คํานํา 

คูมือการใชหองปฏิบัติการ คณะสัตวแพทยศาสตร มหาวิทยาลัยเชียงใหม ไดจัดทําขึ้นเปน 

ครั้งที่ 3 ทั้งนี้เนื่องจากไดมีการปรับเปลี่ยนความรับผิดชอบในแตละหองปฏิบัติการ ดังนั้นคณะผูจัดทํา 

จึงไดเพิ่มเนื้อหาการใชงานครุภัณฑที่ไดรับการจัดสรรเขามาใหม และเทคนิคการปฏิบัติตางๆ ใน 

หองปฏิบัติการที่ทันสมัย ตลอดจนขั้นตอนการปฏิบัติงานในแตละหองปฏิบัติการ เพื่อชวยอํานวย 

ความสะดวกและทําความเขาใจใหกับผูใชหองปฏิบัติการใหสามารถใชงานไดอยางเหมาะสม และมี 

ประสิทธิภาพสูงสุด 

คณะผูจัดทําหวังวาคูมือเลมนี้จะเปนประโยชนแก คณาจารย นักศึกษา และบุคลากร ที่มีความ 

ประสงคจะใชงานหองปฏิบัติการตางๆ ภายในคณะสัตวแพทยศาสตร เพื่อเปนการทําความเขาใจ 

เบื้องตนถึงขั้นตอนตางๆ เกี่ยวกับการใชหองปฏิบัติการ เทคนิคปฏิบัติการตางๆ และวิธีการใชครุภัณฑ 

ชนิดตางๆ ที่พบไดภายในหองปฏิบัติการนั้นๆ 

ขอขอบคุณคณะกรรมการการจัดการความรู (Knowledge Management) คณะสัตว- 

แพทยศาสตร มหาวิทยาลัยเชียงใหม ที่ใหการสนับสนุนทั้งดานคําแนะนําและงบประมาณในการ 

ดําเนินการ ซึ่งทางกลุมผูจัดทําจะไดมีการติดตามผลการใชงานคูมือหองปฏิบัติการเพื่อนํามาปรับปรุง 

ใหดีขึ้นตอไป 

หองปฏิบัติการกลาง

สารบาญ 

เรื่อง หนา 

1.หองปฏิบัติการกายวิภาคศาสตร 1 

ระเบียบการใชหองปฏิบัติการ 1 

Work Instruction 3 

1. การเตรียมสัตวทดลอง 3 

2. การเตรียมกระดูกสัตว 6 

3. การเตรียมสัตวทดลองแบบ In Situation 9 

4. การกําจัดซากสัตว 10 

5. การกําจัดสารพิษในหองปฏิบัติการ 11 

6. การเตรียม Resin cast ปอดสุกร (ชนิด Styrene foam) 11 

2.หองปฏิบัติการจุลทรรศน 1 14 


การใชงานครุภัณฑ 15 

1. วิธีการใชกลองจุลทรรศน 15 

2. วิธีการทําความสะอาดและจัดเก็บกลองจุลทรรศน 18 

3. วิธีการใชกลองจุลทรรศนสําหรับตอกับทีวี 19 

3.หองปฏิบัติการชันสูตรซากและจุลพยาธิวิทยา 21 



1. หลักการพื้นฐานการใชงานกลองจุลทรรศน (ประจําหอง E102) 23 

2. การใชตูดูดไอพิษจากสารเคมี (Fume hood) 24 

3. การใชเครื่องเตรียมชิ้นเนื้ออัตโนมัติ (Tissue-Trek4640B) 24 

4. การใชงานเครื่องเตรียมบล็อกเนื้อเยื่ออัตโนมัติ (Leica EG1160X) 24 

5. การใชงานเครื่องตัดชิ้นเนื้อแบบมือหมุน (Leica RM2125) 25 

4.หองปฏิบัติการปรสิตวิทยา 26 


1. การตรวจอุจจาระดวยวิธี Flotation 26 

2. การตรวจอุจจาระดวยวิธี Sedimentation 27 

3. การตรวจอุจจาระดวยวิธี Sedimentation 27 

4. การตรวจหา Trichinella 27 

5. การยอมสี diff quick 28 

6. การยอมสี Giemsa 28 

7. การตรวจหาตัวออนระยะที่ 3 ของพยาธิตัวกลมในสัตวเคี้ยวเอื้อง 28 


1. กลองจุลทรรศน 29


2. ตูแชสารเคมี 29 

3. การใชงานเครื่อง centrifuge EBA 12 30 

4. เครื่องกวนสารละลายโดยพรอมแผนแมเหล็กใหความรอน (Hot plate stirrer) 30 

5. เครื่องชั่ง OHAUS 31 

5.หองปฏิบัติการจุลชีววิทยา 32 


1. การเตรียมสไลดสําหรับยอมสี 32 

2. การยอมสีแบบแอซิดฟาสต 33 

3. การยอมสีแบบแกรม 34 

4. การยอมสีสปอร 34 

5. การตรวจเชื้อแบคทีเรียกอโรค 35 

6. การถายเชื้อดวยวิธีปราศจากเชื้อปนเปอน 43 

7. การทดสอบความไวของเชื้อตอยาตานจุลชีพโดยวิธี Dish diffusion test 44 


1. กลองจุลทรรศน 45 


3. Autopipette 46 

4. Autoclave 46 

5. อางน้ําควบคุมอุณหภูมิ 47 

6. เครื่องเขยาผสมสารละลาย 47 

7. ตูบมเพาะเชื้อ (Incubator) 48 


9. ตูอบฆาเชื้อโดยใชความรอน (Hot air oven) 48 


11. เครื่องนับโคโลนี 49 

12. เครื่องปนเหวี่ยง (Centrifuge UNIVERSAL 32R) 50 

13. เครื่อง SpectrophotometerSpectronic® 20 Genesys TM 50 

6.หองปฏิบัติการตรวจน้ํานม 51 


1. วิธีการตรวจเชื้อแบคทีเรียกอโรคในน้ํานม 51 

2. การวินิจฉัยเชื้อ Staphylococcus aureus 52 

3.วิธีการตรวจ Somatic cell ในน้ํานม 53 

7.หองปฏิบัติการแบคทีเรียและ หองปฏิบัติการตรวจคุณภาพอาหารและน้ําทางจุลชีววิทยา 55 



1. วิธีเตรียม 70 % Ethanol จาก 95% Ethanol 56


2. วิธีเตรียม normal saline solution 57 

3. วิธีเตรียม Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 57 

4. วิธีเตรียมน้ําเกลือเขมขน 57 

5. วิธีกําจัดขยะ 57 

6. วิธีฆาเชื้อโดยการรมควันดวยฟอรมาลีน 58 

7. วิธีการยอมสี Giemsa 58 

8. วิธียอมสี Diff Quick 59 

9. วิธีการยอมสี Gram 59 

10. วิธีการนับจํานวนโคโลนี (Colony count technique) 60 

11. วิธีการนับจํานวนยีสตและรา (Yeasts and Moulds Count) 64 

12. วิธีการนับจํานวน Coliform (Coliform count) 68 

13. วิธีการตรวจเชื้อซัลโมเนลลาในตัวอยางอาหาร (Salmonella spp.) 73 

14. วิธีการตรวจนับปริมาณ coliform bacteria โดยวิธี Most Probable Number (MPN) 77 

15. วิธีการตรวจนับปริมาณ Fecal coliform bacteria และ E. coli โดยวิธี Most 

78 

Probable Number (MPN) 


1. กลองจุลทรรศน 80 


3. เครื่องปนเหวี่ยง (Centrifuge EBA 12) 80 

4. Hematocrit centrifuge 81 


6. Autoclave 82 

7. Larminar flow 83 

8. อางน้ําควบคุมอุณหภูมิ 84 

9. เครื่องเขยาผสมสารละลายรุน G-560E 84 

10. ตูบมเพาะเชื้อ (Incubator) 84 


12. ตูอบฆาเชื้อโดยใชความรอน (Hot air oven) 85 


14. เครื่องตีผสมสารตัวอยาง 86 

15. เครื่องนับโคโลนี 86 

8.หองปฏิบัติการคุณภาพอาหารสัตว 87 


1.การวิเคราะหเยื่อใยโดยรวม (Crude Fiber) 87 

2.การวิเคราะหไขมัน (Crude Fat) 89 

3.การวิเคราะหโปรตีนโดยรวม (Crude Protein) 90


4.การวิเคราะหความชื้น (Moisture content) 93 

9.หองปฏิบัติการอณูชีวโมเลกุล 96 


1. การสกัดสารพันธุกรรม (DNA) ดวยวิธี CTAB 96 

2. เทคนิคการเพิ่มปริมาณ DNA ดวยปฏิกิริยาลูกโซโพลีเมอเรส (PCR) 97 

3. วิธี Gel electrophoresis 97 


1. เครื่องปนเหวี่ยง Spectrafuge 16 M 98 

2. เครื่องเขยาผสมสารละลาย (VORTEX MIXER Genie -2) 98 

3. เครื่องดูดจายสารละลายอัตโนมัติ (Autopipette) 98 

4. เครื่องเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม รุน PTC-200 99 

5. เครื่องเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม รุน PTC-200 99 

6. ตูเพาะเชื้อแบบเขยา HT MINITRON 100 

7. เครื่องวัดการดูดกลืนแสง (Spectrophotometer : Spectronic Genesys 8) 100 

8. เครื่องอุลตราโซนิค UP100H 101 

9. เครื่องจายกระแสไฟฟา (Power Pac 300/200) 101 

10. ตูแชแข็ง - 80°C 101 



10.หองปฏิบัติการฮอรโมน 103 


1. การตรวจหา Creatinine 103 

2. การตรวจ Luteinizing hormone 104 

3. การตรวจวัด Cortisal 106 

4. การตรวจวัดฮอรโมนโปรเจสเตอโรน ดวยวิธี direct, single antibody competitive 108 

EIA 

11.หองปฏิบัติการสัตวน้ํา 111 



1. การทําความสะอาดอุปกรณ 112 

2. เทคนิคการใชปเปต 113 

3. เทคนิคการไทเทรต 114 

4. เทคนิคการใชบิวเรต 115 

5. เทคนิคการยอมสีโดยวิธี WRIGHT STAIN 115 

6. เทคนิคการยอมสีโดยวิธี GIEMSA STAIN 116 

7. เทคนิคการยอมสีโดยวิธี GRAM’S STAIN 117



1. การใชงานกลองจุลทรรศน (ALPHAPHOT-2 YS2) 117 

2. การใชงานเครื่องวัดความเปนกรด – ดาง (pH meter : Cyber Scan pH 500) 118 

3. การใชงานเครื่องวัดการดูดกลืนแสง (Spectrophotometer : Spectro 23) 119 

4. การใชงานเครื่องวัดการดูดกลืนแสง (Spectrophotometer : Genesys 10 VIS) 120 

5. การใชงานเครื่องวัดความเค็ม (Refractometer) 121 

6. การใชงานเครื่องวัดคาการนําไฟฟา (Conductivity : Cyber Scan CON100) 121 

7. การใชงานเครื่องวัดปริมาณแอมโมเนียในน้ํา (HI 93715) 122 

8. การใชงานเครื่องวัดปริมาณคลอรีน, ความกระดางในน้ํา (HI 93745) 123 

9. การใชงานเครื่องวัดปริมาณออกซิเจนที่ละลายในน้ํา (ภาคสนาม) (YSI#550A) 124 

10. การใชงานเครื่องวัดปริมาณออกซิเจนในน้ํา inoLab Oxi level 2 (แบบตั้งโตะ) 125 

11. การใชงานเครื่องชั่งดิจิตอลทศนิยม 2 และ 4 ตําแหนง 126 

12. การใชงานเครื่องกวนสารละลายพรอมแผนใหความรอน (Hotplate stirrer : SLR) 126 

13. การใชงานเครื่องปมสุญญากาศ (Vacuum pump : ME 2) 128 

12.หองปฏิบัติการซีรั่มวิทยา 129 



1. การตรวจ ADV (Aujeszky Disease Virus or Pseudorabies Virus) โดยวิธี ELISA 131 

2. การตรวจ PRRS (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome) โดยวิธี 132 

ELISA 

3. การตรวจ M.hyo (Mycoplasma hyopneumoniae) โดยวิธี ELISA 133 

4. การตรวจ APP ( Actinobacillus pseudopneumoniae) โดยวิธี ELISA 134 

5. การตรวจ IBV (Infectious Bronchitis Virus) โดยวิธี ELISA 135 

6. การตรวจ IBD (Infectious Bursal Disease) โดยวิธี ELISA 137 

7. การตรวจ MG (Mycoplasma gallisepticum) โดยวิธี ELISA 139 

8. การตรวจ CSFV (Classical Swine Fever Virus ) โดยวิธี ELISA 141 

9. การตรวจ EIA (Equine Infectious Anemia)โดยวิธี Agar Gel Immunodiffusion 142 

10. การตรวจ Brucellosis โดยวิธี Rose Bengal Plate Agglutination 143 

11. การตรวจ MG (Mycoplasma gallisepticum)โดยวิธี Plate Agglutination 144 

12. การตรวจ NDV (New Cassle Disease Virus)โดยวิธี Hemaglutination 145 


1. เครื่องนึ่งฆาเชื้อ (Autimatic Autoclave sterilizer) ยี่หอ STURDY 148 

2. ตูอบเครื่องแกวยี่หอ Memmert 149 

3. เครื่องชั่งไฟฟาความละเอียดทศนิยม 3 ตําแหนงยี ่หอ OHAUS 149 

4. เครื่องปนแยกซีรั่ม Centrifuge UNIVERSAL 320 149 

5. อางน้ําควบคุมอุณหภูมิยี่หอ Memmert 150


6. ตูแชสารเคมียี่หอ SANYO 150 

7. ตูแชแข็งเย็นจัด (– 70°C) ยี่หอ Harris 151 

8. ตูแชแข็ง –20°C ยี่หอ Whirlpool 152 

9. Hot plate stirrer ยี่หอ MyLab 152 


11. เครื่อง Larminar flow 153 

12. เครื่อง Tecan Spectra Classic Elisa Reader 154 

13.หองปฏิบัติการไวรัสวิทยา 160 



1. ขั้นตอนการรับและเก็บตัวอยางเพื่อสงตรวจตัวอยาง ไขหวัดนก (Avain influenza 161 

virus) 

2. การตรวจตัวอยาง ไขหวัดนก (Avain influenza virus) โดยใชวิธี Cell culture 162 

3. การตรวจเชื้อไขหวัดสัตวปกโดยวิธีไขไกฟก 169 

4. การตรวจตัวอยาง ไขหวัดนก (Avain influenza virus) โดยใชวิธี Polymerase chain 171 

reaction 


1. เครื่อง Larminarflow (TELSTAR ® ) 174 

2. เครื่อง Realtime PCR (7300 ABI) 175 

14.หองปฏิบัติการระบบสืบพันธุ 177 



1. เทคนิคการยอมสีเชื้ออสุจิ 178 

2. การเจือจางน้ําเชื้อเพื่อหาความเขมขนของตัวอสุจิโดยใช Red Cell pipette 178 

3. การเจือจางน้ําเชื้อเพื่อหาความเขมขนของตัวอสุจิโดยใช Micropipette 179 

4. การเตรียมน้ําเชื้อที่จะนับจํานวนอสุจิ 179 

5. วิธีนับตัวอสุจิโดยใชกลองจุลทรรศน 179 

6. วิธีคํานวณความเขมขนของตัวอสุจิ 180 

7. วิธีเตรียมสียอม Eosin-Nigrosin 180 


1. การใชงานเครื่องวัดความเขมขนของน้ําเชื้อ (Spermacue) 181 

2. การใชงานอางน้ําควบคุมอุณหภูมิ (Water bath รุน WB-22 ยี่หอ MEMMERT) 182 

3. การใชงานกลองปรับอากาศสําหรับเก็บน้ําเชื้อ 183 

4. การใชงานเครื่องวัดความเปนกรด-ดาง (pH meter) 185 

ภาคผนวก 187 

แบบฟอรมการขอใชหองปฏิบัติการ/ครุภัณฑ/วัสดุอุปกรณ 188


ขั้นตอนการขอใชหองปฏิบัติการ/ครุภัณฑ/วัสดุอุปกรณ 189 

ขั้นตอนการปฏิบัติงานหองปฏิบัติการ (SOP) 190

1 

หองปฏิบัติการกายวิภาคศาสตร 

ชื่อหองปฏิบัติการ : หองปฏิบัติการกายวิภาคศาสตร (Anatomy Laboratory) (D104) 

นักวิทยาศาสตรประจําหอง : นางสาวปยะมาศ คงถึง 

แผนผังหองปฏิบัติการ 

D103 

D106 

D105 

D104 

D109 

D104 = หองปฏิบัติการกายวิภาคศาสตร 

D103 = หองเตรียมสารเคมี 

D105 = หองเก็บอุปกรณ 

D106 = หองเก็บอุปกรณ 

D109 = หองพิพิธภัณฑกระดูก 

ระเบียบการใชหองปฏิบัติการ 

ระเบียบการใชหองปฏิบัติการกายวิภาคศาสตร (D104) 

1. แตงกายใหสุภาพเรียบรอย และสวมเสื้อกาวนทุกครั้งที่เขาเรียนในหองปฏิบัติการ 

2. เก็บสัมภาระตาง ๆ ในตูล็อคเกอรใหเรียบรอย อนุญาตใหนําเขาไดเฉพาะคูมือปฏิบัติการ/สมุดบันทึก/อุปกรณที่ 

ใชประกอบในบทปฏิบัติการเทานั้น 

3. เขาหองเรียนใหตรงเวลา 

4. ตองนําอุปกรณสําหรับชําแหละซากมาทุกครั้งที่มีการเรียนปฏิบัติการกายวิภาคศาสตร 

5. หามนําอาหารและเครื่องดื่มมารับประทานในหองปฏิบัติการ 

6. ชวยกันรักษาความสะอาด และไมสงเสียงดังในหองปฏิบัติการ 

7. หากพบอุปกรณ หรือครุภัณฑใดๆ ในหองปฏิบัติการชํารุด ใหแจงเจาหนาที่ประจําหองปฏิบัติการ 

8. หามนักศึกษาใชอุปกรณโสตทัศนูปกรณภายในหองปฏิบัติการ ยกเวนไดรับ อนุญาตจากอาจารย หรือเจาหนาที่ 

เปนกรณีพิเศษ 

9. เมื่อสิ้นสุดการเรียนในแตละครั้ง ตองเก็บสุนัขทดลอง ชิ้นสวนอวัยวะ หรือแบบจําลองอวัยวะตางๆ เขาที่เดิม 

ใหเรียบรอย โดยสุนัขทดลองใหนําไปใสในถังดอง หรือถังน้ําในกรณีที่มีเรียนอีกในวันถัดไป สวนชิ้นสวน 

ของอวัยวะใหเก็บในโหลดอง 

10. ทําความสะอาดโตะปฏิบัติการทุกครั้งหลังเสร็จสิ้นบทปฏิบัติการ

2 


ระเบียบการใชตูลอคเกอร 

1. ใหนักศึกษาเซ็นตชื่อยืมกุญแจตูลอกเกอรเมื่อเปดภาคการศึกษา 

2. เปดแลวปดตูล็อคเกอรใหเรียบรอยทุกครั้ง 

3. หามทิ้งขยะในตูล็อคเกอร 

4. เมื่อสิ้นสุดภาคการศึกษาใหนํากุญแจตูล็อคเกอรมาคืน หากสูญหาย นักศึกษาตองเสียคาปรับเปนเงิน 50 บาท/ 

ดอก 

5. หามทิ้งของมีคาไวในตูล็อคเกอร เพราะทางหองปฏิบัติการจะไมรับผิดชอบกรณีสูญหาย 

อุปกรณที่นักศึกษาตองเตรียมมาทุกครั้งเมื่อตองเรียนในหองปฏิบัติการกายวิภาคศาสตร 

1. ชุดเครื่องมือชําแหละซาก พรอมใบมีด 

2. เสื้อปฏิบัติการ 

3. ถุงมือตรวจโรค 

4. คูมือการชําแหละซาก (Guide Dog) 

คะแนน : หองปฏิบัติการกายวิภาคศาสตร : 100 คะแนน 

1. เขาเรียนตรงเวลาทุกครั้ง 20 คะแนน 

2. การแตงกาย สวมเสื้อปฏิบัติการทุกครั้ง 20 คะแนน 

3. ความพรอมของอุปกรณที่ใชในหองปฏิบัติการ 20 คะแนน 

4. การทําความสะอาดโตะปฏิบัติการ 20 คะแนน 

5. ความเรียบรอยของการเก็บ specimen 20 คะแนน 

รวม 100 คะแนน

3 


Work Instruction 

1. การเตรียมสัตวทดลอง 

การเรียนการสอนในหองปฏิบัติการกายวิภาคศาสตร คณะสัตวแพทยศาสตร จําเปนตองใชสัตวทดลอง 

ประกอบบทเรียนปฏิบัติการ สัตวที่นิยมใชมากที่สุดในปจจุบันคือ สุนัข ซึ่งทางหองปฏิบัติการตองจัดเตรียมสุนข 

ทดลองทุกปปละ 1 ครั้ง ในชวงเดือน ตุลาคม แลวใชประกอบการเรียนการสอนเปนระยะเวลา 1 ป 

อุปกรณและสารเคมี 

1. 38 % Formaline 

2. Glycerine 

3. Phenol crystal 

4. 95% alcohol 

5. Nembutal ® 

6. สีโปรสเตอร (แดง) 

7. กาวยางพารา 

8. 75% alcohol 

9. Syringe 10, 20 cc. 

10. สําลี 

11. บีกเกอร 2000 ml 

12. เครื่องมือชําแหละซาก 

13. ถุงมือตรวจโรค 

14. ดาย 

15. ถังฉีดฟอรมาลีนเขาเสนเลือด 

16. หนากากปองกันแกสพิษ 

17. แวนตาปองกันสารเคมี 

18. เสื้อกาวนด 

19. ผาขาวบาง 

วิธีการเตรียมสุนัขทดลอง 

1. วางยาสลบโดยใช Nembutal® ฉีดเขาเสนเลือด (Cephalic vein) 

2. เมื่อสุนัขสลบลึกแลว ใหจับสุนัขนอนหงาย กดคางสุนัขเพื่อใหบริเวณลําคอยืดตึง 

3. ใชมีดผาตัดกรีดบริเวณลําคอดาน Ventral โดยกรีดเปนเสนตรงเริ่มจากบริเวณกลองเสียง (Larynx) 

ไปตลอดความยาวของลําคอ (ประมาณกระดูกคอที่ 6 (C6)) แลวคอย ๆ กรีดผานชั้นไขมันจน 

มองเห็นกลามเนื้อ sternohyoideus ซึ่งมีลักษณะเปนแผนกลามเนื้อบาง ๆ 2 แผนวางชิดกัน ใหกรีด 

ผานบริเวณรอยตอของกลามเนื้อทั้งสองแผนนี้ (หามตัดมัดกลามเนื้อ) ก็จะมองเห็นหลอดลม 

(trachea)

4 


4. จากขอ 3 จะสังเกตเห็นเสนเลือด common carotid artery ทอดขนานอยูทางดานลางของ trachea (มี 

2 เสน ซาย - ขวา สามารถใชเสนใดก็ได) ทําการ clean ไขมันออกจากเสนเลือดจนมองเห็นเสน 

เลือดชัดเจน 

** หมายเหตุ : เสนเลือด common carotid artery จะอยูชิดกันเสนประสาท vagus nerve ให clean แตไขมันออก 

โดยไมตองแยกเสนเลือดกับเสนประสาทออกจากกัน 

5. ใชดายผูกเสนเลือดกับเสนประสาทรวมกันใหแนน โดยผูกใหคอนไปทางดานหัวของสุนัข เพื่อให 

เหลือพื้นที่สําหรับฉีดฟอรมาลีนใหมากที่สุด 

6. ใช artery forceps หนีบเสนเลือดใตบริเวณที่ผูกเชือกในขอ 4 แลวใชกรรไกรตัดเสนเลือดที่อยู 

ระหวางบริเวณที่ผูกเชือก กับ artery forceps เปนรูปปากฉลาม โดยตัดประมาณ ¾ ของเสนเลือด 

หาม !! อยาตัดเสนเลือดจนขาดจากกัน 

7. ปลอย artery forceps เลือดสุนัขจะพุงออกจากเสนเลือดอยางแรง และคอย ๆ ชาลงเปนลําดับ 

** หมายเหตุ : ในขั้นตอนนี้อาจยกสุนัขไปดานนอกหองปฏิบัติการ บริเวณทอระบายน้ํา เพื่อใหเลือดสุนัขไหล 

ลงทอระบายน้ํา 

8. ปลอยใหเลือดไหลออกจากตัวสุนัข เมื่ออัตราการไหลของเลือดชาลง ใหใชน้ําฉีดลางบริเวณรอยตัด 

ของเสนเลือด เพราะอาจมีเลือดแข็งตัวปดรอยตัดไวทําใหเลือดไมไหล แลวทําการกดบริเวณหัวใจ 

สุนัขเปนจังหวะเหมือนปลั๊มหัวใจ พรอมกับกดทองเพื่อไลเลือดบริเวณทองออกมาใหหมด รอจน 

เลือดหยุดไหล และสุนัขหยุดหายใจ โดยจะสังเกตเห็นวาไหลที่ไหลออกมามีสีคล้ําเพราะขาด 

ออกซิเจน 

9. อาบน้ําทําความสะอาดรางกายสุนัขใหสะอาดดวยผงซักฟอกหรือแชมพูอาบน้ําสุนัข 

10. จับสุนัขนอนหงายบนโตะปฏิบัติการ จัดทาใหเปนไปตามธรรมชาติ คือ ดึงขาทั้งสี่ขางใหเหยียด 

ตึง จัดหางใหตรง กดคางพรอมทั้งอาปากสุนัขใหสุด ดึงลิ้นออกมาจากปาก 

11. ฉีดฟอรมาลีนเขาเสนเลือด โดยสอดเข็มของเครื่องฉีดฟอรมาลีนเขาไปบริเวณรอยตัดของเสน 

เลือด ใชมือ ลอกเสนเลือดกับเข็มใหแนนแลวปลอยฟอรมาลีนเขาไปดวยความดันประมาณ 50- 

70 ปอนด/ตารางนิ้ว 

** หมายเหตุ : ในขั้นตอนนี้ใชคนประมาณ 3 คน และตองสวมหนากากปองกันฟอรมาลีน และแวนตาปองกัน 

สารเคมีทุกคน เพื่อความปลอดภัยของผูปฏิบัติงาน 

12. เมื่อฟอรมาลีนเขาไปในเสนเลือดสุนัขจะทําใหสุนัขสวนตาง ๆ ของรางกายสุนัขเริ่มแข็งตัว ทอง 

