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Digoxigenin labeled in situ hybridization 107 입해서 관류에 의하여 고정액이 직접 세포들에 전달되게 해야 한다. 16-18 그리고 파라핀 블록의 제작 과정 또한 RNase protection되어 있는 표본 제작 과정이 필요하며, 파라핀 블록의 제작, 보관, 파라핀 절편 제작 등에도 RNase protection의 세심한 주 의가 요구된다. 그러나 실제로 외과병리학적 검사 표본들은 대 부분 10% buffered formalin에 의하여 고정하고, 다수의 병리 조직 표본들을 모아서 한꺼번에 표본 제작을 하며 파라핀 블록 의 제작이나 보관 등에 특별한 주의를 기울이지 않는 실정이다. 그래서 현재까지 많은 연구자들이 일반적인 외과병리학적 파라 핀 블록을 사용해서 RNA in situ hybridization를 수행하는 것 을 꺼려 왔으며 간혹 RNA in situ hybridization에서 양성 반 응을 보였다 하더라도 이를 인정하려 하지 않았다. 19-22 따라서 본 연구에서는 외과병리학적 표본을 사용하여 RNA in situ hybridization을 수행하였을 때 얼마나 양성 반응에 신뢰성 있는 가를 알아보기 위하여 tissue array 표본을 이용해서 검색하였 다. 결과적으로 모두 약 75%의 양성 반응을 관찰하였는데, 이 유전자들은 위암 세포의 증식성 또는 세포분화 정도에 따라 발 현의 차이가 있으므로 실제 파라핀 절편상에 mRNA가 충분히 잔존되어 있을 확률을 의미하는 진성 양성 반응의 가능성은 80% 이상일 것으로 추측된다. 따라서 외과병리학적으로 수집, 제작된 파라핀 절편에 RNA in situ hybridization을 수행하였 을 경우 양성 반응의 가능성이 비교적 높은 것을 알 수 있다. RNA in situ hybridization의 전 과정에서 충분한 양의 정확 한 RNA probe를 제작하는 것이 가장 중요한 부분인데, 통상적 으로 사용되는 plasmid DNA를 사용하여 제작하는 경우에는 우선 충분한 양(한번 반응에 1 g 이상)의 plasmid DNA를 얻기 위하여 plasmid DNA를 증식시켜야 하고 E. coli에서 plasmid를 순수 분리하기 위하여 다량의 RNase를 사용하게 되 므로, 비록 plasmid DNA를 순수 분리하였다 하더라도 용액 내 에 RNase가 소량 남아 있는 경우가 많다. 이런 경우 RNA in vitro 전사를 실패하게 되는 경우가 빈번하다. 23-25 따라서 본 연 구에서는 간편하고 정확하면서도 다량의 RNA probe를 얻기 위한 방법을 고안하였다. 즉 대부분의 RNA polymerase가 dsDNA에서 특이한 promoter sequence에 반응해서 RNA를 전사할 수 있는 특성을 이용해서, 관찰하고자 하는 유전자를 포 함하는 PCR DNA 조각을 제작하기 위한 primer에 T3, T7, 및 SP6 등의 promoter sequence를 5′말단에 연장해서 붙임 으로써 PCR 결과로 얻는 DNA 조각 양끝에 각각의 promoter sequence를 갖게 하였다. 이렇게 함으로써 원하는 probe 크기 를 cDNA의 primer 위치에 따라서 자유롭게 결정할 수 있는데 대체로 1,000 bp 이하의 크기가 적당하다. 그리고 primer를 제 작할 때 primer의 5′말단 부위에 위치하는 promoter sequence 에 RNA polymerase의 부착과 작용을 원활하게 하기 위하여 GAGG 염기서열을 추가시켜 주는 것이 좋다. PCR에 의한 부 정확한 DNA 복제 현상에 대한 우려가 있을 수 있는데, 본 연 구에서 RNA probe 제작에 사용되는 PCR 방법은 단일한 plasmid DNA를 template로 사용하는 반응이므로 PCR 후에 생성된 DNA가 다른 유전자일 가능성은 거의 없다. 또한 드물 게 생기는 PCR 돌연변이가 있다 해도 in situ hybridization에 는 큰 영향을 미치지 않을 것으로 추측된다. 그리고 PCR 생성 DNA의 크기가 예상보다 작은 경우도 목표하는 유전자의 염기 서열이 일부 포함되어 있으면 RNA probe 제작이 가능하므로 전체 크기의 DNA와 함께 사용될 수 있다. 파라핀 포매된 현미경 절편을 xylene으로 탈파라핀시킨 후에 에탄올을 사용해서 함수시키는 과정에서 조직 내의 RNA가 노 출되어 RNase에 의해 파괴되는 것을 막기 위하여 4% 중성 paraformaldehyde 용액으로 현미경 절편을 재고정시키는 방법 이 사용된다. 이에 대해 4% 중성 paraformaldehyde의 처리를 proteinase K 처리 이전에 하는 것이 효과적인가 아니면 이후 에 하는 것이 효과적인가, 또는 이러한 4% 중성 paraformaldehyde의 처리가 반드시 필요한 것인가에 대한 실험을 수행하였 다. 