensare<br />
hepatică, sau dezvoltarea carcinomului hepatic<br />
primitiv, pe plan mondial, infecţia cronică cu<br />
VHC reprezentând cauza cea mai frecventă de<br />
transplant hepatic. În absenţa unui tratament an-<br />
tiviral adecvat, numărul pacienţilor infectaţi<br />
VHC, cu boala hepatică în stadiu terminal, va<br />
creşte dramatic în următorul deceniu [2].<br />
Înţelegerea mecanismelor moleculare din<br />
cursul ciclului replicativ VHC poate duce la dezvoltarea<br />
unui tratament antiviral specific, cu eficacitate<br />
sporită comparativ cu terapia standard<br />
recomandată în prezent (interferon pegylat alfa<br />
şi ribavirină).<br />
VHC face parte din familia Flaviviridae,<br />
genul hepacivirus. Este un virus anvelopat, cu<br />
genom ARN simplu spiralat de aproximativ 9,6<br />
*autor corespondent: simona Ruþã, Institutul de Virusologie Ştefan s. Nicolau, Şos. Mihai Bravu, nr. 285, 030304, Bucureşti, România,<br />
Telefon/Fax:+40213242590, e-mail: simona@simonaruta.ro<br />
15
VAGU et al.<br />
kb, cu polaritate pozitivă, ce codifică trei proteine<br />
structurale (core, E1, E2) şi şapte proteine<br />
non-structurale (p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B,<br />
NS5A, NS5B). Regiunile noncodante de la capetele<br />
3’ şi 5’ ale genomului conţin secvenţe nucleotidice<br />
importante în reglarea replicării virale<br />
[3].<br />
O serie de descoperiri recente permit o mai<br />
bună înţelegere a mecanismelor replicării virale<br />
[4]:<br />
1. repliconii genomici şi subgenomici VHC folosiţi<br />
pentru transfecţia in vitro a liniei Huh-7 au<br />
permis studierea ciclului replicativ VHC [5];<br />
2. sistemele recombinante au facut posibilă izolarea<br />
în culturi celulare a particulelor infecţioase<br />
VHC [6];<br />
3. un număr mare de particule asemănătoare virionilor<br />
VHC (VHC-like particles) au fost<br />
produse în culturi de insecte utilizând un baculovirus<br />
modificat [7];<br />
4. s-au dezvoltat modelele animale (şoareci<br />
transgenici) ce pot susţine parţial replicarea<br />
virală [8, 9].<br />
FAZA DE ECLIPSÃ A REPLICÃRII VIRALE -<br />
COMPUŞI ÞINTÃ PENTRU PROCESELE DE<br />
ADSORBÞIE ŞI INTERNALIZARE<br />
Adsorbţia VHC este iniţiată prin interacţiunea<br />
specifică între proteinele virale E1 şi E2 şi<br />
receptorii specifici de pe suprafaţa celulară, urmată<br />
de internalizare prin endocitoza mediată<br />
clatrina şi decapsidarea virusului. Posibilii liganzi<br />
pentru E1 şi E2 includ un complex de<br />
receptori şi coreceptori: tetraspanina CD81,<br />
claudina-1, ocludina, receptorul scavenger tipul<br />
1 clasa B (SR-B1), receptorul pentru LDL,<br />
glicozaminoglicanii, moleculele de adeziune<br />
intercelulară din celulele dendritice şi limfoide<br />
(DC-SIGN/L-SIGN) [5, 6].<br />
Este de subliniat faptul că multe molecule<br />
implicate în metabolismul lipidic sunt esenţiale<br />
în această etapă: receptorul scavenger tipul 1<br />
clasa B (SR-B1) (principalul receptor pentru<br />
HDL), receptorul LDL şi, mai recent identificat,<br />
receptorul Niemann-Pick C1-like 1 (NPC1L1),<br />
exprimat doar pe hepatocitele umane şi ale primatelor.<br />
Se presupune că NPC1L1 mediază îndepărtarea<br />
colesterolului asociat virionilor,<br />
determinând modificări structurale ce facilitează<br />
internalizarea virusului [10].<br />
Existenţa acestei interconexiuni între metabolismul<br />
lipidic şi internalizarea virală permit<br />
dezvoltarea unor agenţi antivirali care să acţioneze<br />
în fazele timpurii ale replicării virale:<br />
- Ezetimibe, un antagonist al receptorului<br />
NPC1L1, aprobat de FDA ca inhibitor selectiv<br />
al absorbţiei colesterolului, şi-a dovedit eficienţa<br />
in vitro inhibând internalizarea VHC, iar în<br />
cazul şoarecilor cu grefe de ficat uman s-a<br />
observat întârzierea debutului infecţiei cu genotip<br />
1 VHC [8].<br />
- ITX 5061, iniţial recomandat pentru bolile<br />
inflamatorii, datorită acţiunii sale ca inhibitor de<br />
p38 MAP kinaza, şi apoi asociat cu creşterea nivelului<br />
de HDL atât la om, cât şi la animale de<br />
laborator. In prezent, se află în studii clinice de<br />
fază 1, ca inhibitor al etapelor post-adsorbţie virală.<br />
Acest compus ţinteşte receptorul scavenger<br />
tipul 1 clasa B (SR-B1) şi competiţionează pentru<br />
transferul HDL [11]. Studii in vitro au arătat<br />
că ITX 5061 are o acţiune inhibitorie sinergică<br />
în combinaţie cu interferonul alfa, ribavirina şi<br />
inhibitorii de protează şi polimerază virală [12].<br />
Inhibiţia unor factori celulari implicaţi în<br />
etapele timpurii ale replicării virale este o opţiune<br />
terapeutică promiţătoare, ce şi-a dovedit<br />
deja eficienţa în cazul infecţiei HIV, prin utilizarea<br />
maravirocului - un inhibitor al coreceptorului<br />
pentru beta-chemokine CCR5. În cazul<br />
infecţiei VHC, inhibitorii receptorilor celulei gaz -<br />
dă pot fi alternative valoroase în prevenirea reinfecţiei<br />
grefei la pacienţii transplantaţi hepatic.<br />
FAZA DE CREŞTERE LOGARITMICÃ -<br />
COMPUŞII CU ACÞIUNE DIRECTÃ<br />
ANTIVIRALÃ (DAA)<br />
Etapa de creştere logaritmică a VHC se desfăşoară<br />
astfel:<br />
1. ARN-ul viral simplu spiralat cu polaritate<br />
pozitivă este eliberat în citoplasmă şi va servi<br />
direct ca ARNm în procesul de traducere a proteinelor<br />
virale. Genomul VHC conţine un singur<br />
cadru de citire deschis (ORF) care codifică un<br />
polipeptid format din ≈3,000 de aminoacizi, clivat<br />
ulterior de către enzimele virale şi celulare<br />
în proteine structurale şi nestructurale. Traduce-<br />
16
Agenþi terapeutici cu acþiune directã antiviralã în infecþia cu virus hepatitic C - noi þinte moleculare<br />
rea ARN-VHC este mediată de situsul intern de<br />
intrare în ribozomi (IRES), care stabileşte legături<br />
cu mai multe proteine celulare şi virale, incluzând<br />
subunitatea ribozomală 40S [13];<br />
2. Poliproteina precursoare este tradusă de<br />
către proteazele virale şi peptidazele gazdei<br />
(peptidaza- şi peptid-peptidaza- semnal) în trei<br />
proteine structurale şi şapte nestructurale. NS2<br />
este o metaloprotează care clivează proteina<br />
NS2/NS3, în timp ce NS3/4A este o serin-protează<br />
ce clivează legăturile dintre NS3/NS4A,<br />
NS4A/NS4B, NS4B/NS5A şi NS5A/NS5B [14,<br />
15].<br />
3. Replicarea virală este coordonată de către<br />
NS5B: ARN polimerază-ARN dependentă<br />
(RdRp). Această enzimă are o fidelitate scăzută<br />
de transcriere (rata încorporării greşite de nucleotide<br />
este 10 -3 per nucleotid per generaţie virală),<br />
ceea ce, asociat cu o rată foarte rapidă a<br />
replicarii virale (10 10 -10 12 virioni pe zi, cu un<br />
timp de înjumătățire de 2-3 ore), generează o<br />
mare variabilitate virală. S-au descris astfel 6<br />
genotipuri majore VHC (cu divergenţă de 30%<br />
în secvenţa de nucleotide), o serie de subtipuri<br />
în cadrul fiecarui genotip şi multe cvasispecii virale<br />
(ce diferă între ele cu mai puţin de 10% din<br />
nucleotide). Rezultatul acestei mari variabilităţi<br />
a VHC duce la selecţia unor mutante virale nonneutralizabile,<br />
ce persistă în organismul gazdă<br />
şi explică, cel puţin parţial, rata crescută de cronicizare<br />
a infecţiei VHC. De asemenea, din<br />
această populaţie virală înalt heterogenă, compuşii<br />
antivirali pot selecta mutantele rezistente,<br />
ceea ce este un argument pentru utilizarea unor<br />
combinaţii terapeutice.<br />
Faza de platou<br />
Ultima etapă a replicării virale - numită faza<br />
de platou - este iniţiată de interacţiunea între<br />
proteina core VHC şi ARN-ul genomic, care determină<br />
iniţierea asamblării virale. Virionii,<br />
asamblaţi în membranele lipidice intracelulare<br />
derivate din reticulul endoplasmic sau aparatul<br />
Golgi, sunt eliberaţi ulterior din celula gazdă<br />
[17]. NS5A este o fosfo-proteină fără activitate<br />
enzimatică, dar cu rol important în formarea<br />
complexului replicativ şi în asamblarea virală.<br />
NS5A acţioneaza probabil prin recrutarea unor<br />
kinaze specifice (fosfatidil inozitol kinaza 4,<br />
subtipul IIα-PI4KIIIα), stimulând activitatea<br />
acestora şi producţia locală de fosfatidil inozitol<br />
fosfat [18, 19]. Acesta determină recrutarea unor<br />
factori celulari de tipul ciclofilinelor A si B, care<br />
determină izomerizarea cis-trans, necesară replicării<br />
virale. Se presupune că membranele intracelulare<br />
reprezintă un suport pentru<br />
complexul replicativ [19], modificări conformaţionale<br />
ale acestora generând formarea aşa-numitei<br />
reţele membranare (membranous web),<br />
bogată în steroli [20].<br />
INHIBITORII DE PROTEAZÃ NS3/4A<br />
Inhibitorii de Protează Aprobaţi. În anul<br />
2011, două medicamente cu administrare orală,<br />
Telaprevir (produs de Vertex Pharmaceuticals)<br />
şi Boceprevir (produs de Schering Plough/<br />
Merck) au fost aprobate atât de Food and Drug<br />
Administration (FDA), cât şi de European Medicines<br />
Agency (EMA) pentru tratarea pacienţilor<br />
infectaţi cu genotipul 1 VHC, în combinaţie<br />
cu interferonul pegylat şi ribavirină. Nevoia unei<br />
triple terapii derivă din studiile ce au demonstat<br />
că monoterapia cu aceşti inhibitori de protează<br />
determină selecţia rapidă de mutante rezistente<br />
[21, 22]. Telaprevir şi Boceprevir sunt alfa-ketoamide<br />
peptidomimetice, care formează legături<br />
covalente reversibile cu serină din situsul<br />
activ al proteazei NS3, oprind clivarea poli -<br />
proteinei VHC în proteine virale funcţionale<br />
[15]. Inhibarea proteazei VHC poate asigura<br />
clearance-ul viral şi prin restaurarea răspunsului<br />
imun înnăscut, deoarece NS3/NS4A blochează<br />
factorul 3 reglator al interferonului (IRF3) şi<br />
ARN helicază celulară (RIG1), ceea ce duce la<br />
scăderea expresiei unor gene stimulate de interferon<br />
[23, 24].<br />
În prezent, tripla terapie reprezintă opţiunea<br />
standard de tratament în cazul pacienţilor infectaţi<br />
cu genotipul 1 VHC. Aceasta a determinat o<br />
creştere a ratei de obţinere a răspunsului virusologic<br />
susţinut (RVS) atât la pacienţii naivi terapeutic,<br />
cât şi la cei cu răspuns parţial, cu recăderi<br />
sau fără răspuns virusologic anterior [25, 26, 27]<br />
(Tabelul 1).<br />
Telaprevir (Incivek/Incivo TM ) se administrează<br />
per os, (750 mg, 2 tablete de 375 mg, de<br />
3 ori pe zi) timp de 12 săptămâni, în combinaţie<br />
cu IFN pegylat alfa şi ribavirina. Durata trata-<br />
17
VAGU et al.<br />
Tabelul 1. Tripla terapie cu inhibitori de protează (telaprevir or boceprevir),<br />
interferon pegylat alfa-2a şi ribavirina (PegIFN/RBV) – studii clinice de faza 3<br />
Studiul clinic Pacieni/nr. Durata terapiei Scop i rezultate<br />
ADVANCE<br />
(telaprevir-TVR)<br />
[28]<br />
ILLUMINATE<br />
(telaprevir)<br />
[29]<br />
REALISE<br />
(telaprevir)<br />
[30]<br />
SPRINT 2<br />
(boceprevir)<br />
[31]<br />
RESPOND-2<br />
(boceprevir)<br />
[32]<br />
Pacieni naivi<br />
terapeutic/1088<br />
Pacieni naivi<br />
terapeutic/540<br />
Pacieni cu eec<br />
terapeutic<br />
anterior/633<br />
Pacieni naivi<br />
terapeutic/1097<br />
Pacieni cu eec<br />
terapeutic<br />
anterior/403<br />
mentului depinde de nivelul încărcării virale<br />
ARN-VHC. Astfel, dacă ARN-VHC este nedetectabil<br />
în săptămânile 4 şi 12 de tratament, se<br />
administrază tripla terapie în primele 12 săptămâni,<br />
apoi dubla terapie (PEG-IFN plus ribavirină)<br />
încă 12 săptămâni. În schimb, dacă în<br />
săptămânile 4 şi 12, ARN-VHC este detectabil,<br />
dar în concentraţie mai mică de 1000 UI/ml, se<br />
administrează tripla terapie timp de 12 săptămâni,<br />
urmată de dubla terapie pentru încă 36 de<br />
săptămâni [33].<br />
Boceprevir (Victrelis TM ) se administrează<br />
oral (800 mg de trei ori pe zi, în timpul mesei)<br />
pentru 24 - 44 săptămâni în combinaţie cu IFN<br />
pegylat alfa 2a şi ribavirină. Strategia terapeutică<br />
presupune inițierea tratamentului cu interferon<br />
şi ribavirină şi menţinerea lui timp de 4<br />
săptămâni (perioada de lead-in), apoi adăugarea<br />
de boceprevir. Scopurile fazei de lead- in sunt:<br />
reducerea replicării virale, împiedicarea selecţiei<br />
mutantelor rezistente, precum şi identificarea<br />
pacienţilor care au obţinut un răspuns virusologic<br />
rapid (RVR: viremie nedetectabilă după 4<br />
săptămâni de tratament), care au şanse mari de<br />
obţinere a RVS fără adăugarea unui inhibitor de<br />
protează [22, 34].<br />
Pentru ambii inhibitori de protează, s-au stabilit<br />
regulile de oprire a tratamentului, dacă<br />
Tripla terapie pentru<br />
9/12 spt., apoi înc 12/36<br />
spt. cu PegIFN-RBV.<br />
Tripla terapie pentru 12 spt.,<br />
apoi 12/24 spt. doar<br />
cu PegIFN-RBV.<br />
Tripla terapie pentru 12 spt.,<br />
apoi înc 36 spt.<br />
de tratament doar<br />
cu PegIFN-RBV.<br />
4 spt. PegIFN-RBV,<br />
apoi tripla terapie<br />
pentru 24/44 de spt.<br />
4 spt. PegIFN-RBV,<br />
apoi tripla terapie<br />
pentru 32/44 spt.<br />
RVS-79% dup 12 sapt. de terapie<br />
tripl vs 46% cu PegIFN- RBV.<br />
92% din cei cu eRVR obin RVS la<br />
24 de spt. vs. 88% RVS la 48 spt.<br />
Rata RVS: la pacienii cu recdere:<br />
86% vs 22%; la cei cu rspuns<br />
parial: 59% vs 15%; la cei fr<br />
rspuns virusologic: 32% vs 5%<br />
RVS - 63–66% vs 38% în grupul<br />
control<br />
RVS - 59-66% la cei cu rspuns<br />
parial sau cu recdere anterioar vs<br />
21% în grupul control.<br />
a) eRVR (rspuns virusologic rapid extins) – nivelul ARN VHC nedetectabil în sptmânile 4 i 12;<br />
b) RVS- rspuns virusologic susinut<br />
viremia rămâne detectabilă în săptămânile 4 şi,<br />
respectiv 12, de triplă terapie [33, 34].<br />
În cazul pacienţilor infectaţi cu genotipul 2<br />
sau 3 VHC, tratamentul standard rămâne cel cu<br />
IFN pegylat alfa şi ribavirină, durata terapiei<br />
este mai scurtă decât în cazul infecţiei cu genotipul<br />
1 (24 săptămâni vs 48 săptămâni), iar RVS<br />
este mai mare (80% vs sub 60% în cazul celor<br />
infectaţi cu genotipul 1) [35].<br />
Noi inhibitori de protează de primă generaţie<br />
sunt în faze avansate ale studiilor clinice, scopul<br />
fiind de a se obţine medicamente cu<br />
efica citate superioară şi parametri farmacocinetici<br />
superiori (administrarea o dată sau de două<br />
ori pe zi şi durata mai scurtă a terapiei). Recăderea<br />
în urma triplei terapii determină apariţia<br />
mutantelor cu rezistenţă încrucişată la compuşii<br />
din aceeaşi clasă. Inhibitorii de protează de generaţia<br />
a doua, aflaţi în diferite stadii ale dezvoltării<br />
clinice, au activitate pan-genotipică, o<br />
barieră genetică mai înaltă şi un profil de rezistenţă<br />
distinct (Tabelul 2).<br />
INHIBITORII POLIMERAZEI NS5B<br />
NS5B este o ARN-polimerază ARN-dependentă,<br />
asemănătoare din punct de vedere structural<br />
cu reverstranscriptază HIV, având situsul<br />
catalitic alcătuit din 531 aminoacizi şi organizat<br />
18
Agenþi terapeutici cu acþiune directã antiviralã în infecþia cu virus hepatitic C - noi þinte moleculare<br />
Tabelul 2. Inhibitorii de protează de generația a doua<br />
Nume/Productor Activitate Studiul Clinic Rezultate anterioare<br />
Simeprevir (TMC435)<br />
Tibotec Pharmaceutical<br />
[36]<br />
BI<strong>2013</strong>35/<br />
Boehringer Ingelheim<br />
Pharma [37]<br />
Asunaprevir<br />
(BMS 650032)/<br />
Bristol-Myers Squibb<br />
[38]<br />
Danoprevir<br />
(ITMN191/RG7227)/<br />
Roche<br />
[39,40].<br />
Vaniprevir (MK-7009)/<br />
Merck & Co.<br />
[41].<br />
MK-5172/<br />
Merck & Co.<br />
[42]<br />
ABT-450/ritonavir<br />
Abbott and Enanta<br />
[43]<br />
ACH-1625/ Achillion<br />
Pharmaceuticals<br />
[44]<br />
multiple genotipuri VHC<br />
(excepie-genotip 3)<br />
Activ pe multiple<br />
genotipuri VHC<br />
Activ pe genotipurile 1 i<br />
4 VHC<br />
Activ pe genotipurile 1, 4<br />
i 6 VHC<br />
Activ pe genotipurile 1 i<br />
2 VHC<br />
Activ pe toate<br />
genotipurile VHC,<br />
(excepie-genotip 3)<br />
Activ pe genotipul 1<br />
VHC<br />
Activ pe toate<br />
genotipurile VHC,<br />
(excepie-genotip 3)<br />
III<br />
(în derulare)<br />
III<br />
(în derulare)<br />
IIa/IIb<br />
IIb<br />
In studii de faz IIb s-a obinut<br />
RVS de: 85% pt. pacienii cu<br />
recdere, 75% pt. cei cu rspuns<br />
parial i 51% pt. cei fr rspuns.<br />
RVS este de 71-83% la pacienii<br />
naivi i de 28-41% la cei tratai<br />
anterior.<br />
Rate crescute de RVT i RVS<br />
(80%) du 48 de spt. de terapie<br />
tripl, indiferent de polimorfismul<br />
IL28B .<br />
RVS la 67-93% din pacienii<br />
naivi terapeutic, fr ciroz,<br />
infectai cu genotipul 1 i 100%<br />
pt. genotipul 4. Activitatea<br />
antiviral superioar în asociere<br />
cu ritonavir.<br />
IIb La pacienii naivi, în spt. 12,<br />
rspuns virusologic 74-85% vs<br />
67-84% în spt.4<br />
II<br />
IIa<br />
IIa<br />
Scderea viremiei cu 4-5 log 10 la<br />
pacienii infectai cu genotip 1 si<br />
3. Activ pe majoritatea variantelor<br />
rezistente la inhibitorii de<br />
proteaz de prim generaie.<br />
RVT la 92% dintre pacienii naivi<br />
terapeutic, infectai cu genotip 1,<br />
dup 3 zile de monoterapie; se<br />
continu cu 12 spt. tripl terapie,<br />
apoi 48 spt. doar Peg-IFN/RBV.<br />
RVR la 75-81% dintre pacienii<br />
tratai cu tripl terapie vs 20% la<br />
pacienii tratai cu Peg-IFN i<br />
RBV<br />
a) RVT- rspuns virusologic timpuriu; b) RVS - rspuns virusologic susinut; c) RVR - rspuns virusologic rapid<br />
într-o structură tipică de “mână dreaptă” cu domeniile<br />
„palmă”, „degete” şi „police” [45].<br />
Aceşti compuşi, la fel ca şi inhibitorii de reverstranscriptază<br />
HIV, sunt de două tipuri:<br />
Analogi nucleozidici (NI), ce competiţionează<br />
cu nucleotidele celulare, fiind integraţi<br />
preferenţial în genomul ARN progen, şi determinând<br />
stoparea elongării. Deoarece situsul<br />
activ al NS5B este o regiune înalt conservată a<br />
genomului VHC, NI sunt eficienţi împotriva diferitelor<br />
genotipuri şi subtipuri VHC. Aceşti<br />
compuşi aflaţi în faza a II-a a studiilor clinice,<br />
au eficienţă antivirală mai scăzută decât inhibitorii<br />
de protează, dar o barieră genetică de rezistenţă<br />
relativ ridicată (Tabelul 3).<br />
Inhibitorii non-nucleozidici (NNI) realizează<br />
inhibiţia NS5B prin inhibiţia allosterică a<br />
situsului catalitic, cu schimbarea conformaţională<br />
şi reducerea activităţii enzimatice. NS5B<br />
prezintă cel puţin 4 situsuri de legare a acestor<br />
compuşi (spre deosebire de RT HIV care are<br />
doar un singur situs), astfel încât diferiţi inhibitori<br />
de polimerază pot fi utilizaţi în combinaţie<br />
sau succesiv, pentru a împiedica dezvoltarea rezistenţei<br />
antivirale. NNI au o barieră genetică de<br />
rezistenţă scăzută, o activitate virală relativ redusă,<br />
evidentă doar în cazul infecţiei cu genotipurile<br />
1a şi 1b, şi ar putea fi utilizaţi doar în<br />
combinaţie cu alţi agenţi DAA (Tabelul 4).<br />
19
VAGU et al.<br />
Tabelul 3. Inhibitorii de polimerază - Analogii nucleozidici<br />
Nume/ Productor Activitate Studiul clinic Rezultate anterioare<br />
R7128/<br />
Roche & Pharmasset<br />
[46].<br />
Mericitabine (RG7128)/<br />
Gilead<br />
[47].<br />
PSI-7977/ Pharmasset, Inc<br />
[48], Sofosbuvir.<br />
INX-08189/BMS-986094/<br />
Bristol-Myers Squibb<br />
[49]<br />
Activ pe multiple<br />
genotipuri VHC<br />
Activ pe toate<br />
genotipurile VHC<br />
Activ pe genotipurile<br />
1, 2 i 3 VHC<br />
Activ pe genotipurile<br />
1, 2, 3 VHC<br />
a) RVR- rspuns virusologic rapid; b) RVS – rspuns virusologic susinut<br />
IIb<br />
IIb<br />
IIb<br />
IIb<br />
RVR-88% la pacienii naivi<br />
terapeutic infectai cu genotipurile<br />
2 i 3 i 90% la cei fr RVR.<br />
Procente crescute de RVR i RVS<br />
obinute la pacienii naivi infectai cu<br />
genotipurile 1 i 4.<br />
RVS-98% la pacienii naivi infectai<br />
cu genotipul 1. RVS crescut i pentru<br />
genotipurile 2 i 3, conform unui<br />
studiu pilot.<br />
Studiul de faz IIb a fost oprit<br />
în luna august 2012 din cauza<br />
toxicitii cardiace.<br />
INHIBITORI POTENÞIALI AI ASAMBLÃRII<br />
VIRALE<br />
Inhibitorii NS5A. Daclatasvir (BMS<br />
790052) este în faza a 3-a a studiilor clinice, se<br />
administrează împreună cu tratamentul standard<br />
(IFN pegylat alfa şi ribavirină), fiind activ pentru<br />
genotipurile 1 și 4 VHC. Daclatasvir, administrat<br />
per os în doză unică, a demonstrat o<br />
eficienţă deosebită, cu scăderea rapidă a viremiei<br />
[55]. Alţi agenţi antivirali se află în prezent<br />
în studii clinice de fază 1: PPI 461 (activ pentru<br />
toate genotipurile) şi GSK2336805 (activ pentru<br />
genotipurile 1a, 1b, 2a şi 4) [56].<br />
Analogii ciclofilinelor celulare. Ciclofilinele<br />
sunt factori celulari implicaţi în împachetarea<br />
şi asamblarea multor proteine. Inhibitorii<br />
ciclofilinelor blochează interacţiunea acestora<br />
cu NS5A, şi implicit, formarea unui complex replicativ<br />
funcţional. Alisporivir (Debio-025) este<br />
un analog fara activitate imunosupresoare al ciclofilinelor,<br />
cu efect antiviral atât la pacienţii<br />
monoinfectaţi VHC, cât şi la cei coinfectaţi<br />
HIV/VHC. Studiile clinice au arătat că pacienţii<br />
infectaţi cu genotipurile 1, 3 şi 4 VHC, trataţi<br />
timp de 28 de zile cu Debio-25 şi IFN pegylat<br />
alfa, obţin o scădere semnificativă a încărcării<br />
virale VHC [57].<br />
Tabelul 4. Inhibitorii polimerazei - Inhibitorii non-nucleozidici<br />
Nume/Productor Activitate Studiul Clinic Rezultate anterioare<br />
BI207127/<br />
Boehringer Ingelheim<br />
[50]<br />
Activ pe<br />
genotipul 1<br />
VHC<br />
IIa RVT - 92.3% obinut la pacienii naivi<br />
terapeutic i de 20% la cei pretratai.<br />
Filibuvir/ Pfizer<br />
[51]<br />
Activ pe<br />
genotipul 1<br />
IIb Rate de rspuns de 60-70% în spt. 48,<br />
ulterior, pân în spt. 60, 20-50% dintre<br />
pacieni vor face recderi.<br />
ABT 072/Abbott<br />
[52].<br />
Activ pe<br />
genotipul 1<br />
IIa RVT la 70% dintre pacieni dup 12 spt. de<br />
tripl terapie.<br />
ANA598 (Setrobuvir)/<br />
Anadys<br />
Activ pe<br />
genotipul 1<br />
IIb RVT la 73% dintre pacieni dup 12 spt. de<br />
tripl terapie<br />
[53]<br />
ABT 333/<br />
Abbott<br />
Activ pe<br />
genotipul 1<br />
IIa RVT la 75% dintre pacieni dup 12 spt. de<br />
tripl terapie<br />
[52].<br />
GS9190/<br />
Gilead<br />
[54]<br />
Activ pe<br />
genotipul 1<br />
IIb Comparativ cu tratamentul standard (Peg-<br />
IFN+RBV), dup 24-48 spt. de tripl terapie<br />
se obine creterea RVT, fr creterea RVS.<br />
a) RVT – rspuns virusologic timpuriu; b) RVS – rspuns virusologic susinut<br />
20
Agenþi terapeutici cu acþiune directã antiviralã în infecþia cu virus hepatitic C - noi þinte moleculare<br />
Tabelul 5. Combinații terapeutice de agenți DAA cu mecanisme diferite de acțiune<br />
Ageni terapeutici combinai/<br />
Productor<br />
Inhibitor de proteaz NS3<br />
(Danoprevir/ritonavir-boosted)+<br />
Inhibitor nucleozidic NS5B (RG7128)/<br />
Hoffmann-LaRoche/ Genentech [60].<br />
Inhibitor de proteaza NS3 (Telaprevir)+<br />
Inhibitor non-nucleozidic NS5B (VX-222)/<br />
Vertex Pharmaceuticals [61].<br />
Inhibitor de proteaza NS3 (BMS-650032)+<br />
Inhibitor NS5A (BMS790052)/<br />
Bristol-Myers Squibb [62].<br />
Inhibitor de proteaz NS3<br />
(BI <strong>2013</strong>35) + Inhibitor non-nucleozidic<br />
NS5B (BI207127) Boehringer Ingelheim [63]<br />
Inhibitor de proteaz NS3<br />
(ABT-450/r) +<br />
Inhibitor non-nucleozidic NS5B (ABT072)/<br />
Abbot Laboratories [64].<br />
Inhibitori nucleozidici NS5B (PSI-7977 +<br />
PSI-938) / Pharmasset [65]<br />
RBV sau<br />
PegIFN-RBV<br />
Doar DAA<br />
Împreun cu<br />
PegIFN/RBV<br />
DAA cu/fr<br />
PegIFN/RBV<br />
Împreun cu<br />
RBV<br />
Împreun cu<br />
RBV<br />
Doar DAA<br />
Pacieni<br />
Naivi terapeutic<br />
sau pretratai<br />
Pacieni naivi<br />
Pacieni fr<br />
rspuns<br />
virusologic<br />
anterior<br />
Pacieni naivi<br />
terapeutic<br />
Pacieni naivi<br />
terapeutic<br />
Pacieni naivi<br />
terapeutic<br />
Comentarii<br />
Încrcarea viral VHC<br />
scade cu 5.1 log10 în<br />
cazul pacienilor naivi i<br />
cu 4.9 log10 la cei fr<br />
RVS anterior.<br />
RVS - 82-93% dup<br />
12 spt. de tratament<br />
(depinde de dozele<br />
de DAA)<br />
RVS la 5/11 pacieni<br />
tratai doar cu DAA i la<br />
9/10 pacieni tratai cu<br />
DAA plus PegIFN/RBV.<br />
RVR obinut la 100%<br />
dintre pacienii tratai<br />
cu doze mari.<br />
RVT de 91% la pacienii<br />
cu genotip IL28B CC,<br />
82% prezint ARN VHC<br />
nedetectabil dup 36 de<br />
spt.<br />
Bine tolerai i cu profil<br />
bun de siguran dup<br />
7-14 zile de tratament.<br />
a) RVS - rspuns virusologic susinut; b) RVR - rspuns virusologic rapid; c) RVT- rspuns virusologic timpuriu<br />
<br />
PERSPECTIVE<br />
Combinaţii terapeutice de agenţi DAA cu<br />
mecanisme diferite de acţiune. Prin analogie<br />
cu terapia HAART utilizată în infecţia HIV, este<br />
în curs de evaluare şi în infecţia cronică VHC o<br />
strategie bazată pe combinarea medicamentelor<br />
cu moduri diferite de acţiune ce ar putea creşte<br />
rata RVS şi reduce durata tratamentului. Se presupune<br />
că infecţia cronică VHC ar putea fi eradicată,<br />
deoarece replicarea VHC este strict<br />
localizată la nivelul hepatocitelor, intracitoplasmatic,<br />
şi nu există rezervoare virale extrahepatice<br />
(spre deosebire de HIV, care prezintă ADN<br />
proviral integrat în limfocite, sau VHB care<br />
poate genera ADNccc, integrat în genomul hepatocitului).<br />
Se apreciază că tripla terapie cu<br />
DAA poate duce la eradicarea virusului dupa 8-<br />
12 săptămâni, luând în calcul un model de clearance<br />
viral în 2 etape (o scădere bruscă cu 3.5<br />
log 10 a încărcării virale în primele 36 de ore, urmată<br />
de eliminarea virionilor liberi şi, ulterior,<br />
a hepatocitelor infectate) [58]. Perspectivele terapeutice<br />
[59] se bazează pe:<br />
Terapia cvadruplă, ce constă în asocierea<br />
a doi compuşi DAA cu IFN pegylat alfa şi ribavirină,<br />
poate fi eficientă în cazul pacienţilor cu<br />
recăderi, cu răspuns virusologic parţial sau fără<br />
răspuns la tratamentul anterior.<br />
Combinaţii terapeutice fără interferon.<br />
În cazul pacienţilor cu intoleranţă, contraindicaţii<br />
majore pentru administrarea interferonului sau<br />
cu răspuns virusologic foarte scăzut, se poate recomanda<br />
administrarea a doi compuşi DAA, cu<br />
barieră genetică înaltă, în asociere sau nu cu ribavirina.<br />
Cel mai probabil, ribavirina va fi menţinută<br />
în schemele terapeutice, deoarece a fost<br />
demonstrată activitatea ei antivirală directă, ce<br />
contribuie la obţinerea şi menţinerea răspunsului<br />
virusologic susţinut şi la scăderea ratei de recădere.<br />
Tabelul 5 cuprinde o parte din studiile aflate<br />
în diferite faze clinice de dezvoltare.<br />
21
VAGU et al.<br />
CONCLUZII<br />
Cunoaşterea în detaliu a ciclului replicativ<br />
VHC a condus la dezvoltarea unor compuşi cu<br />
acţiune directă asupra ciclului replicativ VHC<br />
(DAA) şi a agenţilor terapeutici care ţintesc proteinele<br />
gazdei, ce cresc eficienţa tratamentului<br />
standard cu interferon pegylat alfa şi ribavirină.<br />
La ora actuală, în cazul pacienţilor infectaţi cu<br />
genotipul 1 VHC, tripla terapie cu un inhibitor<br />
de protează plus interferon pegylat şi ribavirină<br />
reprezintă regimul terapeutic standard. Rezultate<br />
promiţătoare au fost obţinute în urma testării inhibitorilor<br />
de protează de generaţia a doua şi a<br />
inhibitorilor proteinei virale NS5A. În acelaşi<br />
timp, sunt în curs de evaluare diferite combinaţii<br />
de DAA cu sau fără interferon sau ribavarină, cu<br />
monitorizarea atentă a selecţiei tulpinilor virale<br />
multi-rezistente.<br />
MULÞUMIRI<br />
SULTANA CAMELIA a beneficiat de o<br />
bursă în cadrul Programului Operaţional Sectorial<br />
de Dezvoltare a Resurselor Umane (POS-<br />
DRU), finanţat din Fondul Social European şi<br />
Guvernul României prin contractul nr. POS-<br />
DRU/89/1.5/S/64109<br />
BIBLIOGRAFIE<br />
1. National Institutes of Health Consensus Development<br />
Conference Statement: Management of hepatitis C.<br />
Gastroenterology 2002. 123(6): 2082-2099.<br />
2. Deuffic-Burban S, Poynard T, Sulkowski MS, Wong<br />
JB. Estimating the future health burden of chronic hepatitis<br />
C and human immunodeficiency virus infections<br />
in the United States. J Viral Hepat 2007.14:107-115.<br />
3. Choo QL, Richman KH, Han JH, Berger K, Lee C,<br />
Dong C, Gallegos C, Coit D, Medina-Selby R, Barr<br />
PJ. Genetic organization and diversity of the hepatitis<br />
C virus. Proc Natl Acad Sci USA 1991. 88:2451-2455.<br />
4. Rice CM. New insights into HCV replication: potential<br />
antiviral targets. Top Antivir Med 2011.19:117–120.<br />
5. Blight KJ, McKeating JA, Rice CM. Highly permissive<br />
cell lines for subgenomic and genomic hepatitis C<br />
virus RNA replication. J Virol 2002.76:13001-13014.<br />
6. Wakita T, Pietschmann T, Kato T, Date T, Miyamoto<br />
M, Zhao Z, Murthy K. Production of infectious he -<br />
patitis C virus in tissue culture from a cloned viral<br />
genome. Nat Med 2005.11:791-796.<br />
7. Yu X, Qiao M, Atanasov I, Hu Z, Kato T, Liang TJ,<br />
Zhou ZH. Cryo-electron microscopy and three-dimensional<br />
reconstructions of hepatitis C virus particles. Virology<br />
2007. 367:126-34.<br />
8. Dorner M, Horwitz JA, Robbins JB, Barry WT,<br />
Feng Q, Mu K. A genetically humanized mouse model<br />
for hepatitis C virus infection. Nature 2011. 474:208-<br />
211.<br />
9. Washburn ML, Bility MT, Zhang L, Kovalev GI,<br />
Buntzman A, Frelinger JA, Barry W, Ploss A, Rice<br />
CM, Su L. A humanized mouse model to study hepatitis<br />
C virus infection, immune response, and liver disease.<br />
Gastroenterology 2011. 140:1334-1344.<br />
10. Sainz B Jr, Barretto N, Martin DN, Hiraga N, Imamura<br />
M, Hussain S, Marsh KA, Yu X, Chayama<br />
K, Alrefai WA, Uprichard SL. Identification of the<br />
Niemann-Pick C1-like 1 cholesterol absorption receptor<br />
as a new hepatitis C virus entry factor. Nat Med<br />
2012. 18(2):281-285.<br />
11. Syder AJ, Lee H, Zeisel MB, Grove J, Soulier E,<br />
Macdonald J, Chow S, Chang J, Baumert TF,<br />
McKeating JA, McKelvy J, Wong-Staal F. Small<br />
molecule scavenger receptor BI antagonists are potent<br />
HCV entry inhibitors. J Hepatol 2011. 54(1):48-55.<br />
12. Zhu H, Wong-Staal F, Lee H, Syder A, McKelvy J,<br />
Schooley RT, Wyles DL. Evaluation of ITX 5061, a<br />
Scavenger Receptor B1 Antagonist: Resistance Selection<br />
and Activity in Combination With Other Hepatitis<br />
C Virus. Antivirals J Infect Dis 2012. 205(4): 656-662.<br />
13. Otto GA, Puglisi JD. The pathway of HCV IRESmediated<br />
translation initiation. Cell 2004. 119:369–<br />
380.<br />
14. Lorenz IC, Marcotrigiano J, Dentzer TG, Rice<br />
CM. Structure of the catalytic domain of the hepatitis<br />
C virus NS2-3 protease. Nature 2006. 442:831–835.<br />
15. Bartenschlager R, Lohmann V, Wilkinson T,<br />
Koch JO. Complex formation between the NS3 serine-type<br />
proteinase of the hepatitis C virus and NS4A<br />
and its importance for polyprotein maturation. J Virol<br />
1995. 69:7519–7528.<br />
16. Neumann AU, Lam NP, Dahari H, Gretch DR,<br />
Wiley TE, Layden TJ, Perelson AS. Hepatitis C viral<br />
dy namics in vivo and the antiviral efficacy of interferon-alpha<br />
therapy, Science 1998. 282(5386):103-107.<br />
17. Vauloup-Fellous C, Pene V, Garaud-Aunis J,<br />
Harper F, Bardin S, Suire Y. Signal peptide peptidase-catalyzed<br />
cleavage of hepatitis C virus core protein<br />
is dispensable for virus budding but destabilizes<br />
the viral capsid. J Biol Chem 2006. 281:27679–27692<br />
18. Gao M, Nettles RE, Belema M, Snyder LB, Nguyen<br />
VN, Fridell RA, Serrano-Wu MH, Langley DR,<br />
Sun JH, O’Boyle DR. Chemical genetics strategy<br />
identifies an HCV NS5A inhibitor with a potent clinical<br />
effect. Nature 2010. 465: 96–100.<br />
19. Moradpour D, Penin F, Rice CM Replication of hepatitis<br />
C virus. Nat Rev Microbiol 2007. 5: 453–463.<br />
20. Reiss S, Rebhan I, Backes I, Romero-Brey I, Erfl<br />
H, Matula P, Kaderali L, Poenisch M, Blankenburg<br />
H, et al. Recruitment and activation of a lipid kinase<br />
by hepatitis C virus NS5A is essential for<br />
integrity of the membranous replication compartment.<br />
Cell Host & Microbe 2011. 9(1):32-45.<br />
21. Sarrazin C, Kieffer TL, Bartels D, Hanzelka B,<br />
Muh U, Welker M. Dynamic hepatitis C virus genotypic<br />
and phenotypic changes in patients treated with<br />
the protease inhibitor telaprevir. Gastroenterology<br />
2007.132:1767–1777.<br />
22
Agenþi terapeutici cu acþiune directã antiviralã în infecþia cu virus hepatitic C - noi þinte moleculare<br />
22. Susser S, Welsch C, Wang Y, Zettler M, Domingues<br />
FS, Karey U, Hughes E, Ralston R. Characterization<br />
of resistance to the protease inhibitor boceprevir in<br />
hepatitis C virus-infected patients. Hepatology 2009.<br />
50:1709–1718.<br />
23. Gale MJr, Korth MJ, Katze MG. Repression of the<br />
PKR protein kinase by the hepatitis C virus NS5A protein:<br />
a potential mechanism of interferon resistance.<br />
Clinical and Diagnostic Virology 1998. 10 (2-3):157–<br />
162.<br />
24. Johnson C, Owen D, and Gale MJr. Functional and<br />
therapeutic analysis of hepatitis C virus NS3/4A protease<br />
control of antiviral immune defense. Journal of<br />
Biological Chemistry 2007. 282 (14): 10792–10803.<br />
25. Pearlman L. Protease inhibitors for the treatment of<br />
chronic hepatitis C genotype-1 infection: the new standard<br />
of care–review. The Lancet Infectious Diseases<br />
2012. 12(9):717-728.<br />
26. Bacon BR, Gordon SC, Lawitz E, Marcellin P. Boceprevir<br />
for previously treated chronic HCV genotype<br />
1 infection. N Engl J Med 2011. 364:1207-1217.<br />
27. Zeuzem S, Andreone P, Pol S, Lawitz E. Telaprevir<br />
for retreatment of HCV infection. N Engl J Med 2011.<br />
364:2417-2428.<br />
28. Jacobson IM, McHutchison JG, Dusheiko G.<br />
Telaprevir for previously untreated chronic hepatitis C<br />
virus infection. N Engl J Med 2011. 364:2405- 2416.<br />
29. Sherman KE, Flamm SL, Afdhal NH, Nelson DR,<br />
Sulkowski MS, Everson GT. Response-guided<br />
telaprevir combination treatment for hepatitis C virus<br />
infection. N Engl J Med 2011. 365: 1014-1024.<br />
30. Foster GR, Zeuzem S, Andreone P, Pol S, Lawitz<br />
EJ, Diago M, Roberts S. et al Subanalyses of the<br />
telaprevir lead-in arm in the REALIZE study: response<br />
at week 4 is not a substitute for prior null response<br />
categorization. J Hepatol 2011. 54, S3-S4.<br />
31. Poordad F, McCone J. Jr, Bacon BR, Bruno S,<br />
Manns MP, Sulkowski MS. Boceprevir for untreated<br />
chronic HCV genotype 1 infection. N Engl J Med<br />
2011. 364:1195–1206<br />
32. Bacon BR, Gordon SC, Lawitz E. HCV RESPOND-<br />
2 final results: high sustained virologic response<br />
among genotype 1 previous nonresponders and relapsers<br />
to peginterferon/ribavirin when re-treated with<br />
boceprevir plus pegintron (peginterferon alfa-2b)/ribavirin.<br />
Hepatology 2010. 52: 430A.<br />
33. US Food and Drug Administration. Approval of Incivek<br />
(telaprevir), a direct acting antiviral drug (DAA)<br />
to treat hepatitis C (HCV). Available from:<br />
http://www.fda.gov/ForConsumers/ByAudience/For-<br />
PatientAdvocates/ucm256328.htm<br />
34. US Food and Drug Administration. Approval of Victrelis<br />
(boceprevir), a direct acting antiviral drug<br />
(DAA) to treat hepatitis C virus (HCV). Available<br />
from: http://www.fda.gov/ForConsumers/ByAudience/ForPatientAdvocates/<br />
ucm255413.htm<br />
35. Zeuzem S, Berg T, Moeller B, Hinrichsen H, Mauss<br />
S, Wedemeyer H, Sarrazin C, et al. Expert opinion<br />
on the treatment of patients with chronic hepatitis C.<br />
J Viral Hepat 2009. 16(2): 75–90.<br />
36. Marcellin P, Reesink H, Berg T, Cramp M, Flisiak<br />
R, Van Vlierberghe H, Verloes R, Lenz O, Peeters<br />
M, Sekar V, De Smedt G. Antiviral activity and<br />
safety of TMC435 combined with peginterferon a-2a<br />
and ribavirin in patients with genotype-1 hepatitis C<br />
infection who failed previous IFN-based therapy. J<br />
Hepatol 2009. 50: S 385<br />
37. Sulkowski MS, Bouliere M, Bronowicki J-P,<br />
Streinu-Cercel A, Preotescu L, Asselah T, et al.<br />
SILEN-C2: sustained virologic response (SVR) and<br />
safety of BI<strong>2013</strong>35 combined with peginterferon alfa-<br />
2a and ribavirin (P/R) in chronic HCV genotype-1 patients<br />
with non-response to P/R J Hepatol 2011, 54:<br />
S30<br />
38. Bronowicki J-P, Pol S, Thuluvath P. Asunaprevir<br />
(ASV; BMS-650032), an NS3 protease inhibitor, in<br />
combination with peginterferon and ribavirin in treatment-naive<br />
patients with genotype 1 chronic hepatitis<br />
C infection). J Hepatol 2011. 54: S472.<br />
39. Everson G, Cooper C, Hézode C, Shiffman ML,<br />
Yoshida E, Beltran-Jaramillo T, Ferenci P. Rapid<br />
and sustained achievement of undetectable HCV RNA<br />
during treatment with ritonavir-boosted danoprevir/<br />
Peg-IFNα-2A/RBV in HCV genotype 1 or 4 patients:<br />
DAUPHINE week 12 interim analysis. The EASL International<br />
Liver Congress 2012, Barcelona April 18-<br />
22, 2012<br />
40. Gane E, Rouzier R, Stedman C, Wiercinska-Drapalo<br />
E, Horban A, Chang L, Zhang Y. Ritonavir<br />
boosting of low dose RG7227/ITMN-191, HCV<br />
NS3/4A protease inhibitor, results in robust reduction<br />
in HCV RNA at lower exposures than provided by unboosted<br />
regimens. J Hepatol 2010. 52: S16-S17<br />
41. Manns M, Lee A. Sustained viral response (SVR)<br />
rates in genotype 1 treatment-naïve patients with<br />
chronic hepatitis C (CHC) infection treated with vaniprevir<br />
(MK-7009), a NS3/4a protease inhibitor, in<br />
combination with pegylated interferon alfa-2a and ribavirin<br />
for 28 days. http://www.natap.org/2010/<br />
AASLD/AASLD_24.htm<br />
42. S. Ludmerer, N. Liverton, J. McCauleya. Discovery<br />
of MK-5172 a next generation HCV NS3/4a protease<br />
inhibitor: raising the bar of this important class of molecules,<br />
International Conference on Viral Hepatitis<br />
2012, New York, March 26-27, 2012. Abstract 79328.<br />
43. Lawitz E, Gaultier I, Poordad F, Cohen DE,<br />
Menon R, Larsen LM. 1220 ABT-450/ritonavir<br />
(ABT-450/R) combined with pegylated interferon<br />
alpha-2A and ribavirin (SOC) after 3-day monotherapy<br />
in Genotype 1 HCV-infected treatment-naive subjects:<br />
12-week interim efficacy and safety results. J<br />
Hepatol 2011. 54: S482.<br />
44. Lalezari J, Hazan L, Kankam M, Lawitz E. High<br />
rapid virologic response (RVR) with ACH-1625 daily<br />
dosing plus pegIFN-Alpha 2A/RBV in a 28-day phase<br />
2A trial. 62nd Annual Meeting of the American Association<br />
for the Study of Liver Diseases. San Francisco,<br />
Nov 6-9, 2011. Abstract 1341.<br />
45. Bressanelli S, Tomei L, Roussel A, Incitti I, Vitale<br />
RL, Mathieu M, De Francesco R, Rey FA. Crystal<br />
structure of the RNA-dependent RNA polymerase of<br />
hepatitis C virus, PNAS 1999. 96 (23): 13034–13039.<br />
46. Gane EJ, Rodriguez-Torres M, Nelson DR. Antiviral<br />
activity of the HCV nucleoside polymerase in-<br />
23
VAGU et al.<br />
hibitor R7128 in HCV genotype 2 and 3 prior non-responders:<br />
interim results of R7128 1500mg BID with<br />
PEG-IFN and ribavirin for 28 days. Hepatology 2008.<br />
48: ALB10.<br />
47. Jensen DM, Wedemeyer H, Herring RW, Ferenci<br />
P, Ma MM, Zeuzem S, Rodriguez-Torres M, et al.<br />
High rates of early viral response, promising safety<br />
profile and lack resistance-related breakthrough in<br />
HCV GT1/4 patients treated with RG7128 plus<br />
pegIFN alfa-2a (40KD)/RBV: planned week 12 interim<br />
analysis from the PROPEL study. 61st Annual<br />
Meeting of the American Association for the Study of<br />
Liver Diseases. Boston, October 29 - November 2,<br />
2010, Abstract 81.<br />
48. Lawitz E, Lalezari JP, Hassanein T, et al. Oncedaily<br />
PSI-7977 plus Peg/RBV in treatment-naïve patients<br />
with HCV GT1: robust end of treatment<br />
response rates are sustained post-treatment. Hepatology<br />
2011. 54 (suppl 1):225.<br />
49. U.S. National Institutes of Health. ClinicalTrial.gov,<br />
Phase 2b study of BMS-986094 and daclatasvir, with<br />
or without ribavirin for the treatment of patients with<br />
chronic hepatitis C, available from http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01629732<br />
50. Larrey D, Levin J, Lohse A, de Ledinghen V, Trepo<br />
C, Gerlach T. 4 week therapy with the non-nucleosidic<br />
polymerase inhibitor BI 207127 in combination<br />
with peginterferon alfa2A and ribavirin in treatment<br />
naïve and treatment experienced chronic HCV GT1<br />
patients. Journal of Hepatology 2010. 52 (suppl 1):<br />
S466<br />
51. Jacobson IM, Pockros PJ, Lalezari J, Lawitz E,<br />
Rodriguez-Torres M, et al. Virologic response rates<br />
following 4 weeks of filibuvir in combination with pegylated<br />
interferon alfa-2a and ribavirin in chronically<br />