ปองขึ้น ขาเหยียดตึง ลิ้นแข็ง และเมื่อฟอรมาลีนเขาไปจนทั่วรางกายแลวฟอรมาลีนจะดันเลือดที่ 

คางอยูในรางกายสุนัขใหเออลนออกมาทางปากและจมูกของสุนัข ใหรอจนกวาฟอรมาลีนจะเริ่ม 

ใส จึงหยุดการฉีดฟอรมาลีนได 

13. ถอดเข็มออก แลวใชดายผูกเสนเลือดไวเพื่อกันไมใหฟอรมาลีนไหลยอนกลับออกมาได 

14. ปลอยสุนัขทิ้งไว 1 คืน (24 ชั่วโมง) 

15. ทําการฉีดสีผสมกาวยางพารา เขาไปในเสนเลือด โดยมีขั้นตอนดังนี้ 

15.1 แกะเชือกที่มัดเสนเลือดกันฟอรมาลีนไหลยอนกลับในขอ 13 ออก 

15.2 ใชเข็มที่ตัดปลายแหลมออกแลว (เพื่อปองกันไมใหแทงเสนเลือดทะลุ) สอดเขาไปในเสน 

เลือดบริเวณรอยตัด

5 


15.3 ให syringe ขนาด 20 cc. ดูดสีผสมกาวยางพาราใหเต็มหลอด แลวสวมเขากับเข็มในขอ 

15.2 แลวใชมือลอกหัวเข็มกับ syringe ใหแนน เพื่อปองกันไมให syringe หลุดจากเข็มซึ่ง 

อาจทําใหสีกระเด็นเปอนเสื้อผาได 

** หมายเหตุ : สีผสมกาวยางพาราหากเปลื้อนเสื้อผาจะซักไมออก !! 

15.4 ออกแรงดันสีใน syringe เขาไปในเสนเลือด โดยสุนัข 1 ตัวใชสีประมาณ 100 cc. เปนอยาง 

นอย 

15.5 ใชมีดผาตัดกรีดปลายขาหลังของสุนัขดาน Median บริเวณกระดูก tibia เพื่อดูวาสีเขาไปจน 

ทั่วรางกายสุนัขหรือไม ถามองเห็นเสนเลือดมีสีชมพูแลวจึงหยุดฉีดสีได 

15.6 ดึงเข็มออกแลวใหดายมัดเสนเลือดไวเพื่อปองกันไมใหสีไหลยอนกลับออกมา 

15.7 ทิ้งสุนัขไว 1 คืน (24 ชั่วโมง) 

16. นําสุนัขจากขอ 15 ลงแชในอางดองสัตวทดลอง ที่มีฟอรมาลีน 10% อยู เพื่อเก็บไวใชประกอบการเรียน 

การสอนตอไป 

อัตราสวนของสารเคมี 

อัตราสวนของสารเคมีตาง ๆ ที่ใชในการเตรียมสุนัขทดลองมีดังนี้ 

อัตราสวนของฟอรมาลีนสําหรับฉีดเขาเสนเลือด 

1. 38% Formaldehyde 3 ลิตร 

2. Glycerine 1.5 ลิตร 

3. 95% Methyl alcohol 2 ลิตร 

4. Phenol (carboric acid) (solution) 450 cc. 2 ขวด 

5. น้ําปะปา 10 ลิตร 

ผสมสารเคมีทั้งหมดใหเขากัน แลวเติมลงในถังฉีดฟอรมาลีนเขาเสนเลือด โดยการผสม 1 ครั้ง จะ 

เพียงพอสําหรับฉีดเขาเสนเลือดสุนัขได 4-5 ตัว 

อัตราสวนของฟอรมาลีนที่ใชในแชสุนัขทดลองในอางดอง 

1. 38% Formaldehyde 1 สวน 

2. น้ําปะปา 9 สวน 

3. Phenol (carboric acid) (solution) 450 cc. 2 ขวด 

โดยความจุของอางดองในหองปฏิบัติการคือ 1,650 ลิตร ในการผสมฟอรมาลีน 1 ครั้ง จะผสมให 

ระดับฟอรมาลีนอยูที่ ¾ ของอางดองเพื่อไมใหฟอรมาลีนลมเมื่อนําสุนัขทดลองใสลงไปซึ่งปริมาตรของ 

ฟอรมาลีน ¾ ของอางดองเทากับ 1,240 ลิตร เพราะฉะนั้น การคํานวณหาปริมาณฟอรลีนตอการผสม 1 อางมีดังนี้ 

ปริมาตรของอางดอง = 1,650 ลิตร 

ฟอรมาลีนที่ผสมแลวเปน ¾ ของอาง = ¾ x1,650 

= 1,240 ลิตร

6 


อัตราสวนการผสมฟอรมาลีน : น้ํา = 1 : 9 

∴ใชฟอรมาลีน = 1/10 x 1,240 

= 124 ลิตร 

ใชน้ํา = 9/10 x 1,240 

= 1,116 ลิตร 

การผสมสีกับกาวยางพารา 

1. สีโปรสเตอร(สีแดง) 40 cc 1 ขวด 

2. กาวยางพารา (ขวดกลม) 1 ขวด 

ทําการผสมสีและกาวใหเขากันเปนเนื้อเดียว แลวกรองดวยผาขาวบางเพื่อเอาตะกอนออก สามารถเก็บไว 

ใชไดหลายป โดยกอนใชทุกครั้งตองเขยาใหเขากันและกรองดวยผาขาวบาง 

วิธีใชเครื่องฉีดฟอรมาลีนเขาเสนเลือด 

1. เปดวาลวหมายเลข 3 เพื่อระบายลมออกจากถัง ปลอยใหความดันในถังลดลงจนเปน 0 

2. เปดฝาถังรับน้ํายา หมายเลข 2 เพื่อเติมน้ํายาฟอรมาลีน 

3. เปดวาลวหมายเลข 1 

4. ใชผาขาวบางมัดรอบปากถังรับน้ํายาเพื่อกรองเอาตะกอนของสารเคมีออก แลวเติมน้ํายาฟอรมาลีนที่ 

ผสมเสร็จแลวลงไปในถังรับน้ํายา 

5. ปดฝาถังรับน้ํายาหมายเลข 2 แลวปดวาลวหมายเลข 1 และ 3 

6. เสียบปลั๊กไฟ เครื่องอัดลมจะทํางานอัตโนมัติ ความดันในถังจะคอย ๆ เพิ่มขึ้น 

* เครื่องจะหยุดอัตโนมัติเมื่อความดันในถังมากเกินไป 

7. เปดวาลวหมายเลข 4 เพื่อปลอยน้ํายาออกจากถัง 

8. สอดเข็มที่ปลายสายยางเขาไปในเสนเลือดแลวเปดวาลวหมายเลข 5 เพื่อปลอยน้ํายาเขาไปในเสนเลือด 

2. การเตรียมกระดูกสัตว 

การเรียนการสอนในหองปฏิบัติการกายวิภาคศาสตร ตองใชสื่อการสอนหลายประเภท เชน สุนัข และ 

อวัยวะสัตวตาง ๆ ดองฟอรมาลีน, แบบจําลองอวัยวะตาง ๆ ของสัตว, รูปภาพ และกระดูกสัตวชนิดตาง ๆ เปนตน 

ซึ่งในจํานวนนี้ กระดูกสุนัขถือเปนสื่อการสอนที่สําคัญ นักศึกษาที่เรียนวิชา โครงสรางและการทํางานของรางกาย 1 

จะไดรับแจกกระดูกสุนัขจํานวน 1 กลอง ตอ 2 คน ซึ่งจะมีกระดูกสุนัขครบทั้งตัวอยูในกลอง เพื่อใหนักศึกษานํา 

กลับไปศึกษาดวยตนเอง และนอกจากนี้ นักศึกษายังตองไดรับมอบหมายงานใหจัดทํากระดูกสัตวเพื่อสงเปนคะแนน 

ในวิชานี้ดวย 


1. เตาแกส / เตาถาน (พรอมถาน) 

2. หมอตม / ปบ / กะทะใบบัว 

3. ลวด 

4. ผาขาวบาง

7 


5. ไมพาย 

6. ไฟแช็ค 

7. เครื่องมือชําแหละซาก 

8. มีแลเนื้อ 

9. ถุงมือ 

10. ถุงขยะดํา 

11. เชือกฟาง 

12. แปรงสีฟน / แปรงขัดมือ 

13. ผงซักฟอก 

14. โซดาไฟ 

15. ไฮโดรเจนเปอรออกไซด 

วิธีการเตรียมกระดูกสุนัข 

1. ลางทําความสะอาดซากสุนัขดวยผงซักฟอก หรือแชมพูอาบน้ําสุนัข หากมีกลิ่นเหม็นมาก อาจราดดวย 

น้ํายาฆาเชื้อเดทตอลผสมน้ํา เพื่อกําจัดกลิ่นและฆาเชื้อไปพรอม ๆ กัน 

2. ชําแหละซากสุนัข โดยตองเลาะเนื้อออกจากกระดูกใหมากที่สุด แลวแยกกระดูกเปนสวน ๆ ดังนี้ 

2.1 กะโหลก และกระดูกขากรรไกร (Skull + Mandible) 

2.2 กระดูกกนกบ, กระดูกเชิงกราน และกระดูกหาง (pelvic girdle + sacrum + coccygeal bone) 

2.3 กระดูกขาหนา 2 ขาง (แยกจากกัน) (Humerus, radius, ulna, metacarpal, carpal, digits) 

2.4 กระดูกขาหลัง 2 ขาง (แยกจากกัน) (femur, tibia, fibular, metatarsus, tarsus, digits) 

2.5 กระดูกสะบัก (scapular) 

2.6 กระดูกคอ 7 ชิ้น (Cervical bone) 

2.7 กระดูกเอว 7 ชิ้น (Lumbar bone) 

2.8 กระดูกสันหลังและกระดูกซี่โครง (Thoracic bone + rib) 

2.9 กระดูกอก (sternum) และกระดูก Hyoid ไมตองตม 

3. ใชผาขาวบางหอกระดูกสุนัขไวเปนสวน ๆ แลวใชลวดมัดใหแนน ทําลวดใหเปนหวงเพื่อความ 

สะดวกตอการยกขึ้นจากหมอขณะตม โดยแยกเปนสวน ๆ ดังนี้ 

3.1 กระดูกขอ 2.1-2.5 หอดวยผาขาวบาง มัดลวดใหเปนหวง 

3.2 กระดูกขอ 2.6-2.7 ใหใชลวดรอยเขาไปในชองไขสันหลัง แลวมัดลวดเปนหวง โดยไมตองหอดวย 

ผาขาวบาง 

3.3 กระดูกขอ 2.8 ใหใชลวดรอยเขาไปในชองไขสันหลัง และใชลวดพันกระดูกซี่โครงใหยึดติดกัน 

แบงเปน 2 ขาง(ซาย-ขวา) แลวหอดวยผาขาวบางอีกชั้นหนึ่ง 

3.4 กระดูกขอ 2.9 ไมตองตม ใหเลาะเนื้อออกใหมากที่สุดแลวใชลวดมัดใหแนน จุมในน้ําเดือดทิ้งไว 

30 วินาที แลวยกขึ้น ทําซ้ ํา 2-3 ครั้ง แลวนําไปแตกแดดใหแหง หามตมเด็ดขาด !! เพราะเปน 

กระดูกออน หากตมจะถูกกัดกรอนโดยโซดาไฟและสลายไป 

4. นํากระดูกทั้งหมดจากขอ 3 (ยกเวน ขอ 3.4) ไปตมในน้ําที่มีโซดาไฟและผงซักฟอกอยู โดยโซดาไฟ 

จะชวยทําใหเนื้อเปอยยุยและหลุดออกจากกระดูกไดเร็วขึ้น และชวยละลายกระดูกออน ทําใหกระดูก

8 


แยกจากกันเปนชิ้น ๆ โดยใชโซดาไฟประมาณ 300 กรัม สวนผงซักฟอกจะชวยดับกลิ่น และทําให 

กระดูกขาวขึ้น ใชประมาณ 1 กํามือ เมื่อน้ําเดือดจะเกิดฟอง ตองคอยตัดฟองทิ้ง 

5. คนกระดูกเปนครั้งคราว และคอยเติมโซดาไฟเมื่อฟองลดลง หมั่นนํากระดูกขึ้นมาตรวจดูวาเนื้อเริ่ม 

หลุดออกมาจากกระดูกหรือยัง โดยสังเกตจากกระดูกคอหรือกระดูกสะเอวซึ่งไมไดหอดวยผาขาวบาง 

หรือคอยดูวากระดูกซี่โครงหลุดออกจากกระดูกสันหลังหรือยัง 

6. แยกกระดูก scapular และ rib ออกมากอนเพราะมีขนาดบางและเล็ก หากตมนานเกินไปกระดูกจะผุ 

กรอน และสลายไปได 

7. แยกกระดูกคอ กระดูกสันหลัง และกระดูกเอว ออกมาเมื่อเนื้อหลุดออกหมดแลว หรือเนื้อเปอยยุยจน 

สามารถใชแปรงขัดออกได 

8. ตมกระดูกที่เหลือตอไปจนเนื้อหลุดออกหมด หรือเนื้อเปอยยุยจนสามารถใชแปรงขัดออกได 

9. นํากระดูกทั้งหมดมาลางในน้ําผสมผงซักฟอก หรือน้ํายาลางจาน แลวใชแปรงสีฟนหรือแปรงขัดมือ 

ขัดเนื้อบางสวนที่ยังติดอยูออกใหหมด นํากระดูกทั้งหมดไปตากแดดใหแหง ในกรณีที่กระดูกมีสีคล้ํา 

มาก สามารถนํากระดูกไปแชในไฮโดรเจนเปอรออกไซดเจือจางกอนนําไปตากแดด แตตองคอยเฝา 

ระวังอยาแชนานเกินไป หรืออยาใชความเขมขนมากเกินไป เพราะจะทําใหกระดูกกรอนได 

10. นํากระดูกที่แหงสนิดแลวมาตอเปนโครง หรือ เก็บใสกลองพลาสติกที่มีฝาปดสนิด 

** หมายเหตุ : ระยะเวลาในการจัดทํา 

- เลาะกระดูกสุนัข 1 ตัว ใชเวลาประมาณ 3 ชั่วโมง / 2 คน 

- ตมกระดูกสุนัขใชเวลาประมาณ 3-5 ชั่วโมง ขึ้นกับขนาดตัว 

*** สําหรับการเตรียมกระดูกสัตวอื่น ๆ สามารถดัดแปลงไดจากการเตรียมกระดูกสุนัข โดยอุปกรณและ 

สารเคมีรวมทั้งเวลาในการจัดทําเปลี่ยนแปลงไปตามขนาดตัวของสัตว

9 


3. การเตรียมสัตวทดลองแบบ In Situation 

In-situ มาจากภาษาอังกฤษวา In Situation หมายถึง อยูในลักษณะตามธรรมชาติ การทํา In-situ คือการ 

เตรียมสัตวทดลองใหอยูในทาธรรมชาติ คือทายืน มีประโยชนในการสอนที่ตองรูตําแหนงของอวัยวะตางๆ ตาม 

ธรรมชาติ สัตวที่นิยมใชคือ มา และแกะ เปนตน 


1. สวาน 

2. คอน 

3. ตะปู (ขนาดใหญ,กลาง,เล็ก) 

4. ลวด 

5. เชือก (เชือกปานและเชือกไนลอน) 

6. คีบตัดลวด 

7. ผาดิบ 

8. ดาย/ไหมเย็บ 

9. เครื่องมือผาตัด (กรรไกร, forceps,needle holher,Artery forceps) 

10. โครงไม 

11. แผนกระดาน หนาอยางนอย 1 นิ้ว 

12. ลอก 

13. Nembutal 

14. Formaline (38% Formaldehyde bistal : water = 1 : 8) 

วิธีการเตรียมสุนัขทดลอง 

1. วางยาสลบ (Nembutal®) โดยฉีดเขาเสนเลือด cephalic vein ที่ขาหนา 

2. กรีดผาลําคอ ดาน ventral view แลวชําแหละหาเสนเลือด common carotid artery 

3. ใชเชือกผูกเสนเลือดใหแนน โดยพยายามใหชิดไปทางดานบน ตัดเสนเลือด common carotid artery 

ใหเปนรูปปากฉลาม ปลอยใหเลือดไหลออกจากจากตัวสัตวจนหมด ระหวางนี้ตองคอยใชน้ําลางเสน 

เลือดบริเวณรอยตัดเพื่อปองกันไมใหเลือดแข็งตัว รอจนกระทั่งสัตวตาย 

4. ใชดายหรือไหมเย็บแผลเย็บปดบริเวณปาก และทวารหนักของสัตว เพื่อกันไมใหฟอรมาลีนไหล 

ออกมา และเพิ่มความสวยงามใหกับสัตวทดลอง 

5. ตอกตะปูบริเวณกระดูก Patella ที่โคนขาหลังทั้ง 2 ขาง จะทําใหขาหลังของสัตวเหยียดตรง 

6. ตอกตะปูขนาดใหญบริเวณสะโพก เพื่อใชเปนที่ยึดลําตัวดานหลัง ถาสัตวมีขนาดใหญ เชน มา ใหตอก 

ตะปูบริเวณไหล โดยตอกระหวาง process ของ กระดูกสันหลังเพื่อใชเปนที่ยึดบริเวณกลางลําตัว 

7. ตอกตะปูขนาดใหญใตหนังบริเวณกะโหลก เพื่อใชเปนที่ยึดสวนหัว และตอกตะปูที่บริเวณหางเพื่อยึด 

หาง 

8. ใชเชือกมัดยึดบริเวณที่ตอกตะปูแลวมัดเขากับโครงไม เพื่อจัดใหสัตวยืนในทาทางธรรมชาติ หากสัตว 

มีขนาดใหญ เชน มา ตองใชลอกชวยในการยกสัตวขึ้นยืน

10 


9. ใชแผนกระดานหนาประมาณ 2 นิ้ว รองใตเทา จํานวน 2 แผน (หนา และหลัง) แลวตอกตะปูบนกีบ 

เทา ทั้งขาหนาและขาหลังใหยึดติดกับแผนกระดาน 

10. ใชผาดิบพันรอบขาหนาบริเวณหนาแขง (radius) แลวผูกเชือกมัดโยงไปดานหลังเพื่อยึดขาหนาให 

เหยียดตึง 

11. ฉีดฟอรมาลีนเขาเสนเลือดบริเวณที่ถูกตัดเปนปากฉลาม จนสัตวเริ่มแข็ง และมีฟอรมาลีนไหลออกมา 

ทางปาก 

12. ใชผาดิบชุบน้ําใหชุม แลวพันรอบตัวสัตว รดน้ําซ้ําอีกครั้งเพื่อเพิ่มความชุมใหแกผิวหนังสัตว 

13. ทิ้งไว 1 คืน (24 ชั่วโมง) 

14. เก็บสัตวทดลองไวในหองเย็น สามารถใชได 2-3 เดือน 

4. การกําจัดซากสัตว 

การเรียนการสอนในหองปฏิบัติการกายวิภาคศาสตร จําเปนตองใชสัตวทดลองในการเรียนการสอนทั้ง 

สัตวทดลองที่ดองในน้ํายาฟอรมาลีน และสัตวทดลองสด รวมทั้งอวัยวะสัตวสด ๆ ซึ่งเมื่อสิ้นสุดการเรียนการสอน 

แลวจะตองทําการกําจัดซากสัตวตาง ๆ เหลานี้ดวยวิธีการที่ถูกตองเหมาะสม และเพื่อใหไมสงผลกระทดตอสังคม 

และสิ่งแวดลอม 

ประเภทของซากในหองปฏิบัติการกายวิภาคศาสตร 

1. ซากสัตวที่ผานการดองดวยน้ํายาฟอรมาลีน ไดแก สุนัขทดลอง และอวัยวะสัตวตาง ๆ ที่ผานการใช 

งานจนไมอยูในสภาพที่จะใชประกอบการเรียนการสอนได 

2. ซากสัตวที่ไมไดผานการดอง คือซากสัตว และอวัยวะสัตวสด เชน ปอดสุกร ไตสุกร ที่ใชในการเรียน 

การสอนแลวไมสามารถเก็บรักษาโดยการดองในน้ํายาฟอรมาลีนได เนื่องจากเนาเสียแลว หรือสัตวที่ 

ใชซากสดสอนไดมีประสิทธิภาพมากกวาซากดอง เชน ไก ปลา เปนตน 

วิธีการกําจัดซากสัตวที่ผานการดองดวยน้ํายาฟอรมาลีน 

1. นําซากที่ผานการดองดวยน้ํายาฟอรมาลีนที่ตองการกําจัดแชในกะละมังพลาสติก แลวเปนน้ําไหลผาน 

เปนเวลาประมาณ 1-2 ชั่วโมง เพื่อเจือจางน้ํายาฟอรมาลีน 

2. นําซากจากขอ 1 มาใสในถุงขยะดํา แลวมัดปากถุงใหสนิท 

3. เขียน Label รายละเอียดเกี่ยวกับชนิดและ จํานวนของซากที่อยูในถุงดํา พรอมลงวันที่ 

4. ขนยายถุงดําไปยังหองผาซากเพื่อเผาทําลายตอไป 

วิธีการกําจัดซากสัตวที่ไมไดผานการดอง 

ปฏิบัติเชนเดียวกับวิธีการกําจัดซากสัตวที่ผานการดองดวยน้ํายาฟอรมาลีนตั้งแตขอ 2 – 4

11 


5. การกําจัดสารพิษในหองปฏิบัติการ 

สารพิษที่สําคัญในหองปฏิบัติการกายวิภาคศาสตร คือ ฟอรมาลีน (Formaldehyde) ซึ่งเปนสารเคมีที่ใช 

สําหรับดองสัตวทดลองและชิ้นสวนอวัยวะสัตวตาง ๆ ในหองปฏิบัติการ ซึ่งทางหองปฏิบัติการจะทําการเปลี่ยนถาย 

น้ํายาฟอรมาลีนที่ใชดองสัตวทดลองในอางดองปละ 1 ครั้ง ในชวงเดือนตุลาคมของทุกป นอกจากนี้ยังมีสารเคมี 

อื่นๆ เชน Alcohol, Glycerine และ Phenol ซึ่งใชในปริมาณนอยและใชแลวหมดไปโดยไมตองกําจัด กระทําเพียง 

จัดการกับภาชนะบรรจุสารเคมีเหลานี้เทานั้น ซึ่งทางบริษัทตัวแทนจําหนายไดรับภาชนะ ดังกลาวคืนทั้งหมด จึง 

ไมขอกลาวถึงการกําจัดสารเคมีเหลานี้ในที่นี้ 

วิธีการกําจัดน้ํายาฟอรมาลีน 

1. นําสัตวทดลองออกจากอางดองใหหมด โดยหากยังตองการเก็บซากสัตวทดลองไวใชตอใหแช 

สัตวทดลองไวในอางน้ําเพื่อรอน้ํายาฟอรมาลีนชุดใหม แตหากตองการกําจัดซากก็ปฏิบัติตามวิธีการ 

กําจัดซากตอไป 

2. เปดระบายน้ํายาฟอรมาลีน (10% Formaldehyde) ในอางดองใหไหลออกจากอางดองชา ๆ พรอมกับเปด 

น้ําจากสายยางใหไหลไปพรอม ๆ กับฟอรมาลีน โดยใหอัตราการไหลของน้ําสูงกวาอัตราการไหลของ 

ฟอรมาลีน เพื่อเจือจางฟอรมาลีนใหมากที่สุด ขั้นตอนนี้จะใชเวลาประมาณ 1 วัน ซึ่งโดยปกติจะทําให 

วันหยุดราชการ (เสาร-อาทิตย) เพื่อไมใหไอระเหยของฟอรมาลีนไปรบกวนการทํางานของผูอื่น 

3. น้ํายาที่ระบายออกจากถังดองจะผสมกับน้ําจนเจือจางมากและไหลลงสูทอระบายน้ําของคณะ แลวไหล 

ไปสูบอบําบัดน้ําเสียของคณะตอไป 

4. เมื่อระบายน้ํายาออกจากอางดองหมดแลว เปดฝาอางดองแลวใชน้ําฉีดลางภายในอางดองอีกครั้ง จากนั้น 

ทิ้งไวประมาณ 3 วัน เพื่อใหฟอรมาลีนระเหยจนหมด 

5. ลางทําความสะอาดภายในอางดองอีกครั้งดวยผงซักฟอก 

การกําจัดขยะติดเชื้อและของมีคม 

• ขยะติดเชื้อ เชน ถุงมือ กระบอกฉีดยา และเศษเนื้อ ทางหองปฏิบัติการไดจัดถังขยะสําหรับใชทิ้งขยะ 

ติดเชื้อโดยเฉพาะ ซึ่งการกําจัดกระทําโดยนําขยะดังกลาวไปเผาทําลายที่หองผาซาก 

• ของมีคม เชน ใบมีดผาตัด เข็ม ทางหองปฏิบัติการไดจัดภาชานะสําหรับทิ้งไวโดยเฉพาะ เปน 

แกลลอนพลาสติกมีฝาปดสนิท เมื่อเต็มแกลลอนแลวจะนํานึ่งฆาเชื้อที่หองปฏิบัติการกลางของคณะฯ 

แลวสงตอมายังที่หองผาซาก ซึ่งทางหองผาซากจะสงตอไปยังโรงพยาบาลสัตวเล็กเพื่อรอใหเจาหนาที่ 

จากเทศบาลนครเมืองเชียงใหมมารับขยะพวกนี้ไปจัดการโดยเฉพาะอีกตอหนึ่ง 

6. การเตรียม Resin cast ปอดสุกร (ชนิด Styrene foam) 

Resin cast แบงเปน 2 ประเภท ตามวัสดุที่ใชทําคือ 

1. Styrene foam สําหรับจัดแสดง 

2. Acrylic resin สําหรับงานวิจัย

12 


Styrene foam มีสวนผสมหลักคือ โฟม (ธรรมดา) Acetone และสี นํามาผสมกันไดสารละลายที่มี high 

viscosity สามารถฉีดสารละลายนี้เขาไปในหลอดหรือทอตางๆ ของอวัยวะ เชน เสนเลือด ขนาดใหญ กลาง และเล็ก 

แตไมสามารถเขาสู capillary ไดดีนัก อวัยวะที่ไดจึงจัดเปน Macroscopic specimen มักใชสําหรับจัดแสดง 

(Exhibition) 

Acrylic resin จัดเปน Microscopic specimen มันใชสําหรับงานวิจัย (Research) เพราะสารละลายที่มี 