우선 본 연구에서 4% 중성 paraformaldehyde의 재고정 처 리를 proteinase K 처리 이전에 하는 것이 proteinase K 처리 이후에 하는 것보다 훨씬 강한 mRNA의 발현을 관찰할 수 있 었다. 이는 아마도 proteinase K 처리 이후에 4% 중성 paraformaldehyde의 재고정을 하면 proteinase K에 의하여 노출 된 mRNA들이 4% 중성 paraformaldehyde에 의하여 crosslinking 됨에 따라, 나중에 RNA probe의 hybridization 효율이 감소하기 때문인 것으로 추측된다. 결국 4% 중성 paraformaldehyde는 조직 내 mRNA가 RNase에 의하여 파괴되는 것을 막기 위하여 사용하고 proteinase K는 조직 내에 mRNA가 hybridization이 잘 되도록 세포질 내의 단백질을 부분적으로 제 거하기 위하여 사용하므로 4% 중성 paraformaldehyde와 proteinase K는 서로 상반되는 기능이 있다고 할 수 있다. 26-28 어쨌 든 여러 저자들에 의하여 소개된 RNA in situ hybridization 방법에는 4% 중성 paraformaldehyde를 proteinase K 처리 이 후에 사용하는 것이 알려져 있다. 그런데 이 경우에는 4% 중성 paraformaldehyde의 처리로 인한 RNase의 비활성화가 안된 상태에서 바로 proteinase K를 처리하면 노출된 mRNA가 쉽 게 RNase에 의하여 파괴된다. 반면 세포질 내의 mRNA가 proteinase K에 의하여 광범위하게 노출된 다음 다시 4% 중성 paraformaldehyde 재고정 처리를 하면 paraformaldehyde의 강한 cross-linking 환원력에 의하여 mRNA가 다시 고정되므로 효과적인 RNA in situ hybridization이 어렵게 되리라고 추측 된다. 29,30 그리고 본 연구에서는 4% 중성 paraformaldehyde의 재고정 처리를 하는 것이 재고정하지 않는 것보다 mRNA의 발 현량이 증가되었으며 발현 정도가 훨씬 균등한 분포를 보였다. 이는 4% 중성 paraformaldehyde 처리가 비특이적으로 존재하 는 RNase의 활성화를 효과적으로 억제하고 있기 때문인 것으로 생각된다. 또한 이와 같이 충분히 잘 고정된 조직 절편인 경우 에는 RNA가 세포 내 간기질과 강하게 결합되므로 비록 조직 절편 제작 과정에서 RNA가 부분적으로 분해되어도 남아 있는
108 이석근∙김연숙∙송인선 외 4인 RNA가 특정 RNA probe와 반응하여 목적으로 하는 특정 유 전자의 발현을 가능케 하는 것이라고 추측된다. RNA in situ hybridization은 전체적으로 RNA probe 제작 슬라이드 표본의 hybridization 전처리과정, hybridization, 표본 의 세척 과정, 면역조직화학 염색 과정과 발색 과정으로 구성되 어 있다. 29 RNA probe를 미리 제작한 경우에는 제1일에 hybridization 전처리과정을 약 3-4시간 정도에 수행할 수 있고 밤새 동안 hybridization을 한 후 제2일에 3-5시간 정도의 세척 과정과 면역조직화학 염색을 위한 blocking 과정이 2시간 정도 필요하다. 이러한 세척 과정과 blocking 과정은 실제로 반응시 킨 후에 기다리는 시간이 대부분이므로 연구자가 실험에 사용되 는 시간은 매우 짧다고 본다. 만약 RNA in situ hybridization 을 2일 과정 전부 완료하고자 하는 경우에는 제2일에 세척 과정, blocking, 항체 반응 과정, 최종 세척 과정, 발색 과정을 모두 수행하여야 하므로 실험에 소요되는 시간이 매우 많아서 아침에 시작한다 하더라도 밤 늦게 실험을 마치게 된다. 그리고 이러한 과정이 모두 시간을 재고 진행되어야 하므로 연구자가 관여하는 다른 실험을 병행하기가 어렵다. 따라서 본 연구에서는 이러한 불편을 최소화하기 위하여 3일 과정의 RNA in situ hybridization의 방법을 고안하였다. RNA in situ hybridization의 전과정에서, hybridization 전처 리과정은 RNase를 protection된 상태로 진행하여 RNA probe 를 hybridization 할 때까지 RNA의 분해를 방지한다. hybridization을 수행한 후에는 RNase protection된 상태가 필 요없으며 오히려 cross hybridization을 제거하기 위하여 RNase A 처리를 포함하기도 한다. 그러므로 digoxigenin에 대한 항체 를 반응시키는 시간을 조절함으로써 RNA in situ hybridization을 2일 과정에서 3일 과정으로 연장시킬 수 있는가에 대한 연구가 필요하다. 