infected HCV genotype 1 patients. J Hepatol 2010. 52<br />
(suppl 1): S465<br />
52. Middleton T, He Y, Beyer J. Factors affecting HCV<br />
viral load response to the non-nucleoside polymerase<br />
inhibitors ABT-072 and ABT-033. J Hepatol 2011, 54<br />
(suppl 1): S483-S484.<br />
53. National AIDS Treatment Advocacy Project Organisation<br />
(NATAP). ANA-598 HCV non-nuke Phase 2b<br />
study preliminary data results, 2011. Available from:<br />
http://www.natap.org/2011/HCV/101411_01.htm.<br />
54. U.S. National Institutes of Health-ClinicalTrial.gov.<br />
Efficacy and safety study of GS-9256 and GS-9190<br />
Alone and in Combination With Ribavirin for 28 Days<br />
in Patients With Chronic Hepatitis C Virus Infection.<br />
Available from: http://clinicaltrials.gov/ct2/show/<br />
NCT01072695<br />
55. Nettles R, Chien C, Chung E, Persson A, Gao M,<br />
Belema M. BMS-790052 is a first-in-class potent hepatitis<br />
C virus (HCV) NS5A inhibitor for patients with<br />
chronic HCV infection: Results from a proof-of-concept<br />
study. Hepatology 2008. 48(suppl): LB12–LB12.<br />
56. Lalezari JP, Agarwal K, Dusheiko G. Dose-ranging<br />
trial of PPI- 461, a potent new pan-genotypic HCV<br />
NS5A inhibitor, in patients with HCV genotype-1 infection.<br />
Hepatology 2011. 54:400A.<br />
57. Flisiak R, Feinman SV, Jablkowski M. The cyclophilin<br />
inhibitor Debio 025 combined with PEG-<br />
IFN alpha2a significantly reduces viral load in treatment<br />
naive hepatitis C patients. Hepatology 2009.<br />
49:1460-1468.<br />
58. Ohara E, Hiraga N, Imamura M, et al. Elimination<br />
of hepatitis C virus by short term NS3-4A and NS5B<br />
inhibitor combination therapy in human hepatocyte<br />
chimeric mice. J Hepatol 2011. 54: 872–878.<br />
59. Zeuzem S, Buggisch P, Agarwal K. Dual, triple, and<br />
quadruple combination treatment with a protease inhibitor<br />
(GS-9256) and a polymerase inhibitor (GS-<br />
9190) alone and in combination with ribavirin (RBV)<br />
or PegIFN/RBV for up to 28 days in treatment-naive,<br />
genotype 1 HCV subjects. The 61st Annual Meeting<br />
of the American Association for the Study of Liver<br />
Diseases. Boston, October 29 - November 2, 2010,<br />
Abstract LB-1.<br />
60. Gane EJ, Roberts SK, Stedman CA. Oral combination<br />
therapy with a nucleoside polymerase inhibitor<br />
(RG7128) and danoprevir for chronic hepatitis C<br />
genotype 1 infection (INFORM-1): a randomised,<br />
double-blind, placebo-controlled, dose- escalation<br />
trial. Lancet 2010. 376:1467-1475.<br />
61. Nelson DR, Gane EJ, Jacobson IM, Di Bisceglie<br />
AM, Alves K, Koziel MJ. VX-222/Telaprevir in combination<br />
with peginterferon-alfa-2a and ribavirin intreatment-naive<br />
genotype 1 HCV patients treated for<br />
12 weeks: Zenith study, SVR 12 interim analyses. Hepatology<br />
2011. 54:1442.<br />
62. Lok AS, Gardiner DF, Lawitz E. Combination therapy<br />
with BMS-790052 and BMS-650032 alone or<br />
with PEGIFN/RBV results in undetectable HCV RNA<br />
through 12 weeks of therapy in HCV genotype 1 null<br />
responders. Hepatology 2010. 52:877A.<br />
63. Zeuzem S, Asselah T, Angus PW. Strong antiviral<br />
activity and safety of IFN-sparing treatment with the<br />
protease inhibitor BI <strong>2013</strong>35, the HCV polymerase inhibitor<br />
BI 207127 and ribavirin in patients with<br />
chronic hepatitis C. Hepatology 2010, 52:876A.<br />
64. Lawitz E, Poordad F, Kowdley KV. A 12-week interferon-free<br />
regimen of ABT-450/r, ABT-072, and<br />
ribavirin was well tolerated and achieved sustained virologic<br />
response in 91% treatment-naïve HCV IL28B-<br />
CC genotype-1-infected subjects. EASL International<br />
Liver Congress 2012, Barcelona April 18-22, 2012.<br />
Abstract 13.<br />
65. Lawitz E, Rodriguez-Torres M, Denning J. Once<br />
daily dual nucleotide combination of PSI-938 and PSI-<br />
7977 provides 94% HCV RNA
GROWTH OF ENTAMOEBA INVADENS IN SEDIMENTS WITH<br />
METABOLICALLY REPRESSED BACTERIA LEADS TO MULTICELLULARITY<br />
AND REDEFINITION OF THE AMOEBIC CELL SYSTEM<br />
Vladimir F. Niculescu*<br />
institute for Zoology and department of biology iii, University of tübingen, Germany,<br />
and sero-screen Laboratories augsburg, Germany<br />
ABsTRACT<br />
Extracellular signaling and mechanisms of cell differentiation in Entamoeba are misunderstood. The<br />
main reason is the popular use of axenic media, which do not correspond to the natural habitats of Entamoeba.<br />
The axenic environment lacks the exogenous activators and repressors provided by natural<br />
habitats. Absent bacterial commensals understanding of the development of the amoebic cell system<br />
remains deficient. The present Aa(Sm) culture method using mixed sediments of antibiotically repressed<br />
Aerobacter aerogens and amoebae was developed to model in vitro extracellular signaling<br />
that induce multicellularity in cultures of E. invadens. Repressed oxygen consuming sediment bacteria<br />
supply E. invadens the hypoxic environment needed for differentiation and development. The amoebae<br />
themselves alter the environment by consuming the bacteria by phagocytosis thus reversing hypoxia.<br />
Exogenous activators are in this manner down regulated and suppressed. This feedback effect controls<br />
amoebic development and differentiation. Co-existing cell types and cell fractions with different life<br />
spans and cell cycle length could be identified. Aa(Sm) long term cultures contain continuous and<br />
non-continuous self renewing cell lines producing quiescent and terminally differentiated daughter<br />
cells (precysts) by asymmetric division. This culturing method helps to understand the intimate relationship<br />
between hypoxic environments and the multicellular behaviour of E. invadens and the interrelations<br />
existing between the distinct cell types.<br />
Keywords: entamoeba, hypoxia, differentiation, quiescence, terminal differentiation, cyclic and non-cyclic<br />
encystment, cell conversion.<br />
Abbreviations: LT, long term cultures; D1, D2, non-identical daughter cells by asymmetric division, SRL, self renewing<br />
lines comprising D1 cells; QD24 LT , TD6 LT , self renewing lines producing differentiated quiescent (QD)<br />
and terminally differentiated (TD) cells by asymmetric cell division; CE, DI, cysts by cyclic encystment and<br />
direct induction; Aa(Sm), culture medium containing bacterial sediments with aerobacter aerogenes (Aa), after<br />
preconditioning with serratia marcescens (sm).<br />
INTRODUCTION<br />
After 1968, axenic medium TPS-S-1 and its<br />
variants BI-S-33, TYI-S-33 [1-3] have become<br />
extremely popular. Many researchers decided to<br />
use bacteria-free cultures as they are most advantageous<br />
for basic molecular and genetic studies,<br />
but then began to recognize that axenic cultures<br />
are not well suited to elucidate the cell biology<br />
of Entamoeba. Important aspects regarding cell<br />
cycle and differentiation remained unclear, since<br />
in the bacteria-free cultures, naturally occurring<br />
hypoxic micro-niches and specific environmental<br />
triggers are missing. Also important physiological<br />
traits such as virulence were lost in<br />
axenic cultures [4]. Axenic media mainly used<br />
in the past 45 years have been restricting our understanding<br />
of the cellular biology of Entamoeba<br />
in that the Entamoeba are being grown<br />
in an environmental straight jacket which has<br />
little to do with their natural environment.<br />
*Corresponding author: Vladimir Florin Niculescu, D-86420 Diedorf, Germany, Kirschenweg 1;<br />
e-mail: besnea@aol.com; Vladimir.Niculescu@yahoo.com<br />
25
VLADIMIR F. NICULESCU<br />
In xenic cultures, living bacteria are required<br />
to support amoebic growth. Heat-inactivated<br />
bacteria support no amoebic growth [5, 6].<br />
Mirelman [6] investigated the question of what<br />
the bacteria provided to the amoeba in culture.<br />
One hypothesis suggested that bacteria provide<br />
anaerobic conditions or redox potentials that are<br />
suitable for amoebic life [7-9]. Another theory<br />
suggested that products of bacterial metabolism<br />
are essential for the amoebae [10].<br />
Bracha and Mirelman [4] showed that prolonged<br />
axenic cultivation of E. histolytica decreased<br />
its virulence, yet the ability of amoebae<br />
to cause lesions was markedly enhanced after<br />
reassociation with natural or opsonized bacteria,<br />
if an intimate surface contact between E. histo -<br />
ly tica and the added bacteria was provided.<br />
They concluded that the attachment of bacteria<br />
apparently stimulates the electron transport system<br />
of the amoeba. Similar results were obtained<br />
in low-oxygen environments conditions<br />
using a nitrogen- containing atmosphere with<br />
5% O2 and 10% CO2.<br />
The purpose of our study was to improve<br />
the xenic culture method by exploring a more<br />
appropriate environment for better understanding<br />
the cell cycle and differentiation in E. invadens.<br />
The aim was to prevent the unrestricted<br />
bacterial growth, which disturbs amoebic<br />
growth, while providing the intimate surface<br />
con tact and the essential amoebic growth factors<br />
produced by bacteria. We decided to use for our<br />
investigations a non-growing bacterial mass of<br />
oxygen consuming bacteria in mixed sediments<br />
with amoebae. We also intended to determine if<br />
products of bacterial metabolism whether from<br />
the same strain or not, could be provided separately<br />
by preconditioning the basic medium. The<br />
goal of our study was a better understanding of<br />
the inductive environmental stimuli controlling<br />
the amoebic cell cycle and cell fate decisions of<br />
E. invadens.<br />
We assumed that the interplay between the<br />
oxygen consuming bacteria and the phagocytic<br />
amoebae would modify the hypoxic state of the<br />
culture sediment continuously. Aerobic bacteria<br />
attracted our interest. It is known that gram-ne -<br />
gative bacteria, such as Aerobacter aerogenes,<br />
require oxygen to survive and grow, and that<br />
bacterial biomass consumes oxygen and releases<br />
carbon dioxide even when in stationary phase.<br />
The oxygen content in an active A. aerogenes<br />
log culture decreases with a continuously decreasing<br />
rate from about +248 Eh / mV aerobiosis<br />
down to -205 units / mV anaerobiosis [11].<br />
The culture pH values change from 6.8 to 5.2.<br />
At the end of the bacterial log phase the rate of<br />
oxygen consumption decreases until it reaches<br />
a low but constant rate [12].<br />
The present paper describes the culture me -<br />
thodology for the growth of amoebae in hypoxic<br />
modulated culture sediments with A. aerogenes.<br />
The advantages of variable low oxygen contents<br />
in the decryption of the cell biology of E. invadens<br />
are presented. The new culture method<br />
allows for the characterization of distinct subpopulations<br />
of cell types which could not be<br />
otherwise observed in vitro. These findings are<br />
from the author’s early work and were briefly<br />
reported [13, 14]. At that time interpretation of<br />
the results was not possible in the absence of<br />
what is known today on stem cell biology. Yet<br />
by following population development, the presence<br />
of extracellular signals was deduced.<br />
Evaluating the growing culture requires previous<br />
homogenization of the culture which is<br />
problematic, as stirring disturbs the hypoxic<br />
conditions that are being monitored during<br />
amoebic growth and development. Stirred culture<br />
sediments may be reestablished by centrifugation<br />
and E. invadens continues proliferation,<br />
however it differs from unstirred samples grown<br />
in parallel. Stirring may restore oxidative redox<br />
potentials in the culture [15]. Oxidative stress<br />
generally drives eukaryotic cells to negative outcomes<br />
such as growth inhibition or cell death,<br />
or arrest at specific redox-sensitive checkpoints<br />
[16-20] and causes disruption of intracellular<br />
redox homeostasis [21] that prevent the mitotic<br />
proliferation [22, 23]. It occasionally leads to<br />
positive outcomes, such as cell activation and<br />
proliferation [24, 25].<br />
MATERIALS AND METHODS<br />
Organisms<br />
The TR2 / 1 strain of E. invadens (Madagas -<br />
car) was a kind gift from Douglas Cameron<br />
26
Multicellularity in single-celled eukaryotes<br />
Barker, Department of Zoology, University of<br />
Edinburgh, Scotland. This strain was found to<br />
be easily handled under controlled conditions<br />
and fit the many prerequisites for an experimental<br />
cell system. An aerobic bacterial strain was<br />
sought which, under bacteriostatic repression,<br />
would be able to remain metabolically active<br />
and thus ensure the necessary redox potentials<br />
and partial anaerobiosis required to sustain the<br />
amoeba population. It also must be able to be<br />
consumed by phagocytosis and serve as food for<br />
the amoeba. The 20 strains screened for<br />
suitability were kindly provided by the Institute<br />
of Hygiene, University of Tübingen. Best<br />
growth re sults were achieved by preconditioning<br />
the medium with S. marcescens (Sm), and<br />
using A. aerogenes (Aa) strain AH8 in the culture<br />
sediment for redox regulation and phagocytosis<br />
by amoebae. The culture medium was<br />
therefore refered to as Aa(Sm) CM.<br />
Basic medium (BM)<br />
The stock solutions for the basic medium<br />
are: (a) bovine serum 10% in distilled water, autoclaved<br />
(121°C, 10 min) and then stored cool<br />
for several days (
VLADIMIR F. NICULESCU<br />
at 4°C (up to 30 days). Opsonized bacterial cells<br />
are added for the Aa(Sm) culture medium which<br />
is now ready for growing amoebae. En- and excystment<br />
experiments were started with freshly<br />
harvested bacteria.<br />
Inoculum<br />
The culture was carried out in 10 ml centrifuge<br />
glass U-tubes containing 5 ml of CM, 5<br />
mg of A. aerogenes AH8 bacteria and 0.5 or 1.0<br />
x 10 6 amoebae. The bacteria were inhibited by<br />
a combination of streptomycin and erythromycin.<br />
After addition of the amoeba inoculants, the<br />
tubes were centrifuged at 1,000 rpm to gently<br />
form a solid breeding sediment on the tube bottom<br />
and incubated at 28°C. The antibiotic-repressed<br />
bacterial mass provides the redox<br />
environments for optimal amoebic growth.<br />
Amoe bae consumed bacteria in the sediment.<br />
The medium remained transparent. Bacterial superinfections<br />
producing opacity and precipitation<br />
were therefore easy to detect. Aa(Sm)-CM<br />
supports ex-cystment, growth and cyclic encystment<br />
of E. invadens. All work was performed<br />
under sterile conditions.<br />
Quantitative analysis<br />
The size of the amoeba population was determined<br />
using a hematologic counting chamber.<br />
All cell counts were performed under microscope.<br />
Cysts were identified visually. In order to<br />
evaluate the population density of amoebae the<br />
contents of a culture tube needed to be homogenized<br />
by stirring. The contents of culture tubes<br />
(culture sediment and liquid) were mechanically<br />
homogenized by stirring and sucked up and<br />
down using a sterile 2 ml glass pipette. The contents<br />
of the culture tubes were thus also aerated.<br />
This is a serious problem as evaluation of each<br />
culture altered the redox environment and influenced<br />
later development in the Aa(Sm) culture.<br />
The effects of changing redox status due to the<br />
aeration caused by the first measurement were<br />
examined, by taking a second measurement at a<br />
later point. After sampling, the culture sediment<br />
was recovered by centrifugation. Later to minimize<br />
the impact of counting on population kinetics,<br />
many duplicate samples were started in<br />
parallel, each of which may be examined only<br />
once, then discarded.<br />
RESULTS<br />
Culture sediments with oxygen consu -<br />
ming bacteria provided optimal hypoxic<br />
conditions for growth and development of<br />
E. invadens<br />
Work previous to this study showed that E.<br />
invadens preferred low oxygen levels and opsonized<br />
A.aerogenes. Aminoglycosides such as<br />
streptomycin and macrolides such as erythromycin<br />
added in moderate doses to the Aa(Sm)<br />
stopped bacterial growth by inhibiting protein<br />
synthesis. The advantage of the Aa(Sm) sediment<br />
culture is the hypoxic dynamics occurring<br />
during the interplay between the antibiotically<br />
regulated bacteria and the phagocytic amoebae.<br />
Amoebae consume the bacteria by predation reversing<br />
the hypoxia. The initial consumption of<br />
oxygen by the bacteria and the subsquent consumption<br />
of the bacteria by the growing amoeba<br />
modulate the hypoxic conditions causing chan -<br />
ges in growth phases and development in E. invadens<br />
(Fig. 1). The large number of bacteria at<br />
the beginning of growth and the rapid oxygen<br />
depletion in the early initiation phase (0-2 h) induce<br />
mitotically active cells. During the growth<br />
phase (4-72 h) when amoebae feed on the oxygen<br />
consuming bacteria from the culture sediment,<br />
hypoxia is gradually reversed. As opposed<br />
to axenic culture media the environmental<br />
changes occuring in the Aa(Sm) culture, mimic<br />
the extracellular signaling from natural habitats<br />
and reveal new insights concerning growth, cell<br />
cycle and multicellularity in developmental<br />
populations of E. invadens.<br />
Growth and differentiation<br />
The initiation phase (0 - 4 h)*. The initiation<br />
phase begins at t0 and ends at t4 when<br />
amoebic population has doubled. In the early<br />
initiation phase (0-2 h) dissolved oxygen in the<br />
sediment is consumed rapidly by the bacteria.<br />
Mitotic activators cause all passaged cells to reenter<br />
and continue the cell cycle. In the late subphase<br />
(2-4 h) amoeba make the first asymmetric<br />
cell division;<br />
The growth phase I (5 - ca 30 h) * . With<br />
continuing growth the amoeba population increases<br />
and the bacteria are consumed decreasing<br />
their population. 28 - 30 h after culture<br />
*<br />
The duration of individual stages of growth indicates average time periods<br />
28
Multicellularity in single-celled eukaryotes<br />
t0 t4 t30 t72 t96<br />
initiation growth I growth II pre-stationary stationary<br />
3,5<br />
3,0<br />
2,5<br />
2,0<br />
1,5<br />
1,0<br />
0,5<br />
c<br />
v<br />
c<br />
v<br />
c<br />
v<br />
c<br />
v<br />
c (cysts)<br />
v (vege-tative cells)<br />
t 0 24 48 72 96<br />
c( x 104) 0.60 3.00 3.50 3.45 3.50<br />
v( x 106) 0.50 1.08 1.54 2.04 2.01<br />
Ratio(%) 1.20 2.77 2.27 1.69 1.74<br />
Ratio=c/v<br />
Fig. 1 - TD6 LT and QD24 LT in the cyst producing LT- culture of E. invadens<br />
The LT- passage was<br />
F<br />
started with 5 ml of culture medium CM and 5 mg of bacteria in the culture sediment. It began with<br />
0.5 x 10 6 large QD24 LT cells and 0.6 x 10 4 TD6 LT cells. A population of about 2 x 10 6 large vegetative cells (v) reached the<br />
pre-stationary phase, 72 h after the start. The number of cysts (c) at the end of the growth phase has increased to 3.5 x 10 4 .<br />
The total population of large vegetative cells was then up to 98%, which did not form cysts and death in the apoptotic<br />
phase. The ratios values showed the relative numbers of cysts in comparison to the prevailing vegetative cells. The different<br />
kinetics of the two cell lines has a ratio reduction from 2.77% (t0) to 1.69% (t72)<br />
inoculation, decreasing hypoxia arrested proli -<br />
fera tion of the cyst-producing subpopulation, as<br />
described below. This critical point marks the<br />
passage from the more hypoxic growth phase I<br />
to the low hypoxic growth phase II;<br />
The growth phase II (30 - 72 h)*. In this<br />
phase only the cyst-free subpopulation continues<br />
proliferation and consumes the bacteria until<br />
the hypoxic growth stimuli no longer exist. At<br />
the end of this phase 80 % of the cyst-free subpopulation<br />
is mitotically inactive as a quiescent<br />
cell fraction continuing phagocytosis. The few<br />
remaining bacteria provided cannot sustain hypoxic<br />
conditions.<br />
The pre-stationary phase (72 - 96 h)*. In<br />
this phase the number of cell divisions is clear.<br />
But in some cases other than Fig. 1 a few symmetric<br />
divisions were observed.<br />
The stationary phase (97 - 124 h)*. Cultures<br />
enter this absolute stationary phase when<br />
net growth is zero and the amoebic subpopulations<br />
experience oxidative stress and other<br />
growth limiting factors.<br />
The vegetative death phase begins at the<br />
moment when vegetative cell metabolism can<br />
no longer be maintained in the culture. 144 h<br />
after start, the vegetative cells showed increased<br />
lysis, but not encystment. Their senescence was<br />
irreversibly programmed. Thus, in the first 3-4 h<br />
of recultivation about one-third of the 144 h<br />
inoculum went apoptotic.<br />
Subpopulations During a period of four<br />
years more than 100 passages of multicellular<br />
Aa(Sm) culture were examined. In the long term<br />
cultures (LT culture), two subpopulations were<br />
observed, namely (i) a major significant cystfree<br />
subpopulation (90-98% of total population)<br />
and (ii) a minor cyst-containing subpopulation<br />
which supports cell -cycle associated encystment.<br />
An additional metacystic subpopulation<br />
was generated by excysted amoebulae, however<br />
it was quantitatively insignificant in the culture<br />
from Fig. 1 (
VLADIMIR F. NICULESCU<br />
ned (D1 cells) and act as a stable self-renewing<br />
cell line (SRL) whereas the other 50% cells are<br />
mitotically repressed (D2 cells); they exit cell<br />
cycle, accumulating in a differentiated cell compartment.<br />
Asymmetric division and cell cycle<br />
exit are markers for cell differentiation and the<br />
mitotically repressed D2 cells are quiescent differentiated<br />
cells (QD cells). Self renewing lines<br />
remained thereby constant in number and the<br />
population growth by quiescent and cyst units<br />
respectively by accumulation of cells in the differentiated<br />
cell reservoirs of each subpopulation<br />
as seen in Fig. 1.<br />
Amoebic growth follows an arithmetic progression.<br />
Extracellular starting signals from the<br />
early initiation phase reactivate all passaged cell<br />
fractions for cell cycle progress and cell division.<br />
240 min after the start amoebic population<br />
doubled by asymmetric differentiative division<br />
producing once more 50% self renewing cells<br />
(D1) and 50% differentiated cells (D2). Further,<br />
each subpopulation grows arithmetically. The finite<br />
formula for successive members of this<br />
arithmetic growth progression is half the sum<br />
between the previous progression members<br />
(pm) and the later ones<br />
pm (x) = [ pm (x+1) + pm (x-1) ] : 2 (1)<br />
If the valid term for the amobic inoculum<br />
is ai and the common difference of successive<br />
members is b and b = ai, then the n-th term of<br />
the sequence is given by:<br />
an = ai + (n – 1) ai (2)<br />
and the sequence is:<br />
pm (1) = ai ; pm (2) = ai + d ;<br />
pm (3) = ai + 2d… .. pm (n) = ai + (n-1)d (3)<br />
wherein d the sum of differentiated D2 cells is<br />
and d = pm (1)<br />
Based on the multicellularity of inoculating<br />
population, consisting of self renewing and quiescent<br />
cells at the time of passaging, the inoculum<br />
can be described as follows:<br />
ai = Σ (D1 n + D2 1→n ) : x , (4)<br />
where “n” is the number of cell generation in the<br />
preculture, D2 1→n is the size of the quiescent<br />
reservoir and “x” is the dilution factor used passaging<br />
the inoculum. The new self renewing QD<br />
line (QD-SRL) in the subculture replenished by<br />
reactivated QD-cells. The size of the QD-SRL<br />
remains constant only if x = n+1, as happened<br />
in the case of the cyst free subpopulation in Fig.<br />
1. However the TD6 LT shrinks to 25% as it has<br />
no vegetative reservoir which could prevent the<br />
reduction by reactivation. The D2 cells of the<br />
precyst-producing subpopulation converted to<br />
cyclic encystment and a vegetative reservoir no<br />
longer exists. If x> (n+1), the TD6 LT shrinks<br />
even further, and the distance to the QD24 LT is<br />
even greater. In the case of the new self renewing<br />
TD cell line<br />
ai = D1 n : x (5)<br />
Continuous and non-continuous self renewing<br />
cell lines. As seen in Fig. 1 the diffe -<br />
rentiated D2 cells of the cyst-free subpopulation<br />
exit the cell cycle in a reversible state and remain<br />
in a quiescent state (QD cells) as long as<br />
appropriate inducers for reactivation QD cells<br />
are lacking. Thus, the differen tiated D2 cells<br />
exiting cell cycle build a quiescent cell compartment<br />
(QD cell reservoir) and remain for an extended<br />
time mitotically repre ssed (Fig.1: t4 -<br />
t124) keeping phagocytic ability. In other words,<br />
the self-renewing line of the cyst-free subpopulation,<br />
comprising D1 cells, produces continuously<br />
differentiated QD cells. The continuous<br />
self renewing line from the LT cultures was<br />
named in the following QD LT .<br />
The differentiated D2 cells of the cyst-containing<br />
subpopulation exit cell cycle in an irreversible<br />
state commited for terminal diffe rentiated<br />
(TD cells). In the case of E. invadens terminal<br />
differentiated cells are progammed for<br />
further differentiation, coupled with the immediate<br />
formation of cyst wall (CE cysts). In other<br />
words commited TD cells are pre-cysts stages<br />
of E. invadens. The self-renewing line TD LT has<br />
a limited life span ending at t28, when regressing<br />
hypoxia stops its proli feration. Because cyst<br />
production discontinued in some passages the<br />
self-renewing line TD LT seemed to be a non-continuous<br />
SRL closing by low hypoxic conditions.<br />
Average generation time. The average generation<br />
time (AGT) of both SRLs in Fig 1 was<br />
30
Multicellularity in single-celled eukaryotes<br />
different, indicating different cell lines with cell<br />
cycles of different length. While the self renewing<br />
line producing terminal differentiated cells<br />
has an accelerated AGT of about 6 h (TD6 LT<br />
line), the self renewing line producing quiescent<br />
cells showed an increased AGT of approximately<br />
24 h (QD24 LT line). According to the li -<br />
terature the extension of the cell cycle is caused<br />
by lengthening the G1 phase (slow cycling) and<br />
changes in the length of G1 phase are understood<br />
to accompany differentiation [26].<br />
DISCUSSION<br />
In contrast to the results observed with axenic<br />
culture media, the Aa(Sm) hypoxic technique<br />
allows the observation of details of the<br />
cell cycle and differentiation in E. invadens not<br />
possible previously. Hypoxia is a state of oxygen<br />
deficiency in the Aa(Sm) culture sediment,<br />
induced by oxygen consumption by the metabolically<br />
repressed A. aerogenes bacteria. It is a<br />
condition in which the oxygen content of the<br />
culture sediment decreased below the normal<br />
level of the oxygen dissolved in culture medium.<br />
The streptomycin-erythromycin combination inhibits<br />
the bacterial growth resulting in a nonproliferating<br />
bacterial biomass, which still<br />
consumes oxygen. Because cultures are not<br />
shaking only diffusion from the surface can replenish<br />
the oxygen consumed by the culture se -<br />
diment from the bottom of the culture vessel.<br />
When sediment bacteria are phagocytized by E.<br />
invadens, the number of bacteria decreases progressively<br />
and hypoxia is slowly reversed.<br />
Most amoebic species are bacteriophilic and<br />
bacteria are their most important prey. Free-living<br />
amoebae, such as Acanthamoeba, feed as a<br />
motile grazer, on bacteria tightly associated with<br />
surfaces.. This can be viewed in culture were<br />
amoebae attached firmly on the base of culture<br />
dishes amid dense biofilms of bacteria [27]. Undoubtedly,<br />
the protists encounter anaerobic conditions<br />
in the vicinity of densely packed biofilms<br />
of bacteria consuming oxygen [28]. Inside the<br />
films living bacteria develop pronounced oxygen<br />
gradients forming anoxic microniches [29].<br />
Ecologists have assumed the metabolic activity<br />
of bacteria would reduce oxygen levels in amoebic<br />
environments. Strains of Acanthamoeba<br />
grew well under aerobic and microaerophilic<br />
conditions as well as at hypoxic oxygen concentrations.<br />
Environments of 26% O2 saturation<br />
(2mg/L) were considered aerobic, environments<br />
of 11 % microaerophilic. Most of the tested<br />
strains grew faster under low oxygen conditions<br />
[27, 30].<br />
Similar results were reported by Bracha and<br />
Mirelman [4] who found that both microaerobic<br />
conditions and attachment of opsonized bacteria<br />
at the surface of E. histolytica augment amoebic<br />
metabolism (virulence). For increasing the virulence<br />
axenic growth amoebae were preincubated<br />
2.5 x 10 5 amoebae/ml at a ratio of 1:1000<br />
with bacteria capable of adhering to the trophozoites.<br />
Best stimulation was obtained when<br />
preincubation lasts 15 min to 1 h. In this time<br />
60-70 bacteria attached per amoeba but only 5 -<br />
10 of them were ingested. We hypothesized first<br />
that the bacterial adherents seen by Bracha and<br />
Mirelman [4] consume oxygen at the surface of<br />
amoebae, as happened in free-living Acanthamoeba<br />
and considered surface hypoxia as<br />
the most important stimulus for changing amoebic<br />
behaviour. Secondly the preconditioning<br />
phase of 15 - 60 min is likely to correspond to<br />
the initiation phase of the Aa(Sm) culture and<br />
the increasing hypoxia which occurs in the early<br />
initiation phase (0 – 120 min).<br />
As opposed to axenic culture media, the<br />
Aa(Sm) technique enables solving details of<br />
amoebic cell cycle and differentiation. E. inva -<br />
dens shows a preference for low oxygen levels<br />
and hypoxic environments permit multicellula -<br />
rity in the Aa(Sm) culture. Like free living<br />
amoebae E. invadens grew faster under low<br />
oxygen conditions (see TD6 LT line). Its optimal<br />
AGT is about 6 h.<br />
Hypoxia dynamics seemed to be the driving<br />
force for E. invadens behaviour. In Aa(Sm) sedi -<br />
ments consumption of oxygen by bacteria and<br />
depletion of bacteria by phagocytosis control<br />
environment dynamics and the fate of the amoebic<br />
population. Due to the large number of bacteria<br />
at the beginning of growth, the oxygen<br />
depletion in the culture sediment is quite high,<br />
but at the end of growth phase I, when enough<br />
bacteria are consumed, hypoxia is relieved as<br />
31
VLADIMIR F. NICULESCU<br />
oxygen levels slowly increase. Reversing hypoxia<br />
repressed TD6 LT proliferation at the<br />
growth phase I to growth phase II barrier. The<br />
nearly pure amoebae sediment at the end of the<br />
growth phase II loses the protection of the oxygen<br />
consuming bacteria and stops proliferation<br />
of QD24 LT . The environmental changes which<br />
occur in the Aa(Sm) culture, accurately mimic<br />
the events present in the natural habitat.<br />
Hypoxic cultivation of E. invadens in conditions<br />
of increasing and decreasing hypoxia<br />
modulated by both culture sediment partners<br />
lead to co-existing subpopulations comprising<br />
distinct cell types. Following the pattern of proliferation,<br />
we identified in the passage in Fig. 1<br />
a major cyst-free subpopulation (≤ 98%) and a<br />
minor cyst-containing subpopulation (≥ 2%),<br />
which are due to the differing counts of self renewing<br />
lines present. The SRL control the pro -<br />
cess of differentiation within each subpopulation.<br />
Each SRL is a constant, invariable quantity<br />
of cells, from which asymmetric cell divi -<br />
sions are always able to renew themselves<br />
through D1 daughter cells. Others, however, to<br />
produce specifically differentiated D2 daughter<br />
cells.<br />
The question is why the major cyst-free subpopulation<br />
is dominant with >90% of the population<br />
and the precyst-producing subpopulation<br />
is so much lower at 2 percent. Looking at the<br />
formulas (4) and (5) the new SRLs in mixed<br />
subcultures are<br />
Σ (D1 n + D2 1→n ) : x, for the QD-SRL and<br />
D1 n : x, for the TD-SRL. In the case of the Fig.1<br />
the size of the QD-SRL remains constant if n =<br />
3 and x = 4, however the TD-SRL shrinks to<br />
25% as it has no vegetative reservoir which<br />
could prevent the reduction. If x> 4 or n ≠ 3, the<br />
TD6 LT shrinks even further, and the distance to<br />
the QD24 LT is even greater. The data suggest<br />
that production of CE cysts in subsequent subcultures<br />
can only happen with the participation<br />
of the third metacystic subpopulation and its<br />
conversion of a new TD-SRL.<br />
Multicellular communities composed of<br />
various cell types were seldom reported in vitro.<br />
It is interesting that Goldman and Davies [31]<br />
described a significant and consistent bimodal<br />
size distribution in cultures of E. histolytica<br />
grown monoxenically with Trypanosoma cruzi<br />
in sealed low oxygen cultures. The relative sizes<br />
of big (B) and small (S) subpopulations continued<br />
in different media. The measurements of the<br />
authors over a time period of 1.5years showed<br />
that “S” and “B” clones maintain the same relative<br />
percentage. A switch of S and B strains was<br />
not observed. The authors concluded that an endogenous<br />
mechanism controlled size and the<br />
only factor capable of influencing size were<br />
from external factors as the medium composition<br />
and the bacterial culture. The same authors<br />
reported that in axenic cultures the amoebae<br />
grew only at a large size.<br />
This raises the following question; do the<br />
multicellularity and the size differences observed<br />
by Goldman and Davies [31] correspond<br />
to the “magna” and “minuta” cell types seen in<br />
in vivo? Do asymmetric division and multicellularity<br />
exist in axenic cultures? Does a minor<br />
axenical subpopulation producing commited<br />
precysts exist in axenic cultures? Are cyst like<br />
structures (CLS), differentiated from axenically<br />
grown amoebae [50, 51], as the expression of an<br />
incomplete miscarried diffe rentiation, due to the<br />
lack of appropriate hypoxic conditions? Is<br />
“spontaneous” encystment, as seen occasionally<br />
in cultures, the product of cyclic encystment<br />
(CE cysts) or the result of a direct conversion by<br />
unfavorable environmental conditions (noncyclic<br />
encystment, DI cysts)?<br />
“Magna” represents the feeding form of E.<br />
histolytica (E.h.: 20-30μ), living in the submucous<br />
layer of the large intestine and other host’s<br />
tissues and organs while “minuta” (E.h.: 12-<br />
15μ) is the non-feeding form without vacuoles<br />
(precyst), inhabiting in the lumen of the large intestine.<br />
Other authors have seen the “minuta”<br />
form phagocytized in the endoplasm, indicating<br />
“minuta” are, at least in early phases, a feeding<br />
form also. When resistance of the host’s body<br />
was low “minuta” converted to “magna” and invaded<br />
the tissue of the intestine [32]. The conditions<br />
leading to this conversion are not<br />
understood [33]. Bacterial infections, alterations<br />
in the normal bowel flora and the presence or<br />
absence of distinct intestinal flora were suggested<br />
as facilitating the conversion. Generally,<br />
it is accepted that “minuta” may be the primary<br />
32
Multicellularity in single-celled eukaryotes<br />
form of E. histolytica with encysting capabilities<br />
in the intestinal lumen.<br />
This morphologically based terminology<br />
appears quite ambiguous. It does not distinguish<br />
between distinct “minuta” forms, such as between<br />
the primary feeding- minuta that phagocytizes<br />
bacteria and the precyst- minuta<br />
(non-feeding form). “Minuta” is rather a collective<br />
term used for several cell biologically distinct<br />
cell types observed to date, which does<br />
account for differences in function. This also applies<br />
to the “magna” concept used probably for<br />
all cell types of the cyst free subpopulations.<br />
Both collective terms are not well suited to describe<br />
the cell biological processes in the genus<br />
Entamoeba.<br />
The terminology used in this study is based<br />
in cell biology and has an interdisciplinary character.<br />
It allows comparisons between the differentiation<br />
of higher and lower eukaryotes, such<br />
mammalia and protists. We try in the following<br />
to keep a semantic correlation between the two<br />
terminologies to provide an acceptable terminolgy<br />
for both communities of developmental<br />
biologists and protozoologists. Correspondingly,<br />
the Aa(Sm) culture contains two subpopulations<br />
of E. invadens: a subpopulation of magna-like<br />
cells without encystment ability in culture and<br />
a subpopulation of minuta-like cells producing<br />
cysts by cyclic encystment. The engine of the<br />
cyst-free subpopulation (magna-like) in Fig. 1<br />
is the more ubiquitous self renewing line<br />
QD24 LT , which proliferates in the upper, middle<br />
and lower hypoxic ranges (growth phases I and<br />
II). In contrast to the self renewing D1 cells with<br />
an AGT of 24 h, quiescent D2 cells survive up<br />
to 5 days in the Aa(Sm) culture. During the<br />
growth phase (4 to 128 h) QD cells phagocytose<br />
constantly and increase their size to 50-60μ and<br />
more. Perhaps the phagocytical QD cells survive<br />
in vivo indefinitely, if they occupy niches of re -<br />
latively luxurious environmental conditions. It<br />
remains to be clarified in the future, whether<br />
quiescent QD-cell is the cell form penetrating<br />
various host’s tissue and organs, where they remain<br />
mitotically repressed or become reactivated<br />
for cell cycle reentry and formation of<br />
new SRL.<br />
The motor of the precyst-producing sub -<br />
population (minuta-like) is the more hypoxic<br />
TD6 LT line, which has a 6 h generation time on<br />
average. Produced by asymmetric cell divisions,<br />
they have two cell types; a D1 daughter cell identical<br />
to itself by self renewal and a differentiated<br />
short-living daughter cell D2 (precyst). Immediately<br />
after the division of the mother cell, D2<br />
daughter becomes the protecting cyst wall and<br />
differentiate to a resting tetranucleated cell by a<br />
process of terminal differentiation corresponding<br />
to a totipotent developmental progenitor<br />
differentiation. Its excysted progeny (eight<br />
amoebulae) generate a primary metacystic cell<br />
line. The conversion of a terminal differentiated<br />
precyst into a walled cyst during late initiation<br />
phase of the culture lasts about only 120 minutes.<br />
Precysts have a minimum life span. It was therefore<br />
difficult to morphologically identify in the<br />
mass of the remaining cell units (> 98%) (Fig. 1).<br />
They can be detected only through indentifying<br />
the final product, namely the walled cyst.<br />
Whether the easily detectable non-feeding minuta<br />
from the intestinal lumen and the extremely<br />
short-living terminal differentiated D2 precyst<br />
from the Aa(Sm) culture are one and the same<br />
can be questioned. Rather, it could be in the<br />
classical terminology the around 6 h living self<br />
renewing D1 cell, that is easier to find.<br />
The discovery of cyclic encystment and CE<br />
cysts in hypoxic cultures of E. invadens sheds<br />
light on the question of the causes and mechanisms<br />
of “spontaneous encystment”. Models<br />
lacking experimental validation led to conclusions<br />
that spontaneous cyst formation occurred<br />
in E. invadens, at the late growth phase just before<br />
cells reaching stationary phase, and ending<br />
by lysis [34]. Other authors reported that trophozoites<br />
of E. invadens encyst spontaneously in<br />
the LG media when glucose is absent [35].<br />
Many researchers concluded, the molecular<br />
mechanisms leading to formation of cysts in cultures<br />
of Entamoeba remained unresolved [35-<br />
39]. This is especially the case for the<br />
connection between DNA synthesis, cell division<br />
and formation of cysts [40-43]. One specific<br />
unanswered question was why conversion<br />
of one or both of the daughter cells into cysts requires<br />