ลักษณะใสคลายน้ํา (like watery) สามารถฉีดเขาไปจนถึงระดับ capillary ไดเปนอยางดี จึงนิยมใชในการศึกษา 

ลักษณะโครงสรางของเสนเลือดภายในอวัยวะตางๆ เชน การศึกษาโครงสรางของเสนเลือดภายในตับ เปนตน 


1. โฟม 

2. Acetone 

3. Ether 

4. โซดาไฟ (NaOH) 

5. สีฝุนหรือสีน้ํามัน 

6. ขวดแกวปากกวางมีฝาปดสนิท 

7. ตะเกียงแอลกอฮอล 

8. แทงแลวคนสาร 

9. อุปกรณชําแหละ (ใบมีด, กรรไกร, forceps, artery forceps) 

10. เชือก/ดาย 

11. ถาดพลาสติก 

12. Syringe ขนาดตาง ๆ เชน 3, 5, 10, 20 และ 50 ml 

ขั้นตอนการเตรียมกระบอกฉีด 

1. เลือกกระบอกฉีดยาใหมีปริมาตรและขนาดที่เหมาะสมกับอวัยวะที่จะทํา Resin cast 

2. เลือกกระบอกฉีดยาขนาดเล็กอีก 1 อัน ที่มีเสนผาศูนยกลางใกลเคียงกับขนาดของหลอดเลือดหรือ trachea 

ที่จะฉีดสารละลายโฟมเขาไป 

3. ตัดปลายกระบอกฉีดยาอันใหญ สวนที่ใชสวมกับเข็มฉีดยาออกจะทําใหเกิดรูปเล็กๆ ขึ้น แลวขยายขนาด 

ของรูปดังกลาวโดยใชโลหะเผาไฟ ลนโดยรอบจนมีขนาดใกลเคียงกับเสนผาศูนยกลางของกระบอกฉีดยา 

อันเล็ก 

4. ตัดปลายบนของกระบอกฉีดยาอันเล็กออก แลวนําปลายดานลางเล็กลนใหพลาสติกละลายเล็กนอย แลว 

นํามาครอบบริเวณชองบนกระบอกฉีดยาอันใหญที่เตรียมไว 

5. ใชโลหะเผาไฟ ลนบริเวณรอยตอใหสนิท 

6. ทดสอบวามีรูปรั่วหรือไมโดยนําไปเติมน้ํา หากพบรอยรั่วใหทําการซอมแซมใหเรียบรอย 

7. ใชโลหะเผาไฟแลวนํามาแตะปลายกระบอกฉีดยาอันเล็ก ใหมีผิวขรุขระ เพื่อใหสามารถยึดกับเสนเลือดได 

งายเวลาผูกเชือก

13 


การเตรียม Styrene foam 

1. เท acetone ลงในขวดแกวปากกวาง 

2. หักโฟมเปนชิ้นเล็กๆ แลวใสลงในขวดแกวบรรจุ acetone กอนโฟมจะคอยๆ ละลาย ใชแทงแกวคน 

เบา ๆ จนกลายเปนสารละลายโฟมในที่สุด 

3. หากยังไมใชในทันที ใหปดฝาใหสนิทและเก็บในที่แหง 

4. เมื่อตองการใชใหเทลงในภาชนะที่ตองการ เชน ขวดแบงที่ใชในการผสมสี 

5. เติมสีลงไปในสารละลายโฟมที่ จนไดสีตามตองการ ปกติ นิยมใชสีน้ําเงินสําหรับฉีดเสนเลือดดํา สี 

แดงสําหรับฉีดเสนเลือดแดง และสีขาวสําหรับฉีดเขาทอทางเดินหายใจ (trachea) ทั้งนี้ตองเปนสีที่ 

ละลายในน้ํามัน หากเปนสีที่ละลายในน้ําจะไมสามารถผสมเปนเนื้อเดียวกับสารละลายโฟมได 

6. ทดสอบความหนืดของสารละลายโฟมกอนทําการฉีด ไมใหขนหรือเหลวเกินไป 

ขั้นตอนการเตรียม Specimen: ปอดสุกร 

1. สั่งซื้อปอดสุกรที่ไมไดแยกหัวใจออกจากปอด และมีสวนของ trachea ดวย 

2. ทําการเลาะ pericardium ออกจากหัวใจ 

3. ตัดหัวใจออกใหเลือกติดอยูเพียง1/4 สวน สําหรับเปนบริเวณที่จะฉีดสารละลายโฟมเขาไปใน pulmonary 

artery และ pulmonary vein 

4. ตัด trachea ใหมีความยาวที่เหมาะสม จากนั้นทําการเลาะแยกใหเห็นเสนเลือด pulmonary artery และ 

pulmonary vein 

5. ใชเชือกคลองกับ trachea และเสนเลือดที่ตองการจะฉีดสารละลายโฟม 

6. ฉีดสารละลายโฟมเขาไปในสวนที่ตองการใหเต็ม 

a. เมื่อฉีดสารละลายไปจนเต็มปริมาตรความจุของทอนั้นๆ แลวจะมีความรูสึกเหมือนมีแรงดันกลา 

นกระบอกฉีด 

b. ปอดจะขยายขนาดขึ้น เมื่อใชมีดหรือกรรไกรตัดปลายลางสุดของปอด จะพบสารละลายโฟมไห 

ลออกมา แสดงวาปริมาณสารละลายโฟมที่ฉีดเขาไปเพียงพอแลว 

7. ผูกเชือกที่คลองไวใหแนไมใหสารละลายโฟมไหลออกมา 

8. นํา specimen ที่เตรียมเสร็จแลวไปแชในน้ําเปนเวลา 2-3 วัน เพื่อใหสารลายโฟมแข็งตัว **ขอควรระวัง ใน 

ขั้นตอนนี้ตองเก็บในภาชนะที่มิดชิด ไมใหแมลงวันตอมเนื่องจาก specimen จะเริ่มเนา 

9. เมื่อสารละลายโฟมแข็งตัว ใหนําขึ้นมาเลาะเอากระดูกออนและเสนเลือดออกใหมากที่สุด แลวนําไปแชใน 

สารละลาย 10-20% NaOH เพื่อยอยเอาเนื้อเยื่อออกจาก cast ที่แข็งตัว เปนเวลา 3-4 วัน 

10. ทําการลาง specimen ดวยน้ําประปา โดยเปดน้ําแรงๆ เพื่อลางเนื้อเยื่อตางๆ ออก หางยังมีเนื้อเยื่อบางสวน 

ติดอยูกับ cast ใหแชทําการแชใน NaOH ตอไปอีก 1-2 วัน จนกวาเนื้อเยื่อจะหลุดออกจนหมด 

11. นํา specimen ที่เปนเสร็จสมบูรณไปตากหรือผึ่งลมใหแหง เพื่อลดกลิ่น 

12. นํา cast ที่ไดไปตั้งแสดง 

เอกสารอางอิง 

ดัดแปลงจากเอกสารประกอบการสอนวิชา โครงสรางและการทํางานของรางกาย 3 ปการศึกษา 2551 

เทคนิคจากการฝกงานของ อ.สพ.ญ. ประภาวดี ไพรินทร ณ มหาวิทยาลัย Azabu University ประเทศญี่ปุน

14 

หองปฏิบัติการจุลทรรศน 1 

ชื่อหองปฏิบัติการ : หองปฏิบัติการจุลทรรศน 1 (Microscopy Laboratory 1) (E211) 

นักวิทยาศาสตรประจําหอง : นางสาวปยะมาศ คงถึง 


E212 

E211 

E211 = หองปฏิบัติการจุลทรรศน 1 

E212 = หองเก็บอุปกรณและจัดแสดง 


ระเบียบการใชหองปฏิบัติการจุลทรรศน 1 (E211) 

1. แตงกายใหสุภาพเรียบรอยทุกครั้งที่เขาเรียนในหองปฏิบัติการ 

2. เก็บสัมภาระตางๆ ในหองเก็บของดานขางหองปฏิบัติการใหเรียบรอย อนุญาตใหนําเขาไดเฉพาะคูมือ 

ปฏิบัติการ/ สมุดบันทึก/อุปกรณที่ใชประกอบในบทปฏิบัติการเทานั้น 

3. เขาหองเรียนใหตรงเวลา 

4. เซ็นตชื่อยืม-คืนสไลดเปนรายวัน และหามนํากุญแจตูเก็บกลองจุลทรรศนออกนอกหองปฏิบัติการ 

5. ทําการตรวจเช็คสภาพกลองจุลทรรศน และสไลดกอนใชงานทุกครั้ง หากพบวาชํารุดเสียหายใหรีบแจง 

เจาหนาที่ทันที มิฉะนั้นหากเจาหนาที่ตรวจเช็คแลวพบความชํารุดเสียหายภายหลัง จะถือวาเปนการกระทําของ 

ผูใชคนสุดทายและตองเปนผูรับผิดชอบคาใชจายกรณีตองซอมบํารุง 

6. ใชกลองจุลทรรศนและสไลดดวยความระมัดระวัง 

7. หามนําอาหารและเครื่องดื่มเขามารับประทานในหองปฏิบัติการ 

8. หามสงเสียงดังในขณะใชหองปฏิบัติการ และใหชวยกันรักษาความสะอาด 

9. หากพบอุปกรณ หรือครุภัณฑใดๆ ในหองปฏิบัติการชํารุด ใหรีบแจงเจาหนาที่ประจําหองปฏิบัติการทราบทันที 

10. หามนักศึกษาใชอุปกรณโสตทัศนูปกรณภายในหองปฏิบัติการ ยกเวนไดรับอนุญาตจากอาจารย หรือเจาหนาที่ 

เปนกรณีพิเศษ 

11. หลังใชงานกลองจุลทรรศนตองทําความสะอาดกลองเสร็จทุกครั้ง และเก็บเขาที่ใหเรียบรอย แลวจึงนําสไลด มา 

คืนพรอมเซ็นตชื่อคืนสไลด

15 


คะแนนสวน : หองปฏิบัติการจุลทรรศน 1 : 100 คะแนน 

1. เขาหองเรียนตรงเวลาทุกครั้ง 20 คะแนน 

2. ปฏิบัติตามระเบียบการใชหองปฏิบัติการอยางเครงครัด 20 คะแนน 

3. เก็บกลองจุลทรรศนอยางถูกตอง 20 คะแนน 

4. ทักษะการใชและการเคลื่อนยายกลองจุลทรรศน 20 คะแนน 

5. การเก็บเกาอี้เขาที่เดิม 20 คะแนน 

รวม 100 คะแนน 

1. วิธีการใชกลองจุลทรรศน 

การใชงานครุภัณฑ 

กลองจุลทรรศน เปนอุปกรณในหองปฏิบัติการที่มีราคาแพง อาจารย บุคลากร และนักศึกษาทุกคนตองพึง 

ระลึกไวเสมอวาตองใชกลองจุลทรรศนดวยความระมัดระวัง และชวยกันดูแลรักษากลองจุลทรรศนใหสะอาด และมี 

สภาพพรอมใชงานอยูเสมอ เพื่อยืดอายุการใชงานของกลองจุลทรรศนใหยาวนานยิ่งขึ้น 

วิธีการใชกลองจุลทรรศน 

1. เสียบปลั๊ก เปดสวิตชไฟที่กลองจุลทรรศน กลองจุลทรรศนบางตัวสวิตชและปุมปรับความสวางเปนปุม 

เดียวกันโดยเมื่อหมุน เปดตามเข็มนาฬิกา ความสวางจะเพิ่มขึ้นเรื่อย ๆ 

2. ปรับ Condenser iris diaphragm (A) ใหเห็นแสงสวางเปนวงกลมผานขึ้นมาบน condenser 

3. วางแผนสไลดลงบน stage(B) แลวลอคดวย specimen holder(C) 

4. เลื่อนสไลดโดยใช Vertical feed knob(D) และ Horizontal feed knob(E) ใหตําแหนงของ specimen(F) ที่ 

เราตองการสองดูอยูตรงกึ่งกลางของแสงสวางที่สองขึ้นมา (จากขอ 3) 

5. หมุน Revolving nosepiece(G) ใหอยูที่กําลังขยายต่ําสุด (4x) 

6. หมุน Coarse focus adjustment knob(H) ให stage เลื่อนขึ้นมาสูงสุด 

** หมายเหตุ : ตองระวังอยาใหปลาย objective lens(M) สัมผัสกับ slide เพราะอาจทําให objective lens(M) 

เสียหาย ซึ่งอาจเกิดขึ้นไดในกรณีลืมหมุน Revolving nosepiece(G) ใหอยูที่กําลังขยายต่ําสุด แลว 

เลื่อน stage เลื่อนขึ้นมาสูงสุด 

7. ปรับ Interpupillar distance adjustment seat(I) ใหระยะหางของ Eyepiece(J) พอดีกับระยะหางของ 

ดวงตาทั้งสองขาง (จะสังเกตเห็นวา วงกลมที่มองเห็นซอนทับกันเปนวงเดียว) แลวหมุน Coarse focus adjustment 

knob(H) ลงชา ๆ จนมองเห็นชัดเจน 

** หมายเหตุ : หากความชัดของ Eyepiece lens ทั้งสองขางไมเทากันสามารถหมุน Diopter adjustment 

ring(K) ขึ้นลงเล็กนอยใหความชัดของทั้งสองขางเทากัน แตโดยทั่วไปจะไมตองปรับเพราะทางหองปฏิบัติการไดทํา 

การปรับใหเทากันแลว

16 


8. หากตองการเพิ่มกําลังขยาย ใหหมุน Revolving nosepiece(G) ทวนเข็มนาฬิกาใหกําลังขยายเพิ่มขึ้นเปน 

ลําดับ แลวหมุนปรับ Fine focus adjustment knob(L) เพียงเล็กนอยก็จะเห็นภาพชัดเจนโดยไมตองปรับ Coarse focus 

adjustment knob(H) อีกเลย 

** หาม!! หมุน Revolving nosepiece ตามเข็มนาฬิกา คือ เปลี่ยนจาก 4x เปน 100x เพราะอาจทําใหปลาย 

objective lens กระแทกกับสไลดจนชํารุดแตกหักได 

** หมายเหตุ : การเปลี่ยนกําลังขยายใหใหญขึ้น จะทําใหพื้นที่ในการมองเห็นเล็กลง เพราะฉะนั้นจึง 

จําเปนตองเลื่อนตําแหนงที่เราตองการดูใหมาอยูตรงจุดศูนยกลางของวงกลม มิฉะนั้นเมื่อเปลี่ยนกําลังขยายแลวอาจ 

มองไมเห็นตําแหนงดังกลาวเพราะอยูนอกขอบเขตในการมองเห็นของกลอง 

9. การใชกําลังขยาย 100x ตองหยด oil ลงบนแผนสไลด มีขั้นตอนดังนี้ 

9.1 หาตําแหนงของภาพที่ตองการดูโดยใชกําลังขยาย 40x จากนั้นหมุน Revolving 

nosepiece(G) ใหอยูระหวางกําลังขยาย 40x และ 100x 

9.2 หยด oil บนแผนสไลดตรงจุดศูนยกลางของแสงสวาง ระวัง !!! อยาใหมีฟองอากาศ 

9.3 หมุน Revolving nosepiece(G) มาที่กําลังขยาย 100x ชา ๆ 

9.4 ปรับ Fine focus adjustment knob ชา ๆ จนเห็นภาพชัดเจน 

** หมายเหตุ เมื่อใชงานเสร็จตองเช็ด oil ออกทุกครั้งโดยใช Xylene (ดูรายละเอียดการทําความสะอาด 

กลองและเก็บจุลทรรศนประกอบ)

17 


รูปแสดงสวนประกอบของกลองจุลทรรศน

18 หองปฏิบัติการจุลทรรศน 1 

2. วิธีการทําความสะอาดและจัดเก็บกลองจุลทรรศน 

กลองจุลทรรศน เปนอุปกรณในหองปฏิบัติการที่มีราคาแพง อาจารย บุคลากร และนักศึกษาทุกคนตองพึง 

ระลึกไวเสมอวาตองใชกลองจุลทรรศนดวยความระมัดระวัง และทําความสะอาดกลองจุลทรรศนทุกครั้งหลังการใช 

งานกลองจุลทรรศนเสร็จ เพื่อยืดอายุการใชงานของกลองจุลทรรศนใหยาวนานยิ่งขึ้น 

วิธีการเก็บกลองจุลทรรศน 

นักศึกษาตองปฏิบัติดังตอไปนี้ 

1. ปดสวิทซ ถอดปลั๊กไฟออก 

2. นําสไลดออกจากกลองจุลทรรศน 

3. ใชผากอซที่สะอาดและแหงเช็ดทําความสะอาดตัวกลอง 

4. เช็ดเลนสดวยกระดาษเช็ดเลนส ถาใช oil ตองหยด xylene บนกระดาษเช็ดเลนสเพื่อเช็ด oil ออกให 

หมด แลวใชกระดาษเช็ดเลนสแหงเช็ดซ้ําอีกครั้ง 

ระวัง!!! อยาใช xylene เช็ดบริเวณที่เปนพลาสติก 

5. หมุน Revolving nosepiece ใหอยูที่กําลังขยายต่ําสุด (4x) 

6. เลื่อน Interpapillar distance ใชชิดกัน 

7. พันสายไฟไวรอบๆ ฐานกลอง 

8. เลื่อน Stage ลงใหอยูในตําแหนงต่ําสุด 

9. เลื่อน Mechanical stage ใหชิดขอบของ stage ดานใน 

10. คลุมดวยผาคลุมกลอง แลงยกกลองไปเก็บในตู ตามหมายเลขที่ติดอยูบนกลอง 

11. การเคลื่อนยายกลองจุลทรรศน ใหปฏิบัติดังนี้ 

11.1 ตองยกกลองดวยมือทั้งสองขาง 

- กลอง ยี่หอ Nikon ใชมือขางที่ถนัดจับบริเวณ Arm และมืออีกขางหนึ่งรองบริเวณ Base 

- กลอง ยี่หอ Olypus ใหใชมือทั้งสองขางจับบริเวณ Arm ดังรูปที่ 1 

รูปที่ 1 แสดงการยกกลองจุลทรรศน 

11.2 ยกกลองระดับอก และตองประคองใหกลองทํามุมตั้งฉากกับพื้น หาม !! เอียงกลองโดยเด็ดขาด 

เพราะอาจทําให ocular lens หลุดออกจากตัวกลอง ทําใหเกิดการชํารุดเสียหายได 

12 ขอควรระวังในการใชกลองจุลทรรศน (ดังรูปที่ 2)

19 


- หามวางกลองจุลทรรศนบนพื้นที่มีลักษณะออนนุม เพราะจะไมสามารถระบายความรอนออก 

จากตัวกลองได (A) 

- หามซอมแซมกลองจุลทรรศนดวยตนเอง หากมีปญหาใหปรึกษาเจาหนาที่ผูดูแลหองปฏิบัติการ 

(B) 

- หามเก็บกลองจุลทรรศนไวในที่ที่อุณหภูมิและความชื้นสูง (C) 

- เพื่อความปลอดภัยในการใชงานควรตอสายดิน (D) 

(A) 

(B) 

(C) 

(D) 

รูปที่ 2 แสดง ขอควรระวังในการใชกลองจุลทรรศน 

เอกสารอางอิง 

หนังสือคูมือกลองจุลทรรศน : EDUCATIONAL MICROSCOPE CH20 INSTRUCTIONS, OLYMPUS. 

หนังสือคูมือกลองจุลทรรศน : Biological Microscope, ALPHAPHOT-2 YS2-H, NIKON. 

http://www.cas.muohio.edu/~mbi-ws/microscopes/compoundscope.html#how%20it%20works 

3. วิธีการใชกลองจุลทรรศนสําหรับตอกับทีวี 

กลองจุลทรรศนสําหรับตอกับทีวี เปนกลองจุลทรรศนสามตา (Trinocular eyepiece tube) ที่ตอเขากับกลอง 

วิดีโอ (Color vedio camera) ซึ่งจะตอเขาเครื่อง CAMERA ADAPTOR (CMA-D2) และ VIDEO AND AUDIO 

DISTRIBUTOR (DA 1400) แลวตอสัญญาณไปยังทีวีที่ติดตั้งอยูบนเพดานหองปฏิบัติการทุกตัว เครื่องมือดังกลาว 

จะทําใหภาพในกลองจุลทรรศนปรากฏบนจอทีวี ซึ่งจะมีประโยชนอยางมากในการเรียนการสอนจุลกายวิภาค 

ศาสตรเพราะทําใหอาจารยและนักศึกษาสามารถดูภาพภายในกลองจุทรรศนไปพรอม ๆ กันไดทั้งชั้นเรียน 

วิธีการใชกลองจุลทรรศนสําหรับตอกับทีวี 

1. เปดสวิตชไฟที่ปลั๊กไฟ 

2. เปดสวิตชเครื่อง VIDEO AND AUDIO DISTRIBUTOR (DA 1400) (หมายเลข 1) 

3. เปดสวิตชเครื่อง CAMERA ADAPTOR (CMA-D2) (หมายเลข 2) 

4. เปดสวิตชทีวี 

5. เปดสวิตชกลองจุลทรรศน (หมายเลข 3) (หมุนตามเข็มนาฬิกา ความสวางของกลองจะเพิ่มขึ้นเรื่อยๆ)

20 


ปฏิบัติตามขั้นตอนการใชงานกลองจุลทรรศนโดยทั่วไป แตมีขอปฏิบัติเพิ่มเติมดังนี้ 

5.1 เมื่อตองการมองภาพในกลองจุลทรรศน (ภาพจะไมปรากฏบนจอทีวี) ใหกดแทงสแตนเลสที่ติด 

อยูดานขวามือของ observation tube (หมายเลข 4) เขาหาตัวกลอง 

5.2 เมื่อตองการใหภาพปรากฏบนจอทีวี (จะไมสามารถมองภาพในกลองจุลทรรศนได) ใหดึงแทงส 

แตนเลสที่ติดอยูดานขวามือของ observation tube (หมายเลข 4) ออกหางจากกลองจุลทรรศน 

6. เมื่อใชงานเสร็จใหเช็ดทําความสะอาดกลองจุลทรรศน (ปฏิบัติตามขั้นตอนการทําความสะอาดและการ 

เก็บกลองจุลทรรศน) และปดสวิตชทีวี, เครื่อง CAMERA ADAPTOR (CMA-D2) (หมายเลข 2), เครื่อง VIDEO 

AND AUDIO DISTRIBUTOR (DA 1400) (หมายเลข 1) และปลั๊กไฟ พรอมทั้งคลุมกลองและเครื่องมือ อื่นๆ ดวย 

ผาพลาสติกใหเรียบรอย และลงบันทึกการใชกลองจุลทรรศนทุกครั้ง

21 

หองปฏิบัติการชันสูตรซากและ 

หองปฏิบัติการจุลพยาธิวิทยา 

ชื่อหองปฏิบัติการ : หองปฏิบัติการชันสูตรซาก (106) และหองปฏิบัติการจุลพยาธิวิทยา 

(E104-E110) 

นักวิทยาศาสตรประจําหอง : นายณัฐพงศ วังใน 


เตาเผาซากสัตว 

E 106 

E 108 

E 107 E 105 E 109 

E 103 E 110 

E 102 E 101 E 104 

E 111 

โถงทางเดินในอาคาร 

อาคาร E ชั้นที่ 1 

E 101 หองพักเจาหนาที่หองปฏิบัติการ 

E 102 หองปฏิบัติการกลองจุลทรรศน 

E 103 หองอภิปรายกลุมนักศึกษา 

E 104 หองปฏิบัติการจุลพยาธิวิทยา (หองเตรียมบล็อกเนื้อเยื่อและตัดเซ็คชั่น) 

E 105 หองเปลี่ยนเครื่องแตงกาย 

E 106 หองปฏิบัติการชันสูตรซาก 

E 107 หองเก็บอุปกรณชันสูตรซากและวัสดุหองปฏิบัติการ 

E 108 หองสุขาชาย 

E 109 หองสุขาหญิง 

E 110 หองสุขาหองปฏิบัติการจุลพยาธิวิทยา (หองเตรียมเนื้อเยื่อและยอมสี) 

E 111 หองเก็บกระปุกเก็บตัวอยางและสารเคมีใชแลว

22 




1. หองปฏิบัติการชันสูตรซาก 

1. กรอกแบบฟอรมนําสงตัวอยางที่จะนํามาชันสูตร 

2. ลงบันทึกการใชหองปฏิบัติการ (เวลาเขาทําปฏิบัติการ) 

3. กรอกแบบฟอรมใบเบิก-ยืมอุปกรณชันสูตรซาก 

4. เปลี่ยนเครื่องแตงกาย (สวมเสื้อกาวน, Apron, รองเทาบูท) 

5. จุมเทาในน้ํายาฆาเชื้อกอนเขาหองปฏิบัติการ 

6. สวมถุงมือ ผาปดปาก และหมวกคลุมผม 

7. ลงมือปฏิบัติการชันสูตรซากตามคูมือปฏิบัติการ 

8. เก็บซากลงถุงดําเพื่อนําไปจํากัดใหเรียบรอย 

9. ทําความสะอาดอุปกรณและโตะปฏิบัติการ ตลอดจนบริเวณพื้นรอบๆใหสะอาด 

10.จุมเทาในน้ํายาฆาเชื้อกอนออกจากหองปฏิบัติการ 

11.อาบน้ําและเปลี่ยนเสื้อผา โดยนําเสื้อกาวนที่ใชแลวใสในตะกราสําหรับซักทําความสะอาด 

12.ลงบันทึกการใชหองปฏิบัติการ (เวลาออกทําปฏิบัติการ) 

หมายเหตุ 1.หัวเข็มและใบมีดผาตัด ใหทิ้งในภาชนะที่ทางหองปฏิบัติการจัดเตรียมไว 

2.ตัวอยางชิ้นเนื้อที่ตองการสงเพื่อเตรียมสไลดทางจุลพยาธิวิทยาใหนําไปออกหมายเลข 

ตัวอยางที่หนวยชันสูตรฯกอนนํามาสงที่หองปฏิบัติการ 

3.หามนําอาหารและเครื่องดื่มเขามารับประทานในหองปฏิบัติการ 

2. ระเบียบการใชหองเปลี่ยนเสื้อผา 

1. นําสัมภาระและของมีคาเก็บไวในล็อคเกอร ปดล็อค และนํากุญแจติดตัวเขาเรียนปฏิบัติการดวยทุกครั้ง 

2. สวมเสื้อกาวนแขนยาว รองเทาบูท แลวสวมApron ทับดานนอกทุกครั้งที่เขาหองปฏิบัติการ 

3. สวมถุงมือและหนากาก(Mask)ทุกครั้งที่เขาเรียน นักศึกษาหญิงตองรวบผมใหเรียบรอยหรือสวมหมวกคลุมผม 