다시 말해서 장기간의 항체 반응 시간 중에 hybridization되어 있는 RNA probe가 분해되지 않아야 하며, RNA probe의 hybridization은 본래의 생체 내의 DNA-DNA hybridization 만큼 단단한 구조를 갖는 것이 아니므로 RNA probe의 hybridization이 항체반응 기간 중에 이완되지 말아야 한다. 본 연구에서는 항체반응 중에 RNA probe의 분해를 억제 하기 위하여 고농도 염기 성분의 DIG 1 용액을 사용하고 항체 반응을 4℃의 냉장고 안에서 진행하였으며 조직의 부풀림과 이 동을 억제하고 항체 용액의 증발을 방지하기 위하여 조직 표본 위에 parafilm을 덮어서 보관하였다. 결과적으로 RNA in situ hybridization을 3일 과정으로 수행한 경우의 mRNA 발현 정 도가 2일 과정으로 수행한 경우와 거의 같은 결과임을 관찰하였 다. 그리고 지나친 항체 반응으로 인한 background 항체 반응 을 최소화하기 위하여 항체 반응 후에 철저한 세척법을 사용하 여 면역 반응에 의한 비특이성 염색을 충분히 줄일 수 있었다. DNA-DNA 또는 DNA-RNA 사이에 작용하는 hybridization은 항원-항체 반응에 비하여 결합력은 약하지만 hybridization의 경우 결합 특이성이 훨씬 높아서 RNA in situ hybridization의 결과가 면역조직화학 결과보다 신뢰도가 높다. 그러나 RNA in situ hybridization에서도 RNA probe가 유사 한 염기서열의 유전자에 대하여 cross hybridization 할 수 있는 가능성이 있으며, 또는 RNA probe가 부분적으로 hybridization 되고 나머지 부분의 RNA probe 염기들이 매달려 있는 상태로 있는 경우에도 양성 반응으로 보일 수 있다. 그러므로 이러한 잘못된 hybridization을 제어하기 위하여 RNase A를 사용한다. 즉, RNase A는 hybridization이 안된 RNA 염기서열을 선택적 으로 분해하는 효소로서 저농도에서도 신속하게 유리된 RNA를 분해한다. 실제로 RNase는 유리되어 있는 RNA를 신속하게 분 해하기 위하여 세포질 내외에 풍부하게 분포되어 있는데 특히 우유, 타액 등의 분비액과 혈장 내에도 다량 함유되어 있다. 따 라서 RNA in situ hybridization 중의 면역조직화학적 반응에 사용되는 blocking 용액이나 항체 용액에는 다량의 RNase가 포 함되어 있으므로, 이들 용액에서 장시간 반응을 한 경우에는 저 절로 RNase 처리가 이루어졌다고 생각할 수 있다. 본 연구에서 는 RNase A의 처리에 관한 유효성을 알기 위하여 RNase A의 농도를 높여서 10 g/mL의 RNase A를 37℃에서 20분 동안 처리한 경우에는 실질적인 RNA in situ hybridization 양성 반 응이 많이 소실된다는 점을 관찰하였다. 그래서 RNase A의 농 도를 줄인 결과 2 g/mL의 RNase A를 처리하는 것이 가장 적당한 것으로 나타났다. 그런데 mRNA의 발현이 미약한 경우 에는 오히려 RNase A를 처리한 경우에 mRNA의 발현이 전혀 관찰되지 않아서, 경향이 보여서 잘 알려지지 않은 유전자들이 나 mRNA의 발현량이 적을 것으로 예상되는 유전자인 경우에 는 차라리 RNase A의 처리를 생략하는 것이 바람직하다고 생 각된다(Fig. 2E-G). RNA in situ hybridization은 mRNA의 발현을 관찰하기 위 한 방법인데 실제로 관련 mRNA가 단백질을 합성하는지를 확 인하기 위해서는 면역조직화학 염색이 필수적이다. 그런데 생산 된 mRNA가 단백질 합성에 모두 사용되는가? 또는 생산된 mRNA가 단백질 합성에 사용되지 못하고 mRNA 자체가 신호 전달과 반응의 역할만 할 수 있는가? 등에 대한 논란이 계속되 고 있으므로 mRNA의 발현과 단백질의 생성과는 반드시 일치 한다고 볼 수가 없다. 그리고 생산된 단백질이 세포 외로 분비 되어서 세포외 기질이나 다른 부위의 조직에서 주요 기능을 하 는 경우에는, 그 단백질을 생산한 세포의 경우에서 관련되는 mRNA의 발현이 강하지만 그 단백질에 대한 면역조직화학 염 색에서는 미약하게 관찰될 수가 있다. 따라서 RNA in situ hybridization을 한 후 동일한 조직 절편에 면역조직화학 염색을 통한 관찰이 필요하다. 본 연구에서는 생쥐의 대뇌 조직에서 laminin- 1 chain의 RNA in situ hybridization를 수행한 후 에 laminin의 면역조직화학 염색을 이중으로 수행한 결과, 신경 원세포에서는 RNA in situ hybridization에서 laminin- 1 chain mRNA의 발현이 강하게 보이지만 동일한 신경원세포에 서의 laminin 단백질의 면역조직화학 염색은 매우 미약하게 관
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