prior DNA synthesis events. Since little<br />
was known about the molecular mechanisms of<br />
primitive eukaryotes and their connections to<br />
33
VLADIMIR F. NICULESCU<br />
cyst conversion, isolated observations could not<br />
be interpreted satisfactorily and encystment was<br />
considered erroneously as a multiphase process<br />
requiring its own DNA synthesis phase [44, 45].<br />
In complex xenic media containing non-repressed<br />
bacterial commensals “spontaneous”<br />
encystment of E. histolytica was induced by the<br />
natural environmental conditions of the culture.<br />
Byers et al. [35] suggested that production of<br />
cysts in Entamoeba is regulated in part by the<br />
level of short-chain fatty acids SCFA made by<br />
the bacterial population of the colon and the<br />
composition of the mucus layer. Singh and<br />
Ehrenkaufer [46] concluded that components of<br />
the complex xenic media are sufficient to trigger<br />
developmental conversion of Entamoebae<br />
tropozoites to cysts and at least in long term cultures<br />
of E. invadens, parasites appear to cycle<br />
between cysts and trophozoites. However, most<br />
long term axenized populations of E. histolytica<br />
were not able to re-adapt to complex xenic<br />
media with bacteria and all axenized strains lose<br />
encystation competence. Attempts to reculture<br />
axenic grown E. histolytica with bacterial flora<br />
were not able to restore the ability to propagate<br />
and make cysts [46].<br />
The data above suggest that “spontaneous<br />
encystment” observed in complex xenic cultures<br />
could be due to the presence of a minor TD-SRL<br />
as seen in the Aa(Sm) LT culture, producing CE<br />
cysts.<br />
“Spontaneous” cyst formation as cyclic encystment<br />
would differ fundamentally from the<br />
direct conversion, induced experimentally by<br />
stress factors [47-49]. Axenic cultured amoebae<br />
growing at a large size [31] do not provide the<br />
conditions for developmet of a high hypoxic<br />
TD-SRL and lose the capacity for conversion to<br />
another cell type, as described by Sing and<br />
Ehrenkaufer [46].<br />
In the subsequent work of the author the<br />
subject is to uncover further details of what<br />
leads to cyclic and non-cyclic encystment. It<br />
will describe environmental and hypoxic signals<br />
that will control the developmental events in the<br />
initiation phase of the Aa(Sm) culture as well as<br />
during reversal of the hypoxia. It will also analyze<br />
the factors that direct the conversion of<br />
cells from the cyst-free subpopulation to form<br />
cysts. In our experience, QD cells (D2 cells)<br />
need for an induced direct conversion additional<br />
rounds of DNA sythesis, while when SRL cells<br />
(D1 cells) require no additional DNA synthesis<br />
(unpublished data). Induced SRL cells in nonpermissive<br />
cell cycle stages (S, G2/M) produced<br />
by symmetric division two daughter cells, both<br />
determined to form cysts.<br />
ACKNOWLEDGEMENTS<br />
Dr. Helmut Zacharias, cell geneticist, Kiel,<br />
Germany, Dr. Frank Wohlrab, cell pathologist,<br />
Leipzig, Germany, and Dr. Eugenia Rodica<br />
Niculescu, microbiologist, Augsburg, Germany,<br />
for peer support. In addition Dr. Dennis Thomas,<br />
Munich, Germany, and Robert Braun, Conn.<br />
USA, for German-English translation.<br />
CV/Felowships/ Grants:<br />
Vladimir F. Niculescu, Starting in 1983 was<br />
Partner at SeroScreen GmbH in Hannover and<br />
Augsburg and Consultant for Infectious Diseases,<br />
Lab Diagnostics and Epidemiology;<br />
1975-1983 Clinical Virologist at the Medical<br />
University of Hannover (MHH); 1969-1975<br />
post-graduated Researcher at the Biology Institute<br />
III at the University of Tübingen, and Bonn-<br />
Konrad- Adenauer- Foundation scholar; 1964-<br />
1969 Cell Biologist at the Dr.I. Cantacuzino Institute<br />
for Microbiology in Bucharest.<br />
Education: 1959-1964 Master of Science in Biology,<br />
University of Bucharest.<br />
REFERENCES<br />
1. Diamond LS. Techniques of axenic cultivation of Entamoeba<br />
histolytica Schaudinn, 1903 and E. histoly tica<br />
- like amoebae. J. Parasitol. 1968. 54: 1047-1056.<br />
2. Diamond LS. Entamoeba, Giardia and Trichomonas.<br />
In: In vitro methods for parasitic cultivation, (Ed. A.<br />
E. Taylor, J. R. Baker). 1987. Academic Press, London,<br />
pp 1-17.<br />
3. Diamond LS, Harlow DR, Cunnick CC. A new<br />
medium fort the axenic cultivation of Entamoeba histolytica<br />
and other Entamoeba. Trans. Roy. Soc. Trop.<br />
Med. Hyg. 1978. 72: 4331- 4332.<br />
4. Bracha R, Mirelman D. Virulence of Entamoeba histolytica<br />
trophozoites. Effects of bacteria, microaerobic<br />
conditions, and metronidazol. J. Exp.Med. 1984. 160:<br />
353-368.<br />
5. Chang SL. Cultural, cytological and ecological observations<br />
on the amoeba stage of Naegleria gruberi. J.<br />
Gen. Microbiol. 1958. 18: 565-578.<br />
34
Multicellularity in single-celled eukaryotes<br />
6. Mirelman D. Ameba-bacterium relationship in amebiasis.<br />
Microbiol. Rev. 1987. 51: 272-284 (doi: 0146-<br />
0749/87/020272-13$02.00/0).<br />
7. Chang SL. Studies on Endamoeba histolytica. V. The<br />
relation of oxidation reduction potentials to the growth,<br />
encystation and excystation of E. histolytica in water.<br />
Parasitol. 1946. 37: 100-112.<br />
8. Jacobs L. Oxidation-reduction potentials in relation to<br />
the cultivation of Endamoeba histolytica. J. Parasitol.<br />
1941. 27 (Suppl.): 31.<br />
9. Nakamura M. Nutrition and physiology of Endamoeba<br />
histolytica. Bacteriol. Rev. 1953. 17: 189-212<br />
(PMID: 13081544) (PMCID: PMC180769).<br />
10. Reinertson JW, Thomson PE. Experimental amoebic<br />
hepatitis in hamsters. Proc. Soc. Exp Biol. Med.<br />
1951. 76: 518-521 (PMID: 14844258).<br />
11. Troller JA. and Frazier WC. Repression of Staphylococcus<br />
aureus by food bacteria. II. Causes of inhibition.<br />
Appl Microbiol. 1962. 11: 163-165.<br />
12. Clifton CE. A comparison of the metabolic activities<br />
of Aerobacter aerogenes , Eberthella typhi and Escherichia<br />
coli. J. Bacteriol. 1937. 33: 145-162.<br />
13. Niculescu VF. A culture medium for study of the cell<br />
system in E. invadens. 3rd Intern. Congr. Parasit. Munich,<br />
ICOPA III, G3; 1974a. Published on-line.<br />
http://entamoebainvadens2010vfn.wordpress.com.<br />
14. Niculescu VF. The primitive cell system of E. invadens<br />
as related to cell differentiation. 3 rd Intern.<br />
Congr. Parasit. Munich, ICOPA III, A11; 1974b. Pu -<br />
blished on-line http://entamoebainvadens2010vfn.<br />
wordpress.com.<br />
15. Jacob E. Das Redoxpotential in Bakterienkulturen.<br />
II. Ztschr. f. Allg.Mikrobiol. 1971.<br />
11: 691-734 (doi: 10.1002/jobm.19710110809).<br />
16. Kerk NM., Feldman LJ. A biochemical model for<br />
initiation and maintenance of the quiescent center-implications<br />
for organization of root meristems. Development<br />
1999. 121: 2825-2833<br />
17. Reichelt JP. Specific checkpoints regulate plant cell<br />
cycle progression in response to oxidative stress.<br />
Plant. J. 1999. 17: 647-656.<br />
18. Russo T, Zambrano N, Esposito F, Ammendola R,<br />
Cimino F, Fiscella M, Jackman J, O’Connor PM,<br />
Anderson CW, Appella E. A p53 independent pathway<br />
for activation of WAF1/CIP1 expression following<br />
oxidative stress. J. Biol. Chem. 1995. 270:<br />
29386-29391 (doi: 10.1074/jbc.270.49.29386).<br />
19. Katto N, Esaka M. Changes in ascorbate oxidase<br />
gene expression and ascorbate levels in cell division<br />
and cell elongation in tobacco cells. Physiol. Plant<br />
1999. 105: 321-329.<br />
20. Vernoux T. The root meristemless1/cadmium sensitive2<br />
gene defines a glutathione –dependent pathway<br />
involved in initiation and maintenance of cell division<br />
during postembryonic root development. Plant Cell<br />
2000. 12: 97-110.<br />
21. Schafer FQ, Buettner GR. Redox environment of<br />
the cell as viewed through the redox state of the glutathione<br />
disulfide/glutathione couple. Free Radic.<br />
Biol. Med. 2001. 30: 1191-1212 (PII S0891-<br />
5849(01)00480-4) (PMID: 11368918).<br />
22. Potters G, Horemans N., Caubergs RJ., Asard H.<br />
Ascorbate and dehydroascorbate influence cell cycle<br />
progression in a tobacco suspension. Plant Physiol.<br />
2000. 124: 17-20 (doi: 10.1104/pp.124.1.17).<br />
23. Dixit R, Cyr R. Cell damage and reactive oxygen<br />
species production induced by fluorescence microscopy:<br />
effect on mitosis and guidelines for non-invasive<br />
fluorescence microscopy. The Plant J. 2003.<br />
36: 280-290 (doi: 10.1046/j.1365-<br />
313X.2003.01868.x).<br />
24. Nakamura H, Nakamura K, Yodoi J. Redox regulation<br />
of cellular activation. Ann. Rev. Immunol. 1997.<br />
15: 351-369.<br />
25. Moon H, Lee B, Choi G, Shin D, Prasad DT, Lee<br />
O, Kwak SS, Kim DH, Nam J, Bahk J, Hong JC,<br />
Lee SY, Cho MJ, Lim CO, Yun DJ. NDP Kinase 2<br />
interacts with two oxidative stress-activated MAPKs<br />
to regulate cellular redox state and enhance multiple<br />
stress tolerance in transgenic plants. PNAS. 2003.<br />
100:358-363 (doi: 10.1073/pnas.252641899)<br />
(PMCID: PMC140977).<br />
26. Calder A, Roth-Albin I, Bhatia S, Pilquil C, Lee<br />
JH, Bhatia M, Levadoux-Martin M, McNicol J,<br />
Russell J, Collins T, Draper JS. Lengthened G1<br />
Phase Indicates Differentiation Status in Human Embryonic<br />
Stem Cells. Stem Cells Dev. 2012. ahead of<br />
print (doi:10.1089/scd.2012.0168) .<br />
27. Cometa I, Schatz S, Trzyna W, Rogerson A. Tolerance<br />
of naked amoebae to low oxygen levels with an<br />
emphasis to the genus Acanthamoeba. Acta Protozool.<br />
2011. 50: 33-40.<br />
28. Turner NA, Biagini GA, Lloyd D. Anaerobiosis induced<br />
differentiation of Acanthamoeba castelanii.<br />
FEMS Microbiol. Letters. 1997. 157: 149-153 (doi:<br />
10.1111/j.1574-6968.1997.tb12766.x).<br />
29. Kuhl M, Rickelt RF, Thar R. Combined imaging of<br />
bacteria and oxygen in biofilms. Appl.Environ.Microbiol.<br />
2007. 73: 6289-6295 (doi: 10.1128/AEM.01574-<br />
07).<br />
30. Barbeau J, Buhler T. Biofilms augment the number<br />
of free-living amoebae in dental unit waterlines. Res.<br />
Microbiol. 2001. 152: 753-760.<br />
31. Goldman M, Davis V. Isolation of different-size substrains<br />
from three stock cultures of Entamoeba histolytica,<br />
with observations on spontaneous size<br />
changes affecting whole populations. J Protozool.<br />
1965. 12: 509-523 (doi: 10.1111/j.1550-<br />
7408.1965.tb03250.x).<br />
32. Kotpal RT. Entamoeba histolytica. In: Modern textbook<br />
of Zoology: Invertebrates. 2010. 2.nd.ed, chap.7,<br />
pp 72-78 (Ed. Rakesh Kumar Rastogi). Capital Offset<br />
Press New Delhi.<br />
33. Stein E. Anorectal and colon diseases. Amoebiasis,<br />
pp 496-499 In: Textobook and color atlas of Procto -<br />
logy. 2003. 4th ed. Springer Verlag Berlin, Heidelberg.<br />
34. Vazquezdelara-Cisneros LG, Arroyo-Begovich M.<br />
Induction of encystation of Entamoeba invadens by<br />
removal of glucose from the culture medium. J. Parasitol.<br />
1984. 70: 629-633 (http://www.jstor.org/stable/3281741).<br />
35. Byers J, Faigle W, Eichinger D. Colonic short-chain<br />
fatty acids inhibit encystation of Entamoeba invadens.<br />
Cell.Microbiol. 2005. 7: 269-279 (doi:<br />
10.1111/j.1462-5822.2004.00457.x).<br />
35
VLADIMIR F. NICULESCU<br />
36. Kumagai M, Makioka A, Ohtomo H, Kobayashi S,<br />
Takeuchi T. Inhibition of encystation of Entamoeba<br />
invadens by aphidicolin. Tokai J. Exp. Clin. Med.<br />
1998. 23: 313-317.<br />
37. Satish S, Bakre AA, Bhattacharya S, Bhattacharya<br />
A. Stress-dependent expression of a polymorphic,<br />
charged antigen in the protozoan parasite Entamoeba<br />
histolytica. Infect. Immun. 2003. 71: 4472–4486.<br />
38. Ebert F, Bachmann A, Nakada-Tsukui K, Hennings<br />
I, Drescher B, Nozaki T, Tannich E, Bruchhaus<br />
I. An Entamoeba cysteine peptidase specifically<br />
expressed during encystation. Parasitol. Int. 2008. 57:<br />
521-524 (doi: 10.1016/j.parint.2008.07.002).<br />
39. Marien D. Mechanisms of encystation of Entamoeba<br />
invadens. Published online. 2010 (doi:10.1371/journal.pntd.0000607).<br />
40. Balamuth WJ. Effects of some environmental factors<br />
upon growth and encystations of Entamoeba invadens.<br />
J. Parasitol. 1962. 48: 101-109.<br />
41. Meyer DF, Morgan RJ. Evidence for a link between<br />
division and differentiation in Entamoeba invadens.<br />
J.Protozool. 1971. 18: 282-284 (PMID: 5091278).<br />
42. Thepsuparungsikul V, Seng L, Bailey, GB. Differentiation<br />
of Entamoeba: Encystation of Entamoeba<br />
invadens in monoxenic and axenic cultures. J. Parasitol.<br />
1971. 57: 1288-1292.<br />
43. Sirijintakarn P, Bailey GB. The relationship of DNA<br />
synthesis and cell cycle events to encystation by Entamoeba<br />
invadens. Arch. Invest. Med. (Mexico) 1980.<br />
11: 3-10 (Suppl.1) (PMID: 7469646).<br />
44. Eichinger D. Encystation in parasitic protozoa. Curr.<br />
Opin. Microbiol. 2001. 4: 421-426.<br />
45. Singh N, Bhattacharya S, Paul J. Entamoeba invadens:<br />
Dynamics of DNA synthesis during differentiation<br />
from trophozoite to cyst. Exp. Parasitol. 2010.<br />
127:329-333 (doi:10.1016/j.exppara.2010.08.013).<br />
46. Singh U, Ehrenkaufer GM. Recent insights into Entamoeba<br />
development: identification of transcriptional<br />
networks associated with stage conversion. Int. J.<br />
Para sitol. 2009. 39 : 41-47 (doi:10.1016/j.ijpara.<br />
2008.09.004.) (PMCID: PMC2648836).<br />
47. Balamuth WJ. Biological studies on Entamoeba histolytica.<br />
III. Induced encystation in several mediums,<br />
including an account of a new procedure. J. Infect.<br />
Dis. 1951. 88: 230-236 (PMID:14850747).<br />
48. Robinson GL. The laboratory diagnosis of human<br />
parasitic amoebae. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg.<br />
1968. 62: 285-294.<br />
49. Chayen A, Avron B, Nuchamiwitz Y, Mirelman D.<br />
Appearance of sialoglyco-proteins in encysting cells<br />
of Entamoeba histolytica. Infect. Immun. 1988. 56:<br />
673-681<br />
50. Aguilar-Diaz H, Diaz-Gallardo M, Laclette JP,<br />
Carrero JC. In vitro induction of Entamoeba histoly -<br />
tica cyst-like structures from trophozoites. Plos Negl<br />
Trop Dis. 2010. 4(2): e607 (doi:10.1371/journal.<br />
pntd.0000607).<br />
51. Aguilar-Diaz H, Laclette JP, Carrero JC. Silencing<br />
of Entamoeba histolytica glucosamine 6 phosphate<br />
isomerase by RNA interference inhibits the formation<br />
of cyst-like structures. BioMed Research International.<br />
<strong>2013</strong>. (doi:10.1155/<strong>2013</strong>/758341).<br />
36
seDIMeNTe CU BACTeRII AeROBe RePRIMATe<br />
MeTABOLIC eLUCIDeAZÃ LA EntamoEba invadEns<br />
sIsTeMUL MULTICeLULAR ŞI CICLUL De VIAÞÃ AMIBIAN<br />
Vladimir F. Niculescu*<br />
institutul de Zoologie şi departamentul de biologie iii, Universitatea din tübingen, Germania<br />
şi Laboratoarele sero-screen din augsburg, Germania<br />
ReZUMAT<br />
În ciuda progreselor remarcabile ale biologiei celulare din ultima vreme, fenomenele de diferenţiere<br />
celulară la amoebele parazite din genul Entamoeba, îndeosebi mecanismele genetice şi inducţia prin<br />
semnale externe din mediu, au rămas în bună parte neclarificate. Principalul motiv este utilizarea frecventă<br />
a mediilor de cultură axenice, care nu corespund habitatelor naturale ale acestor paraziţi. Mediului<br />
axenic îi lipsesc activatorii şi represorii exogeni, existenţi în habitatele naturale. Majoritatea<br />
cercetătorilor au pierdut din vedere rolul major şi de neînlocuit pe care bacteriile comensale îl au în<br />
reglarea şi controlul ciclului de viaţă al amibelor parazite. În studiul de faţă am reintrodus în mod controlat<br />
beneficiile bacteriene. În mediul de cultură numit Aa(Sm) rolul principal îl au sedimentele de<br />
Aerobacter aerogens reprimate cu antibiotice, care consumă oxigenul dizolvat în mediu. Sedimentele<br />
bacteriene au fost inoculate cu celule vegetative sau chişti de Entamoeba invadens. Bacteriile din sediment<br />
furnizează anturajul hipoxic necesar, care induce şi controlează fenomenele de diferenţiere celulară<br />
la E. invadens. La rândul lor amibele modifică starea de hipoxie prin consumarea bacteriilor din<br />
sediment. Activatorii exogeni sunt în acest mod suprimaţi. Acest model de feedback comensal controlează<br />
dezvoltarea şi diferenţierea amibelor în cadrul ciclului lor de viaţă. Pentru prima dată au putut fi<br />
identificate in vitro populaţii complexe, subpopulaţii distincte şi tipuri celulare diferite, fenomen cunoscut<br />
la organismele unicelulare sub numele de multicelularitate simplă. Culturile Aa(Sm) de scurtă<br />
şi lungă durată conţin linii de celule continue şi discontinue, capabile de autoreînnoire şi diferenţiere,<br />
dat fiind diviziunea asimetrică ce le caracterizează. Liniile autoreproductive produc pe de o parte celule<br />
ce parăsesc ciclu mitotic (celule „quiescente”, QD), a căror diferenţiere este reversibilă, iar pe de altă<br />
parte celule diferenţiate terminal şi ireversibil (prechişti, celule TD), care evolueza ulterior la chişti.<br />
Noua metodă de cultură este un instrument ideal în cercetarea inter-relaţiei existente între diferitele anturaje<br />
hipoxice şi comportamentul multicelular al speciei E. invadens, în cadrul ciclului de viață.<br />
Cuvinte cheie: Entamoeba, hipoxie, diferenþiere, quiescenþã, diferenþiere terminalã, închistare ciclicã şi nonciclicã,<br />
conversie celularã.<br />
Abrevieri: LT, culturi pe termen lung, D1, D2, celule fiice neidentice rezultate din diviziune asimetricã; sRL, liniile<br />
de autoreînnoire, cuprinzând doar celule auto-reproducãtoare (D1); QD24 LT , TD6 LT linii de autoreînnoire, ce<br />
produc celule diferenþiate, în stare de repaus sau „quiescenþa” (QD) sau în starea de diferenþiere terminalã (TD);<br />
Ce şi DI, chişti produşi prin închistare ciclicã sau inducþie directã; Aa(sm), mediu de culturã ce conþine sedimente<br />
bacteriene cu aerobacter aerogenes (Aa), dupã precondiþionare cu serratia marcescens (sm).<br />
INTRODUCERE<br />
După 1968, mediul axenic TPS-S-1 şi variantele<br />
BI-S-33, S-TYI-33 [1-3] au devenit extrem<br />
de populare. Mulţi cercetători au decis să<br />
utilizeze culturile fără bacterii, fiind cele mai<br />
avantajoase pentru studiile moleculare şi genetice,<br />
fără a lua în considerare faptul că aceste<br />
culturi axenice nu sunt potrivite pentru studiul<br />
*autor corespondent: Vladimir Florin Niculescu, D-86420 Diedorf, Germania, Kirschenweg 1;<br />
e-mail besnea@aol.com (principal) sau Vladimir.Niculescu@yahoo.com<br />
37
VLADIMIR F. NICULESCU<br />
biologiei celulare la genul Entamoeba. Aspecte<br />
importante privind ciclul celular şi diferenţierea<br />
au rămas neclare, deoarece în culturile lipsite de<br />
bacterii, lipsesc semnalele vitale, existente în<br />
micro-nişele simbiotice din organismul parazitat.<br />
Trăsături fiziologice importante, cum ar fi<br />
virulenţa, regresează în culturile axenice [4].<br />
Culturile axenice utilizate pe scară largă în ultimii<br />
45 de ani au dus la stagnarea cunoştinţelor<br />
privind ciclul de viaţă al genului Entamoeba, dat<br />
fiind cultivarea în condiţii mult prea diferite faţă<br />
de habitatul natural.<br />
În culturile xenice, bacteriile vii susţin creşterea<br />
amibelor, în timp ce bacterii inactivate termic<br />
au efect contrar [5-6]. Mirelman [6] a<br />
investigat problema aportului bacterian în culturile<br />
xenice. Una dintre ipoteze susţine că bacteriile<br />
anaerobe oferă condiţii sau potenţial<br />
redox adecvat pentru amibe [7-9]. O altă teorie<br />
sugerează că anumite produse ale metabolismului<br />
bacterian sunt esenţiale pentru amibe [10].<br />
Bracha şi Mirelman [4] au arătat că, cultivarea<br />
prelungită a E. histolytica in condiţii axenice<br />
a scăzut virulenţa acesteia, în timp ce<br />
ca pacitatea amibei de a provoca leziuni creşte<br />
semnificativ după o asociere intimă cu bacterii<br />
naturale sau opsonizate. Autorii sunt de părere<br />
că, prin contactul intim de suprafaţă cu amibele,<br />
bacteriile stimulează sistemul de transport de<br />
electroni. Rezultate similare au fost obţinute în<br />
medii cu conţinut de oxigen scăzut, utilizând o<br />
atmosferă de azot, căreia i s-a adăugat 5% O2 şi<br />
10% CO2.<br />
Scopul primar al studiului nostru a fost de a<br />
îmbunătăţi metoda de cultură monoxenică prin<br />
modificări în beneficiul studiilor de biologie celulară.<br />
Am căutat să prevenim multiplicarea daunătoare<br />
a bacteriilor în cultura monoxenică prin<br />
antibiotice dizolvate în mediu, oferind pe de altă<br />
parte amibelor produse de metabolism bacterian,<br />
recoltate în prealabil, şi bacterii suprimate metabolic.<br />
Am asigurat prin centrifugare usoară<br />
contactul intim de suprafată între amibe şi bacterii.<br />
În acest scop, amibele au fost inoculate şi<br />
crescute în sedimente comune cu bacterii consumatoare<br />
de oxigen. Am căutat să identificăm<br />
tulpini bacteriene optimale pentru acest nou sistem<br />
de cultură și am ales în final S. marcescens<br />
(Sm) pentru precondiţionarea mediului de cultură<br />
şi A. aerogenes (Aa) ca particulă fagocitabilă<br />
şi consumatoare de oxigen.<br />
Am emis ipoteza că interacţiunea dintre<br />
bacteriile consumatoare de oxigen şi amiba fagocitară<br />
ar modifica continuu starea hipoxică a<br />
sedimentelor din cultură. Este cunoscut faptul<br />
că bacteriile gram-negative, cum ar fi A. aerogenes,<br />
au nevoie de oxigen pentru a supravieţui<br />
şi a creşte, iar biomasa bacteriană consumă oxigen,<br />
chiar şi în faza staţionară. Conţinutul de<br />
oxigen într-o cultură logaritmică de A. aerogenes<br />
scade zilnic cu o rată continuă, şi anume de<br />
la aproximativ 248 Eh / aerobioză mV până la<br />
-205 unități / mV anaerobioză [11]. Valorile<br />
pH-ului culturii se schimbă de la 6,8 la 5,2. La<br />
sfârşitul fazei de creştere logaritmică rata consumului<br />
de oxigen scade până când se ajunge la<br />
o valoare redusă şi constantă [12].<br />
În prima parte a lucrarii de faţă se descrie<br />
metodologia cultivării amibelor în sedimente hipoxice<br />
intreţinute de A. aerogenes. În partea a<br />
doua a studiului am urmărit cultura şi stimulii<br />
externi ce controlează ciclul mitotic şi diferenţierea<br />
celulară, în timp. Culturile paralele au fost<br />
evaluate o singură dată sau în mod repetat. S-a<br />
reuşit caracterizarea unor subpopulaţii distincte<br />
de celule, neobservate în mediile axenice. Primele<br />
observaţii în această direcţie au fost publicate<br />
de autor în mod succint, cu mulţi ani în<br />
urmă [13,14], dar interpretarea datelor a ramas<br />
dificilă, dat fiind nivelul limitat al cunostiinţelor<br />
de biologie celulară din acel timp.<br />
Evaluările cantitative necesită omogenizarea<br />
tuburilor de cultură prin agitare prealabilă,<br />
ceea ce duce la disturbarea condiţiile hipoxice,<br />
existente în sediment. Sedimentele omogenizate<br />
pot fi refăcute prin centrifugare, şi proliferarea<br />
E. invadens continuă. Există însă diferenţe ulterioare<br />
faţă de evoluţia culturilor neevaluate.<br />
Omogenizarea prin agitare este în fond un proces<br />
de aerare bruscă, care modifică condiţiile hipoxice<br />
din sediment, restabilind potenţiale redox<br />
oxidative [15]. Stresul oxidativ conduce în general<br />
la efecte negative, cum ar fi inhibarea creşterii<br />
sau moartea celulelor [16-20], sau perturbă<br />
homeostazia şi valorile redox intracelulare [21],<br />
ceea ce împiedică proliferarea mitotică [22, 23].<br />
Ocazional însă stresul oxidativ poate avea şi<br />
efecte pozitive, cum ar fi activarea celulelor şi<br />
proliferarea lor [24-25].<br />
38
Sisteme multicelulare la eucariotele primitive<br />
MATERIALE ŞI METODE<br />
Organisme<br />
Tulpina TR2 / 1 de E. invadens (Madagascar)<br />
a fost obţinută de la Douglas Cameron Barker,<br />
Departamentul de Zoologie, Universitatea<br />
din Edinburgh, Scoţia. Această tulpină este uşor<br />
de manipulat în condiţii experimentale. Dintrun<br />
număr de 20 de tulpini bacteriene furnizate<br />
de Institutul de Igienă, Universitatea din Tübingen,<br />
au fost alese S. marcescens pentru precondiţionarea<br />
mediului de bază şi A. aerogenes,<br />
tulpina AH8, drept coparticipant, în sedimentele<br />
mediului de cultură Aa(Sm).<br />
Mediul de bază (MB)<br />
Soluţiile stoc folosite la prepararea mediului<br />
de bază MB au fost: (a) ser bovin 10% în apă<br />
distilată, autoclavat (121°C, 10 min) şi apoi stocat<br />
la rece timp de mai multe zile (
VLADIMIR F. NICULESCU<br />
Inoculul şi starea de hipoxie în cultura<br />
Aa(Sm)<br />
Cultivarea are loc în tuburi de sticlă pentru<br />
centrifugă cu baza în U de 10 ml care conţin<br />
5 ml de MC, în care se inoculează 5 mg de<br />
A. aerogenes AH8 şi 0,5 sau 1,0 x 10 6 amibe.<br />
Chiştii inoculaţi în cultura Aa(Sm) dechisteaza<br />
ca amibe vegetative. După adăugarea inoculanţilor,<br />
tuburile au fost centrifugate la 1000 rpm<br />
pentru a forma un sediment uşor solid pe fundul<br />
tubului şi se incubează la 28°C. Masa bacteriană<br />
sedimentată pe fundul tuburilor de cultură consumă<br />
oxigenul dizolvat în coloana de lichid şi<br />
formeză un gradient. În sediment se instalează în<br />
scurt timp o stare hipoxică, care descreşte odată<br />
cu fagocitarea bacteriilor consumatoare de oxigen.<br />
Mediul de cultură rămâne pe toată durata<br />
creşterii amibelor clar şi transparent. Suprainfecţiile<br />
bacteriene fiind producătoare de opacitate<br />
pot fi uşor detectate şi îndepărtate. Toate experimentele<br />
au fost efectuate în condiţii sterile.<br />
Analiza cantitativă şi efectele ei colaterale<br />
Mărimea populaţiilor amibiene a fost determinată<br />
cu o cameră de numărare hematologică,<br />
sub microscop. Conţinutul tuburilor de cultură<br />
a fost omogenizat în prealabil, prin agitare mecanică,<br />
barbotare şi aerare, utilizând o pipetă<br />
sterilă 2 ml din sticlă. Prin acest procedeu se<br />
modifică valorile potenţialului redox de pe fundul<br />
tubului de cultură şi, implicit, starea de hipoxie.<br />
Amibele, scoase din sediment şi<br />
sus pendate în coloana de lichid, sunt confruntate<br />
pentru scurt timp cu semnale oxidative. După<br />
prelevare, sedimentele de cultură au fost recuperate<br />
prin centrifugare. Pentru a minimiza impactul<br />
asupra cineticii populaţiei, au fost<br />
demarate mai multe replici, în paralel, fiecare<br />
dintre ele fiind examinată doar o singură dată şi<br />
apoi aruncată.<br />
REZULTATE<br />
Am cultivat E. invadens timp de mai mulţi<br />
ani de zile în sedimente cu A.aerogenes prin metoda<br />
Aa(Sm). Pe parcursul unei perioade de<br />
patru ani, am examinat peste 100 de pasaje în<br />
culturi de lungă durată (LT). Rezultatele au arătat<br />
că bacteriile consumatoare de oxigen furnizează<br />
condiţii hipoxice optimale pentru<br />
proli ferarea şi diferenţierea celulară la E. invadens.<br />
Cercetări premergătoare au stabilit că E.<br />
invadens preferă în cultură nivele scăzute de<br />
oxigen şi bacterii opsonizate. Aminoglicozidele,<br />
cum ar fi streptomicina şi macrolidele, cum ar<br />
fi eritromicina, inhibă în cultură sinteza de proteine<br />
şi proliferarea A. aerogenes, fără a dăuna<br />
populaţiei amibiene. Avantajele culturilor<br />
Aa(Sm) sunt semnalele hipoxice induse de bacteriile<br />
consumatoare de oxigen şi dinamica hipoxică<br />
ce rezultă din interacţiunea bacteriilor<br />
reprimate cu amibele fagocitare. E. invadens<br />
consumă bacteriile, reducând starea de hipoxie<br />
din vecinatatea amibelor (anturajul hipoxic).<br />
Consumul de oxigen iniţializat de către bacterii<br />
şi consumarea bacteriilor de către E. invadens<br />
controlează creşterea şi dezvoltarea sistemului<br />
celular la E. invadens.<br />
Consumul rapid de oxigen la începutul cultivării,<br />
atâta vreme cât masa bacteriană rămâne<br />
în bună parte intactă, face ca amibele pasajate<br />
să-şi termine în timp scurt ciclul celular şi să<br />
intre in diviziune. Pe parcursul cultivării, atunci<br />
când populaţia amibiană consumă din ce în ce<br />
mai multe bacterii consumatoare de oxigen, starea<br />
hipoxică se inversează. Spre deosebire de<br />
mediul ambiant din culturile axenice, modificările<br />
hipoxice din cultura Aa(Sm) imită semnalizările<br />
extracelulare şi anturajul redox din<br />
habitatele naturale.<br />
Un exemplu reprezentativ pentru culturile<br />
de lungă durată, il oferă populaţia din Fig. 1, urmarită<br />
pe o perioadă de 96 h. Valorile cinetice<br />
din Fig. 1 arată evoluţia subpopulaţiilor, fazele<br />
de creştere şi produsele de diferenţiere celulară.<br />
Faza de iniţiere a culturii (0-4 h) * . Faza de<br />
iniţiere a culturii începe în momentul t0 şi se termină<br />
la t4, atunci când populația amibiană s-a<br />
dublat. În prima parte a fazei de iniţiere (0-2 h),<br />
oxigenul din sedimente este consumat rapid de<br />
către bacterii. Activatorii mitotici externi determină<br />
toate celulele inoculate - indiferent de faptul<br />
dacă acestea se găsesc în faza G1 şi sunt<br />
active mitotic, sau în faza G0, ca celule inerte,<br />
respectiv ”quiescente” (QD) - să reintre şi să<br />
continue ciclul celular. În ultima parte a fazei de<br />
iniţiere (2-4 h) celulele termină ciclul şi intră în<br />
diviziunea asimetrică.<br />
*<br />
Valori medii<br />
40
Sisteme multicelulare la eucariotele primitive<br />
t0 t4 t30 t72 t96<br />
initiation growth I growth II pre-stationary stationary<br />
3,5<br />
3,0<br />
2,5<br />
2,0<br />
1,5<br />
1,0<br />
0,5<br />
c<br />
v<br />
c<br />
v<br />
c<br />
v<br />
c<br />
v<br />
c (cysts)<br />
v (vege-tative cells)<br />
t 0 24 48 72 96<br />
c( x 104) 0.60 3.00 3.50 3.45 3.50<br />
v( x 106) 0.50 1.08 1.54 2.04 2.01<br />
Ratio(%) 1.20 2.77 2.27 1.69 1.74<br />
Ratio=c/v<br />
Fig. 1 - TD6 LT și QD24 LT în cultura de lungă durată producătoare de chiști la E. invadens<br />
Pasaj din cultura amibiană<br />
F<br />
de lungă durată (LT) cu 5 ml sediment bacterian şi 5 ml supernatant, inoculat cu un amestec de<br />
celule diferite, din pasajul precedent. După faza de iniţiere, linia QD24 LT porneşte proliferarea cu 0,5 x 10 6 celule, linia<br />
TD6 LT cu 0,6 x 10 4 celule. La 72 h după inoculare, noua populaţie conţine 2,0 x 10 6 celule vegetative (cca 98%) şi 3,5 x<br />
10 4 celule închistate (chişti). Celulele vegetative nu închistează şi intră în faza de apoptoză (t120-t144), în măsura în care<br />
nu sunt re-pasajate la timp (t96-t120). Raportul chişti: celule vegetative variază de la 2,77% (t24) la 1,69% (t72), dată<br />
fiind dinamica diferită a celor două linii cellulare.<br />
Faza primară de proliferare (5 - 30 h)*.<br />
Este faza în care o subpopulaţie permisivă produce<br />
succesiv chişti. Fracţiunea chiştilor crește<br />
printr-un număr limitat de diviziuni succesive,<br />
şi anume în progresie aritmetică (C, 2C,<br />
3C....nC). Producţia de chişti încetează la circa<br />
28 - 30 ore după inoculare, find reprimată de<br />
scăderea hipoxiei. Acest punct de barieră marchează<br />
trecerea de la faza 1a de creştere, ce are<br />
loc în condiţii de hipoxie mai accentuată, la faza<br />
2a, cea cu hipoxie mai scăzută.<br />
Faza târzie de proliferare (30-72 h)*. În<br />
această fază continuă să prolifereze doar subpopulaţia<br />
vegetativă - neproducatoare de chişti -<br />
consumând în continuare bacterii şi reducând<br />
astfel, în mod continuu, starea hipoxică din cultură.<br />
La sfârşitul acestei faze, circa 80% din celule<br />
sunt ieşite din ciclul celular, repauzând în<br />
G0. Sunt celule mitotic-inerte sau ”quiescente”<br />
(QD), ce păstrează capacitatea de fagocitare.<br />
Faza prestaţionară (72-96 h)*. În această<br />
fază, diviziunile celulare sunt rare. În unele cazuri,<br />
nedescrise în lucrarea de faţă, s-au observat<br />
pe de altă parte o serie de diviziuni simetrice.<br />
*<br />
Valori medii<br />
Faza staţionară (97-124 h)*. În această<br />
fază, creşterea populaţiei sistează. În lipsa bacteriilor<br />
consumatoare de oxigen, celulele sunt<br />
supuse stresului oxidativ, fară a forma însă<br />
chiști.<br />
Moartea vegetativă începe în momentul în<br />
care metabolismul celular vegetativ nu mai<br />
poate fi menţinut. La 144 h după începerea cultivării,<br />
unele dintre celulele vegetative s-au lizat,<br />
altele se găsesc in stare de senescenţă ireversibilă.<br />
La recultivare, aproximativ o treime din inoculul<br />
în vârstă de 144 h se demaschează drept<br />
apoptotic.<br />
Subpopulaţiile. În culturile pe termen lung<br />
(LT) din Fig. 1, am observat două subpopulaţii<br />
distincte, intreţinute de catre două linii celulare<br />
de autoreînnoire şi diferenţiere, şi anume: (i) o<br />
subpopulaţie principală, neproducătoare de<br />
chişti, ce formează aproximativ 90-98% din totalul<br />
populaţiei şi (ii) o populaţie mai mică, producătoare<br />
de chişti, la care închistarea decurge<br />
în mod ciclic, după fiecare nouă diviziune. O a<br />
treia subpopulaţie este subpopulaţia primară,<br />
metachistică, generată direct după exchistare,<br />
care, în cultura LT din Fig. 1 rămâne cantitativ<br />
nesemnificativă.<br />
41
VLADIMIR F. NICULESCU<br />
Liniile de autoreînnoire şi rezervoarele de<br />
celule diferenţiate. Cele două linii celulare ce<br />
domină populaţia din Fig. 1 sunt catalogate în<br />
funcţie de produşii lor de diferenţiere, durata ciclului<br />
celular şi tipul de cultură. Linia producătoare<br />
de chişti este TD6 LT , iar linia<br />
ne pro du cătoare este QD24 LT . După fiecare diviziune<br />
asimetrică 50% din celulele fiice rămân<br />
mitotic-active şi cu capacitate autoreproductivă<br />
(celulele D1) asigurând, pe timp scurt sau îndelungat,<br />
autoreînnoirea şi durata de viaţă a liniei<br />
celulare din care provin (SRL,”self renewing<br />
line”). Ambele linii TD6 LT -SRL şi QD24 LT -SRL,<br />
rămân în fiecare pasaj constante ca mărime. Celelalte<br />
50% celule surori, cele de după diviziune<br />
(celule D2), sunt celule diferenţiate, care rămân<br />
reprimate mitotic. Reprimarea mitotică este reversibilă<br />
la celulele QD din linia QD24 LT şi ireversibilă<br />
la celulele TD din linia TD6 LT . Diviziunea<br />
asimetrică şi ieşirea din ciclu sunt markeri<br />
de diferenţiere celulară. Celulele QD, oprite in<br />
faza G0, formează un rezervor de celule în afara<br />
ciclului celular, în timp ce celulele TD (pre-chiştii)<br />
se închistează, şi formează de fapt un al doilea<br />
rezervor de diferenţiere, cu rol în refacerea<br />
ciclului de viaţă. Aşadar, pe timpul cultivării,<br />
populaţia vegetativă creşte numeric numai prin<br />
aportul celulelor QD, dezactivate mitotic.<br />
Inoculul şi pasajarea culturii<br />
Semnalele extracelulare din faza de iniţiere<br />
timpurie (0-4 h) stimulează toate fracţiunile celulare<br />
la continuarea ciclului celular şi intrarea<br />
lor în diviziune. În subpopulaţia neproducătoare<br />
de chişti, celulele QD sunt reactivate şi transformate<br />
în celule de autoreînnoire. Cu alte cuvinte,<br />
în ciuda faptului că în momentul inoculării (t0)<br />
raportul dintre celulele autoreproductive şi celule<br />
mitotic-inerte este 1:4 (ca în Fig. 1) ori 1:5,<br />
ori 1:6, la sfârşitul fazei de iniţiere timpurie (0-<br />
2 h) noua linie QD24 LT din subcultură, conţine<br />
de 4, 5 sau 6 ori mai multe celule autoreproductive<br />
decât inoculul din momentul t0. Prin cointeresarea<br />
celulelor de rezervă şi reactivarea lor,<br />
linia autoreproductivă QD24 LT a crescut brusc<br />
între 400% şi 600%. La 240 min după inoculare<br />
(t4) tânăra populaţie s-a dublat încă o dată, dat<br />
fiind prin prima diviziune. În momentul t4 noile<br />
fracţiuni D1 și D2 sunt fiecare cantitativ la fel<br />
de mari ca şi inoculul pasajat în momentul t0.<br />
Succesiunea diviziunilor asimetrice şi<br />
progresia aritmetică a proliferării<br />
După prima diviziune, la sfârşitul fazei de<br />
iniţiere, subpopulaţia creşte aritmetic prin noi<br />
generaţii de celule diferenţiate, după formula<br />
pm (x) = [ pm (x+1) + pm (x-1) ] : 2 (1)<br />
care arată că fiecare termen din progresie<br />
corespunde sumei termenilor învecinaţi, luaţi pe<br />
jumătate.<br />
Dacă mărimea inoculului amibian (ai) este<br />
egală cu diferenţa (b) dintre două generaţii succesive<br />
de celule, datorită faptului ca populaţia<br />
creşte numai prin aportul celulelor diferenţiate<br />
(d) şi deci, pe de-o parte b = d, iar pe de altă<br />
parte b = ai şi d = pm (1) , atunci oricare termen<br />
din cadrul progresiei, să zicem an, poate fi transcris<br />
drept<br />
an = ai + (n – 1) ai (2)<br />
iar în măsura în care vrem să ne referim la<br />
suma totală a celulelor diferenţiate din rezervorul<br />
celulelor QD, progresia va fi<br />
pm (1) = ai ; pm (2) = ai + d ; pm (3) =<br />
ai + 2d… .. pm (n) = ai + (n-1)d (3)<br />
În situaţia în care vrem să definim mărimea<br />
inoculului în raport cu componentele sale celulare<br />
D1 si D2, ecuaţia e<br />
ai = Σ (D1 n + D2 1→n ) : x (4)<br />
unde n este sunt numărul de diviziuni asimetrice<br />
din cultura precedentă, D2 1→n numărul<br />
de celule din rezervorul QD și x factorul de diluţie,<br />
ce reiese din raportul cantitativ dintre populaţia<br />
mamă în întregimea ei şi acea parte din<br />
ea, folosită ca inocul pentru noua subcultură.<br />
Reînnoirea continuă şi discontinuă a liniilor<br />
SRL. Aşa cum se observă în Fig. 1 celulele<br />
diferenţiate QD din subpopulaţia fără chişti<br />
rămân într-o stare mitotic-inertă atâta timp cât<br />
nu există inductori adecvaţi pentru reactivarea<br />
lor. Ele rămân pe timp îndelungat (Fig. 1: T4 -<br />
t124) într-o stare de reprimare („quiescenţă”),<br />
devenind celule de rezervă (rezervorul QD). În<br />
pasajul ce urmează subculturii din Fig. 1, unde<br />
la momentul t72 şi t96 raportul dintre celulele<br />
autoreproductive D1 şi celulele de rezervă D2<br />
este 1:3 (n=3), linia QD24 LT va rămâne constantă<br />
ca mărime, dar numai în situaţia în care<br />
x=4. Apelarea la celulele de rezervă asigură<br />
reînnoirea continuă a liniei QD24 LT , la fiecare<br />
nou pasaj. Linia TD6 LT , care nu are celule vege-<br />
42
Sisteme multicelulare la eucariotele primitive<br />
tative de rezervă, se va micşora în urma pasajului,<br />
în cazul x=4 reducându-se de fapt la 25%.<br />
Dacă însă n 4 TD6 LT se micşorează şi<br />
mai mult, iar valoarea raportului QD24 LT :TD6 LT<br />
creşte, fenomen ce explică reducerea sau dispariţia<br />
totală a liniei producătoare de chişti întruna<br />
dintre subculturile ce urmează. În alte pasaje<br />
linia TD6 LT a fost reînnoită, dat fiind procesele<br />
de dechistare necontrolată ce apar în cadrul culturii<br />
(reînnoire discontinuă).<br />
Celulele diferenţiate ireversibil (prechiştii).<br />
Din punct de vedere evolutiv, celulele D2<br />
- produse de linia TD6 LT - se află într-o stare de<br />
diferenţiere ireversibilă (diferenţiere terminală,<br />
TD). În cazul E. invadens celulele TD posedă<br />
rol de pre-chişti, fiind programate să continue<br />
diferenţierea până la celula intrachistică, reorganizată<br />
genomic.<br />
Durata medie de viaţă a celulelor de autoreînnoire.<br />
În timp ce celulele D1 din linia<br />
TD6 LT au o durată medie de viaţă de aproximativ<br />
6 h (AGT6), durata medie de viaţă a celulelor<br />
D1 din linia QD24 LT este de aproximativ 24 h<br />
(AGT24). În condiţiile de viaţă ale culturii din<br />
Fig. 1, linia TD6 LT , desfăşoară un ciclu de viaţă<br />
scurt şi rapid, în timp ce linia QD24 LT urmează<br />
un ciclu tergiversat. Potrivit literaturii, extinderea<br />
ciclului celular decurge din prelungirea fazei<br />
G1, respectiv oprirea celulelor mitotice, la un<br />
punct de control din interiorul sau sfârşitul fazei<br />
G1 [26].<br />
DISCUÞII<br />
Starea hipoxică<br />
Spre deosebire de studiile în medii axenice,<br />
culturile hipoxice cu sedimente bacteriene dezvăluiesc<br />
o serie de detalii privind ciclul celular<br />
şi diferenţierea la Entamoebae, aspecte necunoscute<br />
până în prezent. Hipoxia este o condiţie deficitară<br />
de oxigen, indusă în sedimentele din<br />
cultură Aa(Sm) de către bacteriile speciei A. aerogenes.<br />
Oxigenul din sedimentul bacterian, în<br />
care au fost inoculate amibele, scade la scurt<br />
timp după inoculare (0-2 h), şi anume sub nivelul<br />
normal al oxigenului dizolvat în mediul de<br />
cultură. Combinaţia streptomicină-eritromicină,<br />
care nu afectează proliferarea amibelor, inhibă<br />
creşterea bacteriilor, ce funcţionează in aceste<br />
condiţii doar ca o biomasă neproliferativă, consumatoare<br />
de oxigen. Deoarece tuburile de cultură<br />
nu sunt agitate după inoculare, se formează<br />
un gradient de oxigen de la suprafaţa coloanei<br />
de lichid către fundul tubului, acolo unde se află<br />
sedimentul cu cultură amibiană. Atunci când<br />
bacteriile din sediment sunt fagocitate de către<br />
E. invadens, numărul de bacterii scade progresiv<br />
şi hipoxia este inversată lent către valori mai<br />