กอนเขาเรียน 

4. หลังจากจบปฏิบัติการใหทําความสะอาดรองเทาบูทและ Apron ใหเรียบรอยกอนออกจากหองปฏิบัติการ 

5. นําเสื้อกาวนที่ใชแลวใสลงในตะกราสําหรับซักแลวเก็บรองเทาบูทขึ้นชั้นวางรองเทาใหเรียบรอย 

6. ตรวจเช็คสัมภาระและของมีคาในตูล็อคเกอรเมื่อนําออกมากอนคืนกุญแจทุกครั้ง 

หมายเหตุ หามวางสัมภาระและของมีคาไวบนมานั่ง ใหเก็บไวในล็อคเกอรเทานั้นเพื่อปองกันการสูญหาย

23 




1. หลักการพื้นฐานการใชงานกลองจุลทรรศน (ประจําหอง E102) 

กลองจุลทรรศนชนิด 3 คนดู Nikon Eclipse E400 พรอมชุดถายภาพนิ่ง 

กลองจุลทรรศนชนิด 2 คนดู Nikon Alphaphot-2 YS2 พรอมชุดถายภาพเคลื่อนไหว 

กลองจุลทรรศน Olympus BX41 พรอมชุดถายภาพและโปรแกรมวิเคราะหภาพถาย 

กลองจุลทรรศน Olympus C011X3 

กลองจุลทรรศนแบบเตอริโอ Olympus SZ30 

1. ปรับเลนสใกลวัตถุ(Objective Lens)ไปที่กําลังขยายต่ําสุดแลวเลื่อนแทนวางสไลดลงจนสุด 

2. เช็ดสไลดที่ตองการดูใหแหงเพราะอาจเกิดความเสียหายแกตัวกลองได จากนั้นวางแผนสไลดลงบนแทน 

วางแลวจึงปรับแทนวางสไลดขึ้นจนสุด มองในกลองโดยการลืมตาทั้งสองขาง คอยๆปรับเลื่อนปุมปรับ 

ภาพหยาบ(Course adjustment)ลงชาๆจนกระทั้งเห็นภาพไดชัดแลวจึงปรับแตงเพิ่มเติมโดยใชปุมปรับภาพ 

ละเอียด(Fine adjustment)ใหภาพชัดขึ้น 

3. การเพิ่มกําลังขยาย ควรปรับจากกําลังขยายต่ําไปหาสูงคือ 4X, 10X, 40X,และ 100X ตามลําดับโดยจะปรับ 

ภาพใหชัดเจนดวยการปุมใชปุมปรับภาพละเอียด(Fine adjustment)เทานั้น และหามเปลี่ยนกําลังขยายจาก 

4X เปน 100X ทันทีโดยเด็ดขาดเพราะจะทําใหเลนสกระทบกับแผนสไลดจนเกิดความเสียหายได 

4. เมื่อใชกําลังขยาย 100X ตองใช Emersion oil เพื่อชวยในการหักเหแสง โดยทําการหยด oil กอนที่จะมีการ 

เลื่อน Objective Lens กําลังขยายสูงสุดลงบนสไลด 

5. ปด Cover slip ทุกครั้งที่ตองสองตรวจตัวอยางที่เปนของเหลว 

6. เมื่อใชกลองจุลทรรศนเสร็จแลวใหปรับ Objective Lens ไปที่กําลังขยายต่ําสุดแลวเลื่อนแทนวางสไลด ลง 

ใหต่ําที่สุด นําแผนสไลดออกเลื่อนเลนสใกลตาใหมาชิดกัน กรณีที่ใชกําลังขยายสูงสุด ควรเช็ดทําความ 

สะอาด Emersion oil ที่ติดบน Objective Lens ออกใหหมดกอน 

7. พันสายไฟและคลุมกลองจุลทรรศนเมื่อเลิกใชงาน 

8. เมื่อมีปญหาหรือขอสงสัยในการใชงานควรปรึกษาเจาหนาที่ประจําหองปฏิบัติการ ไมควรทําการแกไข 

ดวยตนเอง 

9. อุปกรณตอพวงอื่นๆที่มีกับกลองจุลทรรศนเมื่อมีความจําเปนตองใชตองมีการยื่นแบบฟอรมขออนุญาตใช 

ครุภัณฑกับเจาหนาที่ประจําหองปฏิบัติการกอน เพื่อใหเจาหนาที่เปนผูดําเนินการในการดูแลการใชงาน 

อยางใกลชิด

24 



2. การใชตูดูดไอพิษจากสารเคมี (Fume hood) 

1. เลื่อนตูดูดควันพิษไปยังบริเวณที่ตองการใชงาน ตอระบบไฟและระบบน้ําเขากับระบบของอาคาร 

2. เปดเมนสวิทชเพื่อเริ่มตนระบบไฟฟาใหทํางาน จากนั้นเปดพัดลมดูดอากาศ เพื่อใหอยูในสภาวะพรอมใช 

งาน 

3. เปดสวิทชไฟเมื่อตองการแสงสวางภายในตู 

4. ภายหลังเลิกใชงานทุกครั้ง ใหใชน้ําสะอาดผสมน้ํายาฆาเชื้อลางทําความสะอาดโดยปลอยใหพัดลมทํางาน 

ตอไปเปนเวลาประมาณ 10 นาที จึงปดเครื่อง 

5. คาความเร็วลมปกติที่เกจวัดจะอยูที่ 100 พาสคาล หากความเร็วลมมากกวา 500 พาสคาล แสดงวาฟลเตอร 

หมดอายุการใชงาน 

3. การใชเครื่องเตรียมชิ้นเนื้ออัตโนมัติ (Tissue-Trek4640B) 

1. เปดไฟเขาเครื่องและตรวจดูใหแนใจวาปุม Delay timer อยูที่ “0” และจัดให “0” บนแผนตั้งเวลาตรงกับ 

จุดเริ่มตน 

2. ปรับปุมตัวเลือกไปที่ Manual เพื่อใหฝาเครื่องยกขึ้นและเคลื่อนที่ไปที่โถถัดไปแลวปรับปุมไปที่ Off 

3. นําตลับชิ้นเนื้อที่เตรียมไวแลวจัดวางลงในตะกรา จากนั้นปดฝาตะกราแลวนําไปแขวนไวที่ตะขอเกี่ยวบน 

ฝาเครื่อง 

4. ดึงปุม Pull เพื่อเคลื่อนฝายอนกับไปอยูเหนือบริเวณโถน้ํายาที่12 จากนั้นเลื่อนสวิทชเครื่องไปที่คําวา 

AUTO ปลอยใหฝาเครื่องเลื่อนลงจนสุด ปลอยใหตะกราทํางานตามที่ตั้งเวลาเอาไว 

5. หลังจากตะกราไดจุมลงในโถพาราฟนโถสุดทายตามเวลาที่ตั้งไวแลวเครื่องจะหยุดทํางาน ใหปรับปุม 

สวิทชไปที่ Manual ใหฝาเครื่องยกขึ้นสูงสุดแลวปรับกลับไปที่ Off จากนั้นนําเอาตะกราออก เพื่อนําชิ้น 

เนื้อไปทําบล็อกตอไป(Embedding) 

6. ปดครอบโถน้ํายาแตละโถดวยแผนฟอลยแลวจึงปรับปุมสวิทชไปที่ Manual ใหฝาเครื่องเลื่อนลงจนสุดสุด 

แลวปรับกลับไปที่ Off จากนั้นปดเครื่อง 

4. การใชงานเครื่องเตรียมบล็อกเนื้อเยื่ออัตโนมัติ (Leica EG1160X) 

1. กดสวิทช ON เพื่อเปดเครื่องกอนลงมือปฏิบัติการอยางนอย 3 ชั่วโมงเพื่อละลายพาราฟนในถังบรรจุ 

พาราฟน และเพื่อใหความเย็นแกถาดน้ําแข็งบนเครื่อง 

2. กดสวิทชที่เทาเพื่อเติมพาราฟนเหลวลงในแมพิมพ จากนั้นนําชิ้นเนื้อวางลงในแมพิมพ แลววางตลับใสชิ้น 

เนื้อไวชั้นบนสุด 

3. เติมพาราฟนเหลวลงในตลับชิ้นเนื้อจนเต็ม นําไปวางทิ้งไวบนถาดน้ําแข็งจนพาราฟนแข็งตัว 

4. บล็อกพาราฟนที่แข็งตัวมาแกะเพื่อแยกออกจากแมพิมพ ทําการขูดตกแตงพาราฟนสวนเกินบนบล็อก 

เนื้อเยื่อออก กอนนําไปแชเย็นเพื่อทําการตัดเซ็คชั่นเนื้อเยื่อตอไป 

5. กดสวิทช OFF เพื่อปดเครื่องเมื่อเลิกใชงาน

25 



5. การใชงานเครื่องตัดชิ้นเนื้อแบบมือหมุน (Leica RM2125) 

1. ประกอบฐานสําหรับวางใบมีดไมโครโตมลงบนตัวเครื่องตัดชิ้นเนื้อโดยปรับใหใบมีดทํามุมประมาณ 5 

องศากับบล็อกเนื้อเยื่อ 

2. นําบล็อกเนื้อเยื่อบรรจุลงใน Block Holder แลวยึดใหแนน 

3. ทําการตัดแตงหนาบล็อกเนื้อเยื่อโดยการหมุน Course feed wheel ตัดเอาพาราฟนสวนเกินและเนื้อเยื่อ 

บางสวนออกเพื่อใหสามารถตัดเอาเนื้อเยื่อที่ตองการใชจริงไดเต็มสวน จากนั้นนําไปแชใหเย็นจัด 

4. ปรับปุมเลือกความหนาของเนื้อเยื่อใหมีความหนาขนาดประมาณ 3 – 5 ไมโครเมตร จากนั้น นําบล็อก 

เนื้อเยื่อบรรจุลงใน Block Holder แลวยึดใหแนน 

5. ทําการตัดเซ็คชั่นโดยการหมุน Fine feed wheel เพื่อใหไดเซ็คชั่นของเนื้อเยื่อที่มีความหนาตามตองการ 

6. นําปากคีบ คีบเซ็คชั่นดังกลาวไปลอยใน water baht ที่ตั้งอุณหภูมิ 30 -40 องศาเซลเซียส เพื่อใหแผน 

เซ็คชั่นนั้นขยายออกใหเต็มที่ จากนั้นใชแผนสไลดแกวชอนแผนเซ็คชั่นนั้นไวบนสไลด 

7. นําแผนสไลดที่มีเซ็คชั่นชิ้นเนื้อ ไปตากใหแหงสนิทบน Slide warmer ที่ตั้งอุณหภูมิประมาณ 50 องศา 

เซลเซียส ใชเวลาประมาณ 3 – 5 ชั่วโมง หรือนําไปอบที่อุณหภูมิ 100 องศาเซลเซียส เวลา 30 นาทีแลวจึง 

นําไปยอมสีตอไป

26 

หองปฏิบัติการปรสิตวิทยา 

ชื่อหองปฏิบัติการ : หองปฏิบัติการปรสิตวิทยา (E304) 

นักวิทยาศาสตรประจําหองปฏิบัติการ : นางสาวดวงหทัย ศรีภักดี 

แผนผังหองปฏิบัติการปรสิตวิทยา 

ประตู 

หอง 

น้ํา 

E304 

E303 

E302 

E308 

E310 

E311 

E301 

E307 

E309 

E312 

E314 

E313 

E316 

E315 


1. การตรวจอุจจาระดวยวิธี Flotation 

1.1 ใชอุจจาระขนาดเทาหัวแมมือ หรือประมาณ 1 กรัม ใสลงในถวยพลาสติก แลวเติมน้ําเกลืออิ่มตัว 

ประมาณ 10-20 มล. 

1.2 ใชที่กดลิ้นคนใหอุจจาระละลายใหมากที่สุดเทาที่ทําได 

1.3 กรองสารละลายอุจจาระดวยตะแกรงลวด ใหไหลผานกรวยกรองลงในหลอดทดลอง ขนาด 16x100 

mm.จนสารละลายอุจจาระที่ปากหลอดนูนสูงขึ้นจากปากหลอดทดลองเล็กนอย ระวังอยาใหเกิด 

ฟองอากาศ 

1.4 ปดปากหลอดทดลองดวยแผนแกวปดสไลด ขนาด 22x22 mm แลวตั้งทิ้งไวนาน 15 นาที 

1.5 ยกแผนแกวปดสไลดขึ้นจากปากหลอดทดลองโดยยกในแนวตั้งตรง ระวังอยาใหกระทบกับปากหลอด 

ทดลอง 

1.6 วางแผนแกวปดสไลดบนสไลด แลวนําไปตรวจดูดวยกลองจุลทรรศนกําลังขยาย 10X

27 


2. การตรวจอุจจาระดวยวิธี Sedimentation 

2.1 ใชอุจจาระขนาดเทาหัวแมมือ หรือประมาณ 1 กรัม ใสลงในถวยพลาสติก แลวเติมน้ําประปา 

ประมาณ 250 มล. หยดน้ํายาลางจาน 1 หยด 

2.2 ใชที่กดลิ้นคนใหอุจจาระละลายใหมากที่สุดเทาที่ทําได 

2.3 กรองสารละลายอุจจาระดวยตะแกรงลวด ใหไหลลงถวยพลาสติกอีกใบหนึ่ง 

2.4 ตั้งสวนที่กรองไวนาน 4-5 นาที เพื่อใหไขพยาธิตกตะกอนอยูที่กนแกว 

2.5 เทน้ําดานบนทิ้ง แลวเติมน้ําประปาอีกประมาณ 200 มล. ตั้งทิ้งไว 4-5 นาที ทําเชนนี้ 3-4 ครั้ง หรือ จน 

น้ําดานบนใส 

2.6 เทน้ําสวนใสดานบนทิ้ง จะไดตะกอนที่สะอาด แลวเทผานตะแกรงลวดลงสูจานเพาะเชื้อ 

2.7 นําไปตรวจดูดวยกลองจุลทรรศน กําลังขยาย 4X 

3. การตรวจอุจจาระดวยวิธี Sedimentation 

3.1 การเตรียมน้ํายอยเปปซิน 

-นําเปปซินละลายน้ํา แลวเติมโซเดียมคลอไรดและกรดเกลือ 

-ปนใหเขากัน และอุนที่อุณหภูมิประมาณ 40 องศาเซลเซียส นาน 30 นาทีกอนใช 

3.2 การตรวจหา Sarcocystis 

-อุนน้ํายอยเปปซินที่อุณหภูมิ 40 องศาเซลเซียส นาน 30 นาที 

-นําเนื้อ 10 กรัม สับใหละเอียด 

-นําน้ํายอยปริมาตร 100 มิลลิลิตรที่เตรียมไว ใสในขวดรูปชมพูที่มีจุกปดเรียบรอย แลวใสเนื้อที่ 

สับไว ยอยนาน 5 นาทีที่ 40 องศาเซลเซียส 

-กรองน้ํายอยผานกระชอน เพื่อกรองเอาเศษเนื้อที่ไมยอยออกไป 

-นําน้ํายอยไปปนที่ความเร็ว 3000 รอบตอนาที เปนเวลา 5 นาที เทน้ําสวนบนทิ้งแลวนําน้ําที่ 

กนหลอดไปตรวจดูดวยกลองจุลทรรศน กําลังขยาย 40x จะเห็น Bradyzoite โดยไมตองยอมสี 

อาจสงตัวอยางไปทําสไลด 

4. การตรวจหา Trichinella 

4.1 การเตรียมน้ํายอยเปปซิน 

-นําเปปซินละลายน้ํา แลวเติมกรดเกลือ 

-ปนใหเขากัน และอุนที่อุณหภูมิประมาณ 40 องศาเซลเซียส นาน 30 นาทีกอนใช 

4.2 การตรวจหา Trichinella 

-เตรียมน้ํายอยเปปซิน แลวอุนอุณหภูมิ 40 องศาเซลเซียส นาน 30 นาที 

-นําเนื้อ 10 กรัม สับใหละเอียด 

-ผสมเนื้อและน้ํายอยเขาดวยกัน แลวเทใสในกรวยกรองที่ตอสายยางแลวปดดวยคลิปหนีบ 

-บมในตูอบอุณหภูมิสูงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 18 ชั่วโมง 

-เปดคลิปหนีบใหน้ํายอยไหลลงสูจานอาหารเลี้ยงเชื้อ ปริมาตรประมาณ 15 มิลลิลิตร แลว

28 


ตรวจสองดูดวยกลองจุลทรรศนแบบสองกราด ดวยหัว 4X 

5. การยอมสี diff quick 

5.1 ทํา smear ตัวอยางบน Slide และทําใหแหงโดยการผึ่งลม 

5.2 จุม Slide ลงใน Fixation Solution 10 วินาที 

5.3 จุม Slide ลงใน “Instant” Stain A 10 วินาที 

5.4 จุม Slide ลงใน “Instant” Stain B 10 วินาที 

5.5 ลาง Slide ดวยน้ํากลั่น แลวทิ้งไวใหแหง 

6. การยอมสี Giemsa 

6.1 ทํา Smear ตัวอยางบน Slide และทําใหแหงโดยการผึ่งลม 

6.2 หยดสีลงบน Slide ใหทวม ทิ้งไว 3 วินาที 

6.3 คอยๆ หยด buffer ในปริมาณเดียวกับสี mix เบาๆ ทิ้งไว 5 นาที 

6.4 ลาง Slide ดวยน้ํากลั่นแลวทิ้งไวใหแหง 

7. การตรวจหาตัวออนระยะที่ 3 ของพยาธิตัวกลมในสัตวเคี้ยวเอื้อง 

7.1 นําตัวอยางอุจจาระใสลงใน Petri dish 

7.2 ใชที่กดลิ้นบดอุจจาระใหละเอียดบน Petri dish 

7.3 พรมน้ําใหชื้นพอประมาณ นําไปเก็บไวที่อุณหภูมิหองประมาณ 7-10 วัน 

7.4 ตรวจดูความชื้นทุกวัน ถาอุจจาระคอนขางแหง พรมน้ําใหมีความชื้นพอเหมาะอยูเสมอ 

7.5 ตรวจหาตัวออนของพยาธิโดยวิธีของแบรแมน (Baermann’s apparatus) ดังนี้ 

-ใสน้ําลงในกรวยกรองขนาดใหญที่ปลายกรวยตอสายยางแลวปดดวยคลิปหนีบเพื่อควบคุม 

การไหลของน้ํา นํากรวยกรองไปวางบนขาตั้ง 

-เอาตะแกรงขนาดพอดีกับกรวยกรองวางใหแตะผิวน้ํา 

-นําตัวอยางอุจจาระที่เตรียมไววางลงในตะแกรง 

-ตั้งทิ้งไวประมาณ 3 ชม. ถาระดับน้ําลดลงใหเติมถึงระดับเดิมเสมอ 

-ปลอยน้ําออกมาจากสวนลางสุดของสายยาง 2-3 มล. 

-นําไปตรวจและจําแนกชนิดของตัวออน

29 



1. กลองจุลทรรศน 

1. เสียบปลั๊กไฟฟาใหเรียบรอย 

2. วางสไลดที่ตองการตรวจบน stage หมุนหัว Objective lens กําลังขยาย 10 เทา (X10) ใหตรงกับวัตถุที่จะ 

ตรวจ เลื่อน stage ขึ้นชาๆ โดยการหมุน coarse adjustment จนมองเห็นวัตถุที่จะตรวจ 

3. ปรับ fine adjustment เพื่อใหมองเห็นวัตถุที่จะตรวจชัดเจนขึ้น 

4. เปด iris diaphragm ใหกวางที่สุด แลวคอยๆปดเพื่อใหแสงสวางลดลงและเห็นวัตถุชัด จึงเริ่มทําการ 

ตรวจและทําอยางนี้ทุกครั้งที่มีการเปลี่ยนหัว objective lens 

5. ถาตองการจะตรวจดูดวย objective lens ที่มีกําลังขยายมาก (X40) จะตองดูดวย Objective lens (X10) 

กอนเสมอ และเลื่อนจุดที่ตองการขยายใหมาอยูตรงกลาง แลวหมุน Objective lens (X40) มาแทนที่ และ 

ปรับภาพใหชัดดวยการปรับ fine adjustment เทานั้น 

6. ถาตองการดูดวย Objective lens ที่มีกําลังขยายมากที่สุด (X 100) จะตองดูดวย Objective lens (X10) กอน 

แลวหยดน้ํามัน (Oil immersion) ลงไปหนึ่งหยด ตอจากนั้นจึงหมุนหัว Objective lens (X100) ลงมา 

แทนที่ และปรับภาพดวยปุม fine adjustment ก็จะเห็นภาพวัตถุที่ตองการตรวจชัดเจน และตองใช 

กระดาษเช็ดเลนส เช็ด Oil immersion ออกหลังใชงานเสร็จแลว 

2. ตูแชสารเคมี 

1. ตูแชนี้ใชไฟ 220 V และไมควรเสียบปลั๊กรวมกับปลั๊กของเครื่องใชไฟฟาอื่นๆ ในเตาเสียบเดียวกัน 

2. เขียน ชื่อสารเคมี วันเดือนป ผูเตรียมสารเคมีชนิดนั้นหรือเจาของ ติดไวขางขวดทุกขวด 

3. ของที่มีกลิ่นควรคลุมดวยถุงพลาสติกหรือกลองเสียกอนที่จะนําไปแช 

4. ไมควรใสของในตูแชมากเกินไป และควรใหมีชองวางเพื่อใหความเย็นกระจายไดทั่วถึง 

5. เวลาใสหรือนําของออกจากตูแช ไมควรเปดฝาทิ้งเปนเวลานาน

30 


3. การใชงานเครื่อง centrifuge EBA 12 

1. เสียบปลั๊ก แลวเปด switch ที่บริเวณฐานของเครื่อง Centrifuge EBA 12 

2. รอใหมีสัญญาณเสียงดังเตือน 1 ครั้ง และไฟแสดงสัญลักษณเปดฝาเครื่องติดกอน แลวจึงสามารถเปดฝา 

เครื่องได 

3. เปดฝาเครื่อง แลวใสหลอดทดลองลงไป โดยดานตรงขามของแตละแขนของเครื่องจะตองมีน้ําหนักเทากัน 

(Balance) แลวปดฝาเครื่อง 

4. ตั้งเวลาในการปนโดยการกด > < แลวจะมีตัวเลขแสดงเวลา จากนั้นกด 

หรือ จนไดเวลาที่ตองการ 

5. ตั้งความเร็วในการปนโดยการกด > < แลวจะมีตัวเลขแสดงความเร็ว จากนั้นกด 

หรือ จนไดความเร็วที่ตองการ 

6. กด STOP เพื่อตั้งโปรแกรมการทํางาน 

7. กด START เพื่อเริ่มการทํางานตามโปรแกรมที่ตั้งไว รอจนกวาเครื่องทํางานเสร็จ จะมีเสียงดัง 1 ครั้ง และ 

มีไฟที่แสดงสัญลักษณเปดฝาเครื่องติดกอน แลวจึงเปดฝาเครื่องได 

8. หากตองการหยุดการทํางานของเครื่องกอนหมดเวลาที่ตั้งโปรแกรมไว ใหกด STOP เครื่องจะหยุดการ 

ทํางาน แลวรอใหสัญญาณเสียงดัง 1 ครั้ง และมีไฟที่แสดงสัญลักษณเปดฝาเครื่องติดกอน แลวจึงเปดฝา 


9. เมื่อเลิกใชงาน ใหปด switch ที่บริเวณฐานของเครื่อง และถอดปลั๊กออกทุกครั้งหลังการใชงานเสร็จ 

4. เครื่องกวนสารละลายโดยพรอมแผนแมเหล็กใหความรอน (Hot plate stirrer) 

1. เสียบปลั๊ก 

2. เปด main switch ดานหนาเครื่อง 

3. ถาตองการกวนสารใหเปดปุมควมคุมหมวด stirrer ปรับตามความแรงตามที่ตองการ ไฟแสดงการทํางาน 

จะติด 

4. ถาตองการความรอนใหเปดปุมควมคุมหมวด heater ปรับตามความรอนตามที่ตองการ ไฟแสดงการ 

ทํางานจะติด 

5. เมื่อใชงานเสร็จใหหมุนปุมควบคุมทั้ง 2 อยางลงมาในตําแหนง off แลวปด main switch 

6. ถอดปลั๊ก

31 


5. เครื่องชั่ง OHAUS 

1. เปดเครื่องทิ้งไว เพื่อปรับการทํางานของเครื่องใหเขากับสภาวะแวดลอม 30 นาที จอแสดง 0.0 g 

2. หากจอแสดงคาน้ําหนักใดๆอยูสามารถปรับใหเปน 0.0 g โดยกดปุม TARE 

3. วางภาชนะบนจาน จอแสดงน้ําหนักของภาชนะ 

4. กดปุม TARE จอที่แสดงน้ําหนักจะเปลี่ยนเปน 0.0 g 

5. นําสารหรือวัสดุที่ตองการชั่งใสลงไปในภาชนะ คาที่แสดงบนจอหนาปดจะเปนคาของน้ําหนักสารหรือ 

วัสดุนั้นๆ โดยไมรวมน้ําหนักภาชนะ 

6. รอจนคาน้ําหนักคงที่ ซึ่งสังเกตไดจากเครื่องหมาย * บนมุมดานซายของจอหนาปด 

7. ถาเอาภาชนะออกจากจานตราชั่ง จอแสดงคาของภาชนะที่ติดเครื่องหมายลบใหกดปุม TARE คาน้ําหนัก 

ของภาชนะที่ติดเครื่องหมายลบจะเปลี่ยนเปน 0.0 g 

8. เมื่อใชงานเสร็จกดปุม OFF ตัวเลขบนจอจะหายไป

32 

หองปฏิบัติการจุลชีววิทยา 

ชื่อหองปฏิบัติการ : หองปฏิบัติการจุลชีววิทยา 

นักวิทยาศาสตรประจําหองปฏิบัติการ : นางสาวธัญญา วรินทรรักษ 

แผนผังหองปฏิบัติการจุลชีววิทยา 


หอง 

น้ํา 

E304 

E308 

E303 

E310 

E302 

E311 

E301 

E307 

E309 

E312 

E314 

E313 

E316 

E315 


1. การเตรียมสไลดสําหรับยอมสี 

อุปกรณและเครื่องมือ 

1. ตะเกียงบุนเสน หรือตะเกียงแอลกอฮอล 

2. หวงเขี่ยเชื้อ 

3. สไลดแกว 

อาหารเลี้ยงเชื้อและสารเคมี 

1. Distilled water 

วิธีการปฏิบัติงาน 

1. น้ํากลั่นลงบนสไลดแกวที่สะอาด แลวใชหวงเขี่ยเชื้อที่ฆาเชื้อแลวเขี่ยเชื้อที่ตองการทดสอบมาผสมกับหยด 