oxidative.<br />
Cele mai multe specii de amibe sunt bacteriofile,<br />
bacteriile constituind hrana lor de căpătâi.<br />
Amibele libere, cum ar fi Acanthamoeba,<br />
„pasc” în adevăratul sens al cuvântului „gazonuri<br />
bacteriene” prinse de suprafeţe fixe, comportament<br />
observat adesea în biofilmele<br />
bac teriene dense, de la baza vaselor de cultură,<br />
ce au fost inoculate cu amibe [27]. Fără îndoială,<br />
amibele se orientează către zonele de anaerobioză<br />
din interiorul maselor bacteriene stratificate,<br />
consumatoare de oxigen [28]. În interiorul<br />
biofilmelor, se formează adevărate gradiente de<br />
oxigen, cu micronişe anoxice [29]. Ecologii<br />
presupun ca activitatea metabolică a bacterilor<br />
reduce conţinutul de oxigen de la suprafaţa amibelor.<br />
Unele tulpinile de Acanthamoeba preferă<br />
condiţii aerob-microaerofile, în timp ce altele<br />
preferă concentraţii hipoxice. Aerobia începe în<br />
condiţii de saturare de ≤ 26% O2 (2 mg/l), în<br />
timp ce concentraţii de 11% sunt considerate microaerofile.<br />
Multe dintre tulpinile testate cresc<br />
mai repede la concentraţii scăzute de oxigen [27,<br />
30], ceea ce am observat şi noi, referitor la durata<br />
de viaţă a liniei TD6 LT , care se limitează<br />
doar la fazele primare de creştere (0-4 şi 5-30<br />
h), atunci când cantitatea de bacterii - şi implicit<br />
starea hipoxică - sunt cele mai ridicate.<br />
Date asemănătoare au fost raportate şi de<br />
către Bracha şi Mirelman [4], care au constatat<br />
că atât condiţiile de micro-aerobioză, cât şi aderarea<br />
bacteriilor opsonizate la suprafaţa celulelor<br />
de E. histolytica ridică metabolismul amibian şi<br />
virulenţă. Pentru a stimula virulenţa tulpinilor<br />
crescute axenic, autorii au preincubat 2,5 x 10 6<br />
amibe/ml cu bacterii capabile să adere la suprafaţa<br />
trofozoiţilor, şi anume în raport de 1:1000.<br />
Cele mai bune rezultate au fost obţinute cu<br />
preincubări de 15-60 min, timp în care amibele<br />
au adunat la suprafaţa lor circa 60-70 bacterii,<br />
mult peste cerinţele procesului de endocitoză,<br />
43
VLADIMIR F. NICULESCU<br />
notat la 5-10 bacterii pe celulă. Ipoteza noastră<br />
prevede că bacteriile de pe suprafaţa amibei<br />
consumă oxigenul din mediu - atât la E. histolytica,<br />
cât şi la E. invadens şi Acanthamoeba – în<br />
beneficiul amibei. În studiul nostru am aratăt că,<br />
în decursul primelor 120 min după inoculare,<br />
0,5 - 1,0 x 10 6 amibe profită în totalitate de prezenţa<br />
celor 5 mg A. aerogenes, al căror efect hipoxic<br />
și nutritiv exacerbează metabolismul<br />
amibian şi activitatea mitotică.<br />
Spre deosebire de mediile de cultură axenice,<br />
utilizarea tehnicii Aa(Sm) - care imită condiţiile<br />
hipoxice din habitatele naturale - duce la<br />
o serie de noi cunoștinţe privind ciclul celular şi<br />
diferenţierea la amibele parazite. E. invadens<br />
arată o preferinţă clară pentru nivelurile scazute<br />
de oxigen şi stări de hipoxie. Hipoxia pare a fi<br />
condiţie sine qua non pentru multicelularitatea<br />
amibelor parazite. Una dintre liniile observate<br />
in Fig. 1 şi anume TD6 LT , proliferează numai în<br />
condiţii de hipoxie mai ridicată (0-30 h), răspunzând<br />
cu un ciclu celular scurt (AGT6), în contrast<br />
cu linia QD24 LT , care recurge în condiţiile<br />
de creştere din Fig. 1 la un ciclu celular prelungit<br />
(AGT24) şi suportă concentraţii de oxigen<br />
foarte diferite (0-72 h).<br />
Dinamica hipoxiei în culturile Aa(Sm) reprezintă<br />
de fapt forţa motrice care controlează<br />
comportamentul şi evoluţia sistemului celular la<br />
E. invadens. Bacteriile din sedimentele culturii<br />
Aa(Sm) consumă cu maximum de beneficiu<br />
oxigenul din anturajul amibelor, fiind consumate<br />
însă şi ele la rândul lor de către populaţia<br />
amibiană în creştere, fapt ce se răsfrânge ca replică<br />
asupra populaţiei amibiene, forţată să iasă<br />
din anumite stări de echilibru, aşa cum se întâmplă<br />
cu linia TD6 LT , care îşi incetează proliferarea<br />
(t30). Epuizarea oxigenului este destul de<br />
mare la începutul fazei primare de creştere, dar<br />
descreşte ulterior continuu, până în momentul în<br />
care puţinele bacterii care au mai rămas nu mai<br />
pot proteja amibele împotriva oxigenului în revenire.<br />
În consecinţă, chiar şi linia QD24 LT îşi<br />
opreşte la t72 proliferarea şi intră în platou. Modificările<br />
hipoxice, aşa cum apar ele în perioada<br />
t0-t72, imită în mod mimetic evenimente din habitatul<br />
natural.<br />
Multicelularitatea<br />
Ca o consecinţă a evoluţiei diferite a celor<br />
două subpopulaţii, 98% din populaţia din Fig. 1<br />
aparţine la sfârşitul fazei de creştere (t72) subpopulaţiei<br />
lipsite de chişti. Raportul cantitativ<br />
dintre cele două linii autoreproductive TD6 LT şi<br />
QD24 LT este extrem şi discrepant, chiar şi în momente<br />
în care ambele linii sunt proliferative. În<br />
momentul t24 corespund la 0,5 x 10 4 celule D1<br />
din linia TD6 LT , 0,5 x 10 6 celule D1 din linia<br />
QD24 LT , raportul fiind aşadar 1:100. Mărimea liniei<br />
TD6 LT se citeşte din ultima diviziune asimetrică,<br />
ce are loc la scurt timp după t24 şi<br />
diferenţa ce se observă între cantitatea de chişti<br />
la t48 şi la t24.<br />
Lucrările ce discută fenomenul de multicelularitate<br />
la Entamoeba sunt rare. Cu aproape 50<br />
de ani în urmă Goldman şi Davies [31] au descris<br />
la E. histolytica tipuri celulare mari (B) şi<br />
mici (S), şi anume în culturile monoxenice cu<br />
Trypanosoma cruzi, având nivel scăzut de oxigen.<br />
Autorii au mai găsit subpopulaţii de tip B<br />
si C şi în alte medii. Datele adunate pe timp de<br />
1,5 ani au arătat că clonele “S” şi “B” rămân<br />
într-un raport stabil (S:B) una faţă de alta, fără<br />
să apară treceri de la B la S, şi invers. Autorii au<br />
tras concluzia că există un mecanism endogen<br />
răspunzător pentru dimensiunea medie a celulelor,<br />
iar pe de altă parte, factori externi, ce influenţează<br />
fenotipul, aceştia fiind diverşi<br />
componenţi din mediu şi bacteriile asociate.<br />
Posibil ca tipurile B şi S descrise in vitro să corespundă<br />
formelor magna şi minuta, descrise in<br />
vivo.<br />
În concepţia clasică referitoare la E. histolytica,<br />
forma ”magna” este tipul amibei fagocitare,<br />
de aproximativ 20-30μ, care trăieşte atât în<br />
stratul submucos al intestinului gros, cât şi în ţesuturile<br />
şi organele organismului gazdă, în timp<br />
ce forma “minuta”, de numai 12-15μ, este forma<br />
lipsită de vacuole de fagocitoză, ce trăieste ca<br />
formă prechistică în lumenul intestinului gros.<br />
Alţi autori au localizat în forma „minuta” vacuole<br />
de fagocitoză (fagozomi), presupunând că<br />
şi forma minuta - în fazele ei iniţiale – ar avea<br />
capacităţi de endocitoză şi digestie. În general,<br />
forma minuta e considerată drept forma primară<br />
de E. histolytica, capabilă să închisteze în lumenul<br />
intestinal. În accepţiunea noastră, ar trebui<br />
44
Sisteme multicelulare la eucariotele primitive<br />
diferenţiat în mod edificator între minuta endocitară<br />
şi minuta prechistică. Minuta endocitară<br />
ar fi în consecinţă o formă de durată, în timp ce<br />
minuta prechistică ar fi doar o formă de trecere.<br />
Prechiştii identificaţi de noi în cultura Aa(Sm)<br />
sunt tipuri celulare cu o viaţă foarte scurtă, determinate<br />
prin diviziune la închistare rapidă şi<br />
imediată.<br />
Se presupune că, atunci când rezistenţa organismului<br />
gazdă este redusă, forma “minuta”<br />
ar converti în forma “magna”, care invadează<br />
peretele intestinului [32]. Condiţiile de mediu<br />
care ar putea duce la o asemenea conversie<br />
rămân neclare [33]. Conversia ar putea fi facilitată<br />
de coinfecţii bacteriene sau modificări în<br />
microbiota intestinului, în sensul apariţiei unor<br />
bacterii ce avantajează amibele.<br />
Tipizarea magna/minuta rămâne oarecum<br />
ambiguă, prea îngustă şi prea puţin relevantă.<br />
Urmând considerentele de mai sus, ar urma ca<br />
o subpopulaţie minuta să cuprindă atât forme<br />
primare, endocitare, cât şi forme finale, prechistice.<br />
Pentru perpetuarea speciei, subpopulaţia<br />
minuta ar fi suficientă. Subpopulatia magna ar<br />
fi o apariţie adaptativă, homogenă, mai mult sau<br />
mai putin accidentală; o forma tisulară nu absolut<br />
obligatorie, lipsită de capacitate de închistare<br />
şi, prin urmare, nu absolut necesară în scopul<br />
perpetuării speciei.<br />
Terminologia utilizată de noi în studiul de<br />
faţă se bazează pe cunostinţele recente din domeniul<br />
biologiei celulare şi are un caracter interdisciplinar<br />
şi integrativ. O limbă comună<br />
permite comparaţii şi deci o mai bună înţelegere<br />
a fenomenelor de diferenţiere celulară de la diferite<br />
nivele evolutive, cum sunt de exemplu<br />
protistele şi metazoarele. Experienţa noastră cu<br />
culturile Aa(Sm) pe termen lung arată convieţuirea<br />
in vitro a cel puţin două subpopulaţii distincte,<br />
generate de două linii autoreproductive<br />
diferite, cu durată de viaţă diferită, şi anume: (i)<br />
linia autoreproductivă TD6 LT , ce stă la baza subpopulaţiei<br />
producătore de chişti, analoagă formei<br />
minuta , care susţine în cultură închistarea<br />
ciclică, şi işi încetează proliferarea în condiţii de<br />
viaţă neprielnice, şi (ii) linia autoreproductivă<br />
QD24 LT , ce stă la baza subpopulaţiei neproducătoare<br />
de chişti, analoagă formei magna, linie<br />
specializată în producţia de celule-rezervă,<br />
inerte din punct de vedere mitotic. Departe de a<br />
fi o formă accidentală, subpopulaţia neproducătoare<br />
de chişti posedă un mecanism biologic de<br />
mare potenţial multiplicativ, reintroducând celulele-rezervă<br />
în ciclul celular şi întreaga subpopulaţie<br />
în diviziune.<br />
Numărul de celule autoreplicative creşte<br />
astfel de până la opt ori (factor de multiplicare:<br />
=8x), în decurs de numai 2-3 ore. Atât celulele<br />
autoreproductive (D1), cât şi celulele-rezervă<br />
surori (D2) generate de linia QD24 LT supravieţuiesc<br />
timp îndelungat in vitro, în nenumărate<br />
pasaje succesive. Linia QD24 LT este aşadar o<br />
linie continuă (permanentă) şi omniprezentă, în<br />
timp ce linia producătoare de chişti TD6 LT pare<br />
a fi o linie mai hipoxică şi discontinuă/temporară,<br />
cu o durată mai scurtă de viaţă. Rezultate<br />
preliminare privind dechistarea în culturile<br />
Aa(Sm), ne îndreptăţesc a pune ipoteza unei a<br />
treia linii celulare, şi anume o linie metachistică,<br />
primară, în ciclul de viaţă al E.invadens. Problema<br />
va fi discutată pe larg într-o lucrare viitoare,<br />
ca de altfel şi problema duratei ciclului<br />
celular, în funcţie de mediu.<br />
În contrast cu celulele de autoreînnoire D1<br />
ale liniei QD24 LT , cu ciclul celular de cca 24 h<br />
(AGT24), celulele-rezervă rezistă în cultură<br />
până la sfârşitul fazei staţionare (t128) mărinduşi<br />
volumul celular - prin ingerare masivă de bacterii<br />
– până la aproximativ 50-60 μ. Probabil că<br />
in vivo, celulele-rezervă ar putea supravieţui nelimitat<br />
în situaţia unei nutriţii permanente. Rămâne<br />
de clarificat în viitor, dacă celulele în stare<br />
de repaus G0 reprezintă o formă cu posibilităţi<br />
de invazie în ţesuturi, aşa cum ar fi de aşteptat.<br />
Închistarea ciclică (chiștii CE)<br />
Închistarea ciclică este expresia de diferenţiere<br />
a liniei celulare TD6 LT , ce produce în urma<br />
diviziunii asimetrice prechişti, drept celule D2<br />
diferenţiate ireversibil. TD6 LT este o linie de condiţie<br />
hipoxică, cu un ciclu celular scurt, de<br />
numai 6h (AGT6), ce proliferează în prima fază<br />
de creştere a culturii Aa(Sm) şi anume în primele<br />
30h. Atâta timp cât condiţiile hipoxice sunt<br />
favorabile proliferării ei, linia TD6 LT parcurge<br />
mai multe cicluri celulare, producând generaţii<br />
succesive de prechişti. Prechiştii sunt celule diferenţiate<br />
ireversibil, ce nu mai pot intra în ciclul<br />
celular. Fiind determinaţi pentru inchistare, pre-<br />
45
VLADIMIR F. NICULESCU<br />
chiştii continuă diferenţierea către celula tetranucleată<br />
din interiorul chistului, considerată din<br />
punct de vedere al biologiei celulare drept un<br />
progenitor totipotent în stare de repaus, în vederea<br />
reluării ciclului de viaţă. Conversia prechist<br />
→ progenitor totipotent este rapidă şi complexă,<br />
cuprinzând atât elemente evolutive cât şi regresive.<br />
Prin ex-chistare, progenitorul totipotent dă<br />
naştere la opt amibule, care refac o nouă populaţie<br />
amibiană.<br />
Descoperirea închistării ciclice, cu chiști<br />
CE, fenomen observat pentru prima dată în culturile<br />
Aa(Sm), ne duce mai aproape de înţelegerea<br />
fenomenului de închistare „spontană”, ob -<br />
servat de diverşi autori în culturile de E. invadens.<br />
Diverse modele lipsite de validare experimentală<br />
au dus din păcate la concluzii ambigue.<br />
Unii autori relatează cazuri de închistare spontană<br />
în faza târzie de creştere, scurt timp înainte<br />
de perioada staţionară şi de faza de liză [34]. Alţi<br />
autori au observat o închistare spontana în populaţiile<br />
de E. invadens crescute în mediu LG,<br />
privat de glucoză [35]. Nu este exclus ca închistarea<br />
„spontană” sa fie un caz nelămurit de închistare<br />
ciclică, susţinut de către o linie autoreproductivă,<br />
extrem de redusă la număr, înrudită<br />
cu linia QD24 LT , descoperită de noi.<br />
Închistarea extra-ciclică prin conversie<br />
indusă (chiști DI)<br />
Majoritatea autorilor au studiat procesul de<br />
închistare extra-ciclică, în care celule vegetative<br />
sunt induse la formare de chişti DI prin conversie<br />
directă, sub acţiunea unor stimuli fizico-chimici.<br />
Cu toate acestea, mecanismele moleculare<br />
ce susţin închistarea extra-ciclică au rămas neînţelese<br />
şi problema confuză [35-39]. În ciuda<br />
multiplelor studii întreprinse, nu s-a putut clarifica<br />
interrelaţia dintre sinteza de ADN, diviziunea<br />
celulară şi formarea chiştilor [40-43]. Nu se<br />
ştie încă precis dacă conversia directă necesită<br />
o sinteză prealabilă de ADN şi care dintre celule<br />
necesită sinteza. Conceptul unui proces multifazic,<br />
cu o fază sintetică proprie [44-45], rămâne<br />
în discuţie, dar s-ar putea să nu fie valabil pentru<br />
oricare fel de celulă vegetativă.<br />
Printre agenţii chimici ce ar induce conversia<br />
în habitatul natural sunt luaţi în discuţie acizii<br />
graşi cu catenă scurtă (SCFA) produşi de<br />
flora colonului şi de stratul mucos al intestinului<br />
[35], componentele mediilor xenice complexe<br />
[46] şi factorii de stres [47-49]. Singh şi Ehrenkaufer<br />
[46] arată că în culturile pe termen lung<br />
E. invadens oscilează permanent între forme vegetative<br />
şi forme chistice. Pentru tulpinile axenice<br />
de E. histolytica nu există în prezent tehnici<br />
reproductibile de închistare. Experimentele cu<br />
apă oxigenată (peroxid de hidrogen H2O2) au<br />
indus conversia unor trofozoiţi din cultură (cca<br />
10%) în aşa numiti CLS, formaţiuni pseudochistice<br />
multinucleate (1-4 nuclei), cu perete de<br />
chitină şi rezistenţă faţă de detergenţi [50-51],<br />
interpretate drept structuri intermediare pe drumul<br />
conversiei induse de stresul oxidativ.<br />
În perspectivă, ne propunem să adâncim<br />
studiul şi analiza fenomenelor de conversie intercelulară<br />
in cadrul ciclului de viaţă la E. invadens<br />
şi să urmărim semnalele hipoxice din<br />
sedimentul bacterian în regresie. Atenţia noastră<br />
se îndreaptă îndeosebi asupra celulelor din subpopulaţia<br />
vegetativă, neproducătoare de chişti.<br />
Vom urmări „soarta evolutivă” şi capacitatea de<br />
conversie a celulelor-rezervă şi a celulelor autoreproductive<br />
QD24 LT atât în mediul Aa(Sm), cât<br />
şi în afara acestuia. Un interes special îl prezintă<br />
linia primară metachistică cu posibilităţile ei de<br />
evoluţie. Cercetări premergătoare au arătat că<br />
capacitatea de conversie a celulelor autoreproductive<br />
QD24 LT depinde de poziţia acestora în<br />
ciclul celular. Mecanismele moleculare de conversie<br />
la chist sunt blocate atunci cand celula părăseşte<br />
faza G1 şi revin abia după sfârşitul<br />
diviziunii. În cursul procesului de închistare directă<br />
(ne-ciclică) celulele fiice tinere, ce au ieșit<br />
din diviziune, pot închista, fără să treacă printr-o<br />
fază adiţională de sinteză de ADN, fapt care<br />
arată, că sinteza adiţională de ADN nu este o<br />
conditio sine qua non pentru conversia la chist<br />
şi nicidecum o fază obligatorie sau chiar parte<br />
efectivă din procesul de închistare. Situaţia se<br />
schimbă la celulele-rezervă (D2), ieşite din ciclul<br />
celular şi parcate în stare G0, în rezervorul<br />
subpopulaţiei vegetative. Părţi din genomul celulelor<br />
mitotic-inactivate par a fi blocate sau<br />
pierdute. Pentru refacerea lor, sunt intr-adevăr<br />
necesare cicluri adiţionale de sinteză de ADN,<br />
fără de care celula vegetativă mononucleată nu<br />
poate trece la starea tetranucleată a celulei interchistice.<br />
46
Sisteme multicelulare la eucariotele primitive<br />
MULÞUMIRI<br />
Dr. Helmut Zaharia, specialist în genetică<br />
celulară, Kiel, Germania, Dr. Frank Wohlrab,<br />
specialist în patologia celulară, Leipzig, Germania,<br />
Dr. Eugenia Rodica Niculescu, microbiolog,<br />
Augsburg, Germania, pentru sprijin în revizuirea<br />
lucrării, Dr. Dennis Thomas, München, Germania<br />
şi Robert Braun, Connecticut, USA.<br />
AUTORUL<br />
Este fost cercetător al Institutului Dr. I. Cantacuzino<br />
în perioada 1965-1969. A lucrat în secţia<br />
de Parazitologie condusă de Prof. Dr. Gh.<br />
Lupaşcu pe probleme de biologie celulară a protozoarelor<br />
parazite.<br />
BIBLIOGRAFIE<br />
1. Diamond LS. Techniques of axenic cultivation of Entamoeba<br />
histolytica Schaudinn, 1903 and E. histoly tica<br />
- like amoebae. J. Parasitol. 1968. 54: 1047-1056.<br />
2. Diamond LS. Entamoeba, Giardia and Trichomonas.<br />
In: In vitro methods for parasitic cultivation, (Ed. A.<br />
E. Taylor, J. R. Baker). 1987. Academic Press, London,<br />
pp 1-17.<br />
3. Diamond LS, Harlow DR, Cunnick CC. A new medium<br />
fort the axenic cultivation of Entamoeba histolytica<br />
and other Entamoeba. Trans. Roy. Soc. Trop. Med.<br />
Hyg. 1978. 72: 4331- 4332.<br />
4. Bracha R, Mirelman D. Virulence of Entamoeba histolytica<br />
trophozoites. Effects of bacteria, microaerobic<br />
conditions, and metronidazol. J. Exp.Med. 1984. 160:<br />
353-368.<br />
5. Chang SL. Cultural, cytological and ecological observations<br />
on the amoeba stage of Naegleria gruberi. J.<br />
Gen. Microbiol. 1958. 18: 565-578.<br />
6. Mirelman D. Ameba-bacterium relationship in amebiasis.<br />
Microbiol. Rev. 1987. 51: 272-284 (doi: 0146-<br />
0749/87/020272-13$02.00/0).<br />
7. Chang SL. Studies on Endamoeba histolytica. V. The<br />
relation of oxidation reduction potentials to the growth,<br />
encystation and excystation of E. histolytica in water.<br />
Parasitol. 1946. 37: 100-112.<br />
8. Jacobs L. Oxidation-reduction potentials in relation to<br />
the cultivation of Endamoeba histolytica. J. Parasitol.<br />
1941. 27 (Suppl.): 31.<br />
9. Nakamura M. Nutrition and physiology of Endamoeba<br />
histolytica. Bacteriol. Rev. 1953. 17: 189-212<br />
(PMID: 13081544) (PMCID: PMC180769).<br />
10. Reinertson JW, Thomson PE. Experimental amoebic<br />
hepatitis in hamsters. Proc. Soc. Exp Biol. Med.<br />
1951. 76: 518-521 (PMID: 14844258).<br />
11. Troller JA. and Frazier WC. Repression of Staphylococcus<br />
aureus by food bacteria. II. Causes of inhibition.<br />
Appl Microbiol. 1962. 11: 163-165.<br />
12. Clifton CE. A comparison of the metabolic activities<br />
of Aerobacter aerogenes , Eberthella typhi and Escherichia<br />
coli. J. Bacteriol. 1937. 33: 145-162.<br />
13. Niculescu VF. A culture medium for study of the cell<br />
system in E. invadens. 3rd Intern. Congr. Parasit. Munich,<br />
ICOPA III, G3; 1974a. Published on-line.<br />
http://entamoebainvadens2010vfn.wordpress.com.<br />
14. Niculescu VF. The primitive cell system of E. invadens<br />
as related to cell differentiation. 3 rd Intern. Congr.<br />
Parasit. Munich, ICOPA III, A11; 1974b. Published<br />
on-line http://entamoebainvadens2010vfn. wordpress.com.<br />
15. Jacob E. Das Redoxpotential in Bakterienkulturen.<br />
II. Ztschr. f. Allg.Mikrobiol. 1971.<br />
11: 691-734 (doi: 10.1002/jobm.19710110809).<br />
16. Kerk NM., Feldman LJ. A biochemical model for<br />
initiation and maintenance of the quiescent center-implications<br />
for organization of root meristems. Development<br />
1999. 121: 2825-2833<br />
17. Reichelt JP. Specific checkpoints regulate plant cell<br />
cycle progression in response to oxidative stress.<br />
Plant. J. 1999. 17: 647-656.<br />
18. Russo T, Zambrano N, Esposito F, Ammendola R,<br />
Cimino F, Fiscella M, Jackman J, O’Connor PM,<br />
Anderson CW, Appella E. A p53 independent pathway<br />
for activation of WAF1/CIP1 expression following<br />
oxidative stress. J. Biol. Chem. 1995. 270:<br />
29386-29391 (doi: 10.1074/jbc.270.49.29386).<br />
19. Katto N, Esaka M. Changes in ascorbate oxidase<br />
gene expression and ascorbate levels in cell division<br />
and cell elongation in tobacco cells. Physiol. Plant<br />
1999. 105: 321-329.<br />
20. Vernoux T. The root meristemless1/cadmium sensitive2<br />
gene defines a glutathione –dependent pathway<br />
involved in initiation and maintenance of cell division<br />
during postembryonic root development. Plant Cell<br />
2000. 12: 97-110.<br />
21. Schafer FQ, Buettner GR. Redox environment of<br />
the cell as viewed through the redox state of the glutathione<br />
disulfide/glutathione couple. Free Radic.<br />
Biol. Med. 2001. 30: 1191-1212 (PII S0891-<br />
5849(01)00480-4) (PMID: 11368918).<br />
22. Potters G, Horemans N., Caubergs RJ., Asard H.<br />
Ascorbate and dehydroascorbate influence cell cycle<br />
progression in a tobacco suspension. Plant Physiol.<br />
2000. 124: 17-20 (doi: 10.1104/pp.124.1.17).<br />
23. Dixit R, Cyr R. Cell damage and reactive oxygen species<br />
production induced by fluorescence microscopy:<br />
effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence<br />
microscopy. The Plant J. 2003. 36: 280-290<br />
(doi: 10.1046/j.1365-313X.2003.01868.x).<br />
24. Nakamura H, Nakamura K, Yodoi J. Redox regulation<br />
of cellular activation. Ann. Rev. Immunol. 1997.<br />
15: 351-369.<br />
25. Moon H, Lee B, Choi G, Shin D, Prasad DT, Lee<br />
O, Kwak SS, Kim DH, Nam J, Bahk J, Hong JC,<br />
Lee SY, Cho MJ, Lim CO, Yun DJ. NDP Kinase 2<br />
47
VLADIMIR F. NICULESCU<br />
interacts with two oxidative stress-activated MAPKs<br />
to regulate cellular redox state and enhance multiple<br />
stress tolerance in transgenic plants. PNAS. 2003.<br />
100:358-363 (doi: 10.1073/pnas.252641899)<br />
(PMCID: PMC140977).<br />
26. Calder A, Roth-Albin I, Bhatia S, Pilquil C, Lee<br />
JH, Bhatia M, Levadoux-Martin M, McNicol J,<br />
Russell J, Collins T, Draper JS. Lengthened G1<br />
Phase Indicates Differentiation Status in Human Embryonic<br />
Stem Cells. Stem Cells Dev. 2012. ahead of<br />
print (doi:10.1089/scd.2012.0168) .<br />
27. Cometa I, Schatz S, Trzyna W, Rogerson A. Tolerance<br />
of naked amoebae to low oxygen levels with an<br />
emphasis to the genus Acanthamoeba. Acta Protozool.<br />
2011. 50: 33-40.<br />
28. Turner NA, Biagini GA, Lloyd D. Anaerobiosis induced<br />
differentiation of Acanthamoeba castelanii.<br />
FEMS Microbiol. Letters. 1997. 157: 149-153 (doi:<br />
10.1111/j.1574-6968.1997.tb12766.x).<br />
29. Kuhl M, Rickelt RF, Thar R. Combined imaging of<br />
bacteria and oxygen in biofilms. Appl.Environ.Microbiol.<br />
2007. 73: 6289-6295 (doi: 10.1128/AEM.01574-<br />
07).<br />
30. Barbeau J, Buhler T. Biofilms augment the number<br />
of free-living amoebae in dental unit waterlines. Res.<br />
Microbiol. 2001. 152: 753-760.<br />
31. Goldman M, Davis V. Isolation of different-size substrains<br />
from three stock cultures of Entamoeba histolytica,<br />
with observations on spontaneous size changes<br />
affecting whole populations. J Protozool. 1965. 12:<br />
509-523 (doi: 10.1111/j.1550-7408.1965.tb03250.x).<br />
32. Kotpal RT. Entamoeba histolytica. In: Modern textbook<br />
of Zoology: Invertebrates. 2010. 2.nd.ed,<br />
chap.7, pp 72-78 (Ed. Rakesh Kumar Rastogi). Capital<br />
Offset Press New Delhi.<br />
33. Stein E. Anorectal and colon diseases. Amoebiasis,<br />
pp 496-499 In: Textobook and color atlas of Procto -<br />
logy. 2003. 4th ed. Springer Verlag Berlin, Heidelberg.<br />
34. Vazquezdelara-Cisneros LG, Arroyo-Begovich M.<br />
Induction of encystation of Entamoeba invadens by<br />
removal of glucose from the culture medium. J. Parasitol.<br />
1984. 70: 629-633 (http://www.jstor.org/stable/3281741).<br />
35. Byers J, Faigle W, Eichinger D. Colonic short-chain<br />
fatty acids inhibit encystation of Entamoeba invadens.<br />
Cell.Microbiol. 2005. 7: 269-279 (doi:<br />
10.1111/j.1462-5822.2004.00457.x).<br />
36. Kumagai M, Makioka A, Ohtomo H, Kobayashi S,<br />
Takeuchi T. Inhibition of encystation of Entamoeba<br />
invadens by aphidicolin. Tokai J. Exp. Clin. Med.<br />
1998. 23: 313-317.<br />
37. Satish S, Bakre AA, Bhattacharya S, Bhattacharya<br />
A. Stress-dependent expression of a polymorphic,<br />
charged antigen in the protozoan parasite Entamoeba<br />
histolytica. Infect. Immun. 2003. 71: 4472–4486.<br />
38. Ebert F, Bachmann A, Nakada-Tsukui K, Hennings<br />
I, Drescher B, Nozaki T, Tannich E, Bruchhaus I.<br />
An Entamoeba cysteine peptidase specifically expressed<br />
during encystation. Parasitol. Int. 2008. 57: 521-<br />
524 (doi: 10.1016/j.parint.2008.07.002).<br />
39. Marien D. Mechanisms of encystation of Entamoeba<br />
invadens. Published online. 2010 (doi:10.1371/journal.pntd.0000607).<br />
40. Balamuth WJ. Effects of some environmental factors<br />
upon growth and encystations of Entamoeba invadens.<br />
J. Parasitol. 1962. 48: 101-109.<br />
41. Meyer DF, Morgan RJ. Evidence for a link between<br />
division and differentiation in Entamoeba invadens.<br />
J.Protozool. 1971. 18: 282-284 (PMID: 5091278).<br />
42. Thepsuparungsikul V, Seng L, Bailey, GB. Differentiation<br />
of Entamoeba: Encystation of Entamoeba<br />
invadens in monoxenic and axenic cultures. J. Parasitol.<br />
1971. 57: 1288-1292.<br />
43. Sirijintakarn P, Bailey GB. The relationship of DNA<br />
synthesis and cell cycle events to encystation by Entamoeba<br />
invadens. Arch. Invest. Med. (Mexico) 1980.<br />
11: 3-10 (Suppl.1) (PMID: 7469646).<br />
44. Eichinger D. Encystation in parasitic protozoa. Curr.<br />
Opin. Microbiol. 2001. 4: 421-426.<br />
45. Singh N, Bhattacharya S, Paul J. Entamoeba invadens:<br />
Dynamics of DNA synthesis during differentiation<br />
from trophozoite to cyst. Exp. Parasitol. 2010.<br />
127:329-333 (doi:10.1016/j.exppara.2010.08.013).<br />
46. Singh U, Ehrenkaufer GM. Recent insights into Entamoeba<br />
development: identification of transcriptional<br />
networks associated with stage conversion. Int. J.<br />
Para sitol. 2009. 39 : 41-47 (doi:10.1016/j.ijpara.<br />
2008.09.004.) (PMCID: PMC2648836).<br />
47. Balamuth WJ. Biological studies on Entamoeba histolytica.<br />
III. Induced encystation in several mediums,<br />
including an account of a new procedure. J. Infect.<br />
Dis. 1951. 88: 230-236 (PMID:14850747).<br />
48. Robinson GL. The laboratory diagnosis of human parasitic<br />
amoebae. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 1968.<br />
62: 285-294.<br />
49. Chayen A, Avron B, Nuchamiwitz Y, Mirelman D.<br />
Appearance of sialoglyco-proteins in encysting cells<br />
of Entamoeba histolytica. Infect. Immun. 1988. 56:<br />
673-681<br />
50. Aguilar-Diaz H, Diaz-Gallardo M, Laclette JP,<br />
Carrero JC. In vitro induction of Entamoeba histoly -<br />
tica cyst-like structures from trophozoites. Plos Negl<br />
Trop Dis. 2010. 4(2): e607 (doi:10.1371/journal.<br />
pntd.0000607).<br />
51. Aguilar-Diaz H, Laclette JP, Carrero JC. Silencing<br />
of Entamoeba histolytica glucosamine 6 phosphate<br />
isomerase by RNA interference inhibits the formation<br />
of cyst-like structures. BioMed Research International.<br />
<strong>2013</strong>. (doi:10.1155/<strong>2013</strong>/758341).<br />
48
TWO CAse RePORTs ON VIsCeRAL LeIsHMANIAsIs<br />
DIAGNOseD IN ROMANIA<br />
Marian Ghervan Gogoaşe 1 , Irina Teodorescu 2 *,<br />
Carmen Preda 1 , Simona Claudia Ionescu 3<br />
1 Fundeni Clinical institute, 2 University of bucharest, Faculty of biology, Romania<br />
3 victor babeş infectious and tropical diseases Clinical Hospital, bucharest, Romania<br />
ABsTRACT<br />
Two cases of visceral leishmaniasis with a species from Leishmania donovani complex were detected<br />
in the Fundeni Clinical Institute. In one case, two infection sources were possible: one from Italy,<br />
where the patient worked three years, the other from the Southwest of Romania (Dolj County), where<br />
he was resident and where few human and canine leishmaniasis cases were re gistered in the past. In<br />
the second case, the patient lived in the Northeast of Romania (Iaşi County), but worked in the same<br />
southwest zone. In both cases, a local transmission should be considered, situation that could amplify<br />
and extend in the future, supposing that increased temperatures will persist, favoring the persistence<br />
and multiplication of autochthonous and allochthonous Phlebotomus vector species.<br />
Keywords: visceral leishmaniasis, Leishmania, Romania<br />
INTRODUCTION<br />
Human leishmaniasis is a major vector-borne<br />
disease, endemic in 88 countries (16 “developed”<br />
and 72 “developing” countries) [1], caused by more<br />
than 20 species and strains, morphologically indistinguishable,<br />
of the intracellular flagellate protozoan<br />
of genus Leishmania, subgenus Leishmania (Kinetoplastida,<br />
Trypanosomatidae). World Health Organization<br />
classified it as one of the top ten threatening<br />
infective conditions [2]). An estimated 350 million<br />
people are at risk of infection with a global yearly<br />
incidence of 1-1.5 million for cutaneous and 500,000<br />
for visceral leishmaniasis, including about 50 thousand<br />
deaths [3]. The clinical manifestations of the<br />
disease fall into three major forms: visceral, mucocutaneous<br />
and cutaneous (Seventh Programme Report<br />
of Tropical Diseases Research), sometimes with<br />
disseminated disease.<br />
The etiologic agent of visceral leishmaniasis is<br />
Leishmania Leishmania donovani complex, which<br />
according to the previous studies comprises four<br />
species: L.(L.) donovani sensu stricto, L.(L.) infantum,<br />
L.(L.) chagasi and L.(L.) archibaldi. In recent<br />
studies three species are considered: L.(L.) donovani<br />
sensu stricto in East Africa, L. (L.) infantum in Europe,<br />
Africa, China, Latin America (in the latter region<br />
named L. chagasi) and L.(L.) archibaldi in East<br />
Africa [4]. Other authors considered two species: L.<br />
(L.) infantum, in Europe, North Africa, South and<br />
Central America, and L.(L.) donovani sensu stricto,<br />
in East-Africa, India, and parts of the Middle East<br />
[5]. In the genus Leishmania, subgenus Leishmania,<br />
establish five species: L. (L.) donovani, L. (L.)<br />
major, L. (L.) tropica, and L. (L.) mexicana [6]. In<br />
L. (L.) donovani species can be recognized L. (L.)<br />
donovani infantum.<br />
Visceral leishmaniasis is an opportunistic infection<br />
associated with various immunodeficiency conditions:<br />
HIV infection, neoplasma, organ transplan -<br />
tation, and long-term treatment with immunosuppressive<br />
agents. Visceral leishmaniasis (VL) is a<br />
common complication in AIDS patients living in<br />
Leishmania-endemic areas [7]. The co-infection<br />
Leishmania and human immunodeficiency virus<br />
(HIV) [8, 9], both infecting human macrophages,<br />
leads to a drastic increase in the severity of leishmaniasis<br />
cases. The first case of leishmaniasis associated<br />
with HIV was reported in 1985 and later, several<br />
cases of co-infection have been reported from over<br />
*Corresponding author: Irina Teodorescu, University of Bucharest, Romania, Faculty of Biology, e-mail: teodorescubiologie@yahoo.com<br />
49
GHERVAN GOGOAŞE et al.<br />
35 countries around the world, the majority in South-<br />
Western Europe [10, 11, 12]. This co-infection became<br />
endemic in many parts of Southern Europe,<br />
more than 25-75 % of adult cases of visceral leishmaniasis<br />
being detected in HIV-infected persons<br />
[13]. In immunocompromised persons (AIDS), the<br />
leishmaniasis infections, initially asymptomatic,<br />
could progress to severe clinical forms, the co-infections<br />
accelerating and aggravating both AIDS and<br />
leishmaniasis symptoms. According to the World<br />
Health Organization (2012) “The two diseases are<br />
mutually reinforcing: HIV- infected people are particularly<br />
vulnerable to VL, while VL accelerates<br />
HIV replication and progression to AIDS”. This coinfection<br />
could have major consequences for blood<br />
banks. It was shown that asymptomatic blood<br />
donors living in Southern France had 3.4 % leishmaniasis<br />
seropositivity, in Greece 15 % and in Spain<br />
22.1 % [14, 15, 16].<br />
The vectors for Leishmania species are Diptera<br />
Psychodidae (sand flies) species belonging to Phlebotomus<br />
genus in Europe, Africa and Asia and to<br />
Lutzomyia genus in America [17, 18].<br />
In Southern Europe are present visceral leishmaniasis<br />
(with most numerous cases, being the most<br />
dangerous and lethal if untreated), and cutaneous<br />
leishmaniasis (the most benign) [19]. The human<br />
leishmaniasis incidence is relatively low (8.53 cases<br />
to 100,000 people, most cases being registered in<br />
Turkey). The visceral leishmaniasis is found in Albania,<br />
Bosnia, Croatia, Cyprus, France (Southern regions),<br />
Greece, Hungary, Macedonia, Malta,<br />
Portugal, Romania, Spain, Serbia and Montenegro,<br />
and Turkey. Visceral leishmaniasis has spread northward<br />
lately, as shown in the recent reports of indigenous<br />
cases in Northern Italy and Southern Germany.<br />
Each year approximately 3,950 autochthonous<br />
human cases (700 excluding Turkey) were reported,<br />
but from each symptomatic case, a number of 30-<br />
100 asymptomatic ones were estimated [20]. In the<br />
recent years, an increasing proportion of adult cases<br />
(especially in HIV, but also in non-HIV infected individuals)<br />
with visceral leishmaniasis have been re -<br />
gistered, while in the past this disease was<br />
cha racteristic for children [21]. First autochthonous<br />
cases considered as L. donovani infections in Europe<br />
were detected in Cyprus [22, 23].<br />
L. (L.) infantum also infects and represents one<br />
of the main killers of dogs (with a seroprevalence up<br />
to 25 % in Southern Europe, up to 34 % in Spain<br />
[24], in the highly endemic areas, and approximately<br />
5,000 clinical cases each year in France). The dogs,<br />
symptomatic or asymptomatic [25], constitute an important<br />
reservoir of the parasite, which Phlebotomus<br />
vectors could infect and transmit the infection to humans<br />
[26-30]. Another danger is represented by the<br />
possibility that L. (L). infantum might be exported<br />
through dogs, outside Europe.<br />
The cutaneous leishmaniasis with L.(L.) major,<br />
L. (L.) tropica and even L. (L.) infantum etiologic<br />
agents has been reported in Albania, Austria, Bosnia<br />
and Herzegovina, Bulgaria, Croatia, Cyprus, France,<br />
Greece, Italy, Malta, Monaco, Portugal, Romania,<br />
Spain (including the Canary Islands), Serbia and<br />
Montenegro.<br />
In Romania, [31, 32] some authors were mentioned<br />
(Copăceanu et al., 1955; Bârzu et al., 1956;<br />
Lupaşcu et al., 1963; Zaharia, 1972; Wahirapp et al.,<br />
1976; Diaconu, 1981) who diagnosed visceral and<br />
cutaneous leishmaniasis. Other Romanian references<br />
to leishmaniosis in Romania were made between<br />
1919 and 1958 [33, 34, 35]. Some cases of imported<br />
visceral and cutaneous leihmaniasis (in travelers or<br />
workers in endemic areas) were also recently detected<br />
[36-50].<br />
MATERIALS AND METHODS<br />
Investigations were carried out on two patients<br />
hospitalized in 2007 at Fundeni Clinical Institute.<br />
The cytological and histological exams of liver<br />
biopsy were performed using Van Gieson stain. The<br />
patient charts containing the results of clinical investigations<br />
such as physical, biochemical, hematological<br />
exams, abdominal ultrasounds, Chest X-Rays,<br />
and bacteriological assays were used. Patient interviews<br />
offered epidemiological information.<br />
RESULTS<br />
First case report<br />
23 y.o. male patient from Radovan, Dolj<br />
County, who worked in Italy three years ago, was<br />
hospita lized at Fundeni Clinical Institute for one<br />
month with history of pain in the left upper abdominal<br />
quadrant, described as a stinging sensation; a<br />
pain arising on effort at the level of the right upper<br />
abdominal quadrant and marked weight loss (16 kg).<br />
Leptospirosis and septicemia from an acute orchiepididymitis<br />
were taken into consideration as preliminary<br />
diagnosis.<br />
Laboratory results and specific investigations<br />
Blood cells count showed pancytopenia<br />
(Leukocytes 2,600, Hemoglobin 8.0 g/dl, Thrombocytes<br />
81,000) with a moderate anisocytosis (micro-<br />
50
Two case reports on visceral leishmaniasis diagnosed in Romania<br />
cytes), moderate hypochromia, and bulls eye erythrocytes<br />
with a tendency towards rouleaux formation.<br />
ESR was 50 mm/hr. Fibrinogen was normal.<br />
Liver enzymes were high: GGT = 201 µ/1, ALT =<br />
154 µ /1.<br />
Blood cultures were positive for coagulasenegative<br />
staphylococci. RPR was negative. White<br />
cell formula showed: neutrophils 47 %, lymphocytes<br />
45 %, monocytes 2 %, myelocytes 6 %. Negative results<br />
for HBV and HCV were registered. IgG anti-<br />
CMV were 151.3/15 (positive) and IgM anti-CMV<br />
were 0.190/0.500 (negative).<br />
Ultrasound study of the abdomen revealed<br />
grade I steatosis of the liver with hyperechoic structure,<br />
with granular character. Spleno-portal axis,<br />
gallbladder and the pancreas were within normal<br />
limits. The spleen appeared to have irregular margins,<br />
with slightly enlarged veins in the hilus. There<br />
was no ascitis fluid in the peritoneum. The retroperitoneal<br />
space was normal. Chest X-Ray was normal.<br />
Bone marrow biopsy from the iliac bone with<br />
slide preparations showed rich cellularity with a<br />
granulocytic line within normal range, with good<br />
maturation. There were frequent mature lymphocytes,<br />
approximately 17 %, and frequent reactive<br />
plasmocytes (6 %). The red cell line was normoblastic.<br />
Megakaryocytes were present, displaying a<br />
quantitatively slightly reduced thrombocytoformation.<br />
The bone marrow biopsy showed therefore hypercellular<br />
marrow with slight plasmocytosis.<br />
By liver biopsy a relatively small fragment<br />
(~8mm length) of liver tissue was obtained, with<br />
normal lobular architecture, slightly to moderately<br />
enlarged portal spaces, with lympho-plasmocytic inflammatory<br />
infiltrate, and rare granuloma with epithelioid<br />
and multinucleated giant cells. No portal<br />
fibrosis was noted. Rare hemophagocytosis images<br />
were observed. The following aspects were observed<br />
intralobularly: chronic intrasinusoidal inflammatory<br />
infiltrate, hypertrophy and Kupffer cell hyperplasia,<br />
and granuloma sketches made up of macrophages<br />
and epithelioid cells. Very small basophilic<br />
macrophagocytic inclusions (1-2 microns in diameter)<br />
were noticeable, some of them with a clear<br />
halo surrounding them, indicating the presence<br />
of Leishmania spp. amastigotes (Figs. 1, 2 and 3).<br />
Second case report<br />
35 y.o. male residing in Romaneşti, Iaşi County,<br />
was hospitalized in the Gastroenterology Clinic of<br />
Fundeni Clinical Institute following a transfer from<br />
an infectious disease clinic in Iaşi, where the patient<br />
was hospitalized for one month, with a prolonged<br />
febrile syndrome (40-41 Celsius degrees), with no<br />
response to i.v. antibiotherapy. The preliminary diag -<br />
nosis was splenomegaly with hypersplenism. A suspicion<br />
of hydatid splenic cyst was raised. The patient<br />
was admitted to the ICU after ten days of investigations<br />
and i.v. antibiotherapy due to the onset of hypoxemic<br />
respiratory insufficiency. At the entry in<br />
ICU, the patient was febrile (39.6 Celsius degrees),<br />
Fig. 1 - Liver tissue biopsy: histiocytes including Leishmania amastigotes<br />
(immersion oil x 100, Giemsa staining)<br />
51
GHERVAN GOGOAŞE et al.<br />
Fig. 2 - Liver tissue biopsy: histiocytes including Leishmania amastigotes<br />
(immersion oil x 100, Giemsa staining)<br />
polypneic and tachycardic, with jaundice and ecchymosed<br />
at the site of venous punction.<br />
Laboratory results and specific investigations<br />
Blood count showed severe pancytopenia with<br />
1,200 leukocytes, anemia with Hemoglobin of 6.3<br />
g/dl, and very high levels of liver enzymes. ESR was<br />
1 lOmm/hr, and there was thrombocytopenia of<br />
14,000. Microscopic exam of liver tissue revealed<br />
the presence of basophilic inclusions, which highlighted<br />
Leishmania spp. infection. Serology for<br />
Leishmania (performed at the Clinical Hospital for<br />
Infectious and Tropical Diseases “Dr. Victor Babeş”)<br />
was positive and leishmaniasis infection was confirmed.<br />
Acute renal insufficiency developed after<br />
Fig. 3 - Liver tissue biopsy: histiocytes including Leishmania amastigotes<br />
(immersion oil x 100, Giemsa staining) (digitally processing)<br />
52
Two case reports on visceral leishmaniasis diagnosed in Romania<br />
four days of treatment, with signs of acute tubular<br />
necrosis. Kidney functions returned to normal by hemofiltration<br />
and hemodialysis. Liver functions also<br />
returned to normal. During the hospitalization, while<br />
the patient’s status was improving, a splenectomy<br />
was done for the large splenic hydatid cyst (inactivation,<br />
evacuation, pericystectomy). The polyneuropathy<br />
with tetraplegia persisted and the<br />
neuro logical status worsened. The patient developed<br />
severe sepsis from the lung infection due to prolonged<br />
ventilator support, with acute renal failure,<br />
which led to death.<br />
DISCUSSION<br />
The typical clinical and laboratory features<br />
of visceral leishmaniasis include high fever, hepatosplenomegaly,<br />
pancytopenia and hypergammaglobulinaemia,<br />
involving virtually any organ.<br />
For the first patient, who worked in Italy, we<br />
could suppose two possibilities of infection: from<br />
Italy, an endemic zone for leishmaniasis, or from an<br />
autochthonous source, i.e. in Oltenia, where the patient<br />
lived. Few cases of human leishmaniasis were<br />
registered near Craiova, in Southwest Dolj, in 1912,<br />
1945, 1953-1954 and some canine leishmaniasis<br />
cases were signaled in Caraş-Severin County, in<br />
1929 and 1957. In these zones some Phlebotomus<br />
vectors for Leishmania were also present [51].<br />
For the second patient inhabiting in Northeast<br />
area of the country (Iaşi County), no local source of<br />
infection is documented, but he worked in the Southwest<br />
area of Romania, where cases of human leishmaniasis<br />
were registered and we could thus suppose<br />
the possibility of existence of autochthonous source<br />
of infection.<br />
CONCLUSIONS<br />
In Fundeni Clinical Institute two cases of visceral<br />
leishmaniasis were investigated: although in<br />
one case an imported leishmaniasis case was possible,<br />
in both cases a local transmission from an infection<br />
source located in the Southwest zone of<br />
Romania can be considered.<br />
In the patient who worked in Italy, a suggestive<br />
clinicalpresentation associated with his geographical<br />
travel history could lead to an early consideration of<br />
visceral leishmaniasis. Laboratory results and other<br />
specific investigations (febrile syndrome, pancytopenia,<br />
1-2 microns basophilic inclusions in liver<br />
tissue indicating the presence of Leishmania spp.<br />
amastigotes) confirmed the diagnosis.<br />
In the patient resident in Northeast area of country<br />
(Iaşi County) the microscopic exam of liver tissue<br />
indicated the presence of Leishmania spp.<br />
amastigotes and serology was positive to Leishmania<br />
infection. Leishmaniasis with severe pancytopenia<br />
and anemia, accompanied by other clinical<br />
signs (hypoxemic respiratory insufficiency, a large<br />
splenic hydatid cyst and consecutive splenectomy,<br />
acute renal insufficiency with tubular necrosis, lung<br />
infection and severe sepsis) could have a severe<br />
prognosis and lead to death.<br />
The two diagnosed cases represent an alarm signal,<br />
in the context of global climate changes, with a<br />
continuing warming tendency, favoring the multiplication<br />
of autochthonous Phlebotomus species, but<br />
also the possibility of penetration in Romania of<br />
other Phlebotomus species, which are vectors for<br />
Leishmania, raising the risk for Romania to become<br />
an endemic area for leishmaniasis.<br />
REFERENCES<br />
1. Desjeux P, Alvar J. Leishmania/HIV co-infections:<br />
epidemiology in Europe, Ann Trop Med Parasit. 2003.<br />
97 (1): 3-15.<br />
2. World Health Organization. WHO Techical Report Series:<br />
control of the leishmaniasis. Report of a meeting<br />
of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniases.<br />
World Health Organization: Geneva; 22-26<br />
March 2010.<br />
3. Ezra N, Ochoa Maria Teresa, Craft N. Human Immu -<br />
nodeficiency Virus and Leishmaniasis, J Glob Infect Dis.<br />
2010. 2 (3): 248–257. doi: 10.4103/0974-777X.68528.<br />
4. Quispe-Tintaya, KW, Laurent T, Decuypere Saskia,<br />
Hide Mallorie, Banuls Anne-Laure, De Doncker Simonne,<br />
Rijal S, Canavate Carmen, Campino L, Dujardin1<br />
J-C. Fluorogenic Assay for Molecular Typing<br />
of the Leishmania donovani Complex: Taxonomic and<br />
Cli nical Applications, The Jour Inf Dis. 2005. 192: 685–<br />
692.<br />
5. Lukeš J, Mauricio L Isabel, Schönian Gabriele, Dujardin<br />
J-Cl, Soteriadou Ketty, Dedet J P, Kuhls Katrin,<br />
Quispe Tintaya K W, Jirků M, Chocholová<br />
Eva, Haralambous C, Pratlong Francine, Oborník<br />
M, Horák A, Ayala F J, Miles M A. Evolutionary and<br />
geographical history of the Leishmania donovani complex<br />
with a revision of current taxonomy, Proc Nat<br />
Acad Sci USA. 2007. 104 (22): 9375-9380.<br />
6. Fraga J, Montalvo A M, De Doncker S, Dujardin J<br />
C, Van der Auwera G. Phylogeny of Leishmania<br />
species based on the heat-shock protein 70 gene, Infect<br />
Genet Evol. 2010. 10 (2): 238-245. doi: 10.1016/<br />
j.meegid.2009.11.007. Epub 2009 Nov 11.<br />
7. Cota F Glaucia, de Sousa M R, Rabello Ana. Predictors<br />
of Visceral Leishmaniasis Relapse in HIV-Infected<br />
Patients: A Systematic Review. PLOS Neg Trop Dis.<br />
2011. 5, 6: e1153. doi:10.1371/journal.pntd.0001153.<br />
8. Agostoni C, Dorigoni N, Malfitano A, Caggese L,<br />
Marchetti G, Corona S, Gatti S, Scaglia M. Mediter-<br />
53
GHERVAN GOGOAŞE et al.<br />
ranean leishmaniasis in HIV–infected patient: epidemiological,<br />
clinical, and diagnostic features of 22 cases.<br />
Infection, 1998. 26, 2, 93-9.<br />
9. Leishmaniasis and HIV coinfection WHO 2012<br />
http://www.who.int/leishmaniasis/burden/hiv_coinfection/burden_<br />
hiv_coinfection/en/index.html.<br />
10. Alvar J, Canavate C, Gutierrez-Solar B, Jimenez<br />
M, Laguna F, Lopez-Velez R, Molona R, Moreno<br />
J. Leishmania and human immunodeficiency virus<br />
coinfection: the first years, Clin Microbiol Rev. 1997.<br />
10, 2, 298-319.<br />
11. Desjeux P, Alvar J, Leishmania/HIV co-infections:<br />
epidemiology in Europe, Ann Trop Med Parasit. 2003.<br />
97, Suppl. 1, 3–15.<br />
12. Gradoni L, Gaeta G B, Pellizzer G, Maisto A,<br />
Scalone A. Mediterranean visceral leishmaniasis in<br />
pregnancy, Scand Journ Inf Dis. 1994. 26 (5): 627-629.<br />
13. Maguire J H, Leishmania, a Parasite on the Move, in<br />
Scheld W M, Craig W A, Hughes J M. Emerg Inf.<br />
1999. 99-111, ASM Press, Washington D.C.<br />
14. Le Fichoux Y, Quaranta J G, Aufeuvre J P,<br />
Lelievre A, Marty P, Suffia I. Occurrence of Leishmania<br />
infantum parasitemia in asymptomatic blood<br />
donors living in an area of endemicity in southern<br />
France, J Clin Microbiol. 1999. 37: 1953–1957.<br />
15. Riera Cristina, Fisa R, Udina M, Gállego M, Portus<br />
M. Detection of Leishmania infantum cryptic infection<br />
in asymptomatic blood donors living in an<br />
endemic area (Balearic Islands, Spain) by different diagnostic<br />
methods. Trans R Soc Trop Med Hyg. 2004.<br />
98: 102-110. http://dx.doi.org/101016/S0035-<br />
9203(03)0015-4.<br />
16. Riera Cristina, Fisa R, López-Chejade P, Serra<br />
Teresa, Girona E, Jiménez MaTeresa, Muncunill J,<br />
Sedeño Matilde, Mascaró M, Udina Maria, Gállego<br />
M, Carrió J, Forteza A, Portús M. Asymptomatic<br />
infection by Leishmania infantum in blood donors<br />
from the Balearic Islands (Spain), Transfusion, 2008.<br />
48 (7): 1383-1389. DOI: 10.1111/j.1537-<br />
2995.2008.01708.x.<br />
17. Killick-Kendrick R. Phlebotomine vectors of the<br />
leishmaniases: a review, Med Vet Entomol. 1990. 4<br />
(1): 1-24.<br />
18. Nicolescu Gabriela. Flebotomii, in Insecte vectoare<br />
şi generatoare de disconfort, Edit Med Bucureşti,<br />
1986. 137-146.<br />
19. Ready P D. Leishmaniasis emergence in Europe. Euro<br />
Surveill. 2010. 15 (10): pii = 19505. Available online:<br />
http://www.eurosurveillance. org/ViewArticle<br />
.aspx?ArticleId=19505.<br />
20. Dujardin J-C, Campino L, Canavate Carmen,<br />
Dedet J-P, Gradoni L, Soteriadou Ketty, Mazeris<br />
A, Ozbel Y, Boelaert Marleen. Spread of vectorborne<br />
diseases and neglect of leishmaniasis, Europe,<br />
Emerg Inf Dis. 2008. 14, 7.<br />
21. Lindgren Elisabeth, Naucke T, Menne Bettina.<br />
Leishmaniasis in Europe, Sc Work Group, Report on<br />
Leishmaniasis, Geneva, WHO on behalf of the Special<br />
Programme for Research and Training in Tropical Diseases,<br />
2004. http://www.who.int/ tdr/publications/publications/swg_leish.htm.<br />
22. Antoniou M, Haralambous C, Mazeris A, Pratlong<br />
F, Dedet J-P, Soteriadou K. Leishmania donovani<br />
leishmaniasis in Cyprus. Lancet Infect Dis. 2008. 8,<br />
6-7.<br />
23. Antoniou M, Messaritakis I, Christodoulou V, Ascoksilaki<br />
I, Kanavakis N, Sutton A J, Carson C,<br />
Courtenay O, Increasing incidence of zoonotic visceral<br />
leishmaniasis on Crete, Greece, Emerg Infect<br />
Dis. 2009. 15 (6): 932-934.<br />
24. Martín-Sánchez Joaquina, Morales-Yuste M,<br />
Acedo-Sánchez Carmen, Barón S, Díaz V, Morillas-Márquez<br />
F. Canine Leishmaniasis in Southeastern<br />
Spain, Emerg Inf Dis. 2009. 15 (5): 795–798.<br />
25. Razzaghi Maensh M, Mahabadi S, Ghamesi A,<br />
Namjoo A R. Prevalence of canine visceral leishmaniasis<br />
in dogs at Adrestan District detected by PCR,<br />
Veter Res. 2012. 5: 22-25, DOI: 10.3923/<br />
vr.2012.22.25, http://medwelljournals.com /abstract<br />
/?doi= vr.2012.22.25<br />
26. Chamaillé Lise, Tran Annelise, Meunier Anne,<br />
Bourdoiseau G, Ready P, Dedet J-P. Environmental<br />
risk mapping of canine leishmaniasis in France, Paras<br />
& Vect, 2010. 3: 31 doi:10.1186/1756-3305-3-31<br />
http://www.parasitesandvectors. com/content/ 3/1/31<br />
27. Cortes S, Vaz Y, Neves R, Maia C, Cardoso L,<br />
Campino L. Risk factors for canine leishmaniasis in<br />
an endemic Mediterranean region. Vet Parasitol. 2012.<br />
189 (2-4): 189-196. doi: 10.1016/j.vetpar.<br />
2012.04.028.<br />
28. Dereure J, Vanwambeke S O, Malé P, Martinez S,<br />
Pratlong F, Balard Y, Dedet J P. The potential effects<br />
of global warming on changes in canine leishmaniasis<br />
in a focus outside the classical area of the<br />
disease in southern France, Vect Borne Zoonotic Dis.<br />
2009. 9 (6): 687-694.<br />
29. Ferroglio E, Maroli M, Gastaldo S, Mignone W,<br />
Rossi L. Canine leishmaniasis, Italy. Emerg Infect Dis.<br />
2005. [serial on the Internet]. http://dx.doi.org/<br />
10.3201/eid1110.040966 DOI: 10.3201/<br />
eid1110.040966.<br />
30. Tánczos B, Balogh N, Király L, Biksi I, Szeredi L,<br />
Gyurkovsky M, Scalone A, Fiorentino E, Gramiccia<br />
M, Farkas R. First record of autochthonous canine<br />
leishmaniasis in Hungary. Vect Born Zoon Dis.<br />
2012. 12 (7): 588-594. doi: 10.1089/vbz.2011.0906.<br />
Epub 2012 May 18 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/<br />
pubmed22607079.<br />
31. Olteanu Gh, Panaitescu D, Gherman I, Şuteu I,<br />
Cosoroabă I, Rădulescu Simona, Fazakaş B, Codreanu-Bălcescu<br />
Doina, Sârbu V, Popârlan N,<br />
Brănescu Viorica, Nicolae St, Ionescu V, Barcan<br />
Marilena, Mitrea L I, Ciucă N, Ştefănoiu V, Cristea<br />
Gh, Pavel Agneta. Parazitozoonoze, Probleme la<br />
sfârşit de mileniu în România, 1999. Edit Viaţa Med<br />
Rom, Bucureşti.<br />
32. Olteanu Gh, Panaitescu D, Gherman I, Zgardan<br />
E, Apatenko V, Fazakaş B, Codreanu-Bălcescu<br />
Doina, Teodorescu Irina, Iacobiciu I, Tălămbuţă<br />
Nina, Erhan D, Marx Madeleine, Cristea Gh, Junie<br />
Monica, Doicescu D. Poliparazitismul la om, animale<br />
şi plante, 2001. Edit Ceres, Bucureşti.<br />
33. Gherman I, Zaharia A L Const, Bîrzu I, Popescu<br />
Gh, Tiereanu E. Considerații epidemiologice asupra<br />
54
Two case reports on visceral leishmaniasis diagnosed in Romania<br />
primului episod epidemic de leishmanioză infantilă în<br />
țara noastră, Microb Parazit şi Epid. 1957. 6, 556-560.<br />
34. Manicatide M. Sur deux cas de Kala-azar observés<br />
en Roumanie, Bull Sect Scient Acad Roum. VI-eme<br />
Annee, 1919/1920, 5-6, 105 -112.<br />
35. Minculescu M, Bîrzu I, Creţu S, Iovănescu F,<br />
Ionescu D, Lupulescu V, Michel G, Paulon S, Rotaru<br />
A, Rusovici I, Zaharia C. The first focus of infantile<br />
leishmaniasis identified in the Rumanian<br />
People’s Republic, Stud. şi cercet inframicrobiol.<br />
1955. 6 (3-4): 595-603.<br />
36. Ardeleanu Carmen, Zurac Sabina, Zaharia Anca,<br />
Vrabie Alexandra, Lavric Luciana, Andrei R,<br />
Stăniceanu Florica, Giurcăneanu C. Leishmanioza<br />
cutanată – probleme de diagnostic diferenţial, Terapeut,<br />
farmacol şi toxicol clinic. 2005. IX, 4, 99-103.<br />
37. Balea M L A, Guran M, Balea M I, Răzvan A. Diagnostic<br />
difficulties in imported leishmaniasis in Romania,<br />
12 th Congr Europ Hematol Assoc. 2007.<br />
38. Boda D, Cilievici Suzana, Diaconescu Adriana,<br />
Costache Mariana, Popescu Sanda. Leishmanioză<br />
cutanată la o fetiţă de 12 ani, Dermatovenerol. 2001.<br />
46, 4, 283.<br />
39. Erscoiu Simona, Voinea Cristina, Florescu S,<br />
Ceauşu E. Imported visceral leihmaniosis in Romania,<br />
Rev Rom Parazitol, 2004. XIV, 1, 89-91.<br />
40. Florescu S, Popescu C, Cotiga M, Răduţă L, Botgros<br />
R, Voinea C, Erscoiu S, Ceauşu E, Calistru P.<br />
Visceral leishmaniasis cases in Romania, 17th Europ<br />
Congr Clin Microbiol and Inf Dis. ICC, Munich, Germany.<br />
2007.<br />
41. Florescu S, Ceauşu E, Calistru P, Voinea Cristina,<br />
Turcu (Mozes) Elena, Nica Maria, Popescu C,<br />
Păun L. Imported tropical pathology in Romania in<br />
the last 11 years, Rev Rom de boli infecţioase, 2010.<br />
XIII, 1, 11-15.<br />
42. Găman Amelia, Dobrea Camelia, Găman G. A case<br />
of visceral leishmaniasis in Oltenia region (Romania),<br />
Rom Journ Morphol and Embryol. 2010. 51 (2): 391–<br />
394.<br />
43. Halichidis Stela, Rugină S, Dumea Elena. Leishmaniasis<br />
in travellers in endemic areas, 16th Europ Congr<br />
of Clin Microbiol and Infect Dis. Nice, France, April<br />
1-4. 2006.<br />
44. Ioncică N, Bărbulescu C M, Mertoiu G, Ciucă N.<br />
The statistic studying of the leishmaniosis in the Dobrogea<br />
area, between 2000-2005 (abstract), Rev Rom<br />
Parazitol. 2007. XVIII, 95.<br />
45. Lazăr Lidia, Schilo E A, Leventer Mihaela. Ecoepidemilogical<br />
and clinico-therapeurtic assessment on<br />
cutaneous leishmaniosis in Romania and Israel: case<br />
studies (abstract) Rev Rom Parazitol. 2008. XVIII,<br />
128-129.<br />
46. Neghină R, Neghină Adriana-Maria, Merkler Carmen,<br />
Marincu I, Moldovan Roxana, Iacobiciu I.<br />
Importation of visceral leishmaniasis in returning Romanian<br />
workers from Spain, Travel Med and Infect<br />
Dis. 2009. 7 (1): 35-39.<br />
47. Oniţă M, Hornung Edith, Ciobanu C, Sârbu A E,<br />
Olariu Teodora, Oniţă C, Stoica A L. Visceral leishmaniasis-surgical<br />
aspects, Chirurgia, 2006.101 (3):<br />
335-339.<br />
48. Patiu Mariana, Telcian Aurica, Petraşcu Mirela,<br />
Cucuianu A. Visceral leishmaniosis-a case presentation,<br />
Rev Rom Parazitol. (abstract) 2007. XVIII, Supliment,<br />
146.<br />
49. Rugină S, Dumitru Irina Magdalena, Cernat Ro -<br />
xana Carmen. Visceral leishmaniosis in actuality, abstract,<br />
Rev Rom Parazitol. 2008. XVIII, Supliment,<br />
204.<br />
50. Zurac Sabina, Zaharia Anca, Micu Gianina,<br />
Lavric Luciana, Tudose Irina, Preda Georgeta,<br />
Stăniceanu Florica, Giurcaneanu C. Leishmanioza<br />
cutanată – probleme de diagnostic diferenţial, The<br />
XXXVIth Nat Sympos Normal and Pathol Morphol.<br />
(abstract) 2005. 99.<br />
51. Dancesco P. Les espèces de phlébotomes (Diptera:<br />
Psychodidae) de Roumanie, certains aspects de leur<br />
écologie et nouvelles stations de capture, Trav Mus<br />
Nat Hist Nat «Gr. Antipa» 2008. LI, 185–199.<br />
55
DOUÃ RAPOARTe De CAZURI De LeIsHMANIOZÃ<br />
DIAGNOsTICATe ÎN ROMâNIA<br />
Marian Ghervan Gogoaşe 1 , Irina Teodorescu 2 *,<br />
Carmen Preda 1 , Simona Claudia Ionescu 3<br />
1 institutul Clinic Fundeni, 2 Universitatea din bucureşti, Facultatea de biologie, România<br />
3 spitalul Clinic de boli infecþioase şi tropicale „victor babeş“, bucureşti, România<br />
ReZUMAT<br />
În Institutul Clinic Fundeni au fost detectate două cazuri de leishmanioză viscerală produse de o specie<br />
din complexul Leishmania donovani. Într-unul dintre cazuri, pot fi presupuse două posibilităţi de infestare:<br />
în Italia, unde pacientul a lucrat cu trei ani în urmă, sau în România (judeţul Dolj) unde locuieşte<br />
şi unde, în trecut, au mai fost înregistrate unele cazuri de leishmanioză umană şi canină. În celălalt<br />
caz, pacientul locuia în nord-estul ţării (judeţul Iaşi), dar a lucrat în zona de sud-vest a României. În<br />
ambele cazuri există deci posibilitatea unei transmisii locale, care în viitor ar putea fi amplificată şi<br />
extinsă dacă se continuă procesul de creştere a valorilor temperaturii, care favorizează speciile vectoare<br />
autohtone şi alohtone de Phlebotomus.<br />
Cuvinte cheie: leishmaniozã visceralã, Leishmania, România<br />
INTRODUCERE<br />
Leishmanioza umană este una dintre cele mai<br />
importante boli cu transmisie vectorială, endemică<br />
în 88 de ţări (16 “dezvoltate” şi 72 “în curs de dezvoltare”)<br />
[1], cauzată de mai mult de 20 de specii şi<br />
tulpini, imposibil de distins morfologic, din genul de<br />
protozoare flagelate intracelulare Leishmania, subgenul<br />
Leishmania (Kinetoplastida, Trypanosomatidae).<br />
Organizaţia Mondială a Sănătăţii a clasificat-o<br />
în topul primelor zece maladii infecţioase [2] cu risc<br />
de mortalitate (OMS, 2001; 2010). Circa 350 de milioane<br />
de persoane sunt expuse riscului de infecţie,<br />
cu o incidenţă anuală globală de 1-1,5 milioane pentru<br />
leishmanioza cutanată şi 500.000 pentru cea viscerală,<br />
cu circa 50 de mii de decese [3].<br />
Manifes tările clinice ale bolii se înscriu în trei forme<br />
majore: viscerale, cutaneo-mucoase şi cutanate (conform<br />
celui de al VII-a Raport de Cercetare privind<br />
Bolile Tropicale), uneori cu tablou diseminat.<br />
Agentul etiologic al leishmaniozei viscerale este<br />
complexul Leishmania Leishmania donovani, care<br />
conform studiilor anterioare cuprinde patru specii:<br />
L. (L.) donovani sensu stricto, L. (L.) infantum, L.<br />
(L.) chagasi şi L. (L.) archibaldi. În studiile recente,<br />
sunt considerate trei specii: L. (L.) donovani sensu<br />
stricto, în Africa de Est, L. (L.) infantum în Europa,<br />
Africa, China, America Latină (în ultima regiune numită<br />
L. chagasi) şi L. (L.) archibaldi în Africa de Est<br />
[4]. Alţi autori consideră două specii: L. (L.) infantum,<br />
în Europa, nordul Africii, America de Sud şi<br />
Centrală, şi L. (L.) donovani sensu stricto, în estul<br />
Africii, India şi părţi din Orientul Mijlociu [5]. În<br />
genul Leishmania, subgenul Leishmania, au fost stabilite<br />
cinci specii: L. (L.) donovani, L. (L.) major, L.<br />
(L.) tropica, şi L. (L.) mexicana [6]. În specia L. (L.)<br />
donovani este inclusă şi specia L. (L.) donovani infantum.<br />
Leishmanioza viscerală (LV) este o infecţie<br />
oportunistă asociată cu diferite condiţii de imunodeficienţă:<br />
infecţie cu HIV, neoplasme, transplant de<br />
organe şi tratament pe termen lung cu medicamente<br />
imunosupresoare. LV este o complicaţie frecventă la<br />
pacienţii cu SIDA care trăiesc în zone endemice pentru<br />
Leishmania [7]. Coinfecţia cu Leishmania şi virusul<br />
imunodeficienţei umane (HIV) [8, 9], ambele<br />
infectând macrofagele, duce la o creştere drastică a<br />
severităţii cazurilor de leishmanioză. Primul caz de<br />
leishmanioză asociat cu HIV a fost raportat în 1985,<br />
iar ulterior mai multe cazuri de coinfecţie au fost ra-<br />
*autor corespondent: irina teodorescu, Universitatea din bucureşti, Facultatea de biologie, România, e-mail: teodorescubiologie@yahoo.com<br />
56
Douã rapoarte de cazuri de leishmaniozã diagnosticate în România<br />
portate din peste 35 de ţări din întreaga lume, majoritatea<br />
în sud-vestul Europei [10, 11, 12]. Această coinfecţie<br />
a devenit endemică în multe zone din sudul<br />
Europei, mai mult de 25-75% din cazurile de leish -<br />
manioză viscerală fiind detectate la adulţi infectaţi<br />
cu HIV [13]. La persoanele cu imunodepresie<br />
(SIDA), leishmanioza, iniţial asimptomatică, poate<br />
evolua către forme clinice severe, coinfecţia accelerând<br />
şi agravând atât SIDA, cât şi simptomele leish -<br />
maniozei. Conform Organizaţiei Mondiale a<br />
Sănătăţii (2012) „Cele două boli se susţin reciproc:<br />
persoanele infectate cu HIV sunt deosebit de vulnerabile<br />
la LV, în timp ce LV accelereaza replicarea<br />
HIV şi progresia infecţiei către SIDA”. Această coinfecţie<br />
ar putea avea consecinţe majore şi pentru<br />
băncile de sânge. A fost demonstrat că donatorii de<br />
sânge asimptomatici care trăiesc în sudul Franţei au<br />
avut seropozitivitate pentru leishmanioză de 3,4%,<br />
în Grecia de 15% şi în Spania, 22,1% [14, 15, 16].<br />
Vectorii pentru speciile de Leishmania sunt Dipterele<br />
Psychodidae (muşte de nisip) care în Europa,<br />
Africa şi Asia aparţin genului Phlebotomus şi în<br />
America, genului Lutzomyia [17, 18].<br />
În sudul Europei sunt prezente leishmanioza<br />
viscerală (cu numeroase cazuri, periculoase şi letale<br />
dacă nu sunt tratate) şi leishmanioza cutanată (mai<br />
benignă) [19]. Incidenţa leishmaniozei umane este<br />
relativ scăzută (8,53 de cazuri la 100.000 de persoane,<br />
cele mai multe cazuri fiind înregistrate în Turcia).Cazuri<br />
de LV au fost raportate în Albania,<br />
Bosnia, Croaţia, Cipru, Franţa (regiunile de sud),<br />
Grecia, Ungaria, Macedonia, Malta, Muntenegru,<br />
Portugalia, România, Spania, Serbia şi Muntenegru<br />
şi Turcia. În ultimul timp, LV s-a răspândit spre nord,<br />
aşa cum se arată în rapoartele recente referitoare la<br />
cazuri indigene din nordul Italiei şi sudul Germaniei.<br />
În fiecare an, au fost raportate aproximativ 3.950 de<br />
cazuri umane autohtone (700 exclusiv Turcia), dar la<br />
fiecare caz simptomatic au fost estimate 30-100 cazuri<br />
asimptomatice [20]. În ultimii ani, a crescut proporţia<br />
cazurilor de leishmanioză viscerală la adulţi<br />
(în special HIV-pozitivi, dar şi la persoane HIV-negative),<br />
în timp ce în trecut, aceasta boală era caracteristică<br />
pentru copii [21]. Primele cazuri autohtone<br />
din Europa, considerate ca fiind infecţii cu L. donovani,<br />
au fost detectate în Cipru [22, 23].<br />
L. (L.) infantum infectează şi câinii, reprezentând<br />
o cauză importantă de mortalitate (cu o seroprevalenţă<br />
de până la 25% în sudul Europei, până la<br />
34% în zone foarte endemice din Spania [24], şi<br />
aproximativ 5.000 de cazuri clinice în fiecare an în<br />
Franţa). Câinii, simptomatici sau asimptomatici [25]<br />
constituie un important rezervor pentru acest parazit,<br />
de la care vectorii din genul Phlebotomus se pot infecta<br />
şi transmit infecţia la om [26-30]. Un alt risc<br />
este reprezentat de posibilitatea ca L. (L). infantum<br />
să fie exportată în afara Europei prin câinii infectaţi.<br />
Cazuri de leishmanioză cutanată cu L. (L.)<br />
major, L. (L.) tropica şi chiar L. (L.) infantum ca<br />
agenţi etiologici au fost raportate în Albania, Austria,<br />
Bosnia şi Herţegovina, Bulgaria, Croaţia, Cipru,<br />
Franţa, Grecia, Italia, Malta, Monaco, Portugalia,<br />
România, Spania (inclusiv Insulele Canare), Serbia<br />
şi Muntenegru.<br />
În România, Olteanu şi colab. [31, 32] au menţionat<br />
unii autori (Copăceanu et al, 1955; Bârzu et<br />
al, 1956; Lupaşcu et al, 1963; Zaharia, 1972; Wahirapp<br />
et al, 1976; Diaconu, 1981) care au diagnosticat<br />
leishmanioză viscerală şi cutanată. Alte relatări referitoare<br />
la leishmanioză în România au fost făcute<br />
între 1919 şi 1958 [33, 34, 35]. Au fost de asemenea<br />
recent detectate unele cazuri de leishmanioză viscerală<br />
şi cutanată de import (la călători sau lucrători în<br />
zone endemice) [36-50].<br />
MATERIALE ŞI METODE<br />
Investigaţiile au fost efectuate la doi pacienţi internaţi<br />
în 2007 la Institutul Clinic Fundeni. Examenele<br />
citologice şi histologice ale biopsiei hepatice au<br />
fost efectuate pe preparate colorate Van Gieson, coroborate<br />
cu rezultatele investigaţiilor clinice, cum ar<br />
fi examene fizice, biochimice, hematologice, ultrasonografie<br />
abdominală, radiografii toracice şi teste<br />
bacteriologice. Anamneza a oferit şi informaţii epidemiologice.<br />
REZULTATE<br />
Cazul I<br />
Pacient de sex masculin de 23 de ani, din Radovan,<br />
judetul Dolj, care a lucrat în Italia cu trei ani în<br />
urmă, a fost internat la Institutul Clinic Fundeni acuzând<br />
durere în hipocondrul stâng abdominal de o<br />
lună, descrisă ca o senzaţie de înţepătură şi durere<br />
apărută la efort în hipocondrul drept, însoţite de pierdere<br />
marcată în greutate (16 kg). La diagnosticul preliminar,<br />
au fost luate în consideraţie leptospiroza şi<br />
septicemia secundară unei orhiepididimite acute.<br />
Rezultate de laborator şi investigaţii specifice:<br />
i) hemoleucograma a evidenţiat pancitopenie<br />
(leucocite 2.600, hemoglobina 8,0 g/dl, trombocite<br />
81.000), cu anizocitoză moderată (microcite), hipocromie<br />
moderată şi eritrocite în „ochi de bou”, cu o<br />
tendinţă de formare de cilindri; ii) VSH 50 mm/oră;<br />
57
GHERVAN GOGOAŞE et al.<br />
iii), fibrinogen normal; iv) valori crescute ale enzimelor<br />
hepatice: GGT = 201 μ /1, ALT = 154 μ / 1.<br />
Hemocultura a fost pozitivă cu stafilococi coagulazo-negativi,<br />
RPR negativ, formula leucocitară:<br />
neutrofile 47%, limfocite 45%, monocite 2%, mielocite<br />
6%, VHB şi VHC negativ, IgG anti-CMV<br />
151.3/15 (pozitiv) şi IgM anti-CMV 0.190/0.500<br />
(negativ).<br />
Ultrasonografia abdominală a relevat steatoză<br />
hepatică de gradul I cu structură hiperechoică, cu caracter<br />
granular, axa spleno-portală, vezica biliară şi<br />
pancreasul în limite normale, splina cu aspect neregulat,<br />
cu vene uşor extinse în hilus, fără ascită în peritoneu,<br />
spaţiul retroperitoneal normal. Radiografia<br />
toracică era normală.<br />
Biopsia măduvei osoase din osul iliac a arătat<br />
celularitate bogată, cu predominanţa granulocitelor<br />
mature, frecvente limfocite mature (17%) şi frecvente<br />
plasmocite reactive (6%). Linia de celule roşii<br />
a fost normoblastică. Au fost evidenţiate megacariocite,<br />
cu trombocitoformare uşor redusă. Biopsia de<br />
măduvă osoasă a evidenţiat o măduvă hipercelulară<br />
cu o uşoară plasmocitoză.<br />
Biopsia hepatică (fragment de ~ 8mm lungime)<br />
a evidenţiat prezenţa unui ţesut hepatic cu arhitectură<br />
lobulară normală, cu spaţiile portale moderat mărite,<br />
cu granulom de infiltrat inflamator limfo-plasmocitar<br />
şi rare celule epitelioide şi celule gigante multinucleate,<br />
fără fibroză portală, cu rare imagini de<br />
hemofagocitoză. Intralobular s-a evidenţiat infiltrat<br />
intrasinusoidal cronic, hipertrofia şi hiperplazia celulelor<br />
Kupffer, granuloame formate din macrofage<br />
şi celule epitelioide. Au fost vizibile foarte mici incluziuni<br />
bazofile macrofagocitice (1-2 microni in<br />
diametru), unele cu un halou clar, indicând prezenţa<br />
amastigoţilor de Leishmania spp. (Fig. 1, 2<br />
şi 3).<br />
Cazul II<br />
Pacient de sex masculin de 35 de ani, cu domiciliul<br />
în Româneşti, judeţul Iaşi, a fost internat în Clinica<br />
de Gastroenterologie a Institutului Clinic<br />
Fundeni în urma unui transfer de la o clinică de boli<br />
infecţioase din Iaşi, unde pacientul a fost spitalizat<br />
o lună, cu un sindrom febril prelungit (40-41 0 C), fără<br />
răspuns la antibioterapie intravenoasă. Diagnosticul<br />
preliminar a fost de splenomegalie cu hipersplenism,<br />
cu suspiciune de chist hidatic splenic. După zece zile<br />
de investigaţii şi antibioterapie intravenoasă din<br />
cauza unui debut de insuficienţă respiratorie hipoxemică,<br />
pacientul a fost internat la terapie intensivă.<br />
La admiterea în terapie intensivă, pacientul a fost febril<br />
(39,6 0 C), polipneic şi tahicardic, cu icter şi echimoze<br />
la locul puncţiei venoase.<br />
Rezultate de laborator şi investigaţii specifice:<br />
hemoleucograma a evidenţiat pancitopenie severă<br />
cu 1.200 de leucocite, anemie cu hemoglobină<br />
6,3 g/dl şi niveluri foarte ridicate ale enzimelor hepatice,<br />
ESR 1 LOmm/oră, trombocitopenie de<br />
14.000. Examenul microscopic al ţesutului hepa-<br />
Fig. 1 - Biopsie de ţesut hepatic: histiocite cu amastigote de Leishmania<br />
(ob. 100× imersie, frotiu Giemsa)<br />
58
Douã rapoarte de cazuri de leishmaniozã diagnosticate în România<br />
Fig. 2 - Biopsie de ţesut hepatic: histiocite cu amastigote de Leishmania<br />
(ob. 100× imersie, frotiu Giemsa)<br />
tic a relevat prezenţa de incluziuni bazofile, caracteristică<br />
pentru infecţia cu Leishmania spp.<br />
Serologia pentru Leishmania (efectuată la Spitalul<br />
Clinic de Boli Infecţioase şi Tropicale „Dr. Victor<br />
Babeş”) a fost pozitivă, confirmând infecţia. Insuficienţă<br />
renală acută a debutat după patru zile de tratament,<br />
cu semne de necroză tubulară acută.<br />
Funcţiile renale au revenit la normal prin hemofiltrare<br />
şi hemodializă, ca şi funcţiile hepatice. În timpul<br />
spitalizării, după ce starea pacientului s-a<br />
îmbunătăţit, s-a efectuat o splenectomie pentru un<br />
chist hidatic splenic de dimensiuni mari (inactivare,<br />
evacuare, pericistectomie). Polineuropatia cu tetraplegie<br />
a persistat şi starea neurologică s-a înrăutăţit.<br />
Fig. 3 - Biopsie de ţesut hepatic: histiocite cu amastigote de Leishmania<br />
(ob. 100× imersie, frotiu Giemsa) (procesare digitală)<br />
59
GHERVAN GOGOAŞE et al.<br />
Pacientul a dezvoltat un sepsis sever din cauza pneumoniei<br />
de ventilaţie, cu insuficienţă renală acută şi<br />
exitus.<br />
DISCUÞII<br />
Caracteristicile tipice, clinice şi de laborator<br />
pentru leishmanioză viscerală includ febră mare,<br />
hepatosplenomegalie, pancitopenie şi hipergamaglobulinemie,<br />
implicând majoritatea organelor.<br />
În cazul primului pacient, care a lucrat în Italia,<br />
pot fi luate în consideraţie două posibilităţi de infecţie:<br />
din Italia, o zonă endemică pentru leishmanioză,<br />
sau contaminare de la o sursă autohtonă, adică în Oltenia,<br />
unde trăia pacientul. În apropierea Craiovei,<br />
în sud-vestul judeţului Dolj, au fost înregistrate câteva<br />
cazuri de leishmanioză umană, în 1912, 1945,<br />
1953-1954 şi în judeţul Caraş-Severin au fost semnalate<br />
unele cazuri de leishmanioză canină, în 1929<br />
şi 1957. În aceste zone a fost semnalată de asemenea<br />
prezenţa unor specii de Phlebotomus posibili vectori<br />
pentru Leishmania [51].<br />
Pentru al doilea pacient, care locuia în zona de<br />
nord-est a ţării (judeţul Iaşi), nici o sursă de infecţie<br />
locală nu este documentată, dar acesta a lucrat în<br />
zona de sud-vest a României, unde au fost semnalate<br />
cazuri de leishmanioză umană, aşa că ar putea fi<br />
luată în considerare posibilitatea existenţei unei<br />
surse autohtone de infecţie.<br />
CONCLUZII<br />
În Institutul Clinic Fundeni au fost investigate<br />
două cazuri de leishmanioză viscerală. Deşi într-unul<br />
dintre cazuri este probabilă o leishmanioză de import,<br />
în ambele cazuri poate fi luată în considerare şi<br />
o sursă autohtonă de infecţie (în zona de sud-vest a<br />
României).<br />
La pacientul care a lucrat în Italia, prezentarea<br />
clinică sugestivă, asociată cu istoricul său de călătorie<br />
a putut conduce la un diagnostic rapid de leish -<br />
manioză viscerală. Rezultatele de laborator şi alte<br />
investigaţii specifice (sindrom febril, pancitopenie,<br />
incluziuni bazofile de 1-2 microni în ţesutul hepatic<br />
care indică prezenţa amastigoţilor de Leishmania<br />
spp.) au confirmat diagnosticul.<br />
În cazul celui de-al doilea pacient, rezident în<br />
zona de nord-est a ţării (judeţul Iaşi), examenul microscopic<br />
al ţesutului hepatic a indicat prezenţa<br />
amastigoţilor de Leishmania spp., infecţia fiind<br />
confirmată şi serologic. Leishmanioza cu febră<br />
foarte ridicată, pancitopenie şi anemie severe, însoţită<br />
de alte semne clinice (insuficienţă respiratorie<br />
hipoxemică, chist hidatic splenic mare şi splenectomia<br />
consecutivă, insuficienţa renală acută cu necroză<br />
tubulară, infecţia pulmonară şi sepsisul sever) au generat<br />
un prognostic sever şi decesul.<br />
Cele două cazuri diagnosticate reprezintă un<br />
semnal de alarmă, deoarece în contextul schimbărilor<br />
climatice globale, cu o tendinţă de încălzire continuă,<br />
care favorizează înmulţirea speciilor autohtone<br />
de Phlebotomus, dar şi posibilitatea de penetrare în<br />
România a altor specii de Phlebotomus care sunt<br />
vectori pentru Leishmania, creşte riscul ca România<br />
să devină o zonă endemică pentru leishmanioză.<br />
BIBLIOGRAFIE<br />
1. Desjeux P, Alvar J. Leishmania/HIV co-infections:<br />
epidemiology in Europe, Ann Trop Med Parasit. 2003.<br />
97 (1): 3-15.<br />
2. World Health Organization. WHO Techical Report Series:<br />
control of the leishmaniasis. Report of a meeting<br />
of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniases.<br />
World Health Organization: Geneva; 22-26<br />
March 2010.<br />
3. Ezra N, Ochoa Maria Teresa, Craft N. Human Immu -<br />
nodeficiency Virus and Leishmaniasis, J Glob Infect Dis.<br />
2010. 2 (3): 248–257. doi: 10.4103/0974-777X.68528.<br />
4. Quispe-Tintaya, KW, Laurent T, Decuypere Saskia,<br />
Hide Mallorie, Banuls Anne-Laure, De Doncker Simonne,<br />
Rijal S, Canavate Carmen, Campino L, Dujardin1<br />
J-C. Fluorogenic Assay for Molecular Typing<br />
of the Leishmania donovani Complex: Taxonomic and<br />
Cli nical Applications, The Jour Inf Dis. 2005. 192: 685–<br />
692.<br />
5. Lukeš J, Mauricio L Isabel, Schönian Gabriele, Dujardin<br />
J-Cl, Soteriadou Ketty, Dedet J P, Kuhls Katrin,<br />
Quispe Tintaya K W, Jirků M, Chocholová<br />
Eva, Haralambous C, Pratlong Francine, Oborník<br />
M, Horák A, Ayala F J, Miles M A. Evolutionary and<br />
geographical history of the Leishmania donovani complex<br />
with a revision of current taxonomy, Proc Nat<br />
Acad Sci USA. 2007. 104 (22): 9375-9380.<br />
6. Fraga J, Montalvo A M, De Doncker S, Dujardin J<br />
C, Van der Auwera G. Phylogeny of Leishmania species<br />
based on the heat-shock protein 70 gene, Infect<br />
Genet Evol. 2010. 10 (2): 238-245. doi: 10.1016/ j.meegid.2009.11.007.<br />
Epub 2009 Nov 11.<br />
7. Cota F Glaucia, de Sousa M R, Rabello Ana. Predictors<br />
of Visceral Leishmaniasis Relapse in HIV-Infected<br />
Patients: A Systematic Review. PLOS Neg Trop Dis.<br />
2011. 5, 6: e1153. doi:10.1371/journal.pntd.0001153.<br />
8. Agostoni C, Dorigoni N, Malfitano A, Caggese L,<br />
Marchetti G, Corona S, Gatti S, Scaglia M. Mediterranean<br />
leishmaniasis in HIV–infected patient: epidemiological,<br />
clinical, and diagnostic features of 22 cases.<br />
Infection, 1998. 26, 2, 93-9.<br />
9. Leishmaniasis and HIV coinfection WHO 2012<br />
http://www.who.int/leishmaniasis/burden/hiv_coinfection/burden_<br />
hiv_coinfection/en/index.html.<br />
60
Douã rapoarte de cazuri de leishmaniozã diagnosticate în România<br />
10. Alvar J, Canavate C, Gutierrez-Solar B, Jimenez<br />
M, Laguna F, Lopez-Velez R, Molona R, Moreno<br />
J. Leishmania and human immunodeficiency virus coinfection:<br />
the first years, Clin Microbiol Rev. 1997.<br />
10, 2, 298-319.<br />
11. Desjeux P, Alvar J, Leishmania/HIV co-infections:<br />
epidemiology in Europe, Ann Trop Med Parasit. 2003.<br />
97, Suppl. 1, 3–15.<br />
12. Gradoni L, Gaeta G B, Pellizzer G, Maisto A, Scalone<br />
A. Mediterranean visceral leishmaniasis in pregnancy,<br />
Scand Journ Inf Dis. 1994. 26 (5): 627-629.<br />
13. Maguire J H, Leishmania, a Parasite on the Move, in<br />
Scheld W M, Craig W A, Hughes J M. Emerg Inf.<br />
1999. 99-111, ASM Press, Washington D.C.<br />
14. Le Fichoux Y, Quaranta J G, Aufeuvre J P, Lelievre<br />
A, Marty P, Suffia I. Occurrence of Leishmania<br />
infantum parasitemia in asymptomatic blood donors<br />
living in an area of endemicity in southern France, J<br />
Clin Microbiol. 1999. 37: 1953–1957.<br />
15. Riera Cristina, Fisa R, Udina M, Gállego M, Portus<br />
M. Detection of Leishmania infantum cryptic infection<br />
in asymptomatic blood donors living in an<br />
endemic area (Balearic Islands, Spain) by different<br />
diagnostic methods. Trans R Soc Trop Med Hyg. 2004.<br />
98: 102-110. http://dx.doi.org/101016/S0035-<br />
9203(03)0015-4.<br />
16. Riera Cristina, Fisa R, López-Chejade P, Serra Teresa,<br />
Girona E, Jiménez MaTeresa, Muncunill J,<br />
Sedeño Matilde, Mascaró M, Udina Maria, Gállego<br />
M, Carrió J, Forteza A, Portús M. Asymptomatic<br />
infection by Leishmania infantum in blood donors<br />
from the Balearic Islands (Spain), Transfusion, 2008.<br />
48 (7): 1383-1389. DOI: 10.1111/j.1537-<br />
2995.2008.01708.x.<br />
17. Killick-Kendrick R. Phlebotomine vectors of the<br />
leishmaniases: a review, Med Vet Entomol. 1990. 4<br />
(1): 1-24.<br />
18. Nicolescu Gabriela. Flebotomii, in Insecte vectoare<br />
şi generatoare de disconfort, Edit Med Bucureşti,<br />
1986. 137-146.<br />
19. Ready P D. Leishmaniasis emergence in Europe. Euro<br />
Surveill. 2010. 15 (10): pii = 19505. Available online:<br />
http://www.eurosurveillance. org/ViewArticle<br />
.aspx?ArticleId=19505.<br />
20. Dujardin J-C, Campino L, Canavate Carmen,<br />
Dedet J-P, Gradoni L, Soteriadou Ketty, Mazeris<br />
A, Ozbel Y, Boelaert Marleen. Spread of vectorborne<br />
diseases and neglect of leishmaniasis, Europe,<br />
Emerg Inf Dis. 2008. 14, 7.<br />
21. Lindgren Elisabeth, Naucke T, Menne Bettina.<br />
Leishmaniasis in Europe, Sc Work Group, Report on<br />
Leishmaniasis, Geneva, WHO on behalf of the Special<br />
Programme for Research and Training in Tropical Diseases,<br />
2004. http://www.who.int/ tdr/publications/publications/swg_leish.htm.<br />
22. Antoniou M, Haralambous C, Mazeris A, Pratlong<br />
F, Dedet J-P, Soteriadou K. Leishmania donovani<br />
leishmaniasis in Cyprus. Lancet Infect Dis. 2008. 8,<br />
6-7.<br />
23. Antoniou M, Messaritakis I, Christodoulou V, Ascoksilaki<br />
I, Kanavakis N, Sutton A J, Carson C,<br />
Courtenay O, Increasing incidence of zoonotic visceral<br />
leishmaniasis on Crete, Greece, Emerg Infect<br />
Dis. 2009. 15 (6): 932-934.<br />
24. Martín-Sánchez Joaquina, Morales-Yuste M,<br />
Acedo-Sánchez Carmen, Barón S, Díaz V, Morillas-Márquez<br />
F. Canine Leishmaniasis in Southeastern<br />
Spain, Emerg Inf Dis. 2009. 15 (5): 795–798.<br />
25. Razzaghi Maensh M, Mahabadi S, Ghamesi A,<br />
Namjoo A R. Prevalence of canine visceral leishmaniasis<br />
in dogs at Adrestan District detected by PCR,<br />
Veter Res. 2012. 5: 22-25, DOI: 10.3923/<br />
vr.2012.22.25, http://medwelljournals.com /abstract<br />
/?doi= vr.2012.22.25<br />
26. Chamaillé Lise, Tran Annelise, Meunier Anne,<br />
Bourdoiseau G, Ready P, Dedet J-P. Environmental<br />
risk mapping of canine leishmaniasis in France, Paras<br />
& Vect, 2010. 3: 31 doi:10.1186/1756-3305-3-31<br />
http://www.parasitesandvectors. com/content/ 3/1/31<br />
27. Cortes S, Vaz Y, Neves R, Maia C, Cardoso L,<br />
Campino L. Risk factors for canine leishmaniasis in<br />
an endemic Mediterranean region. Vet Parasitol. 2012.<br />
189 (2-4): 189-196. doi: 10.1016/j.vetpar.<br />
2012.04.028.<br />
28. Dereure J, Vanwambeke S O, Malé P, Martinez S,<br />
Pratlong F, Balard Y, Dedet J P. The potential effects<br />
of global warming on changes in canine leishmaniasis<br />
in a focus outside the classical area of the<br />
disease in southern France, Vect Borne Zoonotic Dis.<br />
2009. 9 (6): 687-694.<br />
29. Ferroglio E, Maroli M, Gastaldo S, Mignone W,<br />