น้ําบนสไลด 

2. ละเลง (smear) เชื้อที่อยูบนสไลดใหกระจายออกเปนบริเวณบางๆ

33 


3. ปลอยสไลดทิ้งไวในอากาศใหแหง (air dry) 

4. ทําใหแบคทีเรียติดแนนบนสไลดโดยความรอน (heat-fixed) โดยนําสไลดไปผานเปลวไฟออนๆ จาก 

ตะเกียงบุนเสนหรือตะเกียงแอลกอฮอล ระวังอยาใหรอนเกินไปเพราะอาจทําใหเซลลไหม 

5. ปลอยใหสไลดเย็นลงแลวนําไปยอมสีแบบตางๆ ได 

2. การยอมสีแบบแอซิดฟาสต 


1. ขวดใสสารเคมี 


3. กระดาษเช็ดเลนส 


1. Carbol fuchsin 

2. Acid alcohol 

3. Methylene blue 

4. น้ําประปา 


1. เตรียมสไลดสําหรับยอมสีตาม SOP การเตรียมสไลดสําหรับยอมสี 

2. นําสไลดมาวางบนที่ยอม หยดสี carbol fuchsin ลงบนสไลดจนทวมบริเวณที่มีแบคทีเรีย 

3. ใชเปลวไฟออนๆ จากตะเกียงแอลกอฮอลลนเปนเวลาประมาณ 5 นาที ระวังอยาใหสียอมแหง เติมสียอม 

เมื่อจําเปน 

4. ทิ้งสไลดจนเย็น ลางดวยน้ํา สลัดน้ําออกจากสไลดจนหมด 

5. ลางดวย acid alcohol จนไมมีสีติดออกมากับ acid alcohol ใชเวลาไมเกิน 10 วินาที 

6. ลางน้ํา แลวสลัดน้ําออกจากสไลดจนหมด 

7. ยอมดวยสียอมควบคู (Counterstain) โดยใชสี methylene blue นาน 1-2 นาที 

8. ลางออกดวยน้ํา 

9. ปลอยใหสไลดแหงในอากาศ แลวตรวจเชื้อดูดวยหัวน้ํามันของกลองจุลทรรศน

34 


3. การยอมสีแบบแกรม 






1. Crystal violet 

2. Lugal’s iodine 

3. Decolorizer 

4. Safranin 

5. น้ําประปา 



2. นําสไลดมาวางบนที่ยอม หยดน้ํายา Crystal violet ปลอยทิ้งไวนาน 1 นาที 

3. เทสีออก ลางดวยน้ํากอกที่ไหลออนๆ แลวใสน้ํายา Lugol’s iodine ไวนาน 1 นาที เพื่อชวยใหติดสีดีขึ้น 

4. ลางดวยน้ํากอกที่ไหลออนๆ สลัดน้ําออกจากสไลดจนหมด 

5. ใชน้ํายาลางสี (Decolorizer) หยดใหไหลผานสไลดจนน้ํายาที่หยดผานไมมีสีติดออก ใชเวลาไมเกิน 10 

วินาที 

6. ลางน้ําอยางรวดเร็ว แลวสลัดน้ําออกจากสไลดจนหมด 

7. ยอมดวยสียอมควบคู (Counterstain) โดยใชสี safranin O นาน 30-60 วินาที 


9. ปลอยใหสไลดแหงในอากาศ แลวตรวจเชื้อดูดวยหัวน้ํามันของกลองจุลทรรศน 

4. การยอมสีสปอร 






1. malacrite green 

2. safranin 

3. น้ําประปา

35 




2. นําสไลดมาวางบนที่ยอม หยดสี malachite green ลงบนสไลดจนทวมบริเวณที่มีแบคทีเรีย 

3. ใชเปลวไฟออนๆ จากตะเกียงแอลกอฮอลลนเปนเวลาประมาณ 5 นาที ระวังอยาใหสียอมแหง เติมสียอม 

เมื่อจําเปน 

4. ทิ้งสไลดจนเย็น ลางดวยน้ํา แลวซับใหแหง 

5. ยอมดวยสียอมควบคู (Counterstain) โดยใชสี Safranin O นาน 30-60 วินาที 


7. ปลอยใหสไลดแหงในอากาศ แลวตรวจเชื้อดูดวยหัวน้ํามันของกลองจุลทรรศน 

5. การตรวจเชื้อแบคทีเรียกอโรค 

อุปกรณเครื่องมือ 


2. หวงเขี่ยเชื้อ (Standard loop) 

3. เข็มเขี่ยเชื้อ 

4. กรรไกร 

5. Forceps 


7. Sterile petri dish ขนาด 90x100 mm 

8. Sterile cotton swab 


1. 5% Sheep blood agar (BA) 

2. MacConkey Agar (Mc) 

3. Brain Heart Infusion Broth (BHI) ปริมาตร 10 มล. 

4. สารทดสอบชีวเคมี 

5. ชุดสียอม Gram’s stain 

6. น้ํายาที่ใชทดสอบชีวเคมีตางๆ 

7. 95% Ethanol 


1. นํา BA และ Mc ตากไวในตูบม อุณหภูมิ 37°C อยางนอย 15 นาที หรือจนหนาอาหารเลี้ยงเชื้อไมมีหยดน้ํา 

เกาะ 

2. ลงตัวอยางโดย

36 


ตัวอยางชิ้นเนื้อ 

- ชุบกรรไกรและ Forceps ดวย 95% Ethanol แลวเผาไฟ ทิ้งไวใหเย็น 

- ใชกรรไกรตัดชิ้นเนื้อใหมีขนาดพอเหมาะ ใช Forceps คีบผานเปลวไฟ เพื่อลดการปนเปอน 

- ใชกรรไกรที่ฆาเชื้อแลวทิ้งใหเย็น แลวตัดชิ้นเนื้อใหขาดในครั้งเดียว 

- ปายชิ้นเนื้อในบริเวณที่ตัดลงบน BA และ Mc ตามลําดับ 

- เก็บตัวอยางชิ้นเนื้อใสถุงพลาสติก เขียนเลข Case No. ติดขางถุง และลงวันที่เก็บ แชในชองแชแข็ง 

ตัวอยาง swab 

- ปาย swab ลงบน BA และ Mc ตามลําดับ โดยกลิ้ง swab ใหทั่วทั้งหัวสําลี 

- เมื่อเก็บ swab ลงใน Transport media ใหหักดาม swab สวนที่ใชมือจับทิ้ง หรือใชไฟลนที่กาน swab 

ตรงบริเวณที่ใชมือจับกอนเก็บเขา tube 

- เก็บตัวอยาง swab ใสในตูเย็น หรือที่อุณหภูมิ 4-8°C 

ตัวอยางของเหลว 

- เผาหวงเขี่ยเชื้อใหแดง แลวทิ้งใหเย็น จุมลงในตัวอยางของเหลว แลวปายลงบน BA และ Mc 

ตามลําดับ 

- ดูดตัวอยางของเหลวปริมาตร 1 มล. ใสลงใน BHI แลวนําบมในตูบมเชื้อที่อุณหภูมิ 37°C แตถาเปน 

ตัวอยางน้ํานมสามารถบมเชื้อไดโดยไมตองใช BHI 

3. เผาหวงเขี่ยเชื้อใหแดง แลวทิ้งใหเย็น นํามาเขี่ยบน BA และ Mc ที่ลงเชื้อไว โดยเขี่ยใหแยกเปนโคโลนีเดี่ยว 

(Streak for isolation) 

4. อบเชื้อที่ 37°C นาน 24 ชั่วโมง หรือตามอุณหภูมิหรือสภาวะของเชื้อกอโรคที่สงสัย 

5. คัดเลือกเชื้อ โดย 

- ดูโคโลนีที่เจริญบนอาหารเลี้ยงเชื้อ จดลักษณะตางๆ คือ สี ขนาดเสนผานศูนยกลางของโคโลนี 

รูปแบบและสวนสูงของโคโลนี ลักษณะผิวหนา ขอบโคโลนี การยอยสลายเม็ดเลือดแดง รวมถึง 

จํานวนโคโลนีที่เจริญ (โดยประมาณ) 

- จดลักษณะตางๆ ลงในบันทึกการวิเคราะหตัวอยาง 

6. เพาะเชื้อซ้ําโดยเลือกโคโลนีเดี่ยวๆ ตามขอ 8.5 มาเขี่ยลงบน Blood agar และ MacConkey agar เพื่อเพิ่ม 

ปริมาณเชื้อ 

7. สําหรับตัวอยางของเหลว หากไมมีการเจริญของเชื้อ ใหลงตัวอยางใหมตามขอ 8.2.3.1 โดยใชตัวอยางตาม 

ขอ 8.2.3.2 


9. ดูการเจริญของเชื้อบน Blood agar และ MacConkey agar แลวยอมสี Gram’s strain เพื่อดูลักษณะของเชื้อ 

10. ทดสอบทางชีวเคมี ครั้งที่ 1 โดยเลือกทดสอบตามแผนภาพในภาคผนวก 

11. อบเชื้อที่ 37°C นาน 24 ชั่วโมง 

12. อานผลการทดสอบทางชีวเคมี แลวทดสอบทางชีวเคมี ครั้งที่ 2 ตอ เพื่อแยกชนิดของเชื้อตาม แผนภาพใน 

ภาคผนวก 


14. อานผลการทดสอบทางชีวเคมี 

15. ทําการทดสอบความไวของเชื้อตอยาตานจุลชีพ ตาม SOP การทดสอบความไวของเชื้อตอยาตานจุลชีพ 

ตอไป

37 


16. บันทึกผลการวิเคราะหตัวอยาง 

Group I. Rapid Colony Development on MacConkey Agar 

Table 1 Rapid lactose fermentation (red colonies) : Arizona, Citrobacter, Escherichia, Enterobacter, Klebsiella 

Gram stain 

Citrate utilization 

H 2 S production 

Indole production 

Motility 

Urease production 

Lysine decarboxylase production 

Arizona * - + - + - + 

Citrobacter - + + v + v - 

Escherichia - - - + + - v 

Enterobacter + - + - - + v v 

Klebsiella - + - - - + + 

* Very occasionally Arizona ferments lactose 

+ Enterobacter never produces both urease and lysine decarboxylase 

Table 2 No or delayed lactose fermentation (colorless colonies) ; production of H 2 S : Salmonella, Proteus, 

Arizona, Citrobacter 

Gram stain 



Malonate utilization 

Agglutination, Salmonella 

antiserum 

Salmonella - - + - + 

Proteus - + - - - 

Arizona - - + + - (or w+) 

Citrobacter - - (or w+) * - - (or w+) - 

* 

w+ = weak positive occasionally

38 


Table 3 No lactose fermentation (colorless colonies) ; glucose fermentation (yellow butt on TSI : Proteus, 

Providence, Salmonella, Escherichia, Klebsiella, Serratia, Shigella, Aeromonas 

Gram stain 



Citrate utilization 

Voges Proskauer reaction 

Motility 

Arabinose fermentation 


Agglutination Salmonella antiserum 

Oxidase production 

Proteus - + v v - + - - - - 

Providence - - + + - + - - - - 

Salmonella - - - + - + + + + - 

Escherichia - - + - - + + v - - 

Enterobacter - - (or w+) - + + + + v - - 

Klebsiella - + - + + - + + - - 

Serratia - w+ - + + + - + - - 

Shigella - - - - - - v - - - 

Aeromonas - - - v v v v v - + 

Table 4 Delayed or no lactose fermentation (colorless colonies) ; no glucose fermentation (no change in butt on 

TSI agar) : Pseudomonas, Achromobacter, Alcaligenes 

Gram stain 


OF glucose reaction 

Motility 

Nitrate reduction 

P. aeruginosa - + O + + 

P. pseudomallei - + F + + 

Achromobacter - - O - - 

Alcaligenes - + - + + (-) 

Group II. Slow or Poor Colony Development on MacConkey Agar 

Table 5 Rapid lactose fermentation (red colonies) : Pasteurella, Actinobacillus, Vibrio 

Gram stain 


Motillity 

P. hemolytica - - - 

A. equui - + - 

V. metschnikovii - - +

39 


Table 6 Delayed or no lactose fermentation (colorless colonies) : glucose fermentation (yellow butt on TSI) : 

Actinobacillus, Yersinia, Pasteurella, Vibrio 

Gram stain 


A. lignieresi - + + - v 

Y. pestis - - - - - 

Y. pseudotuberculosis - - + + - 

Pasteurella hemolytica * - + - - + 

Vibrio comma + - + - + - 

* Late lactose fermentation may result in colorless colonies in MacConkey agar 

+ Usually requires CO 2 for initial isolation 


Motility 

Hemolysis on blood agar 

Table 7 Delayed or no lactose fermentation (colorless colonies) ; no glucose fermentation (no change in TSI agar) : 

Bordetella, Mima, Actinobacillus, Vibrio, Brucella, Moraxella, Flavobacterium 

Gram stain 



Motility 

Diplococcoid 

morphology 



Bordetella - + + + - - + 

Mima - - * - - + - - 

A. mallei - - - - - - + 

Rare isolates 

Vibrio fetus - + - + - - + 

Brucella abortus + Type I - + + - - - + 

Moraxella sp. Type II - + + - + - +(-) 

Flavobacterium - + - - - + - 

* Occasionally positive known as Mima polymorpha var. oxidans 

+ 

Usually require CO2 for initial isolation; Brucella abortus (Type I) is also penicillin resistant

40 


Group III. Growth on Blood Agar but no Growth on MacConkey Agar ; Organisms Gram Negative 

Table 8 : Glucose fermentaion (yellow butt on TSI) : Pasteurella, Neisseria 

Gram stain 




Diplococcoid morphology 


P. multocida * - - + + - + 

P. pneumotropica + - + + + - + 

P. gallinarum - - - - - + 

Neisseria - - - - + + 

* Key reaction of Pasteurella multocida are those involving indole and nitrate 

+ May need a drop of serum on slant to give positive urease production 

Table 9 No glucose fermentation (no change in butt on TSI agar) : Brucella, Moraxella, Mima, Actinobacillus, 

Pseudomonas, Neisseria 

Gram stain 

Morphology 



Beta hemolysis 

Motility 

Brucella - bacillus + + - - 

Moraxella - diplococcoid + - + - 

Mima - diplococcoid - (rarely +) - (rarely +) - - 

A. mallei - bacillus - - - - 

P. pseudomallei - bacillus + - + 

Neisseria - diplococcoid + - - - 

Group IV. Growth on Blood Agar but no Growth on MacConkey Agar ; Organisms Gram Positive 

Table 10 Gram positive, catalase-producing cocci : Staphylococcus, Micrococcus 

Gram stain 

Coagulase 

production * 

Acid butt on 

TSI agar 

S. aureus + + + 

S. epidermidis + - + 

Micrococcus + - - 

* 

Coagulase reaction should be done using homologous plasma

41 


Table 11 Gram-positive cocci; no catalase production : Streptoccus, Enterococcus, Diplococcus 

Bacitracin sensitivity 

Growth in Streptococcus 

faecalis SF broth 

Growth in 6.5% NaCl 

Optochin sensitivity 

Streptococcus * - - - - 

S. pyogenes, group A + - - - 

“Enterococci,” group D - + + - 

Diplococcus - - - + 

* All Landfield groups of Streptococcus except A and D 

Table 12 Gram-positive cocci ; no catalase production : Streptoccus, Enterococcus, Diplococcus 

Landfield group 

Hemolysis * 

Bacitracin sensitivity 

CAMP test 

Inulin fermentation 

Lactose fermentation 

Sorbitol fermentation 

Salicin fermentation 

Growth in SF broth 

Optochin sensitivity 

S. pyogenes A beta + - - + - + - - 

S. agalactiae B v - + - + - + - - 

S. uberis C v - + + + + + - - 

S. dysgalactiae C v - - - + v - - - 

S. equi C v - - - - - + - - 

S. zooepidemicus C beta - - - + + + - - 

S. equisimilis C beta - - - v - + - - 

S. canis C beta - - - + - + - - 

“Enterococci” D v - - - + v + + - 

D. pneumoniae alpha - - + + v - + 

Group IV. Gram Positive Bacilli 

Table 13 Branching organisms : Nocardia, Streptomyces 

Branching organisms 

“Sulfur granules” in 

pathological material 

Production of aerial 

mycelium and conidia 

Casein hydrolysis + 

Production of tyrosinase 

Nocardia sp. * + - - - 

Streptomyces sp. - + + + 

* 

May be weakly acid-fast. 

+ 

Within three days

42 


Table 14 Organisms gram-positive bacilli : Corynebacterium, Bacillus, Listeria, Mycobacterium, 

Corynebacterium, Erysipelothrix 

Gram positive 

bacilli 

Beta hemolysis 

Acid-fast 

H 2 S on TSI agar 

Motility 

Spore formation 

Corynebacterium spp. - (+) - - - - 

Bacillus sp. + (-) - - + + 

B. anthracis - - - - + 

Listeria + - - + + - 

Mycobacterium - + - - - 

C. pyogenes + - - - - 

Erysipelothrix - (+) - + * - - 

* May take from three to five days for blackening to become evident 

+ Best demonstrated at room temperature 

Table 15 : Corynebacterium 

Corynebacterium 

Hemolysis 

Catalase production 

Acid on butt in TSI 

glucose fermentation 

Lactose 

fermentation 

sucrose fermentation 

C. pyogenes + - + + + 

C. equi - + - - - 

C. renale - (+) + + - - 

C. pseudotuberculosis - (+) + + + + 

Group V. Organism with Spacial Nutritional Requirment 

Table 16 

Growth in 

thioglycolate broth 

Morphology 


Mannitol 

fermentation 

A. bovis Duffuse Branching rare, few 

- - 

filaments 

A. baudeti Granular, clear broth Branching, filamentous + +

43 


Table 17 

C. movyi 

C. perfringens 

C. septicum 

C. henmolyticum 

C. chauvoei 

C. tetani 

C. botulinum 

C. bifermentans 

C. tertium 

C. sporogenes 

C. histolyticum 

Motility + - + + + + + + + + + 

Glucose fermentation + + + + + - + + + + - 

Lactose fermentation - + + - + - - - + - - 

Sucrose fermentation - + - - + - - - + - - 

Salicin fermentation - - + - - - - + - - - 

Indole production - - - + - - - + - - - 

Nitrate reduction - + + - + - - - + + - 

Sulfide (H 2 S) production - - - - - + + + - + + 

Proteolysis - - - - - - + + - + + 

Spore morphology * 

Table 18 

ovoid 

E 

ovoid 

C 

ovoid 

E 

ovoid 

ST 

ovoid 

E 

round 

T 

ovoid 

E 

ovoid 

E 

ovoid 

T 

ovoid 

E 

ovoid 

ST 

Morphology 

Black colonies 

Gas in culture media 

Fetid odor 

C. contorlum Chains - + - 

C. lottii Chains - - - 

C. nigrum Chains + - + 

E. disciformans Small masses - - - 

E. obstii Single rod - + + 

6. การถายเชื้อดวยวิธีปราศจากเชื้อปนเปอน 



2. หวงเขี่ยเชื้อ 

3. เชื้อตัวอยางในภาชนะตางๆ เชน หลอดแกว จานอาหารเลี้ยงเชื้อ เปนตน 


1. ถือหวงเขี่ยเชื้อระหวางนิ้วหัวแมมือและนิ้วชี้ของมือขา ถือในลักษณะเหมือนจับปากกา 

2. ทําใหหวงเขี่ยเชื้อปราศจากเชื้อโดยนําไปเผาดวยเปลวไฟจากตะเกียงบุนเสนใหรอนแดงประมาณ ¾ ของ 

ความยาวลวด แลวทิ้งไวสักครูใหเย็น 

3. ถายเชื้อโดย

44 


3.1 ถายเชื้อจากหลอดแกว 

- ใชมือซายถือหลอดทดลอง แลวใชนิ้วกอยของมือขวาและฝามือขวายึดฝาจุก จากนั้นใชมือซาย 

หมุนเอาหลอดแกวออกจากฝาจุกเบาๆ ถาเปนฝาจุกแบบสวมหรือจุกสําลีใหเปดฝาจุกออกโดย 

การบิด 

- ลนปากหลอดทดลองโดยผานเปลวไฟอยางรวดเร็ว 

- สอดหวงเขี่ยเชื้อลงไปในหลอดทดลอง และแตะเชื้อที่ขึ้นอยูเบาๆ 

- ดึงหวงเขี่ยเชื้อออกจากหลอดทดลองโดยไมใหสัมผัสกับผิวในหลอดทดลอง 

- ลนปากหลอดทดลองผานเปลวไฟอยางรวดเร็ว 

- ปดฝาจุกใหแนนโดยหมุนที่หลอดแกว 

3.2 ถายเชื้อจากจานอาหารเลี้ยงเชื้อ 

- ใชมือซายเปดดานกนของจานอาหารเลี้ยงเชื้อ 

- หงายจานอาหารเลี้ยงเชื้อดานกน แลวใชหวงเขี่ยเชื้อแตะเชื้อที่ขึ้นอยูเบาๆ 

- วางดานกนของจานอาหารเลี้ยงเชื้อคว่ําลงบนฝาจานอาหารเลี้ยงเชื้อ 

4. จะไดเชื้อบริสุทธิ์ในหวงเขี่ยเชื้อเพื่อถายเชื้อสูสิ่งแวดลอมอื่นตอไป 

5. เมื่อถายเชื้อเสร็จแลว ตองเผาหวงเขี่ยเชื้อเพื่อทําใหปราศจากเชื้อทุกครั้ง 

7. การทดสอบความไวของเชื้อตอยาตานจุลชีพโดยวิธี Dish diffusion test 



2. ไมพันสําลีที่ผานการฆาเชื้อแลว 

3. จานเพาะเชื้อ ขนาดเสนผานศูนยกลาง 100 mm. 

4. หลอดทดลอง ขนาด 13 x 100 มิลลิเมตร พรอมฝาปดหลอดทดลอง 

5. เวอเนียร คาลิปเปอร 

อาหารเลี้ยงเชื้อ 

1. Mueller Hinton Agar (MHA)หรือ Sheep Blood Agar หรือ Bovine Blood Agar (BA) 

2. Brain heart infusion broth (BHI broth) 

3. Standard 0.5 Mc Farland อายุไมเกิน 2 เดือน 

4. แผนทดสอบยาตานจุลชีพ 


1. เขี่ยเชื้อแบคทีเรียที่ตองการทดสอบลงใน Blood agar โดยเขี่ยเชื้อแยกใหเปน Single colony 


3. เขี่ยเชื้อที่เจริญเปน Colony เดี่ยวๆ จํานวน 1-2 colony ลงใน BHI broth เขยาใหเชื้อกระจาย 

4. เปรียบเทียบความขุนของ BHI broth กับ Standard 0.5 MacFarland ถาใสกวาใหบมเชื้อใน Incubator 

อุณหภูมิ 37°C นานประมาณ 1 – 2 ชั่วโมง ขึ้นอยูกับชนิดของเชื้อ ถาขุนกวาใหเติม BHI broth ลงไปจนมี 

ความขุนเทากัน

45 


5. ใชไมพันสําลีที่ผานการฆาเชื้อแลวจุมลงใน BHI broth ที่ปรับความขุนแลว จุมใหไมพันสําลีชุม แลวกดหัว 

สําลีกับดานขางของหลอดทดลอง 

6. นําไมพันสําลีมาปายลงบน Mueller Hinton agar ใหทั่ว plate โดยปาย 3 ทิศทาง ทํามุม 60° (ในกรณีเปน 

เชื้อ Streptococcus spp. ใชอาหารเลี้ยงเชื้อเปน Blood Agar) 

7. พักใหหนา plate แหง โดยไมควรนานเกิน 10 นาที 

8. วางแผนยาตานจุลชีพที่ใชทดสอบลงบน plate โดยใหแผนยาแตละแผนอยูหางกันโดยประมาณ 20 

มิลลิเมตร (ไมควรวางแผนยาทดสอบมากเกิน 7 แผน ในจานอาหารเลี้ยงเชื้อเดียวกัน) 


10. วัดขนาดเสนผานศูนยกลางของ clear zone ที่เกิดขึ้นในหนวยมิลลิเมตร ดวยเวอเนียร คาลิปเปอร (ถามี 

หลายวงซอนกันใหอานวงดานที่แคบที่สุด) 

11. อานผลความไวของเชื้อตอยาตานจุลชีพ โดยอานคาเทียบกับตารางอาน Susceptibility test 







4. เปด iris diaphragm ใหกวางที่สุด แลวคอยๆปดเพื่อใหแสงสวางลดลงและเห็นวัตถุชัด จึงเริ่มทําการตรวจ 

และทําอยางนี้ทุกครั้งที่มีการเปลี่ยนหัว objective lens 

5. ถาตองการจะตรวจดูดวย objective lens ที่มีกําลังขยายมาก (X 40) จะตองดูดวย Objective lens (X10) กอน 

เสมอ และเลื่อนจุดที่ตองการขยายใหมาอยูตรงกลาง แลวหมุน Objective lens (X40) มาแทนที่ และปรับ 

ภาพใหชัดดวยการปรับ fine adjustment เทานั้น 










5. เวลาใสหรือนําของออกจากตูแช ไมควรเปดฝาทิ้งเปนเวลานาน

46 


3. Autopipette 

1. กอนใชงานทุกครั้งใหศึกษาการทํางานของ Autopipette ที่เลือกใชงาน เพราะบางชนิดอาจทํางานได 2 

จังหวะ ซึ่งกําหนดปริมาตรไว แตบางชนิดมี overshoot หรือจังหวะที่ 3 

2. การใช overshoot มีวิธีการใช สองวิธีคือ forward mode และ reverse mode 

3. forward mode คือการกดลูกสูบลง(จังหวะที่ 1) แลวปลอยลูกสูบดูดของเหลวขึ้นมา(จังหวะที่ 2) แตตอน 

เอาของเหลวออก ตองกดลูกสูบชวง overshoot (จังหวะที่ 3) เพื่อไลของเหลวออกใหหมด 

4. reverse mode คือกดลูกสูบชวง overshoot (จังหวะที่ 3)แลวปลอยลูกสูบดูดของเหลวจนสุด เมื่อเอา 

ของเหลวออกก็กดลูกสูบลง (จังหวะที่ 1) จะเห็นวาจะมีของเหลวเหลืออยูที่ Tip 

5. ตรวจดูความสะอาดของตัว pipette ตลอดจนสวนปลายซึ่งใชสวม Tip อยาใหมีซีรั่ม หรือน้ํายาติดอยู 

6. พรอมของ Autopipette ที่จะใชทํางาน คือหลังจากดูดของเหลวเขาไปใน Tip แลว ใหยกขึ้นดูในอากาศ 

ประมาณ 1 นาที ถาหากของเหลวนั้นไมหยดออกมาที่ปลาย Tip แสดงวาพรอมที่จะใชงาน 

7. การใช Autopipette ในการดูดและปลอยของเหลว 

8. ปรับปริมาตร Autopipette ตามตองการ ใส tip ที่ปลาย Autopipette ใหแนบสนิทพอดี ใหสังเกต Tip ดวยวา 

สะอาดและไมมีรอยบุเยิน 

9. จับ Autopipette ตั้งตรงเวลาดูดของเหลว ดูดของเหลวโดยใหปลาย Tip แตะที่ผิวของของเหลว ไมควรจุม 

ลงในของเหลวที่ลึกจนเกินไป เพราะจะทําใหเกิดการติด ที่ภายนอกของตัว Tip และไมควรใชกระดาษซับ 

ที่ปลาย Tip ภายหลังดูดของเหลวแลว 

10. เมื่อดูดของเหลวเขาไปใน Tip แลว หามวาง Autopipette ในแนวนอน เพราะจะทําใหของเหลวไหลยอน 

เขาไปในตัว Autopipette ได 

11. การปลอยของเหลว ใหใชปลาย tip แตะขางภาชนะ แลวปลอยของเหลวลงอยางชาๆ 

12. เปลี่ยน Tip ใหมทุกครั้ง เมื่อจะทําการดูดของเหลวชนิดอื่น 

4. Autoclave 

1. เติมน้ําลงในกรวย หมายเลข 15 โดยเปดวาลวหมายเลข 4 และวาลวหมายเลข 1 สังเกตดูระดับน้ําที่เติมได 

จากหลอดแกวดูระดับน้ําหมายเลข 17 ใหเติมประมาณ 24 ลิตร ใชน้ํากรองเติม เมื่อเติมไดระดับแลวใหปด 

วาลวหมายเลข 1 และ 4 

2. ใสของที่ตองการนึ่งเขาในหองนึ่ง แลวปดประตูเครื่องนึ่งใหสนิท โดยผลักคันล็อกหมายเลข 7 ไปทางขวา 

มือใหสุด (ซึ่งจะอยูที่ตําแหนง 12 นาฬิกา) แลวหมุนพวงมาลัยล็อกหมายเลข 8 ไปทางขวามือเชนกันให 

แนน 

3. ตรวจดูวาลวทุกตัวตั้งแตหมายเลข 1 ถึง 6 ใหอยูในตําแหนงปด 

4. ปรับอุณหภูมินึ่ง (Sterilizing temperature) ที่เครื่องควบคุมอุณหภูมิหมายเลข 29 (Termostat) ใหอยู 

ตําแหนงที่ตองการ ปรับไดตั้งแต 110-130 องศาเซลเซียส 

5. ตั้งเวลานึ่ง (Sterilize timer) ที่นาฬิกาตั้งเวลาหมายเลข 28 ใหอยูในตําแหนงที่ตองการ (หามปรับตั้งเวลาใน 

ขณะที่เครื่องกําลังทํางานอยู)

47 


6. เปดสวิทชไฟ (Main) ใหอยูในตําแหนง ON เครื่องนึ่งจะเริ่มทํางาน สังเกตที่หลอดไฟสีเขียว (Power) 

หมายเลข 24 และหลอดไฟสีแดง (Heater) หมายเลข 25 

7. พอแรงดันไอน้ําขึ้นถึง 28 ปอนด/ตารางนิ้ว สังเกตที่มาตรวัดแรงดันหมายเลข 9 ซึ่งเปนมาตรวัดแรงดันไอ 

น้ําของผนังชั้นนอก จึงคอยเปดวาลวหมายเลข 3 และ 4 เพื่อทําระบบสุญญากาศ โดยสังเกตจากมาตรวัด 

แรงดันหมายเลข 10 เข็มชี้จะคอยๆลดต่ําลงมาจนถึงขีด -10 นิ้วปรอท จากนั้นใหปดวาลวหมายเลข 3 และ 4 


8. เปดวาลวหมายเลข 2 เพื่อใหไอน้ําในผนังชั้นนอกเขาในหองนึ่ง โดยคอยๆเปด สังเกตที่มาตรวัดความดัน 

หมายเลข 10 เข็มที่ชี้จะคอยๆขยับขึ้น แลวกดปุม Drying time เพื่อจับเวลา 

9. จากนั้นเครื่องนึ่งจะทํางานเองโดยอัตโนมัติจนถึงเวลาที่ตั้งไว เมื่อทําการนึ่งเสร็จแลวสัญญาณออดก็จะดัง 

เตือนและจะหยุดเองโดยอัตโนมัติ 

10. คอยๆเปดวาลวหมายเลข 2 และหมายเลข 3 ชาๆ เพื่อปลอยไอน้ําในหองนึ่งทิ้ง จนเข็มของมาตรวัดแรงดัน 

หมายเลข 10 ลดลงจนถึง 0 

11. การเปดประตูเครื่องนึ่งใหเปดวาลวหมายเลข 6 เพื่อใหอากาศเขาไปแทนที่สุญญากาศภายในหองนึ่ง จึงจะ 

เปดประตูเครื่องนึ่งได 

5. อางน้ําควบคุมอุณหภูมิ 

1. ใหเติมน้ํากรองจนถึงขีดที่กําหนดในอาง 


3. เปด main switch 

4. ตั้งคาอุณหภูมิที่ตองการใช โดยกดปุม set คางไวแลวหมุนปุมปรับอุณหภูมิตามที่ตองการ 

5. รอจนคาอุณหภูมิถึงจุดที่กําหนดแลวถึงนําของที่ตองการอุนมาอุนในอางน้ําควบคุมอุณหภูมิ 

6. ถาอุณหภูมิไมถึงจุดที่กําหนดและไฟที่ตําแหนง alarm ติดใหกดปุม reset เครื่องใหม (ปุม reset อยูดานหลัง 

เครื่อง) 

7. เมื่อใชเสร็จใหปดฝาเครื่องและ main switch 

6. เครื่องเขยาผสมสารละลาย รุน G-560E 

1. วางเครื่องบนพื้นโตะพื้นราบเรียบสม่ําเสมอ เสียบปลั๊ก 

2. สําหรับการใชงานที่ตองการใหมีการผสมสารตลอดเวลา ใหปรับสวิทชไปที่ตําแหนง “ON” 

3. สําหรับการใชงานที่ตองการใหมีการผสมสารเปนชวงๆ ใหปรับสวิทชไปที่ตําแหนง “ TOUCH ” 

4. นําสิ่งที่ตองการเขยาผสมสารวางตรงแทนเขยาที่อยูดานบนเครื่อง 

5. ปรับความเร็วของการเขยาตามความตองการโดยใชปุมที่กําหนดความแรงของ Mixer 

6. เมื่อใชงานเสร็จใหปรับสวิทชกลับไปที่ตําแหนง “ OFF “ 


48 


7. ตูบมเพาะเชื้อ (Incubator) 


2. เปดเครื่อง โดยหมุนปุม main switch ไปที่ตําแหนง I ไฟสีเขียวที่ตําแหนง Power และไฟสีเหลืองที่ 

ตําแหนง heat จะติด 

3. ปรับอุณหภูมิที่ตองการโดยกดปุม set คางไวแลวหมุนปรับอุณหภูมิโดยใชปุมปรับที่อยูขางปุม set 

4. รอใหอุณหภูมิถึงจุดที่กําหนดไวไฟสีเหลืองที่ตําแหนง heat จะดับลง ถึงจะนําของที่จะบมเขาเก็บในตู ปด 

ฝาตูใหสนิททั้ง 2 ชั้น 

5. เมื่อใชงานเสร็จแลวใหปดเครื่องโดยหมุนปุม main switch ไปที่ตําแหนง O ไฟสีเขียวที่ตําแหนง Power 

จะดับลง 









6. ถอดปลั๊ก 

9. ตูอบฆาเชื้อโดยใชความรอน (Hot air oven) 

1. นําของที่ตองการอบเขาวางในตู 

2. เปดเครื่อง โดยหมุนปุม main switch ไปที่ตําแหนง ไฟสีเขียวที่ตําแหนง Power และไฟสีเหลืองที่ 


3. หมุนปุมปรับเวลาตั้งเวลาตามที่ตองการจะใช 

4. หมุนปุมปรับอุณหภูมิปรับอุณหภูมิที่ตองการจะใช 

5. ถาอุณหภูมิถึงจุดที่กําหนดไฟสีเหลืองที่ตําแหนง heat จะดับลง 


จะดับลง

49 



1. เปดเครื่องทิ้งไว เพื่อปรับการทํางานของเครื่องใหเขากับสภาวะแวดลอม 30 นาที จอแสดง 0.00 g (หรือ 

0.000 g หรือ 0.0 g) 

2. หากจอแสดงคาน้ําหนักใดๆอยูสามารถปรับใหเปน 0.00 g (หรือ 0.000 g หรือ 0.0 g) โดยกดปุม TARE 


4. กดปุม TARE จอที่แสดงน้ําหนักจะเปลี่ยนเปน 0.00 g (หรือ 0.000 g หรือ 0.0 g) 





ของภาชนะที่ติดเครื่องหมายลบจะเปลี่ยนเปน 0.00 g (หรือ 0.000 g หรือ 0.0 g) 

8. เมื่อใชงานเสร็จกดปุม OFF ตัวเลขบนจอจะหายไป 

11. เครื่องนับโคโลนี 

การดูโคโลนี 

1. วางจาน petri dish ที่จะใชกอนเสียบสายไฟ 

2. ปรับระดับความเอียงของเครื่องใหไดตามตองการ 

3. เปดไฟโดยกดปุมเปด-ปด 

วิธีการนับ ทําได 2 วิธี คือ 

1. วิธีการใชปากกา 

1. เสียบปากกาเขากับชองสําหรับตอปากกา 

2. หากตองการเสียงขณะนับใหเปดปุมเสียง หากไมตองการใหปด 

3. หากเสียบปากกาแลวจะไมสามารถนับดวยการกดปุมบนตัวเครื่อง 

4. กดปุม reset กอนเริ่มการนับ 

5. จิ้มปากกาลงไปบนฝาจานเพื่อนับโคโลนี 

2. วิธีการใชปุมบนตัวเครื่อง 

1. หากเสียบปากกาอยูใหถอดออก 



4. กดปุมบนตัวเครื่องเพื่อนับ

50 


12. เครื่องปนเหวี่ยง (Centrifuge UNIVERSAL 32R) 

1. เสียบปลั๊กแลว เปด Switch ที่บริเวณฐานของเครื่อง 

2. รอใหมีสัญญาณเสียงดังเตือน 1 ครั้ง และไฟแสดงสัญลักษณเปดฝาเครื่องติดกอนแลวจึงสามารถเปดฝา 


3. ตรวจดูหัวปนใหเหมาะสมกับลักษณะหลอดที่จะปน ถาไมเหมาะสมใหเปลี่ยนหัวปนและตรวจเช็คความ 

เรียบรอย (ในกรณีที่เปลี่ยนหัวปน ใหกด Start แลวรอจนกระทั่งรอบการหมุนถึงที่กําหนด เพื่อใหเครื่อง 

ทราบ แลวเครื่องจะแสดงความเร็วสูงสุดในการปนของหัวปนนั้นๆ) 

4. รอใหมีสัญญาณเสียงดังเตือน 1 ครั้ง และไฟแสดงสัญลักษณเปดฝาเครื่องติดกอนแลวจึงสามารถเปดฝา 

เครื่อง แลวใสหลอดทดลองลงไป โดยดานตรงขามของแตละแขนของเครื่อง จะตองมีน้ําหนักเทากัน 

( Balance ) แลวปดฝาเครื่อง 

5. ตั้งเวลาในการปน โดยการกด แลวจะมีตัวเลขแสดงเวลา จากนั้นกด หรือ จนได 

เวลาที่ตองการ 

6. ตั้งความเร็วในการปน โดยการกด แลวจะมีตัวเลขแสดงความเร็ว จากนั้นกด หรือ 

จนไดความเร็วที่ตองการ 

7. ตั้งอัตราเรงในการปน โดยการกด แลวจะมีตัวเลขแสดงอัตราเรง จากนั้นกด หรือ จน 

ไดอัตราเรงที่ตองการ 

8. ตั้งอุณหภูมิในการปน โดยการกด แลวจะมีตัวเลขแสดงอุณหภูมิ จากนั้นกด หรือ จน 

ไดอุณหภูมิที่ตองการ 

9. กด START เพื่อตั้งโปรแกรมการทํางาน 

10. กด START เพื่อเริ่มการทํางานของโปรแกรมตามที่ตั้งไว เมื่อครบเวลาตามที่โปรแกรมกําหนด เครื่องจะ 

หยุดการทํางานเองโดยอัตโนมัติแลวรอใหสัญญาณเสียงดังเตือน 1 ครั้งและมีไฟแสดงสัญลักษณเปดฝา 

เครื่องติดกอนแลวจึงสามารถเปดฝาเครื่องได 


ทํางานแลวรอใหสัญญาณเสียงดังเตือน 1 ครั้งและมีไฟที่แสดงสัญลักษณเปดฝาเครื่องติดกอนแลวจึง 

สามารถเปดฝาเครื่องได 

12. เมื่อเลิกใชงานให ปด Switch ที่บริเวณฐานของเครื่อง และถอดปลั๊กทุกครั้งหลังการใชงานเสร็จแลว 

13. หากมีของเหลวกระเด็นออกมาใหเช็ดทําความสะอาดเครื่อง หลังการใชงานทันที 

13. เครื่อง SpectrophotometerSpectronic® 20 Genesys TM 

1. เปดเครื่องทิ้งไว 15-20 นาที 

2. กดปุม A/T/C เพื่อเลือก mode Absorbance หรือ Transmittance 

3. ตั้งคาความยาวคลื่นโดยใชปุม nm หรือ nm 

4. วาง blank ในชองใสตัวอยาง/ปดฝา 

5. กดปุม 0 ABS/100%T เพื่อ set blank ใหเปน 0 absorbance หรือ 100%T 

6. วาง cuvette ที่บรรจุสารละลายตัวอยางในชองใสตัวอยาง/ปดฝา แลวอานผลจากจอ LCD 

7. ปดสวิทซ/ถอดปลั๊ก

51 

หองปฏิบัติการตรวจน้ํานม 

ชื่อหองปฏิบัติการ : หองปฏิบัติการตรวจน้ํานม (E310) 

นักวิทยาศาสตรประจําหองปฏิบัติการ : นางสาวเสาวรัชรี รินอุตย 

แผนผังหองปฏิบัติการตรวจน้ํานม 

หอง 

น้ํา 

E304 

E303 

E302 

E308 

E310 

E311 

E301 

E307 

E309 

E312 

E314 

E313 

E316 

E315 


1. วิธีการตรวจเชื้อแบคทีเรียกอโรคในน้ํานม 

1.อุปกรณละเครื่องมือ 

1.1ตะเกียงบุนเสน 

1.2หวงเขี่ยเชื้อ 

2.อาหารเลี้ยงเชื้อและสารเคมี 

2.1 5% sheep Blood agar 

2.2 สารทดสอบชีวเคมี 

- Esculin - Hippurate 

- Inulin - Mannitol 

- Raffinose - Salicin 

2.3 ชุดสียอม Gram’s stain 

2.4 น้ํายาที่ใชทดสอบชีวเคมีตางๆ 

2.5 70% Ethanal

52 


3.วิธีการปฏิบัติงาน 

3.1 เผาหวงเขี่ยเชื้อใหรอนแดงแลวทิ้งใหเย็นจุมในตัวอยางนมใหเต็มหวงแลวขีดเชื้อลงบน 5% Blood agar 

3.2 บมเชื้อที่อุณหภูมิ 37 ۫C นาน 24 ชั่วโมง 

3.3 คัดเลือกเชื้อโดย 

- ดูโคโลนีที่เจริญบนอาหารเลี้ยงเชื้อ จดลักษณะตางๆ คือ สี ขนาดเสนผานศูนยกลางของโคโลนี รูปแบบและ 

สวนสูงของโคโลนี ลักษณะผิวหนา ขอบโคโลนี การยอยสลายเม็ดเลือดแดง รวมถึงจํานวนโคโลนีที่เจริญ 

(โดยประมาณ) 

- จดลักษณะตางๆลงในบันทึกวิเคราะหตัวอยาง 

3.4 เพาะเชื้อซ้ําโดยเลือกโคโลนีเดี่ยวๆตามขอ 3.3 มาเขี่ยลงบน 5% Blood agar เพื่อเพิ่มปริมาณเชื้อ 

3.5 นําเชื้อที่ไดมาทําการยอมสี Gram’s stain เพื่อทําการแยกชนิดของเชื้อเพื่อที่จะนําเชื้อไปทดสอบทางชีวเคมี 

3.6 การทดสอบทางชีวเคมี 

- CAMP Test - Esculin 

- Inulin - Hippurate 

- Raffinose - Mannitol 

- Salicin 

3.7 ทําการทดสอบยาปฏิชีวนะ 

Catalase test 

วิธีทํา : ใช sterile loop เขี่ยเชื้อบนอาหารเลี้ยงเชื้อ ปายลงบนสไลด หยด 3%ไฮโดรเจน 

เปอรออกไซด บนเชื้อ สังเกตการณเกิดฟอง 

ผลบวก : มีฟองอากาศเกิดขึ้น 

2. การวินิจฉัยเชื้อ Staphylococcus aureus 

2.1 การยอมสีแกรมและสองดูดวยกลองจุลทรรศน 

ทําการยอมสีแกรมและการแปลผลเชนเดียวกับขอ 1.1 โดยเชื้อ S. aureus จะใหผลดังนี้ 

ผลบวก : เชื้อแกรมบวก ติดสีน้ําเงิน-มวงของคริสตัลไวโอเลต รูปรางกลม เรียงตัวเปน 

กลุมคลายพวงองุน 

2.2 Coagulase test 

เชื้อใน Genus Staphylococcus ที่พบบอยมี 2 species คือ S. aureus และ S. epidermidis 

ดังนั้นการวินิจฉัยแยกเชื้อ 2 ชนิดนี้ จะอาศัยคุณสมบัติการสรางเอนไซม coagulase ของ S. aureus 

ในขณะที่ S. epidermidis จะไมมีคุณสมบัติดังกลาว 

วิธีทํา : ใช sterile loop เขี่ยเชื้อจํานวน 2-3 โคโลนี มากระจายในพลาสมา จํานวน 0.5 มล. 

ในหลอดทดลอง จากนั้นนําไปบมที่อุณหภูมิ 35°ซ สังเกตการจับกันเปนกอนของพลาสมาทุกครึ่ง 

ชั่วโมง ภายในเวลา 4-24 ชั่วโมง 

ผลบวก : เชื้อที่มีการสรางเอนไซม coagulase จะพบวาพลาสมาจับกันเปนกอน 

2.3 การใชน้ําตาลแมนนิทอล (mannitol fermentation) 

เชื้อ S. aureus จะสามารถใชน้ําตาลแมนนิทอล ซึ่งตางจากเชื้อ S. epidermidis จะไมมี 

คุณสมบัตินี้

53 


วิธีทํา : ใช sterile needle แตะเชื้อมา steak บนสวน slant ของ mannitol agar slant จากนั้น 

stab ลงอาหารจนถึงกนหลอด นําไปบมที่อุณหภูมิ 35°ซ ขามคืน อานผลการสรางกรด 

ผลบวก : ถาเชื้อใชน้ําตาลจะเกิดกรดซึ่งสามารถเปลี่ยนสีของ indicator phenol red จากสี 

สมเปนสีเหลืองทั้งหลอด 

2.4 การใชน้ําตาลกลูโคส (glucose fermentation) 

เชื้อ S. aureus จะสามารถใชน้ําตาลกลูโคสได ซึ่งตางจากเชื้อ S. epidermidis จะไมมี 

คุณสมบัตินี้ 

วิธีทํา : ใช sterile needle แตะเชื้อมา steak บนสวน slant ของ glucose agar slant จากนั้น 

stab ลงอาหารจนเกือบถึงกนหลอด บมที่อุณหภูมิ 35°ซ ขามคืน อานผลการสรางกรด 

ผลบวก : ถาเชื้อใชน้ําตาลจะเกิดกรดซึ่งสามารถเปลี่ยนสีของ indicator phenol red จากสี 

แดงเปนสีเหลือง 

2.5 การสลายเม็ดเลือดแดงบน blood agar (hemolysis) 

เชื้อแบคทีเรียแตละชนิดโดยเฉพาะ Gram-positive cocci จะใหโคโลนีและการสลายเม็ด 

เลือดแดง (α, β หรือ γ -hemolysis) บน blood agar plate ได 

วิธีทํา : ใช sterile loop เขี่ยเชื้อมา steak บน blood agar plate เพื่อใหไดโคโลนีเดี่ยวๆ บม 

ที่อุณหภูมิ 35-37°ซ เปนเวลา 18-24 ชั่วโมง สังเกตลักษณะโคโลนีที่ได และการสลายเม็ดเลือดแดง 

ผลบวก : เชื้อ S. aureus จะมีโคโลนีขนาดเล็ก นูน ขุน สีครีม สามารถสลายเม็ดเลือดแดง 

โดยสังเกตเห็น clear zone รอบๆ โคโลนี (β-hemolysis) 

3. วิธีการตรวจ Somatic cell ในน้ํานม 

1. ทําการอุนน้ํานมในอางน้ําควบคุมอุณหภูมิที่ 40 o C 

2. นําสาย waste ใสลงในถัง waste กอนเปดเครื่อง 

3. เปดเครื่อง Somacount 150 และเครื่องพิมพ 

4. เมื่อหนาจอ Main menu ปรากฏ ready 

5. เช็คดูวา Carrier pump ทํางาน 

6. ทิ้งไว 30 นาทีเพื่อใหเครื่อง Stable เพื่อ warm laser และ heating coil 

7. เมื่อครบ 30 นาทีเลือก Run Instrument กด Enter 

8. Pretesing with water 

- จุม pipette ลงใน distil water 100 ml. 

- กด F2 สังเกตหนาจอ count = 0 

- กด F2 เพื่อ Stop (ทํา 3 รอบ) แลวกดF5 เพื่อเปลี่ยนลําดับที่ตรวจ 

9. นํานมมาใสในรางตรวจแลวจุม pipette ลงในนมขวดแรก 

10. กด F2 เพื่อทําการตรวจ 

11. เมื่อตรวจเสร็จกด F2 เพื่อหยุด 

12. ทําการ Cleaning 

- จุม pipette ลงใน 2% RBC 35 Solution (Carrier fluid) ประมาณ 500 ml.

54 


- กด Space bar เพื่อหยุด 

13. ทําการ Rinsing 

- เปลี่ยน 2% RBC 35 Solution เปน distilled water 500 ml. 

- กด F8 เมื่อน้ําใกลหมดกด F8 เพื่อหยุด 

14. Parking the Pumps โดยกด F7 

15. Turning off 

- กด Esc to main menu 

- ปดเครื่อง 

- ปด printer 

- เก็บ pipette และ เก็บสาย waste 

- ปดฝาถัง waste 

**ไมควรเติม Carrier fluid ขณะที่เครื่องกําลังทํางานเพราะอาจเกิด air bubbles** 

วิธีการเตรียมสารสําหรับเครื่อง Somacount 150 

วิธีการเตรียม Dry/Buffer solution 1 ลิตร (สําหรับ 300 ตัวอยาง) 

1. Buffer concentrate 100 ml. 

2. Dye concentrate 10 ml. 

3. deionized water 900 ml. 