Rossi L. Canine leishmaniasis, Italy. Emerg Infect Dis.<br />
2005. [serial on the Internet]. http://dx.doi.org/<br />
10.3201/eid1110.040966 DOI: 10.3201/<br />
eid1110.040966.<br />
30. Tánczos B, Balogh N, Király L, Biksi I, Szeredi L,<br />
Gyurkovsky M, Scalone A, Fiorentino E, Gramiccia<br />
M, Farkas R. First record of autochthonous canine<br />
leishmaniasis in Hungary. Vect Born Zoon Dis.<br />
2012. 12 (7): 588-594. doi: 10.1089/vbz.2011.0906.<br />
Epub 2012 May 18 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed22607079.<br />
31. Olteanu Gh, Panaitescu D, Gherman I, Şuteu I,<br />
Cosoroabă I, Rădulescu Simona, Fazakaş B, Codreanu-Bălcescu<br />
Doina, Sârbu V, Popârlan N, Brănescu<br />
Viorica, Nicolae St, Ionescu V, Barcan<br />
Marilena, Mitrea L I, Ciucă N, Ştefănoiu V, Cristea<br />
Gh, Pavel Agneta. Parazitozoonoze, Probleme la sfârşit<br />
de mileniu în România, 1999. Edit Viaţa Med Rom,<br />
Bucureşti.<br />
32. Olteanu Gh, Panaitescu D, Gherman I, Zgardan<br />
E, Apatenko V, Fazakaş B, Codreanu-Bălcescu<br />
Doina, Teodorescu Irina, Iacobiciu I, Tălămbuţă<br />
Nina, Erhan D, Marx Madeleine, Cristea Gh, Junie<br />
Monica, Doicescu D. Poliparazitismul la om, animale<br />
şi plante, 2001. Edit Ceres, Bucureşti.<br />
33. Gherman I, Zaharia A L Const, Bîrzu I, Popescu<br />
Gh, Tiereanu E. Considerații epidemiologice asupra<br />
primului episod epidemic de leishmanioză infantilă în<br />
țara noastră, Microb Parazit şi Epid. 1957. 6, 556-560.<br />
34. Manicatide M. Sur deux cas de Kala-azar observés<br />
en Roumanie, Bull Sect Scient Acad Roum. VI-eme<br />
Annee, 1919/1920, 5-6, 105 -112.<br />
61
GHERVAN GOGOAŞE et al.<br />
35. Minculescu M, Bîrzu I, Creţu S, Iovănescu F, Ionescu<br />
D, Lupulescu V, Michel G, Paulon S, Rotaru<br />
A, Rusovici I, Zaharia C. The first focus of infantile<br />
leishmaniasis identified in the Rumanian People’s Republic,<br />
Stud. şi cercet inframicrobiol. 1955. 6 (3-4):<br />
595-603.<br />
36. Ardeleanu Carmen, Zurac Sabina, Zaharia Anca,<br />
Vrabie Alexandra, Lavric Luciana, Andrei R, Stăniceanu<br />
Florica, Giurcăneanu C. Leishmanioza cutanată<br />
– probleme de diagnostic diferenţial, Terapeut,<br />
farmacol şi toxicol clinic. 2005. IX, 4, 99-103.<br />
37. Balea M L A, Guran M, Balea M I, Răzvan A.<br />
Diagnostic difficulties in imported leishmaniasis in<br />
Romania, 12 th Congr Europ Hematol Assoc. 2007.<br />
38. Boda D, Cilievici Suzana, Diaconescu Adriana,<br />
Costache Mariana, Popescu Sanda. Leishmanioză<br />
cutanată la o fetiţă de 12 ani, Dermatovenerol. 2001.<br />
46, 4, 283.<br />
39. Erscoiu Simona, Voinea Cristina, Florescu S,<br />
Ceauşu E. Imported visceral leihmaniosis in Romania,<br />
Rev Rom Parazitol, 2004. XIV, 1, 89-91.<br />
40. Florescu S, Popescu C, Cotiga M, Răduţă L, Botgros<br />
R, Voinea C, Erscoiu S, Ceauşu E, Calistru P.<br />
Visceral leishmaniasis cases in Romania, 17th Europ<br />
Congr Clin Microbiol and Inf Dis. ICC, Munich, Germany.<br />
2007.<br />
41. Florescu S, Ceauşu E, Calistru P, Voinea Cristina,<br />
Turcu (Mozes) Elena, Nica Maria, Popescu C,<br />
Păun L. Imported tropical pathology in Romania in<br />
the last 11 years, Rev Rom de boli infecţioase, 2010.<br />
XIII, 1, 11-15.<br />
42. Găman Amelia, Dobrea Camelia, Găman G. A case<br />
of visceral leishmaniasis in Oltenia region (Romania),<br />
Rom Journ Morphol and Embryol. 2010. 51 (2): 391–<br />
394.<br />
43. Halichidis Stela, Rugină S, Dumea Elena. Leishmaniasis<br />
in travellers in endemic areas, 16th Europ Congr<br />
of Clin Microbiol and Infect Dis. Nice, France, April<br />
1-4. 2006.<br />
44. Ioncică N, Bărbulescu C M, Mertoiu G, Ciucă N.<br />
The statistic studying of the leishmaniosis in the Dobrogea<br />
area, between 2000-2005 (abstract), Rev Rom<br />
Parazitol. 2007. XVIII, 95.<br />
45. Lazăr Lidia, Schilo E A, Leventer Mihaela. Ecoepidemilogical<br />
and clinico-therapeurtic assessment on<br />
cutaneous leishmaniosis in Romania and Israel: case<br />
studies (abstract) Rev Rom Parazitol. 2008. XVIII,<br />
128-129.<br />
46. Neghină R, Neghină Adriana-Maria, Merkler Carmen,<br />
Marincu I, Moldovan Roxana, Iacobiciu I.<br />
Importation of visceral leishmaniasis in returning Romanian<br />
workers from Spain, Travel Med and Infect<br />
Dis. 2009. 7 (1): 35-39.<br />
47. Oniţă M, Hornung Edith, Ciobanu C, Sârbu A E,<br />
Olariu Teodora, Oniţă C, Stoica A L. Visceral leishmaniasis-surgical<br />
aspects, Chirurgia, 2006.101 (3):<br />
335-339.<br />
48. Patiu Mariana, Telcian Aurica, Petraşcu Mirela,<br />
Cucuianu A. Visceral leishmaniosis-a case presentation,<br />
Rev Rom Parazitol. (abstract) 2007. XVIII, Supliment,<br />
146.<br />
49. Rugină S, Dumitru Irina Magdalena, Cernat Ro -<br />
xa na Carmen. Visceral leishmaniosis in actuality, abstract,<br />
Rev Rom Parazitol. 2008. XVIII, Supliment, 204.<br />
50. Zurac Sabina, Zaharia Anca, Micu Gianina, Lavric<br />
Luciana, Tudose Irina, Preda Georgeta, Stăniceanu<br />
Florica, Giurcaneanu C. Leishmanioza<br />
cutanată – probleme de diagnostic diferenţial, The<br />
XXXVIth Nat Sympos Normal and Pathol Morphol.<br />
(abstract) 2005. 99.<br />
51. Dancesco P. Les espèces de phlébotomes (Diptera:<br />
Psychodidae) de Roumanie, certains aspects de leur<br />
écologie et nouvelles stations de capture, Trav Mus<br />
Nat Hist Nat «Gr. Antipa» 2008. LI, 185–199.<br />
62
ADeNYLATe CYCLAses INVOLVeMeNT IN PATHOGeNICITY,<br />
A MINIReVIeW<br />
Adriana Costache*, Nadia Bucurenci, Adrian Onu<br />
Laboratory of Enzymologyy and applied microbiology, Cantacuzino national institute<br />
of Research-development for microbiology and immunology, bucharest, Romania<br />
ABsTRACT<br />
Cyclic AMP (cAMP), one of the most important secondary messengers, is produced by adenylate cyclase<br />
(AC) from adenosine triphosphate (ATP). AC is a widespread enzyme, being present both in<br />
prokaryotes and eukaryotes. Although they have the same enzymatic activity (ATP cyclization), the<br />
structure of these proteins varies, depending on their function and the producing organism. Some<br />
patho genic bacteria utilize these enzymes as toxins which interact with calmodulin (or another eukaryote<br />
activator), causing intense cAMP synthesis and disruption of infected cell functions. In contrast,<br />
other pathogenic bacteria benefit of augmentation of AC activity for their own function.<br />
Based on sequence analysis of AC catalytic domain from two pathogenic bacteria (Bacillus anthracis<br />
and Bordetella pertussis) with known three-dimensional structures, a possible secondary structure for<br />
1-255 amino acid fragment from Pseudomonas aeruginosa AC (with 80 TKGFSVKGKSS 90 as the ATP<br />
binding site) is proposed.<br />
Keywords: adenylate cyclase, calmodulin, cAMP, toxin<br />
INTRODUCTION<br />
Adenylate cyclases (AC) (E.C.4.6.1.1) are ubi -<br />
quitous enzymes responsible for the synthesis of<br />
cyclic AMP (adenosine 3’,5’-cyclic monophosphate,<br />
cAMP) from adenosine triphosphate (ATP).<br />
In eukaryotic cells, cAMP is one of the most important<br />
secondary messengers. It is involved in many<br />
cellular processes and controls cellular functions<br />
such as carbohydrate and lipid metabolism. The<br />
cAMP intracellular concentration is regulated by<br />
adenylate cyclases and phosphodiesterases. Certain<br />
pathogenic bacteria exploit this mechanism by using<br />
ACs as exotoxins to increase concentration of cAMP<br />
in infected cells and thus cause severe metabolic disturbances<br />
and cell death. A well documented case is<br />
that of Bacillus anthracis or Bordetella pertussis<br />
AC, which are injected into eukaryotic cells and activated<br />
by calmodulin (CaM) to generate cAMP.<br />
On the other hand, in many bacteria, cAMP<br />
functions as a regulator of transcription activation<br />
with an important role in microorganism adaptation<br />
and pathogenicity.<br />
ACs have been initially divided into three main<br />
classes, based on sequence similarities [1]:<br />
l Class I (the enterobacterial class) includes entero -<br />
bacterial pathogens such as Escherichia coli, Salmonella<br />
typhimurium and Yersinia pestis and<br />
Gram-negative bacteria (e.g. Vibrio cholerae and<br />
Aeromonas hydrophila) ACs [2];<br />
l Class II includes secreted ACs from pathogenic<br />
bacteria (e.g. Bacillus anthracis, Bordetella pertussis,<br />
Pseudomonas aeruginosa, Yersinia pestis)<br />
as components of toxins;<br />
l Class III includes ACs from many organisms. This<br />
class is the largest and includes enzymes that respond<br />
to extracellular signals: hormones, neurotransmitters,<br />
chemokines etc.;<br />
As genome sequencing progressed, this classification<br />
was extended to six classes:<br />
l Class IV includes AC from Aeromonas hydrophila<br />
[3] and Yersinia pestis [4];<br />
l Class V includes AC from Prevotella ruminicola<br />
(anaerobic bacteria from rumen) [5].<br />
l Class VI includes an AC from Rhizobium etli [6].<br />
*Corresponding author: Adriana Costache, Cantacuzino NIRDMI, Bucharest, Romania, email: adriana_rad@yahoo.com<br />
63
COSTACHE et al.<br />
In this paper we shall focus on the first three<br />
classes of AC.<br />
ADENYLATE CYCLASES FROM GRAM-<br />
NEGATIVE BACTERIA (CLASS I ADENYLATE<br />
CYCLASES)<br />
Many Gram-negative bacteria (e.g. Enterobacteria)<br />
are pathogenic. Unlike other ACs, Class I ACs<br />
are not activated by cellular factors such as CaM.<br />
They have other activators, most of them metabolic<br />
ones, demonstrating their role in their own metabolism.<br />
For instance, full activation of Brevibacterium<br />
liquefaciens AC requires pyruvate and the Esche -<br />
richia coli AC is inhibited by NaF, pyrophosphate,<br />
some nucleoside triphosphate and pyridoxal-phosphate<br />
[7].<br />
The most studied member of this class is the Escherichia<br />
coli AC, encoded by cya gene. There are<br />
three promoters that control Escherichia coli cya<br />
translation. Although cya is poorly translated in vivo<br />
[7], cya promoter activity varies with the environmental<br />
carbon source and, in the presence of large<br />
amounts of exogenous cAMP, it decreases greatly<br />
[8]. AC is also repressed in the presence of cAMP<br />
receptor protein-cAMP complex, that binds to the<br />
operator region of the promoter cyaP2 [9]. However,<br />
the cells require a very strict control of cya expression,<br />
as an increase of six fold than normal may be<br />
lethal [10].<br />
Escherichia coli AC is a protein with 848 aa and<br />
a pI of 6.1. It has a 395 amino acids N-terminal domain,<br />
which contains the active catalytic center, and<br />
a region corresponding to the C-terminal regulator<br />
domain. In fact, the entire class of enterobacteria AC<br />
shows proteins composed of two functional domains.<br />
The N-terminal part is responsible for the ca -<br />
talytic activity, while the C-terminus is responsible<br />
for glucose-mediated inhibiting activity or other re -<br />
gulatory features. Digestion of this enzyme releases<br />
a 30 kDa fragment with some specific activity. Interestingly,<br />
this fragment does not lose its activity on<br />
freezing, unlike the integral protein [7].<br />
The AC enzymatic activity has a broad range.<br />
The phosphorylated form of III Glc enzyme (a “phosphocarrier”<br />
protein) acts as a stimulating factor. One<br />
explanation might be that phosphorylated III Glc enzyme<br />
(the dephosphorylated form is inactive) phosphorylate,<br />
in turn, an amino acid (probably histidine<br />
or cysteine) from the AC regulator domain, thereby<br />
stopping inhibition [11]. In the absence of glucose,<br />
AC is fully phosphorylated and has high activity.<br />
Comparing different ACs from this class allo -<br />
wed the identification of two conserved histidine and<br />
one of them is presumably phosphorylated. The<br />
presence of a 95 kDa phosphorylated Escherichia<br />
coli protein was not detected.<br />
A RAS-like protein (cyclase activator from Saccharomyces<br />
cerevisiae) exists in Escherichia coli.<br />
Elongation factor Tu, a protein that binds GTP, activates<br />
the Escherichia coli AC, but their interaction<br />
mechanism is not known. This suggests that, as with<br />
most eukaryotes, enterobacteria cyclases seem to be<br />
regulated by G proteins [12].<br />
In Enterobacteriaceae, all the major features of<br />
the Escherichia coli cya gene (such as number of<br />
promoters and genes upstream and downstream) are<br />
preserved. Salmonella typhimurium AC, similar to<br />
Escherichia coli AC, is controlled by three promoters<br />
and is also repressed by cAMP receptor protein<br />
-cAMP complex [13]. Pasteurella multocida’s AC<br />
gene is very similar to that of enterobacteria, but the<br />
local organization of the genes is different. H. influnzae’s<br />
AC gene shows similarities with its counterpart<br />
in Escherichia coli. The data indicate that the activity<br />
regulating mechanism of the AC protein appears<br />
to be conserved in this class. Gene expression differs<br />
in Pasteurella, Haemophilus and Aeromonas species<br />
compared to the Enterobacteriaceae [1].<br />
ADENYLATE CYCLASE OF PATHOGENIC<br />
BACTERIA (CLASS II ADENYLATE CYCLASES)<br />
Increased production of cAMP in the host cell,<br />
by toxins with AC activity, is a strategy adopted by<br />
many pathogenic bacteria. The enzyme enters into<br />
the target cells and, after its activation by specific<br />
factors (such as CaM), triggers the formation of intracellular<br />
cAMP. Four of these toxins have been<br />
identified and studied: Bordetella pertussis AC<br />
(CyaA), Bacillus anthracis edema factor (EF),<br />
Pseudomonas aeruginosa AC (ExoY) and Yersinia<br />
pestis AC.<br />
The main targets of these toxins are the effector<br />
cells of the immune system. Accumulation of cAMP<br />
in the cytoplasm disrupts cellular functions, affecting<br />
the immune system and facilitates the survival of<br />
bacteria in the body. This often represents a critical<br />
step in the pathogenesis of many infectious diseases.<br />
1. Bordetella pertussis Adenylate Cyclase<br />
Bordetella sp. are Gram-negative aerobic cocobacilli<br />
that cause respiratory tract infections in<br />
mammals. Bordetella pertussis produces a highly<br />
contagious disease known as whooping cough. This<br />
disease is initiated by bacterial adherence to respiratory<br />
epithelium and its colonization.<br />
Bordetella pertussis produces two toxins,<br />
namely the invasive AC (CyaA) and the pertussis<br />
64
Adenylate cyclases involvement in pathogenicity, a minireview<br />
toxin, both of which are essential for bacterial virulence.<br />
AC causes a rapid increase in cAMP intracellular<br />
levels, which is required to initiate colonization<br />
(within days of infection). By accumulation of cAMP<br />
in host cells, cellular functions and the mechanisms<br />
of defense are inhibited [14, 15]. Research has<br />
shown that partially purified CyaA may inhibit<br />
phagocytosis by altering chemotaxis and oxidative<br />
response by increasing intracellular cAMP. It also<br />
causes apoptosis in macrophages. Pertussis toxin<br />
acts later and amplifies the cAMP signal, thus playing<br />
an important role in the persistence of bacteria<br />
in the body [16].<br />
AC was first described as an exotoxin in 1973<br />
[17]. The first attempts to purify it [18] were made<br />
three years later. Subsequently, in 1980, it was reported<br />
that CyaA is activated by CaM [19].<br />
The protein is secreted by a mechanism specific<br />
for Gram-negative bacteria, which is similar to Escherichia<br />
coli hemolysin release [20]. Usually, secretion<br />
of Gram-negative bacteria proteins requires<br />
the presence of a signal peptide at their N-terminal<br />
end. The signal peptide determines protein translocation<br />
into bacteria periplasm. There, the peptide is<br />
cleaved and protein exported by a specific mechanism.<br />
It was observed that Bordetella pertussis AC<br />
does not have this signal peptide, which indicates<br />
that it is not secreted through the normal mechanism<br />
of secretion. Secretion of CyaA protein requires the<br />
presence of three genes (cyaB, cyaD and cyaE) located<br />
downstream from cyaA gene (the gene for<br />
AC). They are organized in one operon, under the<br />
control of cyaA promoter [16]. This is similar to Escherichia<br />
coli hemolysin, where the required genes<br />
are: hlyD, hlyB and hlyC, the latter being involved<br />
in activating the protein. The cyaC gene (counterpart<br />
of Escherichia coli hlyC gene) is located upstream<br />
from the cyaA gene. The order of genes in the Bordetella<br />
pertussis genome is: cyaC, cyaA, cyaB, cyaD<br />
and cyaE [1]. The cyaA gene transcription, as well<br />
as that of the other genes involved in virulence, is<br />
regulated by signals from the environment.<br />
Cloning of Bordetella pertussis AC has played<br />
an important role in analyzing the structure and function<br />
of this protein. The first AC purified and biochemically<br />
studied was the AC from Bordetella<br />
per tussis expressed in Escherichia coli. Despite numerous<br />
attempts, the Bordetella pertussis cyaA gene<br />
was cloned only in 1988 [21].<br />
Synthesized as an inactive protein, Bordetella<br />
pertussis AC is activated by palmitoylation of two<br />
lysine residues located at positions 860 and 983 [22].<br />
This is a CyaC - dependent process [20].<br />
Bordetella pertussis AC is a 1706 amino acids<br />
protein and has a modular structure with two functional<br />
domains. The first ~400 amino acids (the N-<br />
terminal end of the protein) comprise the CaM<br />
dependent catalytic domain. The remaining 1306<br />
amino acids (located in the C-terminal region) form<br />
a hemolysin which mediates the binding and internalization<br />
of the catalytic domain into eukaryotic<br />
cells. Both domains can function independently of<br />
each other [23].<br />
The complete protein has a molecular mass of<br />
200 kDa. Protein digestion with trypsin releases a<br />
fragment of 43 kDa (the catalytic domain), with an<br />
enzymatic activity similar to that of the whole protein.<br />
[24].<br />
CyaA can interact with different cell types, but<br />
the immune effector cells are the main target. Internalization<br />
of bacteria is not necessary to induce cytotoxicity.<br />
The catalytic domain is introduced in the<br />
host cell cytosol, where it is activated by CaM and<br />
produces large quantities of intracellular cAMP. The<br />
catalytic domain is translocated through the membrane<br />
directly into the target cell cytosol by a process<br />
called internalization. There is some evidence concerning<br />
the mechanism of translocation. A rise in intracellular<br />
cAMP can be detected few seconds after<br />
addition of CyaA toxin. The endocytosis requires a<br />
longer time and is pH dependent. And last but not<br />
least, CyaA can invade cells that have a low membrane<br />
transport, such as mammalian erythrocytes [20].<br />
Recently, a model for the mechanism of AC internalization<br />
into cells was proposed. It involves two<br />
distinct conformers that employ the same segment<br />
of the hydrophobic subdomain of the hemolytic AC<br />
domain. One conformer forms oligomeric cation-selective<br />
pores that determine potassium efflux from<br />
phagocytes. The other conformer remains as a mo -<br />
no mer and is responsible for AC translocation into<br />
the cell [25, 26, 27]. The catalytic domain is unfol -<br />
ded and translocated through the membrane. This<br />
process of internalization of the toxin is calcium dependent.<br />
Ca 2+ binding determines conformational<br />
chan ges of the protein, from globular form to elongated<br />
form. Translocation of the AC domain into<br />
host cell allows Ca 2+ influx through a novel type of<br />
calcium path in the target membrane [28]. The region<br />
375-385 is crucial for membrane insertion and<br />
translocation of Bordetella pertussis AC [29].<br />
The Catalytic Domain of Bordetella pertussis<br />
Adenylate Cyclase<br />
Once in the cell, in order to catalyze cAMP synthesis,<br />
the AC is activated by the C-terminal lobe of<br />
CaM [19] (Fig. 1) through conformational drift of the<br />
65
COSTACHE et al.<br />
catalytic domain. Experiments have shown that the<br />
enzyme remains membrane associated, with ATP and<br />
CaM -binding domains exposed to the cytoplasm.<br />
The ATP binding site, 54 GVATKGLGVHAKSS-<br />
DWG 70 , is represented by the sequence of the amino<br />
acids 54-70. Fluorescence studies have shown that<br />
AC forms a complex with CaM, tightly bound by<br />
several contact points. The Bordetella pertussis AC<br />
binds CaM with high affinity, increasing its enzymatic<br />
activity over 1000-fold. Ca 2+ ions, bound to<br />
CaM, contribute to the stabilization of the AC-CaM<br />
complex [30].<br />
The catalytic domain is comprised in two regions:<br />
T25 and T18 (obtained in vitro by limited proteolysis).<br />
The catalytic site is in T25 (amino acids<br />
1-224), while T18 (amino acids 225-399) contains<br />
the CaM-binding domain [20]. The 224 amino acids<br />
N-terminal fragment of the Bordetella pertussis AC<br />
catalytic domain shows only 0.1% of the native enzyme<br />
activity. It seems that this fragment is particularly<br />
important in the structure of the catalytic active<br />
center, but it cannot be fully active in the absence of<br />
the 225-399 fragment (which acts as an activator of<br />
the first), the N 304 residue of CyaA being involved<br />
in catalysis [31]. Residues 196-267 (partially overlapping<br />
sequence over the two regions) play an important<br />
role in binding CaM. The regions of contact<br />
between CyaA and CaM include four AC segments:<br />
H 197 –R 206 , R 235 –R 246 , R 250 –R 259 and E 346 –R 360 . Directed<br />
mutagenesis and crystallization studies have<br />
demonstrated that W 242 is the key binding residue.<br />
It interacts with the C-terminal segment of CaM,<br />
being surrounded into a hydrophobic pocket by I 125 ,<br />
F 141 and four Methionine residues (M 169 , M 124 , M 144<br />
and M 145 ) [31]. Another important role in CaM binding<br />
is played by residues R 258 , R 259 and E 356 [32].<br />
Full enzymatic activity can be restored if the<br />
two fragments (T25 and T18) are reunited in the<br />
presence of CaM or fused to peptides or proteins that<br />
are able to interact [33].<br />
CaM-binding domain of myosin kinase from<br />
chicken smooth muscle ( 494 RRKWQKTGHA -<br />
VRAIG 505 ) has a similar sequence with a protein<br />
fragment located in the N-terminal half of Bordetella<br />
pertussis AC catalytic domain ( 164 RRKGGDDFEA -<br />
VKVIG 178 ). Replacing the first three amino acids<br />
(RRK) with glutamic acid residues reduces the AC<br />
affinity for CaM. Stabilization of the AC-CaM complex<br />
is done by the interaction between the CaM<br />
negatively charged amino acids and the AC basic<br />
ones (such as fragment RRK) [1]. CaM is necessary<br />
both for nucleotide binding to the catalytic active<br />
center and for initiating the catalytic activity.<br />
There are four amino acids essential in ATP<br />
binding and enzymatic activity. They are: K 58 and<br />
K 65 , present in G - - - - GK (T / S) sequence and D 188<br />
and D 190 , present in 184 PLTADID 190 region. All four<br />
interact with Mg 2+ -ATP (at α and β phosphate<br />
moieties) [1].<br />
AC enzymatic activity is dependent on divalent<br />
cations, but is not affected by α-ketoacids or guanine.<br />
Various amphiphilic substances, such as phosphatidyl-choline,<br />
phosphatidyl-ethanolamine and<br />
phosphatidyl-serine, were found to have a stimula -<br />
ting effect on enzymatic activity. [34].<br />
Hemolysin Domain of the Bordetella pertussis<br />
Adenylate Cyclase<br />
At the C-terminus of the protein, after the ca -<br />
talytic sequence, there is a 1300 amino acids domain<br />
highly similar to the Escherichia coli α-hemolysin.<br />
The C-terminal domain of Bordetella pertussis AC<br />
(represented by amino acids 400-1706) has a Ca 2+ -<br />
dependent hemolytic activity. This hemolytic domain<br />
forms cation-selective channels in target cells<br />
membrane to insert the AC catalytic domain into the<br />
eukaryotic cytoplasm. It is divided into three subdomains.<br />
The pore-forming region, located at amino<br />
acids 500-700, is rich in hydrophobic amino acids,<br />
forming four potential transmembrane spans [35].<br />
The second subdomain, between amino acids 700-<br />
1000, is a fatty acylation domain highly similar with<br />
internal domain of Escherichia coli α-hemolysin,<br />
where the posttranslational activation by palmitoylation<br />
of K 983 and K 860 is taking place [22]. Both of<br />
these subdomains are required for channel formation<br />
in lipid bilayer membranes [36]. The third subdomain,<br />
between amino acids 1006-1638, contains<br />
glycine- and aspartate-rich nonapeptide repeats,<br />
characteristic of RTX proteins, involved in binding<br />
of Ca 2+ and the interaction with the host cell membrane<br />
[37, 38].<br />
2. Bacillus anthracis Adenylate Cyclase<br />
Anthrax is a disease that affects mainly animals,<br />
but may spread to humans through contact with infected<br />
animals or contaminated animal products. It<br />
is caused by aerobic spores of a Gram-positive bacterium,<br />
called Bacillus anthracis. The disease is initiated<br />
by spores entering the body.<br />
The anthrax toxic complex has a binary character,<br />
expressing its components independently. Enzymatic<br />
component (lethal factor - LF and edema fac tor - EF<br />
proteins) acts on the substrate located in the cytosol,<br />
while the binding component protective antigen (PA)<br />
is a multifunctional protein that binds to receptors<br />
on the surface of target cells. After bin d ing, it is<br />
cleaved by other surface proteins (such as Furin),<br />
66
Adenylate cyclases involvement in pathogenicity, a minireview<br />
with the release of a 20 kDa fragment from the<br />
N-terminus. The remaining fragment of 63 kDa (also<br />
called PA 63 ) is then subjected to oligomerization and<br />
form a heptamer ring which binds up to three molecules<br />
of EF, LF or both, by competitive binding [39].<br />
The complex formed undergoes receptor-mediated<br />
endocytosis. Later, conformational chan ges, due to<br />
increased acidity, lead to the insertion of the heptamer<br />
in the endozomal membrane and subsequent<br />
translocation of LF and EF into the cytosol. Here<br />
they exert their toxic effect against the host cell.<br />
Deletion of PA abolishes the Bacillus anthracis virulence<br />
[40].<br />
Separately, the three proteins PA, LF, EF are not<br />
toxic. Combination of PA and LF, called lethal toxin,<br />
results in death of laboratory animals, while combination<br />
of PA and EF, called edema toxin, induces increased<br />
intracellular levels of cAMP and produce<br />
edema [41].<br />
LF is a zinc dependent metalloproteinase that<br />
cleaves certain MAP kinase isoforms from macro -<br />
phages, leading to death and inhibition of cell proliferation.<br />
EF is a Ca 2+ -CaM - dependent AC, which<br />
produces high intracellular cAMP levels by interfering<br />
with cell signaling [42, 43]. EF alone is not toxic,<br />
but is necessary to the survival of germinated spores<br />
in the early stages of infection [40].<br />
After EF is translocated into the cytosol, it triggers<br />
an increased influx of Ca 2+ . Absence of Ca 2+ or<br />
presence of Ca 2+ channels antagonists in the extracellular<br />
environment prevents the accumulation of<br />
intracellular cAMP [16, 44]. Once arrived into the<br />
cytoplasm, EF is activated by CaM and catalyzes the<br />
synthesis of cAMP from ATP.<br />
The genes responsible for virulence are located<br />
on two plasmids: pXO1 plasmid (182 kb) and pXO2<br />
plasmid (95 kb). The pXO1 plasmid contains pagA,<br />
lef and cya genes, which encode components of the<br />
anthrax toxic complex, namely PA, LF and EF [42,<br />
43]. The expression of the three genes is regulated<br />
on transcriptional level through the carbonate / bicarbonate<br />
buffer system and temperature [16]. The<br />
pXO2 plasmid contains genes capA, capB and capC,<br />
required for capsule formation.<br />
The cya gene encodes an 800 amino acids protein<br />
with a signal sequence of 33 amino acids, located<br />
at N-terminal, which is removed after<br />
secretion. X-ray crystallography studies, performed<br />
in the presence and absence of CaM, have determined<br />
the structure of EF. This protein has two functional<br />
domains. The N-terminal 30kDa domain is<br />
similar with the LF terminal fragment domain and<br />
binds PA. The residues 1-28 of EF have a high proportion<br />
of highly charged residues. Residues<br />
136VYYEIGK 142 of EF (identical to the LF sequence<br />
147VYYEIGK 152 ) are involved in PA binding. Replacing<br />
residues Y 137 , Y 138 , I 140 and K 142 with A<br />
abolishes the ability of EF to bind to PA. The 58kDa<br />
EF catalytic domain is situated immediately after the<br />
PA binding domain, within 262-767 residues. It is<br />
dependent of CaM (Fig. 1). No activity can be detected<br />
in its absence, Ca 2+ -CaM complex being a<br />
more potent activator of EF than CaM alone [45].<br />
The Catalytic Domain of Bacillus anthracis<br />
Adenylate Cyclase<br />
The catalytic domain consists of two subdomains:<br />
the N-terminal region, which contains the ca -<br />
talytic center and the C-terminal region, which binds<br />
CaM.<br />
Bacillus antracis AC activity is dependent of<br />
CaM and divalent ions such as Mg 2+ and Ca 2+ . Ca 2+<br />
ions are needed to form Ca 2+ -CaM complex with<br />
high affinity for the enzyme (the complex having a<br />
stronger activator effect than CaM alone [45]). Mg 2+<br />
and ATP forms Mg 2+ -ATP complex that acts as substrate.<br />
Ca 2+ can replace Mg 2+ to form a complex with<br />
ATP, with an affinity for the active site five times<br />
greater. Ca 2+ -ATP complex reduces the enzymatic reaction<br />
rate 250 times. The catalytic domain of EF<br />
has three globular domains [46, 47]. Studies on AC<br />
secondary structure showed that it has 34% β structure,<br />
16% α-helix structure and 14% “β-turn” structures<br />
[48]. The pI value of the protein without the<br />
N-terminal 261 amino acids, responsible for its interaction<br />
with PA, increases above 8, compared to<br />
the native protein whose pI is 6.45 [1].<br />
NMR spectroscopy, secondary structure prediction<br />
and circular dichroism studies suggest that the<br />
segment located between amino acids 548 and 564<br />
of the Bacillus anthracis AC could be involved in<br />
CaM binding. By using a synthetic peptide, it has<br />
been observed that the sequence located between<br />
522-565 shows a high affinity for CaM. This segment,<br />
like other peptides known to bind CaM, shows<br />
mostly basic and hydrophobic amino acids, separated<br />
by an α-helix structure [49]. Four regions of<br />
EF are involved in CaM binding (516-540, 615-634,<br />
647-672 and 695-721), residue K 525 being the key<br />
binding residue [46]. The amino acids segment 579-<br />
590 forms a catalytic loop stabilized upon CaM<br />
binding [46, 50].<br />
After binding of CaM conformational changes<br />
occur that lead to the formation of a binding site with<br />
high affinity for ATP. This site, identified by directed<br />
mutagenesis, is 314 GxxxxGKS 321 (a consensus sequence).<br />
By replacing K 320 with N, the AC catalytic<br />
67
COSTACHE et al.<br />
activity decreases 10 times compared to the native<br />
protein. The EF crystal structure suggests that H 351<br />
(H 318 , if we take into account the protein without signal<br />
sequence) has an important role in catalysis [46].<br />
However the mutational and crystallographic results<br />
show that H 351 does not serve as a catalytic base. It<br />
may be responsible for deprotonation of the ATP<br />
3’OH group [50]. R 329 , K 346 , K 352 , and K 372 are involved<br />
in the tight binding of ATP to the active site<br />
[48, 50]. The conserved aspartates D 491 and D 493<br />
have an important contribution in the AC activity by<br />
binding two metal ions that stabilize the reaction intermediate<br />
[50]. EF has a high catalytic activity with<br />
a V max of 1.2 mmol cAMP/min/mg protein. Its optimal<br />
catalytic activity is at 0.2 mM Ca 2+ . The enzy -<br />
ma tic activity is inhibited by higher calcium<br />
con cen trations [45].<br />
3. Adenylate Cyclase of Pseudomonas aeruginosa<br />
(ExoY)<br />
Three species of Pseudomonas genus are known<br />
to cause infections in humans. Pseudomonas mallei<br />
is a nonmotile species that causes glanders in horses.<br />
It can also infect humans. Pseudomonas pseudomallei<br />
causes melioidosis, a tropical disease that affects<br />
both humans and animals. Pseudomonas aeruginosa,<br />
a Gram-negative aerobic bacterium, is found<br />
predominantly in soil and water. It is a common<br />
pathogen for plants and animals. It is an opportunistic<br />
pathogen that causes infections of the urinary<br />
tract and respiratory system, dermatitis, soft tissue<br />
infections, bacteremia and a variety of systemic infections,<br />
especially in people with severe burns, cancer<br />
or AIDS, usually in immunosuppressed persons.<br />
Pseudomonas aeruginosa infection has three stages:<br />
attachment and colonization, local invasion and dissemination<br />
in the body [16].<br />
Various determinants such as certain proteases,<br />
alginate, phospholipases and toxins are involved in<br />
Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. An important<br />
determinant of virulence is ExoS regulon, whose<br />
expression is correlated with dissemination of bacteria,<br />
from the colonization site, into the vascular<br />
system. ExoS regulon comprises a set of virulence<br />
genes, regulated in a coordinated manner at the transcriptional<br />
level by ExsA (a regulatory protein from<br />
AraC family). It regulates its own synthesis, as well<br />
as some operons which encode proteins involved in<br />
eukaryotic cell cytotoxicity, a process achieved<br />
through type III secretion. Three classes of proteins<br />
are involved: components of the secretion apparatus,<br />
effectors that mediate protein translocation into the<br />
host cell and effector proteins that disrupt normal<br />
cellular processes [16]. Effectors translocation leads<br />
to inhibition of phagocytosis, allowing the bacteria<br />
to multiply and damage the epithelium. Four effector<br />
proteins have been identified: ExoS – a bifunctional<br />
protein with N-terminal GTPase activating protein<br />
(GAP) and ADP-ribosyltransferase activities, ExoU<br />
– with a phospholipase A2 activity causing acute cytotoxicity,<br />
ExoT – a bifunctional protein closely related<br />
to ExoS and ExoY - an AC [51, 52]. Almost no<br />
strain encodes both ExoU and ExoS, while ExoT and<br />
ExoY are encoded by almost all strains. All four effectors<br />
require a host cofactor for their activities [52]<br />
Infection of eukaryotic cells with strains of<br />
Pseudomonas aeruginosa expressing AC (ExoY)<br />
leads to increases in intracellular cAMP levels, as<br />
well as morphological changes of the cell such as cytoskeleton<br />
disruption and cell rounding and temporarily<br />
inhibits the internalization of Pseudomonas<br />
aeruginosa in the epithelial cells [53]. These effects<br />
cannot be observed when the type III secretion apparatus<br />
is inactivated (by mutations or deletions) or<br />
there is an inactive form of ExoY and simply adding<br />
ExoY does not increase the level of cAMP. This suggests<br />
that ExoY is introduced into the cell through a<br />
mechanism of type III translocation system (also<br />
called polarized translocation) [16, 54].<br />
ExoY is a 42 kDa protein encoded by a gene of<br />
1134 bp. It is a thermolabile protein. Residues 41-<br />
107 and 209-221 of ExoY show homology with sequences<br />
of Bacillus anthracis EF and of Bordetella<br />
pertussis invasive AC. The first conserved region<br />
(41-107 fragment) contains ATP / GTP, binding sites<br />
(it binds the α-phosphate moiety). The second conserved<br />
region (located at 209-221) binds the β and<br />
γ-phosphate moieties of ATP and shows homology<br />
with several proteins that bind nucleotides, including<br />
pyruvate kinase and phosphofructokinase [16].<br />
ExoY sequence does not contain any similarities<br />
with the Bordetella pertussis or Bacillus anthracis<br />
ACs CaM-binding domains. Another distinctive feature<br />
is that ExoY has five cysteines. Enzyme activity<br />
is stimulated by an eukaryotic protein, different from<br />
CaM, which has not yet been identified [54]. The<br />
amino acids K 81 , K 88 , D 212 and D 214 , essential for<br />
ExoY enzymatic activity, were identified by directed<br />
mutagenesis [16].<br />
4. Adenylate Cyclase from Yersinia pestis<br />
Genus Yersinia is composed of eleven species.<br />
Three of them, Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica<br />
and Yersinia pseudotuberculosis, are pathogenic<br />
to humans. They cause a wide spectrum of illnesses,<br />
from pulmonary plague to acute gastroenteritis.<br />
Yersinia pestis, a Gram-negative, facultative anaerobe<br />
bacterium, is a pleomorphic bacillus and does<br />
68
Adenylate cyclases involvement in pathogenicity, a minireview<br />
not ferment lactose. This aerobic bacillus, facultative<br />
anaerobic, produces plague. It is a pathogen that<br />
mainly affects rodents. Humans get plague bacte rium,<br />
accidentally via fleas or by handling an infected animal.<br />
In humans, the majority of bacterial cells is<br />
phagocytated and killed by polymorphonuclear leukocytes<br />
(PMN). Few bacilli are internalized and survive<br />
in macrophages to synthesize virulence factors. By<br />
breaking the cell, they are released into the extracellular<br />
environment, triggering systemic infection. Lung<br />
infections have a very high mortality [16].<br />
There are three types of AC in Yersinia pestis:<br />
membrane-bound, cytoplasmic and extracellular. Extracellular<br />
AC is a 30kDa protein. Little is known<br />
about the role of this AC, but studies have shown that<br />
the protein suppresses the oxidative metabolism of<br />
peritoneal leukocytes in white mice [55]. Therefore<br />
it is supposed to be an important virulence factor.<br />
CLASS III ADENYLATE CYCLASES<br />
Class III ACs are found in prokaryotes and eukaryotes.<br />
Activation of these ACs is initiated by<br />
binding of stimulus to receptors on the cell surface.<br />
Based on the catalytic domains, four subgroups<br />
of class III ACs (a-d) have been proposed. The subclass<br />
IIIa ACs have the (F/Y)XX(F/Y)D motif at the<br />
dimer interface and EKIK motif. The subclass IIIb<br />
is characteristic for pseudo dimer bacteria and soluble<br />
mammalian ACs, that are activated by bicarbonate.<br />
The subclass IIIc corresponds to homodimer<br />
Gram-positive and Gram-negative bacteria ACs. The<br />
subclass IIId is represented by protozoan, trypanosomatids<br />
and fungi ACs, which have YEVKY [56, 57].<br />
Ten different mammalian AC isoforms have been<br />
identified and cloned: nine membrane-associated<br />
(subclass IIIa) and one soluble isoform (subclass IIIb),<br />
coming from different sources (Table 1) [58].<br />
Although genes coding for class III ACs are not<br />
organized into clusters and are dispersed over several<br />
chromosomes, the enzymes show a similar topology.<br />
They function as dimmers: heterodimers (mammals),<br />
pseudo heterodimers (metazoa) or homodimer<br />
(protozoa). The catalysis takes place at the interface<br />
of the dimmers [56]. The membrane-bound mammalian<br />
AC has two domains with six transmembrane<br />
spans and several potential phosphorylation sites,<br />
which could be involved in regulation. AC from<br />
bovine brain shares also this structure. The active<br />
catalytic core of the AC enzyme is formed by two<br />
protein fragments: one of 350 amino acids located<br />
between the first and second transmembrane region<br />
and one fragment of 300 amino acids located in the<br />
C-terminal end of the protein [1].<br />
Despite increased expression, the two halves of<br />
the AC from bovine brain (each containing one<br />
transmembrane domain and one cytoplasmic do-<br />
Table 1. The mammalian adenylate cyclase isoforms<br />
Properties<br />
Ca 2 + -calmodulin<br />
complex sensitive<br />
types<br />
Stimulated by<br />
G subunit of G<br />
protein<br />
Inhibited by Ca 2+<br />
and G subunit<br />
of G protein<br />
Not influenced<br />
by forskolin<br />
Soluble<br />
Adenylate cyclase<br />
isoforms<br />
Type I<br />
Type III<br />
Type VIII<br />
Type II<br />
Type IV<br />
Type VII<br />
Type V<br />
Type VI (considered<br />
as a subfamily of type<br />
V adenylate cyclases)<br />
Type IX (the most<br />
divergent family<br />
of membrane-bound<br />
adenylate cyclases)<br />
Soluble adenylate<br />
cyclase<br />
Source<br />
Brain and adrenal medulla<br />
Brain and olfactory epithelium<br />
Brain, lung, testis, adrenal gland, uterus, heart<br />
Brain, skeletal muscle, lung and heart<br />
Brain, kidney, liver, lung, brown adipose tissue,<br />
uterus<br />
Ubiquitous (highly expressed in the brain)<br />
Heart, brain, kidney, liver, uterus, adrenal gland,<br />
brown adipose tissue<br />
Ubiquitous<br />
Brain and muscle tissue<br />
Testis<br />
69
COSTACHE et al.<br />
main) show enzyme activities less than 1% compared<br />
with the whole protein. But, as in the case of<br />
Bordetella pertussis AC, its activity increases significantly<br />
after co-expression of both domains [59].<br />
The first mammalian AC was cloned from<br />
bovine brain. It was expressed in Sf9 cells, into a<br />
baculovirus vector. This enzyme can be activated by<br />
CaM, forskolin and Gαs (G protein α subunit which<br />
stimulates AC). Recombinant enzyme is inhibited by<br />
β and γ subunits of G protein. Other mammalian ACs<br />
were cloned using probes derived from the bovine<br />
sequence [60].<br />
There are eight amino acids very important for<br />
catalysis in the class III AC: two aspartate residues<br />
that coordinate two metal cofactors (Mg 2+ or Mn 2+ ),<br />
a lysine and aspartate pair involved in selective bin -<br />
ding of the substrate, an arginine and asparagine pair<br />
which stabilizes the transition state and an arginine<br />
and lysine pair involved in positioning the pyrophosphate<br />
group [56, 61].<br />
All types of membrane-bound mammalian ACs<br />
are stimulated by G sα -GTP. Other stimulatory effectors<br />
are: forskolin (types I-VIII), G βϒ (types II, IV<br />
and VII), protein kinase C (types I, II, III, V and VII).<br />
Type I, III and VII ACs are the only mammalian AC<br />
that interact with CaM, as seen in Fig. 1. AC-inhi -<br />
bitory properties have: protein kinase A, G iα -GTP and<br />
Ca 2+ (types V and VI), G βϒ (types I, III and VIII), protein<br />
kinase C (types IV and VI). Soluble AC is the<br />
most divergent of mammalian ACs and similar to<br />
that found in cyanobacteria. It is activated by bicarbonate<br />
and Ca 2+ [1, 56, 57, 61].<br />
Ca 2+ -CaM complex is a potent stimulator of<br />
type I and VIII ACs activity. There are two CaMbinding<br />
domains in the structure of type I AC: one<br />
located between amino acids 495-522 and the other<br />
between amino acids 1027-1050. Both are rich in<br />
basic amino acids. The fluorescence analysis showed<br />
that the most plausible CaM-binding domain is the<br />
sequence situated between residues 495 and 522.<br />
The affinity of this peptide to CaM is seven times<br />
higher than that of the whole protein [59]. On the<br />
other hand, the CaM binding site of other types of<br />
ACs differs from this one: a site is located in the<br />
N-terminal region and the other in the C-terminal region.<br />
Studies have shown that the C-terminal region<br />
is sufficient for in vitro activation of the enzyme, but<br />
in vivo are needed both C- and N-terminal region.<br />
Ca 2+ -CaM complex (activated by G protein α<br />
subunit or by forskolin) can also act as a secondary<br />
activator of type III AC activity [57].<br />
A COMPARISON OF ADENYLATE CYCLA SES:<br />
SIMILARITIES AND DIFFERENCES<br />
Distribution of genetic information for AC in<br />
different sources is distinct. Thus, the gene for the<br />
Bordetella pertussis AC (cyaA) is located in an<br />
operon (under the control of cyaA promoter), the<br />
Bacillus. anthracis cya gene is located in one of the<br />
two virulence plasmid, namely pXO1 and the gene<br />
for Pseudomonas aeruginosa ExoY belongs to ExoS<br />
regulon, which is regulated by ExsA protein [16, 42,<br />
43]. Genes for different types of class III ACs are organized<br />
on many chromosomes. This shows that the<br />
expression of these enzymes may be regulated differently<br />
depending on environmental conditions.<br />
The structure of these proteins varies, depen -<br />
ding on their function and the organism from which<br />
they arise. CyaA and Escherichia coli AC have a<br />
modular configuration, which consists of two functional<br />
domains: one catalytic and one hemolytic for<br />
CyaA or regulator for Escherichia coli Cya [23].<br />
Bacillus anthracis EF belongs to the toxic complex.<br />
In order to exercise their function in the host cell it<br />
must first interact with PA. Bacillus anthracis enzyme’s<br />
catalytic domain is located in the C-terminal<br />
part of the protein, while the N-terminal part comprises<br />
the PA binding [39]. The catalytic domain of<br />
other pathogenic bacteria enzymes is located in the<br />
N-terminal end (e.g. CyaA, ExoY). For the class III<br />
ACs, the situation is different because they function<br />
as dimers, with the catalytic site at the interface of<br />
the dimers [56]. The class III membrane-bound<br />
mammalian ACs have two similar areas (each one<br />
has a cytoplasmic subdomain and a transmembrane<br />
subdomain, consisting of six hydrophobic regions)<br />
that cannot operate independently [1].<br />
Fig. 1 - Enzyme activation by Calmodulin-Calcium complex<br />
70
Adenylate cyclases involvement in pathogenicity, a minireview<br />
These pathogenic bacteria AC have three highly<br />
homologous regions, but the mechanisms of secretion<br />
and entry in eukaryotic cell is different. Internalization<br />
of toxins by eukaryotic host cells is<br />
achieved through the hemolytic domain (which creates<br />
pores in the membrane) for Bordetella pertussis<br />
AC; by endocytosis for Bacillus anthracis AC [16,<br />
25, 26, 27, 39]. For both ACs, internalization of the<br />
catalytic domain triggers an increased influx of Ca 2+<br />
into the host cell [16, 28, 44]. These ACs are activated<br />
by CaM [19, 42]. Another virulence factor<br />
found in Pseudomonas aeruginosa, an AC protein<br />
called ExoY, is inserted into the host cell via a type<br />
III mechanism and activated by an eukaryotic factor,<br />
other than CaM [16, 54].<br />
After entering the cytoplasm, the enzyme interacts<br />
with CaM (or other activator), causing intense<br />
cAMP synthesis and disruption of cell functions [14,<br />
15, 41, 53]. Class II ACs (eg. Bordetella pertussis<br />
CyaA toxin, Bacillus anthracis edema factor) have<br />
some special features, most important of which is<br />
the activation by CaM, protein absent in bacteria [19,<br />
42, 43]. Dependence of bacterial ACs on CaM is an<br />
important aspect. CaM is not synthesized by bacteria<br />
and a constitutive AC activity would be lethal.<br />
Although at first glance, these cyclases similar<br />
functions (in particular those of Bordetella pertussis<br />
and Bacillus anthracis) suggest a similar structure,<br />
the primary structure shows important differences in<br />
terms of size and a relatively low sequence similarity.<br />
Location of the ATP binding sites and activation<br />
mechanism of Bordetella pertussis and Bacillus anthracis<br />
ACs are similar. Following our sequence<br />
analysis of pathogenic bacteria AC catalytic domains<br />
– in particular Bacillus anthracis CyaA (residues<br />
224-506), Pseudomonas aeruginosa ExoY (residues<br />
1-255) and Bordetella pertussis CyaA (residues 1-<br />
231) - we presume that the ATP binding site of<br />
Pseudomonas aeruginosa could be 80 TKGFSVK -<br />
GKSS 90 (see box in alignment in Fig. 2). In addition<br />
to protein sequence, three-dimensional structure<br />
analysis of these fragments (Fig. 3) has helped us to<br />
propose a possible secondary structure for this ExoY<br />
fragment, as evidenced in Fig. 2.<br />
ACs are widespread enzymes, being present<br />
both in prokaryotes and eukaryotes. Although they<br />
have the same enzymatic activity (ATP cyclization),<br />
the structure of these proteins varies, depending on<br />
their function and the producing organism. The sequence<br />
analysis of catalytic domain of AC from bacterial<br />
species with known three-dimensional<br />
struc tures could make possible the prediction of the<br />
ATP binding site structure of ACs produced by other<br />
bacterial strains.<br />
Fig. 2 - Sequence alignment: Bacillus anthracis CyaA (residues 224-506),<br />
Pseudomonas aeruginosa ExoY (residues 1-255) and Bordetella pertussis CyaA (residues 1-231)<br />
and the proposed secondary structure of the catalytic ExoY domain (see box in alignment)<br />
71
COSTACHE et al.<br />
Fig. 3 - Three-dimensional structure analysis of AC fragments:<br />
A. Bacillus. anthracis CyaA (residues 224-506); B. Bordetella pertussis CyaA (residues 1-231) and<br />
C. Bacillus anthracis CyaA (residues 224-506) superimposed over Bordetella pertussis CyaA (residues 1-231).<br />
REFERENCES<br />
1. Barzu O. and Danchin A. Adenylyl Cyclases: A He -<br />
terogeneous Class of ATP-Utilizing Enzymes. Prog<br />
Nucleic Acid Res Mol Biol. 1994. 49:241-83.<br />
2. Baker DA, Kelly JM. Structure, function and evolution<br />
of microbial adenylyl and guanylyl cyclases. Mol Microbiol<br />
2004. 52(5):1229-42.<br />
3. Sismeiro O, Trotot P, Biville F, Vivares C, Danchin A.,<br />
Aeromonas hydrophila adenylyl cyclase 2: a new class<br />
of adenylyl cyclases with thermophilic properties and<br />
sequence similarities to proteins from hyperthermophilic<br />
archaebacteria., J Bacteriol. 1998 Jul;<br />
180(13):3339-44.<br />
4. Smith N, Kim SK, Reddy PT, Gallagher DT., Crystallization<br />
of the class IV adenylyl cyclase from Yersinia<br />
pestis., Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun.<br />
2006 Mar 1;62(Pt 3):200-4. Epub 2006 Feb 10.<br />
5. Cotta MA, Whitehead TR & Wheeler MB (1998) Identification<br />
of a novel adenylate cyclase in the ruminal<br />
anaerobe, Prevotella ruminicola D31d. FEMS Microbiol<br />
Lett 164, 257–260.<br />
6. Tellez-Sosa J, Soberon N, Vega-Segura A, Torres-Marquez<br />
ME, Cevallos MA., The Rhizobium etli cyaC<br />
product: characterization of a novel adenylate cyclase<br />
class., J Bacteriol. 2002 Jul; 184(13):3560-8.<br />
7. Roy, A., P. Glaser, and A. Danchin. Aspects of the regu -<br />
lation of adenylate cyclase synthesis by Escherichia<br />
coli K-12. J. Gen. Microbiol. 1988. 134(2):359-67.<br />
8. Jovanovitch, S. B. Regulation of cya-lac fusions by<br />
cyclic AMP in Salmonella typhimurium. J Bacteriol.<br />
1985. 161(2):641-9.<br />
9. Mori, K., and H. Aiba. Evidence for negative control<br />
of cya transcription by cAMP and cAMP receptor protein<br />
in intact Escherichia coli cells. J Biol Chem. 1985.<br />
260(27):14838-43.<br />
10. Reddy, P. S., A. Peterkofsky, and K. McKenney.<br />
Transla tional efficiency of the E. coli adenylate cyclase<br />
gene: mutating the UUG initiation codon to<br />
GUG or AUG results in increased gene expression.<br />
Proc Natl Acad Sci U S A. 1985. 82(17):5656-60.<br />
11. Levy S., Zeng G.Q., and Danchin A. Cyclic AMP synthesis<br />
in Escherichia coli strains bearing known deletions<br />
in the pts phosphotransferase operon. Gene.<br />
1990. 86(1):27-33.<br />
12. Reddy P., Miller D. and Peterkofsky A., Stimulation of<br />
Escherichia coli adenylate cyclase activity by elongation<br />
factor Tu, a GTP-binding protein essential for protein<br />
synthesis. J Biol Chem. 1986 261(25):11448-51.<br />
13. Thorner, L. K., J. P. Fandl, and S. W. Artz. Analysis<br />
of sequence elements important for expression and<br />
regulation of the adenylate cyclase gene (cya) of Salmonella<br />
typhimurium. Genetics. 1990. 125(4):709-17.<br />
14. Confer DL, Eaton JW. (1982), Phagocyte impotence<br />
caused by an invasive bacterial adenylate cyclase.,<br />
Science. 1982 Sep 3;217(4563):948-50.<br />
15. Hanski E., Invasive adenylate cyclase toxin of Bordetella<br />
pertussis, Trends Biochem Sci. 1989 Nov;<br />
14(11):459-63.<br />
16. Ahuja N, Kumar P, Bhatnagar R. The Adenylate Cyclase<br />
Toxins. Crit Rev Microbiol 2004. 30(3):187-196.<br />
17. Wolff J, Cook GH. Activation of thyroid membrane<br />
adenylate cyclase by purine nucleotides. J Biol Chem.<br />
1973, 248(1):350-5.<br />
18. Hewlett E, Wolff J. Soluble adenylate cyclase from the<br />
culture medium of Bordetella pertussis: purification and<br />
characterization. J Bacteriol. 1976, 127(2):890-8.<br />
19. Wolff J., Cook G. H., Goldhammer A. R., and Ber -<br />
kowitz S. A. Calmodulin activates prokaryotic adenylate<br />
cyclase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1980, 77(7):<br />
3841-844.<br />
20. Landant D., Ullmann A. Bordetella pertussis adenylate<br />
cyclase: a toxin with multiple talents. Trends Micobiol<br />
1999. 7(4): 172-6.<br />
72
Adenylate cyclases involvement in pathogenicity, a minireview<br />
21. Glaser P, Ladant D, Sezer O, Pichot F, Ullmann A,<br />
Danchin A. The calmodulin-sensitive adenylate cyclase<br />
of Bordetella pertussis: cloning and expression<br />
in Escherichia coli. Mol Microbiol 1988. 2(1):19-30.<br />
22. Masin J, Basler M, Knapp O, El-Azami-El-Idrissi M,<br />
Maier E, Konopasek I, Benz R, Leclerc C, Sebo P.,<br />
Acylation of lysine 860 allows tight binding and cytotoxicity<br />
of Bordetella adenylate cyclase on CD11bexpressing<br />
cells., Biochemistry. 2005 Sep 27;<br />
44(38):12759-66.<br />
23. Sakamoto H, Bellalou J, Sebo P, Ladant D. Bordetella<br />
pertussis adenylate cyclase toxin. Structural and functional<br />
independence of the catalytic and hemolytic activities.<br />
J Biol Chem. 1992 267(19):13598-602.<br />
24. Bellalou J, Sakamoto H, Ladant D, Geoffroy C, Ullmann<br />
A. Deletions affecting hemolytic and toxin activities<br />
of Bordetella pertussis adenylate cyclase.<br />
Infect Immun. 1990, 58(10):3242-7.<br />
25. Vojtova-Vodolanova J, Basler M, Osicka R, Knapp O,<br />
Maier E, Cerny J, Benada O, Benz R, Sebo P.,<br />
Oligomerization is involved in pore formation by Bordetella<br />
adenylate cyclase toxin., FASEB J. 2009<br />
Sep;23(9):2831-43. Epub 2009 May 5.<br />
26. Osickova A, Masin J, Fayolle C, Krusek J, Basler M,<br />
Pospisilova E, Leclerc C, Osicka R, Sebo P., Adenylate<br />
cyclase toxin translocates across target cell membrane<br />
without forming a pore., Mol Microbiol. 2010<br />
Mar;75(6):1550-62. Epub 2010 Feb 23.<br />
27. Fiser R, Masin J, Bumba L, Pospisilova E, Fayolle C,<br />
Basler M, Sadilkova L, Adkins I, Kamanova J, Cerny<br />
J, Konopasek I, Osicka R, Leclerc C, Sebo P., Calcium<br />
Influx Rescues Adenylate Cyclase-Hemolysin from<br />
Rapid Cell Membrane Removal and Enables Phagocyte<br />
Permeabilization by Toxin Pores, PLoS Pathog.<br />
2012 April; 8(4): e1002580.<br />
28. Fiser R, Masín J, Basler M, Krusek J, Spuláková V,<br />
Konopásek I, Sebo P., Third activity of Bordetella<br />
adenylate cyclase (AC) toxin-hemolysin. Membrane<br />
translocation of AC domain polypeptide promotes calcium<br />
influx into CD11b+ monocytes independently of<br />
the catalytic and hemolytic activities., J Biol Chem.<br />
2007 Feb 2; 282(5):2808-20. Epub 2006 Dec 4.<br />
29. Karst JC, Barker R, Devi U, Swann MJ, Davi M,<br />
Roser SJ, Ladant D, Chenal A., Identification of a region<br />
that assists membrane insertion and translocation<br />
of the catalytic domain of Bordetella pertussis CyaA<br />
toxin., J Biol Chem. 2012 Mar 16; 287(12):9200-12.<br />
Epub 2012 Jan 12.<br />
30. Selwa E, Laine E, Malliavin TE., Differential role of<br />
calmodulin and calcium ions in the stabilization of the<br />
catalytic domain of adenyl cyclase CyaA from Bordetella<br />
pertussis., Proteins. 2012 Apr; 80(4):1028-40.<br />
doi: 10.1002/prot.24005. Epub 2012 Jan 9.<br />
31. Guo Q, Shen Y, Lee YS, Gibbs CS, Mrksich M, Tang<br />
WJ. Structural basis for the interaction of Bordetella<br />
pertussis adenylyl cyclase toxin with calmodulin.<br />
EMBO J. 2005. 24(18):3190-201.<br />
32. Glaser P, Elmaoglou-Lazaridou A, Krin E, Ladant D,<br />
Bârzu O, Danchin A. Identification of residues essential<br />
for catalysis and binding of calmodulin in Bordetella<br />
pertussis adenylate cyclase by site-directed<br />
mutagenesis. EMBO J. 1989, 8(3):967-72.<br />
33. Dautin N., Karimova G., Ladant D. Bordetella pertussis<br />
adenylate cyclase toxin: a versatile screening tool.<br />
Toxicon 2002. 40: 1383–1387.<br />
34. Wolff J, Cook GH. Amphiphile-mediated activation<br />
of soluble adenylate cyclase of Bordetella pertussis.<br />
Arch Biochem Biophys. 1982 215(2):524-31.<br />
35. Osickova A, Osicka R, Maier E, Benz R, Sebo P., An<br />
amphipathic alpha-helix including glutamates 509 and<br />
516 is crucial for membrane translocation of adenylate<br />
cyclase toxin and modulates formation and cation selectivity<br />
of its membrane channels., J Biol Chem. 1999<br />
Dec 31;274(52):37644-50.<br />
36. Benz R, Maier E, Ladant D, Ullmann A, Sebo P<br />
(1994), Adenylate cyclase toxin (CyaA) of Bordetella<br />
pertussis. Evidence for the formation of small ion-permeable<br />
channels and comparison with HlyA of Escherichia<br />
coli., J Biol Chem. 1994 Nov 4;<br />
269(44):27231-9.<br />
37. Welch RA. Pore-forming cytolysins of gram-negative<br />
bacteria. Mol Microbiol. 1991 5(3):521-8.<br />
38. Rose T, Sebo P, Bellalou J, Ladant D., Interaction of<br />
calcium with Bordetella pertussis adenylate cyclase<br />
toxin. Characterization of multiple calcium-binding<br />
sites and calcium-induced conformational changes., J<br />
Biol Chem. 1995 Nov 3; 270(44):26370-6.<br />
39. Collier RJ., Membrane translocation by anthrax toxin.,<br />
Mol Aspects Med. 2009 Dec; 30(6):413-22. Epub<br />
2009 Jun 27.<br />
40. Levy H, Weiss S, Altboum Z, Schlomovitz J, Rothschild<br />
N, Glinert I, Sittner A, Kobiler D., The effect<br />
of deletion of the edema factor on Bacillus anthracis<br />
pathogenicity in guinea pigs and rabbits., Microb<br />
Pathog. 2012 Jan; 52(1):55-60. Epub 2011 Oct 17.<br />
41. Stanley JL, Smith H. Purification of factor I and<br />
recognition of a third factor of the anthrax toxin. J Gen<br />
Microbiol. 1961 26:49-63.<br />
42. Robertson DL, Leppla SH. Molecular cloning and expression<br />
in Escherichia coli of the lethal factor gene<br />
of Bacillus anthracis. Gene. 1986 44(1):71-8.<br />
43. Robertson DL, Tippetts MT, Leppla SH. Nucleotide<br />
sequence of the Bacillus anthracis edema factor gene<br />
(cya): a calmodulin-dependent adenylate cyclase.<br />
Gene. 1988 73(2):363-71.<br />
44. Kumar P, Ahuja N, Bhatnagar R., Anthrax edema<br />
toxin requires influx of calcium for inducing cyclic<br />
AMP toxicity in target cells., Infect Immun. 2002 Sep;<br />
70(9):4997-5007<br />
45. Leppla SH. Bacillus anthracis calmodulin-dependent<br />
adenylate cyclase: chemical and enzymatic properties<br />
and interactions with eucaryotic cells. Adv Cyclic Nucleotide<br />
Protein Phosphorylation Res. 1984 17:189-<br />
98.<br />
46. Drum C. L., Yan S. Z., Bard J., Shen Y. Q., Lu D., Soelaiman<br />
S., Grabarek Z., Bohm A. and Tang W. J. Structural<br />
basis for the activation of anthrax adenylyl<br />
cy clase exotoxin by calmodulin. Nature 2002.<br />
415(6870):396-402.<br />
47. Liddington R. C. Anthrax: a molecular full nelson.<br />
Nature 2002. 415(6870):373-4.<br />
48. Labruyère E, Mock M, Surewicz WK, Mantsch HH,<br />
Rose T, Munier H, Sarfati RS, Bârzu O. Structural and<br />
ligand-binding properties of a truncated form of Bacil-<br />
73
COSTACHE et al.<br />
lus anthracis adenylate cyclase and of a catalytically<br />
inactive variant in which glutamine substitutes for lysine-346.<br />
Biochemistry. 1991 30(10):2619-24.<br />
49. Munier H, Blanco FJ, Prêcheur B, Diesis E, Nieto JL,<br />
Craescu CT, Bârzu O. Characterization of a synthetic<br />
calmodulin-binding peptide derived from Bacillus anthracis<br />
adenylate cyclase. J Biol Chem. 1993<br />
268(3):1695-701.<br />
50. Shen Y, Zhukovskaya NL, Guo Q, Florian J, Tang<br />
WJ., Calcium-independent calmodulin binding and<br />
two-metal-ion catalytic mechanism of anthrax edema<br />
factor., EMBO J. 2005 Mar 9; 24(5):929-41. Epub<br />
2005 Feb 17.<br />
51. Frank DW. The exoenzyme S regulon of Pseudo -<br />
monas aeruginosa. Mol Microbiol. 1997 26(4):621-9.<br />
52. Engel J, Balachandran P., Role of Pseudomonas aeruginosa<br />
type III effectors in disease., Curr Opin Microbiol.<br />
2009 Feb; 12(1):61-6. Epub 2009 Jan 23.<br />
53. Cowell BA, Evans DJ, Fleiszig SM., Actin cytoskeleton<br />
disruption by ExoY and its effects on Pseudomo -<br />
nas aeruginosa invasion., FEMS Microbiol Lett. 2005<br />
Sep 1;250(1):71-6.<br />
54. Yahr TL, Vallis AJ, Hancock MK, Barbieri JT, Frank<br />
DW., ExoY, an adenylate cyclase secreted by the<br />
Pseudomonas aeruginosa type III system., Proc Natl<br />
Acad Sci U S A. 1998 Nov 10; 95(23):13899-904.<br />
55. Shevchenko LA, Mishankin BN. Adenylate cyclase<br />
of the causative agent of plague: its purification and<br />
pro perties. Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol.<br />
1987, 15-20.<br />
56. Linder JU, Schultz JE., The class III adenylyl cyclases:<br />
multi-purpose signalling modules., Cell Signal.<br />
2003 Dec; 15(12):1081-9.<br />
57. Krupinski J, Coussen F, Bakalyar HA, Tang WJ, Fein -<br />
stein PG, Orth K, Slaughter C, Reed RR, Gilman AG.<br />
Adenylyl cyclase amino acid sequence: possible channel-<br />
or transporter-like structure. Science 1989.<br />
244(4912):1558-64.<br />
58. Sunahara R. K. and Taussig R. Isoforms of Mammalian<br />
Adenylyl Cyclase: Multiplicities of Signaling.<br />
Mol Interv. 2002. 2(3):168-84.<br />
59. Tang WJ, Krupinski J, Gilman AG. Expression and cha -<br />
racterization of calmodulin-activated (type I) adenylylcyclase.<br />
J Biol Chem. 1991, 266(13):8595-603.<br />
60. Linder J. U.. Class III adenylyl cyclases: molecular<br />
mechanisms of catalysis and regulation. Cell Mol Life<br />
Sci. 2006. 63(15):1736-51.<br />
61. William F. Simonds, G protein regulation of adenylate<br />
cyclase, Trends Pharmacol Sci. 1999 Feb; 20(2):66-73.<br />
74
IMPLICAReA ADeNILAT CICLAZeLOR ÎN PATOGeNITATe,<br />
UN MINIReVIeW<br />
Adriana Costache*, Nadia Bucurenci, Adrian Onu<br />
Laboratorul de Enzimologie şi microbiologie aplicatã, institutul naþional de Cercetare –<br />
dezvoltare pentru microbiologie şi imunologie „Cantacuzino”, bucureşti, România<br />
ReZUMAT<br />
AMP ciclic (AMPc), unul dintre cei mai importanţi mesageri secundari, se formează prin ciclizarea<br />
ATP, catalizată de adenilat ciclază (AC). AC este o enzimă larg răspândită, fiind prezentă atât în<br />
eucariote, cât şi în procariote. Deşi au aceeaşi funcţie enzimatică (ciclizarea ATP), structura acestor<br />
proteine variază în funcţie de rolul lor metabolic şi de organismul din care provin. Unele bacterii<br />
patogene le utilizează ca toxine, care interacţionează cu calmodulina (sau alt activator eucariot),<br />
ducând la sinteza AMPc şi perturbarea funcţiilor celulare în celula infectată. Alte bacterii patogene<br />
utilizează creşterea activităţii AC în beneficiul metabolismului propriu.<br />
Am folosit analiza secvenţelor domeniilor catalitice ale adenilat ciclazelor a două bacterii patogene<br />
(Bacillus anthracis şi Bordetella pertussis) cu structuri tridimensionale cunoscute, pentru a<br />
evidenţia o structură secundară posibilă pentru aminoacizii 1-255 al AC din Pseudomonas aeruginosa<br />
(cu 80 TKGFSVKGKSS 90 ca situs de legare pentru ATP).<br />
Cuvinte cheie: adenilat ciclazã, calmodulinã, AMPc, toxinã<br />
INTRODUCERE<br />
Adenilat ciclazele (AC) (E.C.4.6.1.1) sunt enzimele<br />
care catalizează sinteza AMP ciclic (adenozin<br />
3’, 5’-monofosfat ciclic, AMPc), prin ciclizarea adenozin<br />
trifosfatului (ATP).<br />
AMPc este unul dintre cei mai importanţi mesageri<br />
secundari din celulele eucariote. Acest mesager<br />
este implicat în multe procese și funcţii celulare,<br />
ca metabolismul glucidelor şi al lipidelor. Reglarea<br />
concentraţiei sale intracelulare se realizează prin acţiunea<br />
adenilat ciclazei şi fosfodiesterazei. AC este<br />
utilizată de unele bacterii patogene ca exotoxină<br />
care, prin creşterea concentraţiei AMPc în celulele<br />
infectate, provoacă perturbări metabolice severe şi<br />
moarte celulară. Cel mai cunoscut exemplu este AC<br />
din Bacillus anthracis sau Bordetella pertussis care,<br />
translocată în celula eucariotă şi activată de calmodulină<br />
(CaM), generează AMPc.<br />
Pe de altă parte, în alte bacterii, AMPc este implicată<br />
în reglarea activării transcrierii, care are un<br />
rol important în adaptarea la mediu şi patogenitatea<br />
microorganismelor.<br />
AC au fost împărţite, în funcţie de secvenţa proteică,<br />
în trei clase principale [1]:<br />
l Clasa I (clasa Enterobacteria) include AC prezente<br />
în patogeni enterobacterieni ca Escherichia coli,<br />
Salmonella typhimurium şi Yersinia pestis şi în<br />
bacterii Gram negative (de ex. Vibrio cholerae şi<br />
Aeromonas hydrophila) [2];<br />
l Clasa II include AC secretate de anumite bacterii<br />
(ex. Bacillus anthracis, Bordetella pertussis, Pseudomonas<br />
aeruginosa, Yersinia pestis), ca şi componente<br />
ale unor toxine;<br />
l Clasa III include AC prezente în numeroase organisme.<br />
Această clasă este cea mai mare şi include<br />
enzime care răspund la semnale extracelulare: hormoni,<br />
neurotransmiţători, chemochine etc.<br />
Pe măsură ce secvenţierea genomului a progresat,<br />
această clasificare a fost extinsă la şase clase:<br />
l Clasa IV include AC prezentă în Aeromonas hydrophila<br />
[3] şi Yersinia pestis [4];<br />
l Clasa V include AC prezentă în Prevotella ruminicola<br />
(o bacterie anaerobă din rumen) [5].<br />
l Clasa VI include AC prezentă în Rhizobium etli [6].<br />
În această lucrare ne vom focaliza pe primele<br />
trei clase de AC.<br />
*autor corespondent: Adriana Costache, INCDMI Cantacuzino, Bucureşti, România, email: adriana_rad@yahoo.com<br />
75
COSTACHE et al.<br />
ADENILAT CICLAZELE BACTERIILOR<br />
GRAM NEGATIVE (ADENILAT CICLAZELE DE<br />
CLASĂ I)<br />
Multe bacterii Gram negative sunt patogene (de<br />
ex. Enterobacteria), însă AC din această clasă nu<br />
sunt activate de factori celulari precum CaM. Ele au<br />
alţi activatori, având de cele mai multe ori roluri metabolice.<br />
De exemplu, pentru activarea completă a<br />
adenilat ciclazei Brevibacterium liquefaciens este<br />
necesar piruvatul, iar AC prezentă în Escherichia<br />
coli este inhibată de NaF, pirofosfat, anumiţi nucleozid-trifosfaţi<br />
şi de piridoxal-fosfat [7].<br />
Cea mai studiată AC din această clasă este cea<br />
a Escherichiei coli, codificată de gena cya. Există<br />
trei promotori care îi controlează translaţia. Deşi cya<br />
este slab tradusă in vivo [7], activitatea promotorilor<br />
cya variază în funcţie de sursa de carbon din mediul<br />
extracelular şi scade foarte mult în prezenţa unor<br />
mari cantităţi de AMPc exogen [8]. AC este de asemenea<br />
inhibată în prezenţa complexului AMPc - receptori<br />
pentru AMPc, care se leagă la regiunea<br />
operator a promotorului cyaP2 [9]. Celulele exercită<br />
un control foarte strict al expresiei cya, o creştere de<br />
şase ori peste valoarea normală putând fi letală [10].<br />
AC prezentă în Escherichia coli este o proteină<br />
de 848 aa, cu pI de 6,1. Este formată dintr-un domeniu<br />
de 395 de aminoacizi la capătul N-terminal, care<br />
conţine centrul catalitic activ şi un domeniu la capătul<br />
C-terminal, ce conţine domeniul reglator. De fapt,<br />
toate AC enterobacteriene sunt proteine alcătuite din<br />
două domenii funcţionale. Secvenţa N-terminală are<br />
activitate catalitică, în timp ce capătul C-terminal<br />
controlează inhibarea activităţii, mediată de glucoză,<br />
sau alte funcţii reglatoare. Digestia acestei enzime a<br />
permis izolarea unui fragment de 30 kDa care păstrează<br />
o parte din activitatea catalitică. Acest fragment,<br />
odată îngheţat, nu îşi pierde activitatea, spre<br />
deosebire de proteina integrală [7].<br />
Activitatea enzimatică AC poate varia într-un<br />
interval larg. Forma fosforilată a enzimei III Glc (proteină<br />
“phosphocarrier” – proteină transportoare de<br />
grupări fosfat) acţionează ca un factor de stimulare<br />
(forma defosforilată fiind inactivă). O explicaţie ar<br />
putea fi că enzima III Glc fosforilată fosforilează la<br />
rândul ei un aminoacid (probabil histidina sau cisteina)<br />
din domeniul reglator al AC, oprind astfel inhibiţia<br />
[11]. În absenţa glucozei, AC este fosforilată<br />
în totalitate şi are o înaltă activitate enzimatică.<br />
Compararea diferitelor AC din această clasă a<br />
permis identificarea a două histidine conservate şi se<br />
presupune că una dintre ele este fosforilată. Nu a fost<br />
depistată în Escherichia coli prezenţa unei proteine<br />
fosforilate de 95 kDa.<br />
O proteină oarecum similară cu RAS (activator<br />
al ciclazei Saccharomyces cerevisiae) există şi în Escherichia<br />
coli. Factorul de elongare Tu, o proteină<br />
care leagă GTP, activează AC prezentă în Escherichia<br />
coli, însă nu se cunoaşte încă modul în care interacţionează<br />
cu AC. Aceasta sugerează ca şi în cazul<br />
majorităţii eucariotelor, că ciclazele enterobacteriene<br />
par a fi reglate prin intermediul proteinei G [12].<br />
La enterobacterii, toate caracteristicile majore<br />
ale genei cya din Escherichia coli (ca numărul promotorilor<br />
şi genele din amonte şi aval) sunt conservate.<br />
AC Salmonellei typhimurium, ca şi cea a<br />
Esche richiei coli, este controlată de trei promotori şi<br />
este de asemenea inhibată de complexul AMPc - receptor<br />
pentru AMPc [13]. Gena Pasteurellei multocida<br />
este foarte asemănătoare cu cea de la entero -<br />
bacterii, însă organizarea locală a genelor este diferită.<br />
Gena din H. influenzae prezintă similitudini cu<br />
omoloaga sa din E. coli. Datele indică faptul că mecanismul<br />
de reglare a activităţii proteinelor corespunzătoare<br />
pare să fie conservat în această clasă.<br />
Expresia genică diferă la specii ca Pasteurella, Haemophillus<br />
sau Aeromonas, comparativ cu cea de la<br />
Enterobacteriaceae [1].<br />
ADENILAT CICLAZELE BACTERIILOR PA-<br />
TOGENE (ADENILAT CICLAZELE DE CLASĂ<br />
II)<br />
O strategie adoptată de bacteriile patogene este<br />
creşterea nivelului de AMPc prin secreţia de toxine<br />
cu activitate de adenilat ciclază. Acestea intră în celulele<br />
ţintă şi, după activarea lor de factori specifici<br />
din eucariote (precum CaM), declanşează sinteza intracelulară<br />
de AMPc. Au fost identificate şi studiate<br />
patru astfel de toxine: AC invazivă din Bordetella<br />
pertussis, factorul edematos al Bacillus anthracis,<br />
AC (ExoY) a Pseudomonas aeruginosa şi AC din<br />
Yersinia pestis.<br />
Principala ţintă a acestor toxine o reprezintă celulele<br />
efectoare ale sistemului imun. Modificarea<br />
concentraţiei intracelulare a AMPc duce la modificări<br />
ale proceselor celulare, ce influenţează sistemul<br />
imun şi facilitează supravieţuirea bacteriei în organism.<br />
Aceasta reprezintă, de cele mai multe ori, o<br />
etapă critică în patogenia multor boli infecţioase.<br />
1. Adenilat ciclaza Bodetellei pertussis<br />
Bacteriile din genul Bordetella sunt cocobacili<br />
gram negativi, aerobi, care determină infecţii ale<br />
tractului respirator al mamiferelor. Bordetella pertussis<br />
produce o afecţiune înalt contagioasă numită<br />
tuse convulsivă. Această boală este iniţiată în momentul<br />
aderării bacteriei la epiteliul respirator şi colonizării<br />
sale.<br />
76
Implicarea adenilat ciclazelor în patogenitate, un minireview<br />
Bordetella pertussis produce mai multe toxine,<br />
printre care AC invazivă (CyaA) şi toxina pertussis,<br />
ambele fiind esenţiale pentru virulenţa bacteriei. AC<br />
determină o creştere rapidă a nivelelor intracelulare<br />
de AMPc, necesare pentru iniţierea colonizării (în<br />
primele zile după infecţie). Acumularea AMPc în celulă<br />
duce la inhibarea funcţiilor celulare şi a mecanismelor<br />
de apărare [14, 15]. Cercetările au arătat că<br />
CyaA parţial purificată poate inhiba fagocitoza prin<br />
alterarea chemotaxiei şi a răspunsului oxidativ, prin<br />
creşterea AMPc intracelular şi poate determina apoptoza<br />
macrofagelor. Toxina pertussis, ce acţionează mai<br />
târziu, amplifică semnalul AMPc, jucând astfel un rol<br />
important în persistenţa bacteriei în organism [16].<br />
AC a fost menţionată ca exotoxină, pentru prima<br />
dată, în 1973 [17], iar după trei ani s-au făcut primele<br />
încercări de purificare [18]. Ulterior, în 1980, s-a observat<br />
că CyaA este activată de CaM [19].<br />
Proteina este secretată printr-un mecanism specific<br />
bacteriilor gram negative, care este similar eliberării<br />
hemolizinei din Escherichia coli [20]. În<br />
general, pentru secreţia proteinelor bacteriilor Gram<br />
negative, este necesară prezenţa unui peptid semnal<br />
la capătul N-terminal. Acesta determină translocarea<br />
lor în periplasmul bacteriei, după care peptidul este<br />
clivat şi proteina exportată printr-un mecanism specific.<br />
S-a observat că AC din Bordetella pertussis nu<br />
prezintă acest semnal peptidic, ceea ce indică faptul<br />
că ea nu este secretată prin mecanismul obişnuit de<br />
secreţie. Pentru secreţia proteinei CyaA, sunt necesare<br />
trei gene (cyaB, cyaD şi cyaE) situate în aval<br />
(downstream) faţă de gena cyaA (gena pentru adenilat<br />
ciclază). Toate sunt organizate într-un singur operon<br />
şi aflate sub controlul promotorului cyaA [16].<br />
În cazul hemolizinei (Escherichiei coli) sunt necesare<br />
genele hlyB şi hlyD, a treia (hlyC) fiind implicată<br />
în activarea proteinei. Gena cyaC, omoloaga<br />
genei hlyC, este situată în amonte (upstream) faţă de<br />
gena cyaA. Ordinea genelor în genomul Bordetellei<br />
pertussis este: cyaC, cyaA, cyaB, cyaD şi cyaE [1].<br />
Transcrierea genei cyaA, ca şi a celorlalte gene implicate<br />
în virulenţă, este reglată de semnale din mediul<br />
înconjurător.<br />
Clonarea AC din Bordetella pertussis a avut un<br />
rol important în analiza structurii şi a funcţiei acestei<br />
proteine. Prima adenilat ciclază purificată şi studiată<br />
din punct de vedere biochimic este cea a Bordetellei<br />
pertussis şi exprimată în Escherichia coli. În ciuda<br />
numeroaselor încercări, gena cyaA din Bordetella<br />
pertussis a fost clonată abia în 1988 [21].<br />
Sintetizată sub formă inactivă, AC este activată<br />
prin palmitoilarea a două resturi de lizină aflate în<br />
poziţiile 860 şi 983 [22], proces dependent de produsul<br />
genei cyaC [20].<br />
AC prezentă în Bordetella pertussis este o proteină<br />
de 1706 aminoacizi, cu o structură modulară<br />
cu două domenii funcţionale. Primii ~400 aminoacizi<br />
(capătul N-terminal) constituie domeniul catalitic<br />
activat de CaM. Restul de 1306 aminoacizi<br />
(situaţi în regiunea C-terminală) formează o hemolizină<br />
cu rol în legarea şi internalizarea domeniului<br />
catalitic în celula eucariotă. Cele două domenii pot<br />
funcţiona independent unul de celălalt [23].<br />
Proteina completă are o masă moleculară de 200<br />
kDa. Prin digestia proteinei cu enzime proteolitice<br />
se obţine un fragment de 43 kDa (domeniul catalitic)<br />
cu o activitate enzimatică similară cu cea a proteinei<br />
întregi [24].<br />
CyaA poate interacţiona cu diferite tipuri de celule,<br />
însă principala ţintă a toxinei o constituie celulele<br />
efectoare ale sistemului imun. Aceasta îşi<br />
injectează domeniul catalitic în citosolul celulei<br />
gazdă, unde, după activarea de către CaM, produce<br />
cantităţi mari de AMPc. Domeniul catalitic pare a fi<br />
translocat prin membrana celulei ţintă direct în citosol<br />
printr-un proces de internalizare. Există câteva<br />
dovezi care privesc mecanismul de translocare. În<br />
primul rând, se poate detecta creşterea nivelului de<br />
AMPc intracelular, la câteva secunde după adăugarea<br />
toxinei CyaA. Pătrunderea prin vezicule necesită<br />
un timp mai îndelungat şi este dependentă de pH-ul<br />
veziculelor endocitare. Şi, nu în ultimul rând, CyaA<br />
poate invada celulele care au un transport membranar<br />
redus, cum ar fi eritrocitul mamalian [20].<br />
Recent a fost propus un model pentru mecanismul<br />
de internalizare a AC în celule. Acesta implică<br />
doi conformeri distincţi care utilizează acelaşi segment<br />
al subdomeniului hidrofob din domeniul hemo -<br />
litic al AC. Un conformer formează pori oligomerici<br />
selectivi pentru cationi, care determină efluxul de<br />
potasiu din fagocit. Celălalt conformer este monomer<br />
şi răspunde de translocarea AC în celulă [25, 26,<br />
27]. Domeniul catalitic este depliat şi translocat prin<br />
membrană. Acest proces de pătrundere în interiorul<br />
celulei eucariote este dependent de calciu. Legarea<br />
Ca 2+ determină modificări conformaţionale ale proteinei,<br />
de la forma globulară la forma alungită.<br />
Translocarea domeniului AC în celula gazdă permite<br />
afluxul Ca 2+ printr-un mecanism specific [28]. S-a<br />
demonstrat că regiunea 375-385 joacă un rol crucial<br />
în inserarea în membrană şi translocarea AC din Bordetella<br />
pertussis [29].<br />
Domeniul catalitic al adenilat ciclazei Bordetella<br />
pertussis<br />
Odată ajunsă în celulă, proteina este activată<br />
(prin modificarea conformaţiei domeniului catalitic)<br />
de lobul C-terminal al CaM şi catalizează sinteza<br />
77
COSTACHE et al.<br />
AMPc [19] (Fig. 1). Experimentele au arătat că enzima<br />
rămâne asociată membranei, cu domeniile de<br />
legare a ATP şi CaM expuse citosolului. Situsul de<br />
legare pentru ATP se află între aminoacizii 54-70 şi<br />
are secvenţa 54 GVATKGLGVHAKSSDWG 70 . Studiile<br />
de fluorescenţă au arătat că AC formează cu<br />
CaM un complex strâns legat prin mai multe puncte<br />
de contact. AC din Bordetella pertussis prezintă o<br />
mare afinitate pentru CaM, complexul format având<br />
o activitate enzimatică de peste 1000 ori mai mare<br />
faţă de enzima nativă. Ionii de Ca 2+ legaţi de CaM<br />
contribuie la stabilizarea complexului AC-CaM [30].<br />
Domeniul catalitic este alcătuit din două subdomenii:<br />
T 25 şi T 18 (obţinute in vitro prin proteoliză limitată).<br />
În T 25 (aminoacizii 1-224 = P 1-224 ) se<br />
gă seşte situsul catalitic, iar T 18 (aminoacizii 225-<br />
399 = P 225-399 ) conţine domeniul de legare a CaM<br />
[20]. Fragmentul N-terminal de 224 aminoacizi prezintă<br />
doar 0,1% din activitatea enzimei native. Se<br />
pare că acest fragment este deosebit de important în<br />
formarea centrului catalitic activ, dar în absenţa celuilalt<br />
fragment (care acţionează ca un activator al<br />
primului) nu poate avea activitate maximă, aminoacidul<br />
N 304 din structura CyaA fiind implicat în cataliză<br />
[31]. S-a dovedit experimental că fragmentul<br />
196-267 (parţial suprapus peste secvenţa celor două<br />
regiuni T 25 şi T 18 ) joacă un rol important în legarea<br />
CaM. Regiunile de contact între CyaA şi CaM includ<br />
patru segmente ale AC: H 197 –R 206 , R 235 –R 246 , R 250 –<br />
R 259 şi E 346 –R 360 . Studiile de cristalografie şi mutageneză<br />
dirijată au demonstrat că triptofanul W 242 este<br />
aminoacidul cheie implicat în legarea CaM. Acesta<br />
interacţionează cu segmentul C-terminal al CaM,<br />
fiind înconjurat, în buzunarul hidrofob, de I 125 , F 141<br />
şi patru reziduuri de metionină (M 169 , M 124 , M 144 şi<br />
M 145 ) [31]. Un alt rol important în legarea CaM este<br />
jucat de aminoacizii: R 258 , R 259 şi E 356 . [32].<br />
Cele două subdomenii (T 25 şi T 18 ), odată sepa -<br />
rate, se reasociază, cu refacerea activităţii enzimatice<br />
în prezenţa CaM [33].<br />
Domeniul de legare a CaM din miozin kinaza<br />
din muşchiul neted al găinii ( 494 RRKWQKTGHA-<br />
VRAIG 505 ) are o secvenţă similară cu un fragment<br />
din AC a Bordetellei pertussis, aflat în jumătatea N-<br />
terminală a centrului catalitic activ ( 164 RRKGGDD -<br />
FEAVKVIG 178 ), iar înlocuirea primilor trei ami no -<br />
acizi (RRK) cu resturi de acid glutamic duce la scăderea<br />
afinităţii AC pentru CaM. Aceasta se poate datora<br />
faptului că stabilizarea complexului AC-CaM se<br />
face prin interacţia dintre aminoacizii încărcaţi negativ<br />
ai CaM şi cei bazici (ca fragmentul RRK) ai<br />
AC [1]. CaM este necesară atât pentru declanşarea<br />
activităţii catalitice, cât şi pentru legarea nucleotidului<br />
la centrul catalitic activ al AC a Bordetellei pertussis.<br />
În interiorul situsului catalitic activ s-a identificat<br />
prezenţa a patru aminoacizi, cu rol esenţial atât<br />
în legarea ATP, cât şi din punct de vedere catalitic.<br />
Aceştia sunt: K 58 şi K 65 care aparţin unor secvenţe<br />
de tipul G——GK(T/S), precum şi D 188 şi D 190 din<br />
regiunea 184 PLTADID 190 . Toţi patru interacţionează<br />
cu Mg 2+ -ATP (la nivelul grupărilor fosfat din poziţiile<br />
α şi β) [1].<br />