**ใชภายใน 7 วัน** 

วิธีการเตรียม Carrier fluid (2%) (สําหรับ 150 ตัวอยาง) 

- RBC 35 Detergent concentrate 20 ml. เติมน้ําจนครบ 1 ลิตร 

**ใชภายใน 7 วัน**

55 

หองปฏิบัติการแบคทีเรียและ 

หองปฏิบัติการตรวจคุณภาพอาหารและน้ําทางจุลชีววิทยา 

ชื่อหองปฏิบัติการ : หองปฏิบัติการแบคทีเรีย (E315) และ 

หองปฏิบัติการตรวจคุณภาพอาหารและน้ําทางจุลชีววิทยา (E316) 

นักวิทยาศาสตรประจําหองปฏิบัติการ : นางสาวนิตยา ชะนะญาติ 

แผนผังหองปฏิบัติการแบคทีเรียและหองปฏิบัติการตรวจคุณภาพอาหารและน้ําทางจุลชีววิทยา 

หอง 

น้ํา 

E304 

E308 

E303 

E310 

E302 

E311 

E301 

E307 

E309 

E314 

E316 

E312 

E313 

E315 

E301 หองจุลทรรศนเปยก 2 

E307 หองนึ่งฆาเชื้อ 

E308 หองเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อ 

E309, E311 หองเก็บเครื่องแกว 

E312 หองลางเครื่องแกว 

E313 หองเก็บอุปกรณและหองพักนักวิทยาศาสตร 

E315, E316 หองปฏิบัติการแบคทีเรีย

56 




1. จํากัดการเขาออกขณะมีการทํางาน 

2. ลางมือทุกครั้ง หลัง สัมผัสสิ่งที่มีเชื้อ, ถอดถุงมือ และกอนออกจากหอง 

3. หามกิน, ดื่ม, สูบบุหรี่, แตงหนา, ถอด / ใสคอนแทคเลนส และเก็บอาหารในบริเวณหอง (ใหเก็บ 

อาหารไวในหองพักเทานั้น) 

4. สวมเสื้อกาวนทุกครั้ง ขณะปฏิบัติงาน สวมถุงมือหากมีแผล ( สงซักที่ชั้น 3 ทุกสัปดาห, หามใสเสื้อ 

กาวนนอกหองปฏิบัติการ) 

5. ทิ้งของมีคมในภาชนะที่จัดไวใหเทานั้น 

6. ลดการแพรกระจายของสิ่งติดเชื้อทางอากาศ หรือการกระเด็น ขณะปฏิบัติงาน 

7. เช็ดพื้นผิวที่ทํางานดวยน้ํายาฆาเชื้อทันที หลังสิ่งติดเชื้อหกและหลังปฏิบัติงานทุกครั้ง 

8. ทิ้งวัสดุติดเชื้อในภาชนะที่เตรียมไว เพื่อนึ่งฆาเชื้อกอนจะลางตอไป 

9. หามเคลื่อนยาย ครุภัณฑและวัสดุอุปกรณในหองปฏิบัติการ 


1. วิธีเตรียม 70 % Ethanol จาก 95% Ethanol 

การคํานวณหาปริมาตร 95 % Ethanol ที่ตองใชเตรียม เตรียมไดจากสูตร 

C1V1 = C2V2 

C1 = ความเขมขนของสารตั้งตน 

V1 = ปริมาตรสารตั้งตน 

C2 = ความเขมขนของสารที่ตองการเตรียม 

V2 = ปริมาตรสารที่ตองการเตรียม 

ตัวอยาง 

1. ตองการเตรียม 70% Ethanol ปริมาตร 1 ลิตร 

2. แทนคาสารที่ตองการเตรียมในสูตรเคมีขางตน 

95(V1) = 70 (1000) 

V1 = 70000 / 95 

V1 = 736.84 

ดังนั้นตองใช 95% Ethanol ปริมาตร 736.84 ml เติมน้ําใหครบ 1,000 ml

2. วิธีเตรียม normal saline solution 

57 



1. ชั่ง NaCl 8.5 g 

2. ละลายใหหมดในน้ํา 1 ลิตร 

3. นําไปฆาเชื้อโดยการ Autoclave ที่ 121 o C เปนเวลา 15 นาที 

3. วิธีเตรียม Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 

1. ชั่ง NaCl 7.650 g 

2. ชั่ง Na 2 HPO 4 , anhydrous 0.724 g 

3. ชั่ง KH 2 PO 4 0.210 g 

4. ละลายสารประกอบทั้งหมดในน้ํา 1 ลิตร ปรับ pH ใหได 7.4 โดยใช NaOH ความเขมขน 1 N 

5. นําไปฆาเชื้อโดยการ Autoclave ที่ 121 o C เปนเวลา 15 นาที 

4. วิธีเตรียมน้ําเกลือเขมขน 

1. ใชเกลือปนที่มีขายตามรานคาทั่วไป 

2. ตมโดยใชน้ําเปลาธรรมดาจนกระทั่งเกลือไมละลาย ทิ้งใหตกตะกอน 

3. เทน้ําเกลือสวนใสเก็บใสถังเก็บ 

4. เกลือที่เหลือสามารถเติมน้ําลงไปแลวตมไดอีก 

*** เกลือ 1 กิโลกรัม สามารถตมไดน้ําเกลือเขมขนประมาณ 1.5 ลิตร 

5. วิธีกําจัดขยะ 

1. ขยะติดเชื้อ 

1.1 แยกทิ้งในถุงพลาสติก ปดปากถุงใหมิดชิด 

1.2 ทําการนึ่งฆาเชื้อโดยการนึ่งฆาเชื้อ ที่ 121 o C เปนเวลา 15 นาที 

1.3 เก็บใสถุงขยะสีดําอีกชั้น รอทิ้งเหมือนขยะทั่วไป 

ของมีคมแยกใสขวดพลาสติก ฝากไปทําลายที่คณะแพทยศาสตร 

2. ขยะทั่วไป 

2.1 ทิ้งในถุงขยะสีดํา ในถังขยะที่มีฝาปด 

2.2 ปดปากถุงใหมิดชิดกอนทิ้งทั้งถุง 

2.3 เก็บรวบรวมทิ้งทุกวัน รอรถเก็บขยะมาเก็บ 

2.4 เศษแกว 

2.4.1 ทิ้งในกลองที่มีถุงขยะสีเขียวที่จัดไวให 

2.4.2 รอจนเต็มแลวปดปากถุงใหมิดชิดกอนทิ้ง 

2.4.3 เก็บไวในโรงเก็บขยะสําหรับเศษแกวเพื่อรอรถมาเก็บ

6. วิธีฆาเชื้อโดยการรมควันดวยฟอรมาลีน 

58 



1. คํานวณสารเคมีที่ใชโดย พื้นที่ 100 ตารางฟุตจะใชสารเคมีดังนี้ 

ก. Potassium permanganate (KMnO 4 ) 17.5 g 

ข. 37% Formaline 35 ml 

2. ผสมสารทั้ง 2 ชนิดเขาดวยกันในภาชนะที่ทนการกัดกรอนไดแลวปดหองไวประมาณ 2 วัน 

• ขณะทําการผสมสารเพื่อทําความสะอาดหองโดยใชวิธีฆาเชื้อโดยการรมควันดวยฟอรมาลีน 

ควรใสหนากากกันสารเคมีและถุงมือทุกครั้ง 

• เมื่อทําความสะอาดหองโดยใชวิธีฆาเชื้อโดยการรมควันดวยฟอรมาลีน ควรติดปายแสดงถึง 

วัน เวลา ที่ทําการฆาเชื้อใหชัดเจน 

7. วิธีการยอมสี Giemsa 

Reagent ประกอบดวย 

1. Wright Giemsa ความเขมขน 30% 

2. Phosphate Buffer pH 7.0-7.2 


1. ทํา smear ตัวอยางบน slide โดยใช capillary ที่มีเลือดแตะลงบนแผน slide และใชขอบของแผน slide 

อีกแผนแตะหยดเลือดใหเอียงทํามุมประมาณ 30-45 o ถอยกระจกที่ใชไถมาดานหลังเล็กนอย เพื่อให 

เลือดกระจายไปตามขอบของกระจกที่ใชไถ แลวไถกระจกมาดานหนาประมาณ 2 ใน 3 สวนของ 

slide เมื่อไถเสร็จก็นําแผน slide ไปผึ่งลมใหแหง 

2. fixed slide ดวย absolute methyl alcohol 15-30 วินาที แลวทิ้งไวใหแหง 

3. หยดสี Giemsa ที่มีความเขมขน 30% ลงบน slide ใหทวม ทิ้งไว 30 นาที 

4. คอยๆหยด Phosphate buffer ในปริมาณเดียวกับสี mix เบาๆ ทิ้งไว 5 นาที 

5. ลาง slide ดวย Phosphate buffer จนสีหมดแลวทิ้งไวใหแหง

8. วิธียอมสี Diff Quick 

59 




1. Fixative solution 

2. “ Instant “ Stain A 

3. “ Instant “ Stain B 


1. ทํา smear ตัวอยางบน slide โดยใช capillary ที่มีเลือดแตะลงบนแผน slide และใชขอบของแผน slideอีก 

แผนแตะหยดเลือดใหเอียงทํามุมประมาณ 30-45 o ถอยกระจกที่ใชไถมาดานหลังเล็กนอย เพื่อใหเลือด 

กระจายไปตามขอบของกระจกที่ใชไถ แลวไถกระจกมาดานหนาประมาณ 2 ใน 3 สวนของ slide เมื่อ 

ไถเสร็จก็นําแผน slide ไปผึ่งลมใหแหง 

2. fixed slide ดวย absolute methyl alcohol 15-30 วินาที แลวทิ้งไวใหแหง 

3. จุม slide ลงใน “ Instant “ Stain A 10 วินาที 

4. แตะปลาย slide ลงบนกระดาษกรองเพื่อดูดซับน้ําสีที่มากเกิน 

5. ลาง slide ดวยน้ํากลั่น 

6. จุม slide ลงใน “ Instant “ Stain B 10 วินาที 

7. แตะปลาย slide ลงบนกระดาษกรองเพื่อดูดซับน้ําสีที่มากเกิน 

8. ลาง slide ดวยน้ํากลั่น แลวทิ้งไวใหแหง 

9. วิธีการยอมสี Gram 


crystal violet, iodine, decolourizer, safranin 


1. Fix slide โดยการผานเปลวไฟหรือ Fixโดยการใชเมทานอล 

2. หยดสี crystal violet ลงบน slide จนทวม ทิ้งไว 10-30 วินาที 

3. ลาง slide ดวยน้ําเปลา สลัดน้ําที่เกาะติด slide ออก 

4. หยด iodine ลงบน slide จนทวม ทิ้งไว 20-60 วินาที (ใชเวลาเปน 2 เทาของเวลาที่ยอมดวย crystal 

violet) 

5. ลาง slide ดวยน้ําเปลา สลัดน้ําที่เกาะติด slide ออก 

6. หยด decolorizer ลงบน slide ประมาณ 10 วินาที ลางดวยน้ําเปลาเบาๆ ทําซ้ําจนกระทั่งไมมีสีของ 

crystal violet หลุดออกมาอีกแลวสลัดน้ําที่เกาะติด slide ออก 

7. หยดสี safranin ลงบน slide จนทวม ทิ้งไว 30 วินาที 

8. ลาง slide ดวยน้ําเปลา สลัดน้ําที่เกาะติด slide ออก ทิ้งใหแผน slide แหง 

9. นําแผนslide ไปตรวจดูดวยกลองจุลทรรศน กําลังขยาย 1000 เทา

60 



การอานผล 

เชื้อที่ติดสีมวงจัดอยูในกลุม Gram positive bacteria 

เชื้อที่ติดสีแดงจัดอยูในกลุม Gram negative bacteria 

วิธีการลางอุปกรณเครื่องแกว 

1. อุปกรณเครื่องแกวที่สัมผัสเชื้อโรค 

ก. แยกในถุงพลาสติก ปดปากถุงใหมิดชิด 

ข. ทําการนึ่งฆาเชื้อโดย Autoclave ที่ 121 o C เปนเวลา 15 นาที 

ค. แยกเศษขยะเก็บใสถุงขยะพลาสติก ปดปากถุงใหมิดชิด ใสในถุงขยะสีดําอีกชั้น รอทิ้งเหมือน 

ขยะทั่วไป 

ง. แยกอุปกรณเครื่องแกว แชในน้ํายาฆาเชื้อ Hyter ที่เจือจาง 10 เทา 

จ. ลางอุปกรณเครื่องแกวดวยน้ํายาลางเครื่องแกว 

ฉ. ลางซ้ําดวยน้ําสะอาดอีก 2 ครั้ง 

ช. ลางครั้งสุดทายดวยน้ํากลั่น 

ซ. นําเครื่องแกวไปตากผึ่งใหแหงสนิท 

2. อุปกรณเครื่องแกวทั่วไป 

ก. ลางอุปกรณเครื่องแกวดวยน้ํายาลางเครื่องแกว 

ข. ลางซ้ําดวยน้ําเปลาอีก 2 ครั้ง 

ค. ลางครั้งสุดทายดวยน้ํากลั่น 

ง. นําเครื่องแกวไปตากผึ่งใหแหงสนิท 

10. วิธีการนับจํานวนโคโลนี (Colony count technique) 

เครื่องมือ 

- อางควบคุมอุณหภูมิ (Water bath) ตั้งอุณหภูมิไวที่ 45±2 

- หมอนึ่งความดัน (Autoclave) ตั้งอุณหภูมิไวที่ 121 o C เวลา 15 นาที 

- ตูบมเพาะ (Incubator) ตั้งอุณหภูมิไวที่ 37 o C 

- เครื่องชั่งดิจิตัล ทศนิยม 2 ตําแหนง 

- เครื่องตีตัวอยาง (Stomacher) 

- เครื่องเขยา (Vortex mixer) 

อุปกรณ 

- หลอดทดลองขนาด 16 mm x 150 mm และฝาปดหลอดทดลอง ที่ผานการฆาเชื้อแลว 

- ขวดเก็บอาหารเลี้ยงเชื้อ หรือสารละลายขนาด 250 ml มีฝาปดแบบเกลียว ที่ฆาเชื้อแลว 

- ปเปตแกวขนาด 1 และ10 ml ที่ผานการฆาเชื้อแลว 

- ลูกยางสําหรับดูดสาร 

- ถุงใสตัวอยางและอาหารเลี้ยงเชื้อ ขนาด 12 นิ้ว x 24 นิ้ว 

- ถุงใสตัวอยาง (Stomacher bag) ขนาด 5 นิ้ว x 8 นิ้ว 

- กรรไกร และปากคีบที่ฆาเชื้อแลวสําหรับตัดแบงตัวอยาง 

- ยางรัด 

- ตะเกียงแอลกอฮอล หรือชุดตะเกียงบุนเซนพรอมถังแกส

61 



- ปากกาเขียนเครื่องแกว 

- กระบอกตวงขนาด 100 ml ที่ผานการฆาเชื้อแลว 

- เทอรโมมิเตอรสําหรับวัดอุณหภูมิในชวง 0-100 o C 

- จานเพาะเลี้ยงเชื้อ ที่ผานการฆาเชื้อแลว ขนาดเสนผานศูนยกลาง 100 mm 

- ถังใสน้ํายาฆาเชื้อสําหรับใสปเปตที่ใชแลว 

- แทนวางหลอดทดลอง (Test tube rack) 

สารเคมี 

- สารละลาย Maximum Recovery Diluent (MRD) 

- อาหารเลี้ยงเชื้อ Plate count agar (PCA) 

วิธีปฏิบัติงาน 

ใชวิธี Aseptic technique ในการปฏิบัติทุกขั้นตอน อาหารเลี้ยงเชื้อ น้ํายาเจือจาง เครื่องแกวและเครื่องใชทุก 

ชนิดที่สัมผัสกับตัวอยาง ตองผานการอบหรือนึ่งฆาเชื้อกอน 

1. ตัวอยางที่เปนของแข็งทําการตัดโดยวิธีปลอดเชื้อ จํานวน 10 กรัม สวนตัวอยางที่เปนของเหลว นํามา 

10 ml แลวนําตัวอยางใสลงใน sterile plastic bag เติม Maximum Recovery Diluent (MRD) 90 ml. ผสมใหเขากัน 

กับตัวอยาง จะไดความเขมขน 10 -1 แลวหลังจากนั้นใชนิ้วมือคอย ๆ ไลอากาศออกจาถุงพลาสติก เพื่อใหอากาศออก 

แลว นําไปใสในเครื่องตีตัวอยาง (Stomacher) เปนเวลา 1 นาที แลวนํา stomacher bag ออกจากเครื่อง stomacher 

แลวทําใหตัวอยางเจือจางลงลําดับละ 10 เทา โดยจับปเปตที่ฆาเชื้อแลวในแนวดิ่ง จุมปลายปเปตใหต่ํากวาผิวของ 

สารละลายในถุงที่เตรียมไว ประมาณ 1 นิ้ว แลวดูดสารละลายนี้จํานวน 1 มล. มาแตะปลายปเปตกับ stomacher 

bag หลังจากนั้นนําไปใสลงใน 9 ml ของ Maximum Recovery Diluent (MRD) (สารละลายสําหรับเจือจาง) ที่ 

เตรียมไวในหลอดทดลอง โดยแตะปลายปเปตที่มีสารละลายที่ต่ํากวาผิวระดับสารละลายที่อยูในหลอด ประมาณ 1 

นิ้ว แลวปลอยสารละลายลงไปในหลอดทดลอง ยกปเปตขึ้นเหนือระดับของ MRD แตะปลายของปเปตที่ขางหลอด 

เปนเวลา 3 วินาที หลังจากนั้นนําปเปตที่ใชแลวใสในภาชนะที่มีสารละลายฆาเชื้อ 

2. เขียนตัวเลขกํากับขางหลอดนี้เปน 10 -2 แลวเขยาหลอดดวยเครื่องเขยาสาร เขยาหลอดประมาณ 15 

วินาที (ตัวอยางในขั้นตอนนี้จะมีความเจือจางเปน 1:10 = 10 -2 ) 

3. ใชปเปตดูดสารละลายที่มีความเขมขน 10 -2 มาปริมาณ 1 ml ใสลงใน 9 ml ของ Maximum Recovery 

Diluent (MRD) ซึ่งตัวอยางในขั้นตอนนี้จะมีความเจือจางเปน 10 -3 ทําซ้ําเชนนี้จนไดสารละลายที่มีความเจือจาง 

สูงสุดตามที่ตองการ ตั้งแต 10 -1 จนถึง 10 -6 โดยเปลี่ยนปเปตใหมทุกๆ ระดับความเจือจางที่เตรียม และผสมใหเขากัน 

ดวย vortex mixer 

4. ใชปเปตขนาด 1 ml ที่ฆาเชื้อแลว ดูดสารละลายจากหลอดที่มีความเขมขนต่ําที่สุด คือ 10 -6 จํานวน 1 

ml ลงในจานเพาะเชื้อที่ผานการนึ่งฆาเชื้อแลว และเขียนวันที่ ความเขมขนของสารละลาย และรหัสของตัวอยางไวที่ 

กนจานอาหารเลี้ยงเชื้อทุกใบแลว จํานวน 2 จานตอ 1 ความเขมขน 

5. ใชปเปตอันเดิมดูดสารละลาย 1 ml ที่มีความเขมขนเพิ่มขึ้นอันดับถัดไป คือ 10 -5 ลงใน จานเพาะเชื้อ 

ที่ผานการนึ่งฆาเชื้อแลว จํานวน 2 จานตอ 1 ความเขมขน เชนกัน และทําเชนนี้จนถึงระดับความเขมขนสูงสุด 

6. เทอาหารเลี้ยงเชื้อ PCA agar ที่ไดฆาเชื้อและหลอมเหลวแลวประมาณ 15-20 มิลลิลิตร ลงในจานเพาะ 

เชื้อที่หยอดตัวอยางไวแลวดวยเทคนิคปลอดเชื้อ โดยที่อุณหภูมิอาหารเลี้ยงเชื้อตองอยูระหวาง 45±2 o C จากนั้นผสม 

สารละลายของเชื้อและอาหารเลี้ยงเชื้อใหกระจายเขากันดี โดย 

a. เขยาตามแนวราบของโตะไปขางหนาและหลัง 5 ครั้ง 

b. เขยาตามแนวราบของโตะไปดานซายและขวา 5 ครั้ง

62 



c. วนจานใหหมุนตามเข็มนาฬิกา 5 ครั้ง 

d. วนจานใหหมุนทวนเข็มนาฬิกา 5 ครั้ง 

หมายเหตุ ในขณะที่เขยาควรระมัดระวังไมใหอาหารเลอะติดฝาจานเลี้ยงเชื้อ 

7. ปลอยใหอาหารเลี้ยงเชื้อแข็งตัว แลวกลับจานเลี้ยงเชื้อใหคว่ําลง 

8. นําไปบมที่ Incubator ณ อุณหภูมิ 37±1 o C เปนเวลา 48±2 ชั่วโมง 

9. จากนั้นนับจํานวนโคโลนีบนอาหารเลี้ยงเชื้อ โดยนับบนจานอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีโคโลนีอยูระหวาง 

10-300 โคโลนี ตอ 1 ความเขมขน 

10. คํานวณปริมาณเชื้อ และรายงานผล 

แผนภาพแสดงวิธีการปฏิบัติงาน 

ใสตัวอยางในสารละลาย MRD 90 ml 

ใสในเครื่องตีตัวอยาง (Stomacher) 1 นาที 

นําตัวอยางที่ไดมาทําการเจือจางใน MRD ดวยวิธี 10-fold dilution

1 ml 

63 



1 ml transfer 

เท PCA Agar , mix 

นําไปบมที่อุณหภูมิ 37±1 o C นาน 48 ±2 ชั่วโมง 

อานผลโดยการนับจํานวน colony และนํามาคํานวณ cfu/g หรือ ml 

การคํานวณและแปรผล 

การนับจํานวนโคโลนีจากสวนที่มีจํานวนโคโลนีตามแตละเทคนิคที่เลือกใช Pour plate technique นับ 

จํานวนโคโลนีในจานเลี้ยงเชื้อที่มีจํานวนระหวาง 10 - 300 โคโลนี 

Cfu/g หรือ mlคํานวณจากสูตร N = ∑C 

V[( n1*1) + (n2 * 0.1)] * d 

โดยที่ N คือ ปริมาณเชื้อ cfu/ml หรือ cfu/g 

∑C คือ ผลรวมของจํานวนโคโลนีที่เลือกมาคํานวณ 

V คือ ปริมาตรของสารละลายเชื้อที่นํามาทดสอบ (1 ml) 

n 1 คือ จํานวนของ plate ที่เลือกมา ของ ความเขมขนแรก 

n 2 คือ จํานวนของ plate ที่เลือกมา ของ ความเขมขนที่ 2 (เจือจางกวา) 

d คือ Dilution ที่สูงที่สุดที่เลือก โดยเปน dilution ที่จํานวนโคโลนีอยูในชวงที่นับได

64 

การคํานวณตัวอยาง Pour plate 



120 โคโลนี 






ความเขมขน 10 -1 ความเขมขน 10 -2 ความเขมขน 10 -3 

แทนคาในสูตร N = 78+65+120+136 

1[2*1+(0.1x2)]x10 -1 

= 399 x10 1 

= 4.0 x10 3 cfu/g (ml) 

ดังนั้นในตัวอยางนี้จะพบเชื้อแบคทีเรียทั้งหมด จํานวน 4.0x10 3 ตอกรัม หรือ มิลลิลิตร 

คาที่คํานวณไดควรปดเปนทศนิยม 1 ตําแหนง โดยที่ถาทศนิยม ตําแหนงที่ 2 มีคาตั้งแต 5 ขึ้นไปใหปด 

ตัวเลขทศนิยมตําแหนงที่ 1 ขึ้น แตถาตัวเลขทศนิยมตําแหนงที่ 2 มีคานอยกวา 5 ลงมาใหคงตัวเลขทศนิยมตําแหนงที่ 

1 ไว หลังจากไดปริมาณเชื้อออกมาแลว จึงนําผลที่ไดไปเทียบกับคามาตรฐานที่กําหนดไววามาก หรือนอยกวาที่ 

มาตรฐานกําหนดหรือไม 

1. หากไมมีโคโลนีเจริญบนจานเลย หรือมีจํานวนโคโลนีนอยกวา 10 โคโลนี ใหรายงานผลเปนนอยกวา 

1.0 X ระดับการเจือจางนอยที่สุดที่ทํา 

2. ในกรณีที่ทุกจานมีการเจริญของเชื้อมาก จนไมสามารถนับได ใหรายงานผลเปน TNTC (Too Numerous 

To Count ) นําตัวอยางที่ตัดสํารองไวมาทําซ้ําเพื่อยืนยันผลอีกครั้งหนึ่ง 

11. วิธีการนับจํานวนยีสตและรา (Yeasts and Moulds Count) 


- อางควบคุมอุณหภูมิ (Water bath) ตั้งอุณหภูมิไวที่ 45±2 o C 

- หมอนึ่งความดัน (Autoclave) ตั้งอุณหภูมิไวที่ 121 o C 

- ตูบมเพาะ (Incubator) ตั้งอุณหภูมิไวที่ 25 o C 





- หลอดทดลองขนาด 16 mm x 100 mm และฝาปดหลอดทดลองแบบเกลียว ที่ผานการฆาเชื้อ 


- ปเปตขนาด 1 และ10 ml ที่ผานการฆาเชื้อแลว 

- ลูกยางสําหรับดูดสาร

65 







- ตะเกียงแอลกอฮอล หรือชุดตะเกียงบุนเซนพรอมถังแกส 




- จานอาหารเพาะเชื้อ ที่ผานการฆาเชื้อแลว ขนาดเสนผานศูนยกลาง 100 mm 




1. สารละลาย Maximum Recovery Diluent (MRD) 

2. อาหารเลี้ยงเชื้อ YDC agar 






กับตัวอยาง จะไดความเขมขน 10 -1 แลวหลังจากนั้นใชนิ้วมือคอย ๆ ไลอากาศออกจากถุงพลาสติกเพื่อใหอากาศ 

ออกแลว นําไปใสในเครื่องตีตัวอยาง (Stomacher) เปนเวลา 1 นาที แลวนํา stomacher bag ออกจากเครื่อง stomacher 

แลวทําใหตัวอยางเจือจางลงลําดับละ 10 เทา โดยจับปเปตที่ฆาเชื้อแลวในแนวดิ่ง จุมปลายปเปตใหต่ํากวาผิวของ 

สารละลายในถุงที่เตรียมไว ประมาณ 1 นิ้ว แลวดูดสารละลายนี้จํานวน 1 มล. มาแตะปลายปเปตกับ stomacher 

bag หลังจากนั้นนําไปใสลงใน 9 ml ของ Maximum Recovery Diluent (MRD) (สารละลายสําหรับเจือจาง) ที่ 

เตรียมไวในหลอดทดลอง โดยแตะปลายปเปตที่มีสารละลายที่ต่ํากวาผิวระดับสารละลายที่อยูในหลอด ประมาณ 1 

นิ้ว แลวปลอยสารละลายลงไปในหลอดทดลอง ยกปเปตขึ้นเหนือระดับของ MRD แตะปลายของปเปตที่ขางหลอด 

เปนเวลา 3 วินาที หลังจากนั้นนําปเปตที่ใชแลวใสในภาชนะที่มีสารละลายฆาเชื้อ 





สูงสุดตามที่ตองการ ตั้งแต 10 -1 จนถึง 10 -6 โดยเปลี่ยนปเปตใหมทุกๆ ระดับความเจือจางที่เตรียม และผสมใหเขากัน 

ดวย vortex mixer 



กนจานอาหารเลี้ยงเชื้อทุกใบแลว) จํานวน 2 จานตอ 1 ความเขมขน 


ที่ผานการนึ่งฆาเชื้อแลว จํานวน 2 จานตอ 1 ความเขมขน เชนกัน และทําเชนนี้จนถึงระดับความเขมขนสูงสุด

66 



16. เทอาหารเลี้ยงเชื้อ YDC agar ที่ไดฆาเชื้อและหลอมเหลวแลวประมาณ 15-20 มิลลิลิตร ลงในจานเพาะ 

เชื้อที่หยอดตัวอยางไวแลวดวยเทคนิคปลอดเชื้อ โดยที่อุณหภูมิอาหารเลี้ยงเชื้อตองอยูระหวาง 45±2 

o C จากนั้นผสมสารละลายของเชื้อและอาหารเลี้ยงเชื้อใหกระจายเขากันดี โดย 


b. เขยาตามแนวราบของโตะไปดานซายและขวา 5 ครั้ง 




17. ปลอยใหอาหารเลี้ยงเชื้อแข็งตัว 

18. นําไปบมที่Incubator ณ อุณหภูมิ 25 o C โดยใหหงายจานเพาะเชื้อขึ้น เปนเวลา 3-5 วัน 

19. จากนั้นนับจํานวนโคโลนีบนอาหารเลี้ยงเชื้อ โดยนับบนจานอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีโคโลนีอยูระหวาง 10- 




ใสตัวอยางในสารละลาย MRD 90 ml 


นําตัวอยางที่ไดมาทําการเจือจางใน MRD ดวยวิธี 10-fold dilution

1 ml 

67 



1 ml transfer 

เท YDC Agar, mix 

นําไปบมที่อุณหภูมิ 25 o C นาน 3-5 วัน 

อานผลที่ได จาก Typical colony และนํามาคํานวณ cfu/g หรือ ml 


การนับจํานวนโคโลนีจากสวนที่มีจํานวนโคโลนีตามแตละเทคนิคที่เลือกใช 

Pour plate technique นับจํานวนโคโลนีในจานเลี้ยงเชื้อที่มีจํานวนระหวาง 10 - 300 โคโลนี 