Activitatea enzimatică a AC este dependentă de<br />
prezenţa cationilor divalenţi, dar nu este influenţată<br />
de prezenţa α-cetoacizilor sau a guaninei. Diferite<br />
substanţe amfifile, cum ar fi fosfatidil-colina, fosfatidil-etanolamina<br />
şi fosfatidil-serina, s-au dovedit a<br />
avea un efect stimulator asupra activităţii enzimatice<br />
a acestei proteine [34].<br />
Domeniul cu activitate de hemolizină al adenilat<br />
ciclazei Bordetellei pertussis<br />
La capătul C-terminal al proteinei, după domeniul<br />
catalitic, se află o secvenţă de 1300 de aminoacizi<br />
similară cu α-hemolizina din Escherichia coli.<br />
Domeniul este reprezentat de aminoacizii 400-1706,<br />
cu o activitate hemolitică dependentă de Ca 2+ şi are<br />
rolul de a traversa domeniul catalitic prin învelişul<br />
bacterian şi apoi prin cel al celulelor eucariote ţintă,<br />
fiind capabil să formeze canale ionice (selective pentru<br />
cationi) în membrana eucariotă. Este împărţit în<br />
trei subdomenii. Primul, localizat la nivelul aminoacizilor<br />
500-700, regiune formatoare de pori, este<br />
bogat în aminoacizi hidrofobi care formează patru<br />
potenţiale regiuni transmembranare [35]. Al doilea<br />
se situează între aminoacizii 700-1000 şi se aseamănă<br />
domeniului intern al α-hemolizinei Escherichiei<br />
coli, segment la nivelul căreia se produce<br />
palmitoilarea K 983 şi K 860 dependentă de CyaC [22].<br />
Ambele subdomenii sunt necesare pentru formarea<br />
de canale în bistratul lipidic membranar [36]. Al treilea,<br />
aflat între aminoacizii 1006-1638, alcătuit din<br />
38-42 nonapeptide bogate în glicină şi aspartat, este<br />
implicat în legarea ionilor de Ca 2+ şi în interacţia cu<br />
membrana celulelor ţintă [37, 38].<br />
2. Adenilat ciclaza Bacillus anthracis<br />
Antraxul este, în principal, o zoonoză transmisibilă<br />
şi la om prin contact cu animale infectate sau<br />
produse din animale contaminate. Boala este cauzată<br />
de o bacterie gram pozitivă, aerobă, sporulată, numită<br />
Bacillus anthracis. Este iniţiată prin pătrunderea<br />
sporilor în organism.<br />
Complexul toxic al antraxului are un caracter<br />
binar, componentele acestuia exprimându-se independent.<br />
Componenta enzimatică (factorul letal - LF<br />
şi factorul edematos - EF) acţionează în prezenţa<br />
78
Implicarea adenilat ciclazelor în patogenitate, un minireview<br />
substratului aflat în citosol, în timp ce componenta<br />
de legare (antigenul protector - PA) este o proteină<br />
multifuncţională care se leagă la receptorii de pe suprafaţa<br />
celulelor ţintă. În urma legării, are loc clivarea<br />
acesteia de către alte proteine de suprafaţă (de<br />
ex. furina), cu eliberarea unui fragment de 20 kDa<br />
de la capătul N-terminal. Fragmentul rămas de 63<br />
kDa (numit PA 63 ) este supus apoi oligomerizării,<br />
pentru a forma un heptamer inelar care leagă competitiv<br />
până la trei molecule (EF, LF sau ambele)<br />
[39]. Complexul rezultat suferă o endocitoză mediată<br />
de receptor. Ulterior, modificările conformaţionale<br />
datorate creşterii acidităţii din endosom duc la<br />
inserţia heptamerului în membrana endosomală şi la<br />
translocarea ulterioară a LF şi EF în citosol, unde îşi<br />
exercită efectul toxic asupra celulei gazdă. Deleţia<br />
PA influenţează virulenţa bacteriei [40].<br />
Luate separat, cele trei proteine PA, LF, EF nu<br />
sunt toxice. Combinaţia între PA şi LF, numită şi toxina<br />
letală, duce la moartea animalelor de laborator,<br />
în timp ce combinaţia între PA şi EF, numită şi toxina<br />
edematoasă, induce creşterea nivelelor de AMPc intracelulare<br />
şi produce edem [41].<br />
LF este o metaloproteinază dependentă de Zn,<br />
care clivează anumite izoforme de MAP kinaze ducând<br />
la moartea macrofagelor şi inhibarea proliferării<br />
celulare. EF este o adenilat ciclază dependentă de<br />
CaM şi Ca 2+ , care produce creşterea puternică a nivelelor<br />
intracelulare de AMPc, interferând cu semnalizarea<br />
celulară [42, 43]. EF singură nu este toxică,<br />
dar este necesară supravieţuirii sporilor germinaţi, în<br />
stadiile incipiente ale infecţiei [40].<br />
S-a demonstrat că, după translocarea EF în citosol,<br />
se declanşează un influx crescut de Ca 2+ . Absenţa<br />
Ca 2+ sau prezenţa unor antagonişti ai canalelor<br />
de Ca 2+ în mediul extracelular previne acumularea<br />
intracelulară a AMPc [16, 44]. Odată ajuns în citoplasmă,<br />
EF este activat de CaM şi catalizează sinteza<br />
de AMPc din ATP.<br />
Genele răspunzătoare de virulenţă sunt localizate<br />
în două plasmide: pXO1 (182 kb) şi pXO2 (95<br />
kb). Plasmida pXO1 conţine genele pagA, lef şi cya,<br />
care codifică componentele complexului toxic al antraxului<br />
şi anume proteinele PA, LF şi EF [42, 43].<br />
Expresia celor trei gene este reglată coordonat la<br />
nivel transcripţional prin sistemul tampon carbo -<br />
nat/bicarbonat şi prin temperatură [16]. Plasmida<br />
pXO2 conţine genele capA, capB şi capC, implicate<br />
în formarea capsulei.<br />
Gena cya codifică o proteină cu 800 de aminoacizi,<br />
cu o secvenţă semnal de 33 reziduuri de aminoacizi,<br />
aflată la capătul N-terminal şi care este îndepărtată<br />
după secreţie. Structura EF a fost determinată prin<br />
studii de cristalografie de raze X, făcute în prezenţa<br />
şi absenţa CaM. Această proteină este alcătuită din<br />
două domenii funcţionale. Domeniul N-terminal de<br />
30kDa, care prezintă o înaltă omologie cu cel din LF,<br />
este domeniul de legare la PA. Fragmentul 1-28 conţine<br />
un procent mare de reziduuri cu mare încărcătură<br />
electrică. Fragmentul 136 VYYEIGK 142 , identic<br />
cu secvenţa 147 VYYEIGK 153 al LF, este implicat în<br />
legarea PA. Iar înlocuirea resturilor de Y 137 , Y 138 ,<br />
I 140 şi K 142 cu A aboleşte capacitatea EF de a se lega<br />
la PA. Domeniul catalitic (de 58kDa) este situat imediat<br />
după cel de legare PA la nivelul reziduurilor<br />
262-767. Este dependent de CaM (Fig. 1.). Nici o<br />
activitate nu poate fi detectată în absenţa ei, complexul<br />
Ca 2+ -CaM fiind un activator pentru EF mult mai<br />
puternic decat CaM singură [45].<br />
Domeniul catalitic al adenilat ciclazei Bacillus<br />
anthracis<br />
Domeniul catalitic este alcătuit din 2 subdomenii:<br />
unul spre partea N-terminală, care conţine centrul<br />
catalitic, şi celălalt la capătul C-terminal, care<br />
leagă CaM.<br />
AC al Bacillus anthracis este dependentă de<br />
CaM şi de ioni divalenţi ca Mg 2+ şi Ca 2+ . Ionii de<br />
Ca 2+ sunt necesari pentru a forma complexul Ca 2+ -<br />
CaM, cu mare afinitate pentru enzimă (acest complex<br />
având un efect activator mai puternic decât<br />
CaM singură [45]). Mg 2+ formează cu ATP complexul<br />
Mg 2+ -ATP care acţionează ca substrat. Ca 2+ poate<br />
înlocui Mg 2+ , formând un complex cu ATP cu afinitate<br />
de cinci ori mai mare pentru situsul activ, dar<br />
care reduce viteza de reacţie enzimatică de 250 de<br />
ori. Domeniul catalitic al EF prezintă trei domenii<br />
globulare [46, 47]. Studiile asupra structurii secundare<br />
a AC au dus la concluzia că aceasta prezintă<br />
34% structuri β, 10% structuri α-helix şi 14% structuri<br />
“β-turn” [48]. S-a observat că valoarea pI a proteinei<br />
(fără domeniul N-terminal de 261 de ami noacizi<br />
răspunzător de interacţia acesteia cu PA), creşte<br />
peste 8, în comparaţie cu cea nativă care are un pI<br />
de 6,45 [1].<br />
Predicţia structurii secundare, precum şi studiile<br />
de dicroism circular şi spectroscopie RMN, sugerează<br />
că segmentul situat între aminoacizii 548 şi<br />
564 a AC prezentă în Bacillus anthracis ar putea lua<br />
parte la legarea CaM. Prin folosirea unui peptid sintetic,<br />
s-a observat că secvenţa de aminoacizi 532-565<br />
al acestei proteine prezintă o afinitate crescută pentru<br />
CaM. Acest segment, ca şi alte peptide cunoscute<br />
care leagă CaM, prezintă în mare parte aminoacizi<br />
bazici şi hidrofobi, separaţi în două fragmente de o<br />
structură α-helix [49]. La legarea CaM, sunt implicate<br />
patru regiuni din structura EF: 510-540, 615-<br />
79
COSTACHE et al.<br />
634, 647-672 şi 695-721, K 525 fiind aminoacidul<br />
cheie implicat în legare [46]. Fragmentul 579-590<br />
formează o buclă catalitică cu rolul de a stabiliza legarea<br />
de CaM [46, 50].<br />
În urma legării CaM, se produc modificări conformaţionale<br />
care duc la formarea unui situs cu înaltă<br />
afinitate pentru legarea ATP. Acest situs, identificat<br />
prin mutageneză dirijată, se află la nivelul<br />
314GxxxxGKS 321 (o secvenţă consens). Prin înlocuirea<br />
K 320 cu N are loc scăderea de 10 ori a activităţii,<br />
în raport cu proteina nativă. Structura cristalină a EF<br />
sugerează că H 351 (H 318 , dacă se ia în considerare<br />
proteina fără secvenţa semnal) are un rol important<br />
în cataliză [46]. Cu toate acestea, rezultatele cristalografice<br />
şi de mutageneză arată că H 351 nu serveşte<br />
ca bază catalitică, el putând fi răspunzător pentru deprotonarea<br />
grupării 3’OH a ATP [50]. R 329 , K 346 ,<br />
K 353 şi K 372 sunt implicaţi în legarea strânsă a ATP<br />
la centrul catalitic activ al enzimei [48, 50]. Aminoacizii<br />
D 491 şi D 493 au o contribuţie importantă în activitatea<br />
AC de legare a doi ioni metalici pentru a<br />
stabiliza intermediarul de reacţie [50]. Studii de activitate<br />
enzimatică au demonstrat că EF are o activitate<br />
mare, cu V max de 1,2 mmol AMPc/min/mg de<br />
proteină. EF este foarte sensibil la concentraţia Ca 2+ ,<br />
având o activitate optimă la 0,2 mM şi fiind inhibat<br />
de concentraţii mari [45].<br />
3. Adenilat ciclaza Pseudomonas aeruginosa<br />
(ExoY)<br />
Se cunosc trei specii de Pseudomonas care produc<br />
infecţii la subiecţi umani. Pseudomonas mallei<br />
produce răpciuga (morva) la cai, dar poate infecta şi<br />
omul. Pseudomonas pseudomallei produce melioidoză,<br />
o boală tropicală care afectează deopotrivă oamenii<br />
şi animalele. Pseudomonas aeruginosa, bac terie<br />
aerobă gram negativă, se găseşte predominant în<br />
sol şi apă. Este un patogen comun pentru plante şi animale.<br />
Este un agent patogen oportunist care produce<br />
infecţii ale tractului urinar şi ale sistemului respirator,<br />
dermatite, infecţii ale ţesuturilor moi, bacteriemie şi<br />
o varietate de infecţii sistemice, în special la persoanele<br />
cu arsuri grave, cancer sau SIDA, în general la<br />
persoane imunosupresate. Infecţia cu Pseudomonas<br />
aeruginosa prezintă trei etape: ataşarea şi colonizarea,<br />
invazia locală şi diseminarea în organism [16].<br />
În patogeneza Pseudomonas aeruginosa sunt<br />
implicaţi diferiţi determinanţi ca unele proteaze, alginatul,<br />
fosfolipazele şi toxinele. Un determinant important<br />
pentru virulenţă este regulonul ExoS, a cărui<br />
expresie este corelată cu diseminarea bacteriei de la<br />
locul colonizării în sistemul vascular. Regulonul<br />
ExoS reprezintă un set de gene pentru virulenţă, reglate<br />
în mod coordonat la nivel transcripţional de<br />
ExsA (o proteină reglatoare din familia AraC).<br />
Acesta îşi reglează propria sinteză, precum şi a unor<br />
operoni care codifică proteine implicate în citotoxicitatea<br />
eucariotelor, proces realizat prin intermediul<br />
unei secreţii de tip III, la care participă trei clase de<br />
proteine: componente ale aparatului de secreţie, proteine<br />
care mediază translocaţia efectorilor în celula<br />
gazdă şi proteine efectoare care perturbă procesele<br />
celulare normale [16]. Translocarea efectorilor duce<br />
la inhibarea fagocitozei, ceea ce permite multiplicarea<br />
bacteriei şi lezarea epiteliului. S-au identificat<br />
patru proteine efectoare, aparţinând regulonului<br />
ExoS: ExoS – o proteină bifuncţională cu activitate<br />
de activator N-terminal al GTP-azelor (GAP) şi<br />
ADP-riboziltransferazică, ExoU – cu o activitate de<br />
fosfolipază A2 care determină citotoxicitate acută,<br />
ExoT - o proteină bifuncţională înrudită cu ExoS şi<br />
ExoY – o AC [51, 52]. ExoU şi ExoS nu pot fi găsite<br />
împreună în aproape nici o tulpină, însă proteinele<br />
ExoT şi ExoY sunt codificate de aproape toate tulpinile.<br />
Toate cele patru proteine efector necesită câte<br />
un cofactor din celula gazdă pentru activare [52].<br />
Infecţia celulelor eucariote cu tulpini de Pseudomonas<br />
aeruginosa care exprimă AC (ExoY) duce<br />
la creşteri ale nivelelor de AMPc intracelular, precum<br />
şi la modificări morfologice ale celulei ca fragmentări<br />
ale citoscheletului şi rotunjirea celulelor.<br />
Acestea duc la inhibarea temporară a internalizării<br />
bacteriei în celulele epiteliale [53]. Aceste efecte nu<br />
se pot observa atunci când aparatul de secreţie de tip<br />
III este inactivat (prin mutaţii sau deleţii) sau se produce<br />
o formă inactivă de ExoY. Simpla adăugare de<br />
ExoY nu duce la creşterea nivelului de AMPc, ceea<br />
ce dovedeşte faptul că ExoY este introdusă în celulă<br />
printr-un mecanism de translocare de tip III (numit<br />
şi translocare polarizată) [16, 54].<br />
ExoY este o proteină de 42 kDa codificată de o<br />
genă de 1134 pb. Este o proteină termolabilă. Resturile<br />
de aminoacizi 41-107 şi 209-221 din ExoY<br />
prezintă omologie cu secvenţe ale EF din Bacillus<br />
anthracis şi ale AC invazive din Bordetella pertussis.<br />
Prima regiune conservată (cea între 41-107) conţine<br />
situsurile pentru ATP/GTP, situsuri care leagă α-fosfatul.<br />
Cea de-a doua regiune conservată (aflată între<br />
209-221) leagă β şi γ- fosfaţii din ATP şi prezintă<br />
omologie cu o serie de proteine care leagă nucleotide,<br />
incluzând piruvatkinaza şi fosfofructokinaza<br />
[16]. ExoY nu conţine sevenţe asemănătoare domeniilor<br />
de legare a CaM la AC din Bordetella pertussis<br />
sau Bacillus anthracis. Altă trăsătură distinctă este<br />
prezenţa a cinci cisteine în molecula ExoY. Pentru<br />
stimularea activităţii enzimatice, ea necesită o proteină<br />
eucariotă, diferită de CaM şi care nu a fost încă<br />
80
Implicarea adenilat ciclazelor în patogenitate, un minireview<br />
identificată [54]. Stimularea activităţii ExoY poate<br />
fi o strategie pentru prevenirea generării de AMPc<br />
în interiorul bacteriei. Prin mutageneză dirijată au<br />
fost identificaţi aminoacizii esenţiali pentru activitatea<br />
enzimatică a ExoY, aceştia fiind K 81 , K 88 , D 212<br />
şi D 214 [16].<br />
4. Adenilat ciclaza Yersiniei pestis<br />
Genul Yersinia cuprinde 11 specii, din care trei,<br />
Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica şi Yersinia<br />
pseudotuberculosis, sunt patogene pentru om. Ele<br />
determină un spectru larg de boli, de la ciuma pulmonară<br />
până la gastroenterita acută. Yersinia pestis,<br />
bacterie gram negativă, imobilă, nesporulată, este un<br />
bacil pleomorf care nu fermentează lactoza. Acest<br />
bacil aerob, facultativ anaerob, produce ciuma. Yersinia<br />
pestis este un patogen preponderent al rozătoarelor,<br />
transmiterea la om facându-se accidental, prin<br />
intermediul puricilor. La om, majoritatea celulelor<br />
bacteriene sunt fagocitate şi omorâte de leucocite polimorfonucleare<br />
(PMN). Puţinii bacili care sunt internalizaţi<br />
în macrofage, supravieţuiesc şi sinteti -<br />
zează factori de virulenţă. Prin spargerea celulei,<br />
aceştia sunt eliberaţi în mediul extracelular, declanşând<br />
infecţii sistemice. Infecţiile pulmonare prezintă<br />
o rată de mortalitate foarte mare [16].<br />
În Yersinia pestis s-au identificat trei forme de<br />
adenilat ciclază: cea legată de membrană, cea citoplasmatică<br />
şi cea secretată în mediul extracelular.<br />
Forma extracelulară este o proteină de 30kDa. Nu se<br />
ştiu prea multe despre rolul acestei AC, însă s-a arătat<br />
că proteina suprimă metabolismul oxidativ al leucocitelor<br />
peritoneale la şoarecii albi [55]. Din acest<br />
motiv, se presupune că ar fi un important factor de<br />
virulenţă.<br />
ADENILAT CICLAZELE DIN CLASA III<br />
AC din clasa III sunt prezente atât în procariote,<br />
cât şi în eucariote. Activarea acestor AC este iniţiată<br />
de legarea unor stimuli de receptorii de pe suprafaţa<br />
celulei.<br />
Au fost propuse patru subgrupuri (a-d) ale AC de<br />
clasă III, pe baza domeniilor catalitice. Subclasa IIIa<br />
prezintă motivul (F/Y)XX(F/Y)D la interfaţa dimerilor,<br />
precum şi motivul EKIK. Subclasa IIIb este caracteristică<br />
pentru AC sub formă de pseudodimer în<br />
bacterii şi mamifere (cea solubilă), activată de bicarbonat.<br />
Subclasa IIIc corespunde AC homodimere ale<br />
bacteriilor Gram pozitive şi Gram negative. Subclasa<br />
IIId este reprezentată de AC din protozoare, tripanosomatide<br />
şi ciuperci cu motivul YEVKY [56, 57].<br />
La mamifere, au fost identificate şi clonate nouă<br />
izoforme de AC ataşate de membrană (subclasa IIIa)<br />
şi una solubilă (subclasa IIIb) (Tabelul 1) [58].<br />
Deşi genele care codifică AC din clasa III nu<br />
sunt organizate în clustere, fiind dispersate pe mai<br />
mulţi cromozomi, enzimele au o topologie similară.<br />
Ele funcţionează ca dimeri: heterodimeri (mamifere),<br />
pseudoheterodimeri (metazoare) sau homodimeri<br />
(protozoare). Cataliza are loc la interfaţa<br />
dimerilor [56]. AC membranare ale mamiferelor prezintă<br />
două domenii transmembranare cu şase regiuni<br />
şi câteva posibile situsuri de fosforilare, care ar putea<br />
fi implicate în reglare. AC din creierul bovinelor are<br />
aceeaşi structură. Fiecare domeniu conţine şase regiuni<br />
hidrofobe transmembranare. Există două fragmente<br />
de aproximativ 350 şi 300 aminoacizi, una<br />
situată între prima şi a doua regiune transmembranară<br />
şi cealaltă la capătul C-teminal al proteinei. Ele<br />
formează centrul catalitic activ [1].<br />
Deşi nivelul expresiei celor două jumatăţi (fiecare<br />
conţine câte un domeniu transmembranar şi<br />
unul citoplasmatic) ale AC din creierul bovinelor<br />
(ex primate separat) este foarte mare, activitatea enzimatică<br />
a fiecăreia este sub 1%, comparativ cu cea<br />
a proteinei întregi. Însă, ca şi în cazul AC din Borde -<br />
tella pertussis, activitatea acesteia creşte semnificativ<br />
după coexpresia celor două domenii [59].<br />
Prima AC clonată de la mamifere a fost cea din<br />
creierul bovin, exprimată apoi în celule Sf9, vectorul<br />
utilizat fiind de orgine baculovirală. Această enzimă<br />
poate fi activată de CaM, forskolina şi G αs (subunitatea<br />
α a proteinei G care stimulează AC). Enzima<br />
recombinată este inhibată de subunităţile β şi γ ale<br />
proteinei G. Au mai fost clonate şi alte AC mamaliene,<br />
utilizând sonde obţinute din secvenţa celei bovine<br />
[60].<br />
Există opt aminoacizi foarte importanţi pentru<br />
cataliza AC de clasă III: două reziduuri aspartat care<br />
coordinează doi cofactori metalici (Mg 2+ sau Mn 2+ ),<br />
perechea lizină - aspartat implicată în legarea selectivă<br />
a substratului, perechea arginină - asparagină,<br />
care stabilizează structura de tranziţie şi perechea arginină<br />
- lizină implicată în poziţionarea grupării pirofosfat<br />
[56, 61].<br />
Toate tipurile de AC mamaliene, ataşate de<br />
membrană, sunt stimulate de G sα -GTP. Alţi factori<br />
stimulanţi sunt: forskolina (tipurile I-VIII), G βϒ (tipurile<br />
II, IV şi VII), protein-kinaza C (tipurile I, II,<br />
III, V şi VII). AC de tip I, III şi VII sunt singurele<br />
AC mamaliene care interacţionează cu CaM, aşa<br />
cum reiese din Fig. 1. Factori inhibitori ai AC sunt:<br />
protein-kinaza A, G iα -GTP şi Ca 2+ (tipurile V şi VI),<br />
G βϒ (tipurile I, III şi VIII), protein-kinaza C (tipurile<br />
IV şi VI). AC solubilă este diferită faţă de AC mamaliene,<br />
similară însă cu cea găsită în cianobacterii.<br />
Ea este activată de bicarbonat şi Ca 2+ [1, 56, 57, 61].<br />
81
COSTACHE et al.<br />
Proprieti<br />
Sensibile la<br />
complexul Ca 2 + -<br />
calmodulin<br />
Stimulate de<br />
subunitatea G <br />
a proteinei G<br />
Inhibate de Ca 2+<br />
i de subunitatea<br />
G a proteinei G<br />
Neinfluenat de<br />
forskolin<br />
Izoformele<br />
adenilat ciclazelor<br />
Tip I<br />
Tip III<br />
Tip VIII<br />
Tip II<br />
Tip IV<br />
Tip VII<br />
Tip V<br />
Tabel 1. Izoformele adenilat ciclazelor mamaliene<br />
Tip VI (considerate<br />
i ca o subfamilie<br />
a tipului V)<br />
Tip IX (cea mai divergent<br />
din familia adenilat<br />
ciclazelor membranare)<br />
Sursa<br />
Creier i glanda medulo-suprarenal<br />
Creier i în epiteliul olfactiv<br />
Creier, plmân, testicule, glanda suprarenal,<br />
uter, inima<br />
Creier, muchiul scheletic, plmân i inima<br />
Creier, rinichi, ficat, plmân, esut adipos brun,<br />
uter<br />
Origine ubicuitar (înalt exprimate în creier)<br />
Inim, creier, rinichi, ficat, uter, glanda<br />
suprarenal, esut adipos brun<br />
Ubicuitare<br />
Solubil Adenilat ciclaza solubil Testicule<br />
Creier i în esut muscular<br />
Complexul CaM·- Ca 2+ este un puternic stimulator<br />
al AC de tip I şi VIII. Se presupune că există<br />
două domenii de legare a CaM în structura AC de tip<br />
I: unul situat între aminoacizii 495-522 şi celălalt<br />
între aminoacizii 1027-1050, ambele bogate în aminoacizi<br />
bazici. Analizele de fluorescenţă au arătat că<br />
secvenţa de la nivelul 495-522 este cea mai probabilă<br />
a fi un astfel de domeniu. Afinitatea acestui peptid<br />
pentru CaM este de şapte ori mai mare decât a<br />
proteinei întregi [59]. Pe de altă parte, situsul de legare<br />
a CaM din celelalte tipuri de AC diferă de<br />
acesta, unul din situsuri aflându-se în regiunea N-<br />
terminală, iar celălalt în regiunea C-terminală. Studiile<br />
au arătat că, pentru activarea in vitro a enzimei,<br />
este suficient cel din regiunea C-terminală, dar in<br />
vivo este necesar şi cel din regiunea N-terminală.<br />
Acelaşi complex CaM·- Ca 2+ acţionează ca un<br />
activator secundar al activităţii AC de tip III. Aceasta<br />
este activată în prealabil de către subunitatea α a proteinei<br />
G sau de către forskolină [57].<br />
ADENILAT CICLAZE – ASEMĂNĂRI ŞI<br />
DEOSEBIRI<br />
Organizarea informaţiei genetice pentru AC din<br />
diverse surse este diferită. Astfel, gena pentru adenilat<br />
ciclază la Bordetella pertussis (cyaA) este situată<br />
într-un operon (aflat sub controlul promotorului<br />
cyaA). La Bacillus anthracis cya se găseşte într-una<br />
din cele două plasmide de virulenţă pe care le conţine<br />
(pXO1), iar la Pseudomonas aeruginosa, gena<br />
pentru ExoY aparţine regulonului ExoS, care este reglat<br />
de către proteina ExsA [16, 42, 43]. Genele pentru<br />
diferite tipuri de AC de clasă III sunt organizate<br />
pe mai mulţi cromozomi. Aceasta denotă faptul că<br />
expresia acestor enzime este reglată diferit, în funcţie<br />
de condiţiile de mediu.<br />
Structura acestor proteine enzimatice variază în<br />
funcţie de organismul din care provin şi de modul<br />
lor de acţiune. CyaA şi AC din Escherichia coli au o<br />
construcţie modulară, fiind alcătuite din două domenii<br />
funcţionale: unul catalitic şi altul hemolitic pentru<br />
Fig. 1 - Activarea AC de complexul Ca 2+ -CaM<br />
82
Implicarea adenilat ciclazelor în patogenitate, un minireview<br />
CyaA şi reglator pentru Cya din Escherichia coli<br />
[23]. EF din Bacillus anthracis apar ţine complexului<br />
toxic. Pentru a-şi exercita funcţia în celula gazdă, enzima<br />
trebuie mai întâi să interacţioneze cu PA. Domeniul<br />
catalitic al enzimei din Bacillus anthracis se<br />
află în zona C-terminală a proteinei, în timp ce la capătul<br />
N-terminal se găseşte domeniul de legare la PA<br />
[38]. Pentru enzimele din celelalte bacterii patogene,<br />
domeniul catalitic se află la capătul N-terminal (ex.<br />
CyaA, ExoY). La AC de clasă III situaţia este diferită,<br />
deoarece ele funcţionează ca dimeri cu situsul<br />
catalitic aflat la interfaţa dintre dimeri [56]. AC mamaliene<br />
membranare prezintă două domenii similare<br />
(fiecare având cate un subdomeniu transmembranar,<br />
alcătuit din şase regiuni hidrofobe şi un subdomeniu<br />
citoplasmatic) care nu pot funcţiona independent unul<br />
de celălalt [1].<br />
AC din bacterii patogene prezintă trei regiuni<br />
înalt omoloage, însă mecanismele de secreţie şi pătrundere<br />
în celula eucariotă diferă. Internalizarea<br />
acestor toxine de către celulele gazdă eucariote se<br />
realizează prin intermediul domeniului hemolitic<br />
(care creează pori în membrană) în cazul Bordetella<br />
pertussis şi prin endocitoză în cazul Bacillus anthracis<br />
[16, 25, 26, 27, 39]. In ambele cazuri, internalizarea<br />
domeniului catalitic declanşează un aflux<br />
crescut de Ca 2+ în celula gazdă [16, 28, 44]. Ele sunt<br />
actívate de CaM [19, 42]. Un alt factor de virulenţă<br />
aflat la Pseudomonas aeruginosa, numit proteina<br />
ExoY, este o adenilat ciclază “injectată” în celula<br />
gazdă printr-un mecanism de tip III şi activată de un<br />
factor eucariot diferit de CaM [16, 54].<br />
După pătrundere în citoplasmă, enzima interacţionează<br />
cu CaM (sau alt activator), determinând sinteza<br />
puternică a AMPc şi perturbarea funcţiilor<br />
celulare [14, 15, 41, 53]. AC din clasa II , dintre care<br />
toxina CyaA din Bordetella pertussis sau factorul<br />
edematos (EF), produs de Bacillus anthracis, prezintă<br />
nişte trăsături speciale, dintre care cea mai importantă<br />
este activarea acesteia de către CaM,<br />
proteină absentă în bacterie [19, 42, 43]. Dependenţa<br />
AC bacteriene de CaM reprezintă un aspect important<br />
al acestora deoarece CaM nu este sintetizată de<br />
bacterie. O activitate adenilat ciclazică constitutivă<br />
ar putea fi letală pentru bacterie.<br />
Deşi, la prima vedere, reactivitatea încrucișată<br />
a acestor ciclaze (în special a celor din Bordetella<br />
pertussis şi Bacillus anthracis) sugerează o structură<br />
similară, structura primară prezintă diferenţe im por -<br />
tante în ceea ce priveşte dimensiunea, precum şi o<br />
similitudine relativ scăzută a secvenţelor. Locaţia situsurilor<br />
de legare a ATP şi mecanismul de activare<br />
al AC din Bordetella pertussis şi Bacillus anthracis<br />
sunt asemănătoare. După ce am analizat secvenţele<br />
celor trei AC din bacterii patogene corespunzătoare<br />
domeniilor catalitice - respectiv CyaA din Bacillus<br />
Fig. 2 - Aliniamentul secvenţelor: CyaA din Bacillus anthracis (resturile 224-506),<br />
ExoY din Pseudomonas aeruginosa (resturile 1-255) şi CyaA din Bordetella pertussis (1-231)<br />
şi structura secundară propusă pentru domeniul catalitic al ExoY (vezi casuţa)<br />
83
COSTACHE et al.<br />
Fig. 3 - Analiza structurii tridimensionale a fragmentelor de AC:<br />
A. Bacillus. anthracis CyaA (fragmentul 224-506); B. Bordetella pertussis CyaA (fragmentul 1-231) şi<br />
C. Bacillus anthracis CyaA (fragmentul 224-506) suprapus peste Bordetella pertussis CyaA (fragmentul 1-231)<br />
anthracis (resturile 224-506), ExoY din Pseudomonas<br />
aeruginosa (resturile 1-255) şi CyaA din Bordetella<br />
pertussis (1-231) - am ajuns la concluzia că<br />
situsul de legare a ATP din Pseudomonas aeruginosa<br />
ar putea fi: 80 TKGFSVKGKSS 90 (vezi căsuţa din<br />
aliniamentul din Fig. 2). Pe baza acestei analize a<br />
secvenţelor proteice şi a analizei structurii tridimensionale<br />
a acestor fragmente, propunem o structură<br />
secundară (evidenţiată în Fig. 2) pentru acest fragment<br />
din ExoY.<br />
AC sunt enzime larg răspândite, fiind prezente<br />
atât la procariote, cât şi la eucariote. Deşi au acelaşi<br />
tip de activitate (ciclizarea ATP), structura acestor<br />
proteine variază, depinzând atât de funcţie, cât şi de<br />
organismul care le produce. Analiza secvenţei domeniului<br />
catalitic de la diferite specii bacteriene cu<br />
structură tridimensională cunoscută face posibilă<br />
predicţia conformaţiei regiunii de legare a ATP şi la<br />
AC produse de alte tulpini bateriene.<br />
BIBLIOGRAFIE<br />
1. Barzu O. and Danchin A. Adenylyl Cyclases: A He -<br />
terogeneous Class of ATP-Utilizing Enzymes. Prog<br />
Nucleic Acid Res Mol Biol. 1994. 49:241-83.<br />
2. Baker DA, Kelly JM. Structure, function and evolution<br />
of microbial adenylyl and guanylyl cyclases. Mol Microbiol<br />
2004. 52(5):1229-42.<br />
3. Sismeiro O, Trotot P, Biville F, Vivares C, Danchin A.,<br />
Aeromonas hydrophila adenylyl cyclase 2: a new class<br />
of adenylyl cyclases with thermophilic properties and<br />
sequence similarities to proteins from hyperthermophilic<br />
archaebacteria., J Bacteriol. 1998 Jul;<br />
180(13):3339-44.<br />
4. Smith N, Kim SK, Reddy PT, Gallagher DT., Crystallization<br />
of the class IV adenylyl cyclase from Yersinia<br />
pestis., Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun.<br />
2006 Mar 1;62(Pt 3):200-4. Epub 2006 Feb 10.<br />
5. Cotta MA, Whitehead TR & Wheeler MB (1998) Identification<br />
of a novel adenylate cyclase in the ruminal<br />
anaerobe, Prevotella ruminicola D31d. FEMS Microbiol<br />
Lett 164, 257–260.<br />
6. Tellez-Sosa J, Soberon N, Vega-Segura A, Torres-Marquez<br />
ME, Cevallos MA., The Rhizobium etli cyaC<br />
product: characterization of a novel adenylate cyclase<br />
class., J Bacteriol. 2002 Jul; 184(13):3560-8.<br />
7. Roy, A., P. Glaser, and A. Danchin. Aspects of the regulation<br />
of adenylate cyclase synthesis by Escherichia<br />
coli K-12. J. Gen. Microbiol. 1988. 134(2):359-67.<br />
8. Jovanovitch, S. B. Regulation of cya-lac fusions by<br />
cyclic AMP in Salmonella typhimurium. J Bacteriol.<br />
1985. 161(2):641-9.<br />
9. Mori, K., and H. Aiba. Evidence for negative control<br />
of cya transcription by cAMP and cAMP receptor protein<br />
in intact Escherichia coli cells. J Biol Chem. 1985.<br />
260(27):14838-43.<br />
10. Reddy, P. S., A. Peterkofsky, and K. McKenney.<br />
Translational efficiency of the E. coli adenylate cyclase<br />
gene: mutating the UUG initiation codon to<br />
GUG or AUG results in increased gene expression.<br />
Proc Natl Acad Sci U S A. 1985. 82(17):5656-60.<br />
11. Levy S., Zeng G.Q., and Danchin A. Cyclic AMP synthesis<br />
in Escherichia coli strains bearing known deletions<br />
in the pts phosphotransferase operon. Gene.<br />
1990. 86(1):27-33.<br />
12. Reddy P., Miller D. and Peterkofsky A., Stimulation of<br />
Escherichia coli adenylate cyclase activity by elongation<br />
factor Tu, a GTP-binding protein essential for protein<br />
synthesis. J Biol Chem. 1986 261(25):11448-51.<br />
13. Thorner, L. K., J. P. Fandl, and S. W. Artz. Analysis<br />
of sequence elements important for expression and<br />
84
Implicarea adenilat ciclazelor în patogenitate, un minireview<br />
regulation of the adenylate cyclase gene (cya) of Salmonella<br />
typhimurium. Genetics. 1990. 125(4):709-17.<br />
14. Confer DL, Eaton JW. (1982), Phagocyte impotence<br />
caused by an invasive bacterial adenylate cyclase.,<br />
Science. 1982 Sep 3;217(4563):948-50.<br />
15. Hanski E., Invasive adenylate cyclase toxin of Bordetella<br />
pertussis, Trends Biochem Sci. 1989 Nov;<br />
14(11):459-63.<br />
16. Ahuja N, Kumar P, Bhatnagar R. The Adenylate Cyclase<br />
Toxins. Crit Rev Microbiol 2004. 30(3):187-196.<br />
17. Wolff J, Cook GH. Activation of thyroid membrane<br />
adenylate cyclase by purine nucleotides. J Biol Chem.<br />
1973, 248(1):350-5.<br />
18. Hewlett E, Wolff J. Soluble adenylate cyclase from the<br />
culture medium of Bordetella pertussis: purification and<br />
characterization. J Bacteriol. 1976, 127(2):890-8.<br />
19. Wolff J., Cook G. H., Goldhammer A. R., and Ber -<br />
kowitz S. A. Calmodulin activates prokaryotic adenylate<br />
cyclase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1980, 77(7):<br />
3841-844.<br />
20. Landant D., Ullmann A. Bordetella pertussis adenylate<br />
cyclase: a toxin with multiple talents. Trends Micobiol<br />
1999. 7(4): 172-6.<br />
21. Glaser P, Ladant D, Sezer O, Pichot F, Ullmann A,<br />
Danchin A. The calmodulin-sensitive adenylate cyclase<br />
of Bordetella pertussis: cloning and expression<br />
in Escherichia coli. Mol Microbiol 1988. 2(1):19-30.<br />
22. Masin J, Basler M, Knapp O, El-Azami-El-Idrissi M,<br />
Maier E, Konopasek I, Benz R, Leclerc C, Sebo P.,<br />
Acylation of lysine 860 allows tight binding and cytotoxicity<br />
of Bordetella adenylate cyclase on CD11bexpressing<br />
cells., Biochemistry. 2005 Sep 27;<br />
44(38):12759-66.<br />
23. Sakamoto H, Bellalou J, Sebo P, Ladant D. Bordetella<br />
pertussis adenylate cyclase toxin. Structural and functional<br />
independence of the catalytic and hemolytic activities.<br />
J Biol Chem. 1992 267(19):13598-602.<br />
24. Bellalou J, Sakamoto H, Ladant D, Geoffroy C, Ullmann<br />
A. Deletions affecting hemolytic and toxin activities<br />
of Bordetella pertussis adenylate cyclase.<br />
Infect Immun. 1990, 58(10):3242-7.<br />
25. Vojtova-Vodolanova J, Basler M, Osicka R, Knapp O,<br />
Maier E, Cerny J, Benada O, Benz R, Sebo P.,<br />
Oligomerization is involved in pore formation by Bordetella<br />
adenylate cyclase toxin., FASEB J. 2009<br />
Sep;23(9):2831-43. Epub 2009 May 5.<br />
26. Osickova A, Masin J, Fayolle C, Krusek J, Basler M,<br />
Pospisilova E, Leclerc C, Osicka R, Sebo P., Adenylate<br />
cyclase toxin translocates across target cell membrane<br />
without forming a pore., Mol Microbiol. 2010<br />
Mar;75(6):1550-62. Epub 2010 Feb 23.<br />
27. Fiser R, Masin J, Bumba L, Pospisilova E, Fayolle C,<br />
Basler M, Sadilkova L, Adkins I, Kamanova J, Cerny<br />
J, Konopasek I, Osicka R, Leclerc C, Sebo P., Calcium<br />
Influx Rescues Adenylate Cyclase-Hemolysin from<br />
Rapid Cell Membrane Removal and Enables Phagocyte<br />
Permeabilization by Toxin Pores, PLoS Pathog.<br />
2012 April; 8(4): e1002580.<br />
28. Fiser R, Masín J, Basler M, Krusek J, Spuláková V,<br />
Konopásek I, Sebo P., Third activity of Bordetella<br />
adenylate cyclase (AC) toxin-hemolysin. Membrane<br />
translocation of AC domain polypeptide promotes calcium<br />
influx into CD11b+ monocytes independently of<br />
the catalytic and hemolytic activities., J Biol Chem.<br />
2007 Feb 2; 282(5):2808-20. Epub 2006 Dec 4.<br />
29. Karst JC, Barker R, Devi U, Swann MJ, Davi M,<br />
Roser SJ, Ladant D, Chenal A., Identification of a region<br />
that assists membrane insertion and translocation<br />
of the catalytic domain of Bordetella pertussis CyaA<br />
toxin., J Biol Chem. 2012 Mar 16; 287(12):9200-12.<br />
Epub 2012 Jan 12.<br />
30. Selwa E, Laine E, Malliavin TE., Differential role of<br />
calmodulin and calcium ions in the stabilization of the<br />
catalytic domain of adenyl cyclase CyaA from Bordetella<br />
pertussis., Proteins. 2012 Apr; 80(4):1028-40.<br />
doi: 10.1002/prot.24005. Epub 2012 Jan 9.<br />
31. Guo Q, Shen Y, Lee YS, Gibbs CS, Mrksich M, Tang<br />
WJ. Structural basis for the interaction of Bordetella<br />
pertussis adenylyl cyclase toxin with calmodulin.<br />
EMBO J. 2005. 24(18):3190-201.<br />
32. Glaser P, Elmaoglou-Lazaridou A, Krin E, Ladant D,<br />
Bârzu O, Danchin A. Identification of residues essential<br />
for catalysis and binding of calmodulin in Bordetella<br />
pertussis adenylate cyclase by site-directed<br />
mutagenesis. EMBO J. 1989, 8(3):967-72.<br />
33. Dautin N., Karimova G., Ladant D. Bordetella pertussis<br />
adenylate cyclase toxin: a versatile screening tool.<br />
Toxicon 2002. 40: 1383–1387.<br />
34. Wolff J, Cook GH. Amphiphile-mediated activation<br />
of soluble adenylate cyclase of Bordetella pertussis.<br />
Arch Biochem Biophys. 1982 215(2):524-31.<br />
35. Osickova A, Osicka R, Maier E, Benz R, Sebo P., An<br />
amphipathic alpha-helix including glutamates 509 and<br />
516 is crucial for membrane translocation of adenylate<br />
cyclase toxin and modulates formation and cation selectivity<br />
of its membrane channels., J Biol Chem. 1999<br />
Dec 31;274(52):37644-50.<br />
36. Benz R, Maier E, Ladant D, Ullmann A, Sebo P (1994),<br />
Adenylate cyclase toxin (CyaA) of Bordetella pertussis.<br />
Evidence for the formation of small ion-permeable<br />
channels and comparison with HlyA of Escherichia<br />
coli., J Biol Chem. 1994 Nov 4; 269(44):27231-9.<br />
37. Welch RA. Pore-forming cytolysins of gram-negative<br />
bacteria. Mol Microbiol. 1991 5(3):521-8.<br />
38. Rose T, Sebo P, Bellalou J, Ladant D., Interaction of<br />
calcium with Bordetella pertussis adenylate cyclase<br />
toxin. Characterization of multiple calcium-binding<br />
sites and calcium-induced conformational changes., J<br />
Biol Chem. 1995 Nov 3; 270(44):26370-6.<br />
39. Collier RJ., Membrane translocation by anthrax toxin.,<br />
Mol Aspects Med. 2009 Dec; 30(6):413-22. Epub<br />
2009 Jun 27.<br />
40. Levy H, Weiss S, Altboum Z, Schlomovitz J, Rothschild<br />
N, Glinert I, Sittner A, Kobiler D., The effect<br />
of deletion of the edema factor on Bacillus anthracis<br />
pathogenicity in guinea pigs and rabbits., Microb<br />
Pathog. 2012 Jan; 52(1):55-60. Epub 2011 Oct 17.<br />
41. Stanley JL, Smith H. Purification of factor I and<br />
recognition of a third factor of the anthrax toxin. J Gen<br />
Microbiol. 1961 26:49-63.<br />
42. Robertson DL, Leppla SH. Molecular cloning and expression<br />
in Escherichia coli of the lethal factor gene<br />
of Bacillus anthracis. Gene. 1986 44(1):71-8.<br />
43. Robertson DL, Tippetts MT, Leppla SH. Nucleotide<br />
sequence of the Bacillus anthracis edema factor gene<br />
85
COSTACHE et al.<br />
(cya): a calmodulin-dependent adenylate cyclase.<br />
Gene. 1988 73(2):363-71.<br />
44. Kumar P, Ahuja N, Bhatnagar R., Anthrax edema<br />
toxin requires influx of calcium for inducing cyclic<br />
AMP toxicity in target cells., Infect Immun. 2002 Sep;<br />
70(9):4997-5007<br />
45. Leppla SH. Bacillus anthracis calmodulin-dependent<br />
adenylate cyclase: chemical and enzymatic properties<br />
and interactions with eucaryotic cells. Adv Cyclic Nucleotide<br />
Protein Phosphorylation Res. 1984 17:189-98.<br />
46. Drum C. L., Yan S. Z., Bard J., Shen Y. Q., Lu D., Soelaiman<br />
S., Grabarek Z., Bohm A. and Tang W. J. Structural<br />
basis for the activation of anthrax adenylyl<br />
cy clase exotoxin by calmodulin. Nature 2002.<br />
415(6870):396-402.<br />
47. Liddington R. C. Anthrax: a molecular full nelson.<br />
Nature 2002. 415(6870):373-4.<br />
48. Labruyère E, Mock M, Surewicz WK, Mantsch HH,<br />
Rose T, Munier H, Sarfati RS, Bârzu O. Structural and<br />
ligand-binding properties of a truncated form of Bacillus<br />
anthracis adenylate cyclase and of a catalytically<br />
inactive variant in which glutamine substitutes for lysine-346.<br />
Biochemistry. 1991 30(10):2619-24.<br />
49. Munier H, Blanco FJ, Prêcheur B, Diesis E, Nieto JL,<br />
Craescu CT, Bârzu O. Characterization of a synthetic<br />
calmodulin-binding peptide derived from Bacillus anthracis<br />
adenylate cyclase. J Biol Chem. 1993<br />
268(3):1695-701.<br />
50. Shen Y, Zhukovskaya NL, Guo Q, Florian J, Tang<br />
WJ., Calcium-independent calmodulin binding and<br />
two-metal-ion catalytic mechanism of anthrax edema<br />
factor., EMBO J. 2005 Mar 9; 24(5):929-41. Epub<br />
2005 Feb 17.<br />
51. Frank DW. The exoenzyme S regulon of Pseudo -<br />
monas aeruginosa. Mol Microbiol. 1997 26(4):621-9.<br />
52. Engel J, Balachandran P., Role of Pseudomonas aeru -<br />
ginosa type III effectors in disease., Curr Opin Microbiol.<br />
2009 Feb; 12(1):61-6. Epub 2009 Jan 23.<br />
53. Cowell BA, Evans DJ, Fleiszig SM., Actin cytoskeleton<br />
disruption by ExoY and its effects on Pseudomo -<br />
nas aeruginosa invasion., FEMS Microbiol Lett. 2005<br />
Sep 1;250(1):71-6.<br />
54. Yahr TL, Vallis AJ, Hancock MK, Barbieri JT, Frank<br />
DW., ExoY, an adenylate cyclase secreted by the<br />
Pseudomonas aeruginosa type III system., Proc Natl<br />
Acad Sci U S A. 1998 Nov 10; 95(23):13899-904.<br />
55. Shevchenko LA, Mishankin BN. Adenylate cyclase<br />
of the causative agent of plague: its purification and<br />
pro perties. Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol.<br />
1987, 15-20.<br />
56. Linder JU, Schultz JE., The class III adenylyl cyclases:<br />
multi-purpose signalling modules., Cell Signal.<br />
2003 Dec; 15(12):1081-9.<br />
57. Krupinski J, Coussen F, Bakalyar HA, Tang WJ, Fein -<br />
stein PG, Orth K, Slaughter C, Reed RR, Gilman AG.<br />
Adenylyl cyclase amino acid sequence: possible channel-<br />
or transporter-like structure. Science 1989.<br />
244(4912):1558-64.<br />
58. Sunahara R. K. and Taussig R. Isoforms of Mammalian<br />
Adenylyl Cyclase: Multiplicities of Signaling.<br />
Mol Interv. 2002. 2(3):168-84.<br />
59. Tang WJ, Krupinski J, Gilman AG. Expression and cha -<br />
racterization of calmodulin-activated (type I) adenylylcyclase.<br />
J Biol Chem. 1991, 266(13):8595-603.<br />
60. Linder J. U.. Class III adenylyl cyclases: molecular<br />
mechanisms of catalysis and regulation. Cell Mol Life<br />
Sci. 2006. 63(15):1736-51.<br />
61. William F. Simonds, G protein regulation of adenylate<br />
cyclase, Trends Pharmacol Sci. 1999 Feb; 20(2):66-73.<br />
86