Cfu/g คํานวณจากสูตร N = ∑C 

V[( n1*1) + (n2 * 0.1)] * d 






d คือ Dilution ที่สูงที่สุดที่เลือก โดยเปน dilution ที่จํานวนโคโลนีอยูในชวงที่นับได

68 












1[2*1+(0.1x2)]x10 -1 

= 399 x10 1 

= 4.0 x10 3 cfu/g (ml) 






1. หากไมมีโคโลนีเจริญบนจานเลย หรือมีจํานวนโคโลนีนอยกวา 10 โคโลนี ใหรายงานผลเปน นอยกวา 


2. ในกรณีที่ทุกจานมีการเจริญของเชื้อมาก จนไมสามารถนับได ใหรายงานผลเปน TNTC (Too Numerous 

To Count ) นําตัวอยางที่ตัดสํารองไวมาทําซ้ําเพื่อยืนยันผลอีกครั้งหนึ่ง 

12. วิธีการนับจํานวน Coliform (Coliform count) 


- อางควบคุมอุณหภูมิ (Water bath) ตั้งอุณหภูมิไวที่ 45±2 o C 

- หมอนึ่งความดัน (Autoclave) ตั้งอุณหภูมิไวที่ 121 o C 15 นาที 

- ตูบมเพาะ (Incubator) ตั้งอุณหภูมิไวที่ 37 ±1 o C 





- หลอดทดลองขนาด 16 mm x 150 mm และฝาปดหลอดทดลอง ที่ผานการฆาเชื้อแลว

69 




- ปเปตแกวขนาด 1 และ10 ml ที่ผานการฆาเชื้อแลว 

- ลูกยางสําหรับดูดสาร 





- ตะเกียงแอลกอฮอล หรือชุดตะเกียงบุนเซนพรอมถังแกส 




- จานเพาะเลี้ยงเชื้อ ที่ผานการฆาเชื้อแลว ขนาดเสนผานศูนยกลาง 100 mm 




- สารละลาย Maximum Recovery Diluent (MRD) 

- อาหารเลี้ยงเชื้อ VRB agar 






กับตัวอยาง จะไดความเขมขน 10 -1 แลวหลังจากนั้นใชนิ้วมือคอย ๆ ไลอากาศออกจากถุงพลาสติกเพื่อใหอากาศ 

ออกแลว นําไปใสในเครื่องตีตัวอยาง (Stomacher) เปนเวลา 1 นาที แลวนํา stomacher bag ออกจากเครื่อง 

stomacher แลวทําใหตัวอยางเจือจางลงลําดับละ 10 เทา โดยจับปเปตที่ฆาเชื้อแลวในแนวดิ่ง จุมปลายปเปตใหต่ํา 

กวาผิวของสารละลายในถุงที่เตรียมไว ประมาณ 1 นิ้ว แลวดูดสารละลายนี้จํานวน 1 มล. มาแตะปลายปเปตกับ 

stomacher bag หลังจากนั้นนําไปใสลงใน 9 ml ของ Maximum Recovery Diluent (MRD) (สารละลายสําหรับเจือ 

จาง) ที่เตรียมไวในหลอดทดลอง โดยแตะปลาย ปเปตที่มีสารละลายที่ต่ํากวาผิวระดับสารละลายที่อยูในหลอด 

ประมาณ 1 นิ้ว แลวปลอยสารละลายลงไปในหลอดทดลอง ยกปเปตขึ้นเหนือระดับของ MRD แตะปลายของปเปต 

ที่ขางหลอดเปนเวลา 3 วินาที หลังจากนั้นนําปเปตที่ใชแลวใสในภาชนะที่มีสารละลายฆาเชื้อ 





สูงสุดตามที่ตองการ ตั้งแต 10 -1 จนถึง 10 -6 โดยเปลี่ยน ปเปตใหมทุกๆ ระดับความเจือจางที่เตรียม และผสมใหเขา 

กันดวย vortex mixer

70 





กนจานอาหารเลี้ยงเชื้อทุกใบแลว) จํานวน 2 จานตอ 1 ความเขมขน 


ที่ผานการนึ่งฆาเชื้อแลว จํานวน 2 จานตอ 1 ความเขมขน เชนกัน และทําเชนนี้จนถึงระดับความเขมขนสูงสุด 

26. เทอาหารเลี้ยงเชื้อ VRB agar ที่ไดฆาเชื้อและหลอมเหลวแลวประมาณ 15-20 มิลลิลิตร ลงในจานเพาะ 

เชื้อที่หยอดตัวอยางไวแลวดวยเทคนิคปลอดเชื้อ โดยที่อุณหภูมิอาหารเลี้ยงเชื้อตองอยูระหวาง 45±2 

o C จากนั้นผสมสารละลายของเชื้อและอาหารเลี้ยงเชื้อใหกระจายเขากันดี โดย 


b. เขยาตามแนวราบของโตะไปดานซายและขวา 5 ครั้ง 




27. ปลอยใหอาหารเลี้ยงเชื้อแข็งตัว แลวเทอาหารเลี้ยงเชื้อ VRB agar ทับใหทั่วอาหารเลี้ยงเชื้ออีกชั้นหนึ่ง 

ปลอยใหอาหารเลี้ยงเชื้อแข็งตัว แลวกลับจานเลี้ยงเชื้อใหคว่ําลง 

28. นําไปบมที่Incubator ณ อุณหภูมิ 37±1 o C เปนเวลา 24±2 ชั่วโมง 

29. จากนั้นนับจํานวนโคโลนีบนอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีโคโลนีสีมวงแดง ขนาดเสนผานศูนยกลางประมาณ 

0.5 mm หรือมากกวานั้น โดยนับบนจานอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีโคโลนีอยูระหวาง 10-300 โคโลนี 



ใสตัวอยางในสารละลาย MRD 90 ml

71 




นําตัวอยางที่ไดมาทําการเจือจางใน MRD ดวยวิธี 10-fold dilution 

1 ml 

1 ml transfer 

เท VRB Agar , mix 

นําไปบมที่อุณหภูมิ 37±1 o C นาน 24 ±2 ชั่วโมง 

อานผลที่ได จาก Typical colony และนํามาคํานวณ cfu/g หรือ ml 


การนับจํานวนโคโลนีจากสวนที่มีจํานวนโคโลนีตามแตละเทคนิคที่เลือกใช 

Pour plate technique นับจํานวนโคโลนีในจานเลี้ยงเชื้อที่มีจํานวนระหวาง 10 - 300 โคโลนี 

Cfu/g คํานวณจากสูตร N = ∑C 

V[( n1*1) + (n2 * 0.1)] * d

72 








d คือ Dilution ที่สูงที่สุดที่เลือก โดยเปน dilution ที่จํานวนโคโลนีอยูในชวงที่นับได 










1[2*1+(0.1x2)]x10 -1 

= 399 x10 1 

= 4.0 x10 3 cfu/g (ml) 






1. หากไมมีโคโลนีเจริญบนจานเลย หรือมีจํานวนโคโลนีนอยกวา 10 โคโลนี ใหรายงานผลเปน นอยกวา 


2. ในกรณีที่ทุกจานมีการเจริญของเชื้อมาก จนไมสามารถนับได ใหรายงานผลเปน TNTC ( Too 

Numerous To Count ) นําตัวอยางที่ตัดสํารองไวมาทําซ้ําเพื่อยืนยันผลอีกครั้งหนึ่ง

13. วิธีการตรวจเชื้อซัลโมเนลลา ในตัวอยางอาหาร (Salmonella spp.) 

73 



อุปกรณและสารเคมีสําหรับการตรวจหาเชื้อซัลโมเนลลา 

1. อาหารเลี้ยงเชื้อ Pre enrichment media 

• Buffered peptone water 

2. อาหารเลี้ยงเชื้อ Selective Enrichment Media 

• Tetrathionate Broth • Rappaport-Vassiliadis broth 

3. อาหารเลี้ยงเชื้อ Selective Plating Media 

• BPLS agar 

• XLD agar 

4. อาหารเลี้ยงเชื้อที่ใชในขั้นตอน Biochemical confirmation 

• Simmon citrate agar • TSI agar 

• Urea Agar 

• MIL medium 

5. ตัวอยางอาหาร 

6. ตูบม (Incubator) สําหรับใชบมที่อุณหภูมิ 37 ±1 องศาเซลเซียส และ 41.5 ±1 องศาเซลเซียส 

7. หวงเขี่ยเชื้อ เสนผาศูนยกลาง 3 มิลลิเมตร 

8. เข็มเขี่ยเชื้อ 

9. หลอดทดลอง ขนาด 16 mm x 150 mm ชนิดแบบมีฝาปด ผานการฆาเชื้อ 

หลอดทดลอง ขนาด 13 mm x 100 mm ชนิดแบบมีฝาปด ผานการฆาเชื้อ 

10. ปเปต ชนิด Graduated pipettes ขนาด 1 และ 10 มิลลิลิตร 

11. Salmonella polyvalent O antiserum (A-67) 

12. สารละลาย Kovac’s reagent 

13. ตะเกียงแอลกอฮอล หรือชุดตะเกียงบุนเซนพรอมถังแกส 

14. ตะแกรงวางหลอดทดลอง 

15. ปากกาเขียนแกว 

16. stomacher 

17.อางควบคุมอุณหภูมิ (Water bath) ตั้งอุณหภูมิไวที่ 44-47 o C 

18.เครื่องชั่งดิจิตัล ทศนิยม 2 ตําแหนง 

19.เครื่องเขยาสาร (Vortex mixer) 

20.ลูกยางสําหรับดูดสาร 

21.ถุงใสตัวอยาง (Stomacher bag) ขนาด 5 นิ้ว x 8 นิ้ว 

22. กรรไกร และปากคีบสําหรับตัดแบงตัวอยางที่ฆาเชื้อแลว 

23.กระบอกตวงขนาด 250 ml ที่ผานการฆาเชื้อแลว 

24. เทอรโมมิเตอรสําหรับวัดอุณหภูมิในชวง 0-100 o C 

25.จานพาะเลี้ยงเชื้อ ที่ผานการฆาเชื้อแลว ขนาดเสนผานศูนยกลาง 90 mm 

26.ยางรัด 

27. ถังใสน้ํายาฆาเชื้อสําหรับใสปเปตที่ใชแลว 

28. แอลกอฮอล 70 % 

29. แอลกอฮอล 95 % 

30.อาหารเลี้ยงเชื้อ Nutrient agar (อาหารและจานเพาะเชื้อผานการฆาเชื้อแลว)

74 



31.ถุงใสตัวอยาง หรืออาหารเลี้ยงเชื้อสําหรับนําไปฆาเชื้อ ขนาด 12 นิ้ว x 24 นิ้ว 


ถาตัวอยางอาหารที่เก็บมาเพื่อตรวจหาซัลโมเนลลามีปริมาณนอยกวาหรือมากวา 25 กรัมหรือ 25มิลลิลิตร 

จะใช pre-enrichment medium ในอัตราสวน ตัวอยาง 1 กรัมหรือมิลลิลิตร ตอ สารละลายอาหารเลี้ยงเชื้อ 9 มิลลิลิตร 

ขั้นตอนการปฏิบัติงาน 

1. นําตัวอยางอาหารที่เก็บมาเพื่อทําการการตรวจ ชั่งน้ําหนัก 25 กรัม แลวใสในถุงพลาสติกที่มีสารละลาย 

buffered peptone water (BPW) 225 มิลลิลิตร หลังจากนั้นใชนิ้วมือคอยๆ ไลอากาศออกจากถุงพลาสติก แลวนําเขา 

เครื่อง stomacher นาน 60 วินาที ( ในกรณีที่ตัวอยางอาหารเปนจําพวกเครื่องเทศ เชน กระเทียม กานพลู ไมตอง 

นําเขา stomacher เนื่องจากอาหารกลุมนี้เปนสมุนไพรที่มีสารยับยั้งเชื้อจุลินทรียอยูภายใน ) จากนั้นนําไปบมในตูบม 

ที่อุณหภูมิ 37 ±1 องศาเซลเซียส เปนเวลา 18± 2 ชั่วโมง 

2. ทําการถายเชื้อจากสารละลายอาหารเลี้ยงเชื้อ BPW โดยใชปเปต (pipette) ดูดสารละลายอาหารเลี้ยงเชื้อ 

มาจํานวน 0.1 มิลลิลิตร โดยนําปลายปเปตที่มีสารละลายตัวอยางจุมต่ํากวาระดับสารละลายอาหารเลี้ยงเชื้อ 

Rappaport-Vassiliadis Broth (RVB) ( Selective Enrichment Media 10 มิลลิลิตร)ที่อยูในหลอดประมาณ 2 

เซนติเมตร แลวปลอยสารละลายลงไปในหลอดทดลอง ยกปเปตขึ้นเหนือระดับของสารละลาย RVB แตะปลาย 

ของปเปตที่ขางหลอดเปนเวลา 3 วินาที แลวยกปเปตขึ้น หลังจากนั้นทําการปดฝาหลอดแลวนําไปทําใหสารละลาย 

ผสมเขากันโดยใชเครื่องผสมสาร (vortex mixer) เปนเวลา 15 วินาที แลวบมเชื้อที่ 41.5±1 องศาเซลเซียส เปน 

เวลา 24±3 ชั่วโมง ปเปตที่ใชแลวใสในภาชนะที่มีน้ํายาฆาเชื้อ และถายเชื้อจากสารละลายอาหารเลี้ยงเชื้อ BPW 

โดยใชปเปตดูดสารละลายอาหารเลี้ยงเชื้อ จํานวน 1 มิลลิลิตร โดยนําปลายปเปตที่มีสารละลายตัวอยางจุมต่ํากวา 

ระดับสารละลายอาหารเลี้ยงเชื้อ Tetrathionate Broth (TTB10 มิลลิลิตร) ที่อยูในหลอดประมาณ 2 เซนติเมตร แลว 

ปลอยสารละลายลงไปในหลอดทดลอง ยกปเปตขึ้นเหนือระดับของสารละลาย แตะปลายของปเปตที่ขางหลอดเปน 

เวลา 3 วินาที แลวยกปเปตขึ้น หลังจากนั้นทําการปดฝาหลอดแลวนําไปทําใหสารละลายผสมเขากันโดยใชเครื่อง 

ผสมสาร (vortex mixer) เปนเวลา 15 วินาที แลวนําไปบมในตูบมเชื้อที่อุณหภูมิ 37 ±1 องศาเซลเซียส เปนเวลา 24±3 

ชั่วโมง นําปเปตที่ใชแลวใสในภาชนะที่มีน้ํายาฆาเชื้อ 

3. ถายเชื้อจากอาหาร RVB และ TTB ลงในอาหารเลี้ยงเชื้อ BPLS agar และ XLD agar โดยวิธี streak 

plate technique กอนที่จะถายเชื้อออกมา ใหนําหลอดอาหารเลี้ยงเชื้อไปผสมดวยเครื่องเขยาสาร เปนเวลา 15 วินาที แลวใช 

หวงเขี่ยเชื้อ ที่ผานการฆาเชื้อดวยการเผาไฟกอนถายเชื้อมาขีดบนอาหารเลี้ยงเชื้อทั้งสองชนิด 

• BPLS จํานวน 1 จาน บมที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เปนเวลา 24 ±3 ชั่วโมง 

ลักษณะโคโลนีของเชื้อซัลโมเนลลา ที่เจริญบนอาหาร BPLS จะเปนโคโลนีสีแดง บนอาหารเลี้ยงเชื้อที่ไมเปลี่ยนสี 

(สีแดง) หรือโคโลนีสีเหลืองบนอาหารเลี้ยงเชื้อสีเหลือง 

• XLD จํานวน 1 จาน บมที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เปนเวลา 24 ±3 ชั่วโมง ลักษณะ โคโลนีของเชื้อซัล 

โมเนลลา ที่เจริญบนอาหาร XLD จะเปนสีแดงใส ตรงกลางเปนสีดําหรือไมก็ได 

4. การเลือกโคโลนีเพื่อยืนยันผลเชื้อ เลือกจากโคโลนีเดียวที่เปนลักษณะเฉพาะของเชื้อซัลโมเนลลาที่เจริญ 

บนอาหารแตละชนิด โดยเลือกมาอยางนอย 2 โคโลนีสําหรับโคโลนีที่มีลักษณะเฉพาะตอเชื้อซัลโมเนลลา หรือ 

2 โคโลนีจากโคโลนีที่คาดวาจะเปนเชื้อซัลโมเนลลา ถายเชื้อจากอาหารที่ใชแยกเชื้อ ขีดลงในอาหารเลี้ยงเชื้อ 

Nutrient agar ตามลําดับแลวนําไป บมที่อุณหภูมิ 37±1 องศาเซลเซียส เปนเวลา 24 ±3 ชั่วโมง เพื่อเลือกโคโลนี 

ที่บริสุทธิ์ นําไปทดสอบคุณสมบัติทางชีวเคมีของอาหารเลี้ยงเชื้อตอไปนี้

75 



1. Simmon citrate agar โดยการขีดใหทั่วหนาเอียงของอาหารเลี้ยงเชื้อจํานวน 1 หลอด เหลืออีกหนึ่งหลอดไว 

เปนหลอดควบคุม บมที่อุณหภูมิ 37±1 องศาเซลเซียส นาน 24 ±3 ชั่วโมง จากนั้นจึงใชเข็มเขี่ยเชื้ออันเดิม ถาย 

เชื้อลงในอาหารชนิดตอไป โดยไมตองเผาเข็มเขี่ยเชื้อ 

2. Urea Agar โดยขีดเชื้อบนผิวหนาของอาหารเลี้ยงเชื้อ จํานวน 1 หลอด เหลืออีกหนึ่งหลอดไวเปนหลอด 

ควบคุม บมที่อุณหภูมิ 37 ±1 องศาเซลเซียส นาน 24 ±3 ชั่วโมง 

3. TSI agar โดยการแทง ( stab) ลึกลงไปประมาณ 2 ใน 3 สวนของอาหารเลี้ยงเชื้อ และขีดเชื้อที่ผิวเอียงของอาหาร 

เลี้ยงเชื้อ จํานวน 1 หลอด เหลืออีกหนึ่งหลอดไวเปนหลอดควบคุม บมที่อุณหภูมิ 37±1 องศาเซลเซียส นาน 

24±3 ชั่วโมง 

4. MIL medium ใชเข็มเขี่ยเชื้อแทงลงไปในอาหาร MIL medium ตรงๆ ลึกลงไปประมาณ 2 ใน 3 สวนของอาหาร 

เลี้ยงเชื้อ จํานวน 1 หลอด เหลืออีกหนึ่งหลอดไวเปนหลอดควบคุม บมที่อุณหภูมิ 37 ±1 องศาเซลเซียส นาน 24 ±3 

ชั่วโมง 

แผนผังการตรวจหาเชื้อซัลโมเนลลาในอาหาร 

BPW บมที่ 37 องศาเซลเซียส นาน 16-20 ชั่วโมง 

 

RVB 

TTB 

บมที่ 41.5 ±1 องศาเซลเซียส นาน 24 ชั่วโมง บมที่ 37±1 องศาเซลเซียส นาน 24 ชั่วโมง 

 

streak plate technique บน Selective Plating Media อยางละ 2 plate 

BPLS 

XLD 

บมที่ 37 ±1 องศาเซลเซียส นาน 24 ชั่วโมง 

 

ถายเชื้อจากลักษณะโคโลนีที่เจริญบนอาหารวุนเลี้ยงเชื้อทั้งสองชนิด 

ที่คาดวาจะเปนโคโลนีของเชื้อซัลโมเนลลา ขีดลงในอาหารเลี้ยงเชื้อ Nutrient agar ตามลําดับแลวนําไป 

บมที่อุณหภูมิ 37±1 องศาเซลเซียส เปนเวลา 24 ±3 ชั่วโมง 

 

ทดสอบคุณสมบัติทางชีวเคมี 

ทําการขีดเชื้อ (streak) ลงบนอาหาร simmon citrate agar และ Urea agar 

ทําการขีดและแทงเชื้อ (streak & stab) ในอาหาร TSI 

ทําการแทงเชื้อ (stab) ในอาหาร MIL 

บมที่ 37 องศาเซลเซียส นาน 24 ชั่วโมง

76 



 

1. Simmon citrate 2. Urea 3. TSI 4.MIL 

การยืนยันผลทางปฏิกิริยาชีวเคมี 

ทําการถายเชื้อจากโคโลนีที่ไดจากขั้นตอนขางตนลงในอาหารที่ใชทดลอบ โดยใชเข็มเขี่ยเชื้อเขี่ยเชื้อจาก 

โคโลนีทีเลือกไว แลวนําไปใสในอาหารเลี้ยงเชื้อที่ใชทดสอบคุณสมบัติทางชีวเคมีของเชื้อซัลโมเนลลาตามลําดับ 

ดังนี้ เริ่มจากขีดบน simmon citrate agar แลวมาขีดบน Urea agar จากนั้นมาขีดและแทงใน TSI agar และสุดทาย 

แทงลงไปใน MIL medium โดยขั้นตอนทั้งหมดทําการเขี่ยเชื้อมาครั้งเดียวและใหเข็มเขี่ยเชื้ออันเดียว 

อาหารเลี้ยงเชื้อ simmon citrate agar 

หลังจากนําไปบมที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเปนเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นนํามาอานผลถาไดผลบวกจะมี 

การใช citrate มีการเปลี่ยนสีของอาหารเลี้ยงเชื้อจากสีเขียวกลายเปนสีน้ําเงิน กรณีอานไดผลลบ จะไมมีการใช 

citrate อาหารเลี้ยงเชื้อจะไมเปลี่ยนเปนสีน้ําเงิน เชื้อซัลโมเนลลาจะใหผลทดสอบเปนบวก เนื่องจากสามารถใช 

citrateได 

อาหารเลี้ยงเชื้อ Urea agar 

หลังจากนําไปบมที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเปนเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นนํามาอานผลถาไดผลบวกจะมี 

การสรางแอมโมเนีย โดยจะมีการเปลี่ยนสีของอาหารเลี้ยงเชื้อจากสีฟนอลเรด (Phenol red) กลายเปนสีชมพู กรณี 

อานไดผลลบ จะไมมีการสรางแอมโมเนีย อาหารเลี้ยงเชื้อจะไมเปลี่ยนเปนสีชมพู เชื้อซัลโมเนลลาจะใหผลทดสอบ 

เปนลบ เนื่องจากไมมีการสรางแอมโมเนีย 

อาหารเลี้ยงเชื้อ TSI Agar 

หลงัจากนําไปบมที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เปนเวลา 24 ชั่วโมง 

ลักษณะสีของกนหลอดอาหารเลี้ยงเชื้อ (Butt) เมื่อบมเปนเวลา 24 ชั่วโมง 

• สีเหลือง มีการใชกลูโคส 

• สีแดงหรือไมเปลี่ยนแปลง ไมมีการใชกลูโคส 

• สีดํา มีการสรางกาซไฮโดรเจนซัลไฟด 

• มีฟองอากาศ หรือ รอยแยก มีการสรางกาซจากกลูโคส 

ลักษณะสีของผิวหนาอาหารเลี้ยงเชื้อ (Slant surface) เมื่อบมเปนเวลา 24 ชั่วโมง 

• สีเหลือง มีการใชแลคโตสหรือซูโครส 

• สีแดงหรือไมเปลี่ยนแปลง ไมมีการใชแลคโตสหรือซูโครส 

ลักษณะเฉพาะของเชื้อซัลโมเนลลา คือ มีคุณสมบัติเปนเบส หรือเปลี่ยนเปนสีแดงที่ผิวหนาของอาหาร 

เลี้ยงเชื้อ และมีคุณสมบัติเปนกรด หรือเปลี่ยนเปนสีเหลืองที่กนหลอดอาหารเลี้ยงเชื้อ และมีการสรางกาซ 

ไฮโดรเจนซัลไฟด หรือเกิดสีดําที่กนหลอดอาหารเลี้ยงเชื้อ 

อาหารเลี้ยงเชื้อ MIL medium 

หลังจากนําไปบมที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเปนเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นนํามาอานผล การเคลื่อนที่ถาไดผลบวก 

จะพบวาอาหารเลี้ยงเชื้อขุนทั่วทั้งหลอด กรณีอานไดผลลบ จะพบการเจริญของเชื้อเฉพาะบริเวณที่แทงเข็มเขี่ยเชื้อลง 

ไปเทานั้น การสรางอินโดล หลังจากหยดน้ํายา kovac อานผลภายใน 5 วินาที ผลบวก สารละลาย kovac ที่หยดลงไป

77 



จะเปนสีชมพูแดง ผลลบสารละลาย kovac จะไมเปลี่ยนสี การทดสอบ lysine decarboxylase ผลบวก อาหารเลี้ยงเชื้อ 

จะไมเปลี่ยนสี ยังคงเปนสีมวงเหมือนตั้งตน ผลลบอาหารเลี้ยงเชื้อจะเปลี่ยนเปนสีเหลือง เชื้อซัลโมเนลลาจะให 

ผลทดสอบเปนลบในการทดสอบอินโดล ใหผลบวกในการทดสอบการเคลื่อนที่เปนสวนใหญและใหผลบวกเปน 

สวนใหญกับการทดสอบ lysine decarboylase 

การแปลผลการทดสอบทางปฏิกิริยาชีวเคมีของเชื้อซัลโมเนลลา 

Test 

Salmonella strains 

S.typhi S.paratyphi A S.paratyphi B S.paratyphi C Other strains 

Reaction Reaction Reaction Reaction Reaction 

TSI acid from glucose + VE + + VE + VE + VE 

TSI gas from glucose - NE + + VE + VE + VE 

TSI acid from lactose - NE - NE - NE - NE - NE 

TSI acid from sucrose - NE - NE - NE - NE - NE 

TSI H 2 S produce + VE - NE + VE + VE + VE 

Urea hydrolysis - NE - NE - NE - NE - NE 

Lysine decarboxylase + VE - NE + VE + VE + VE 

Production of indole - NE - NE - NE - NE - NE 

14. วิธีการตรวจนับปริมาณ coliform bacteria โดยวิธี Most Probable Number (MPN) 



2. ลูกยางสามทาง หรือ Pipette aid 

3. อางน้ําควบคุมอุณหภูมิ (Water bath) อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส 

4. หลอดดักกาซ (Durham tube) 

5. ตูบมเชื้อ อุณหภูมิ 30+1 องศาเซลเซียส 

6. ที่ใสหลอดทดลอง 

7. ปเปต ปริมาตร 10 ml. 


9. หลอดทดลอง ขนาด 16 x 150 มม. พรอมฝาปดหลอดทดลอง 

10. หลอดทดลอง ขนาด 18 x 150 มม. พรอมฝาปดหลอดทดลอง 

อาหารเลี้ยงเชื้อ 

1. Double strength lauryl sulfate broth (D-TSB) ปริมาตร 10 ml. พรอมหลอดดักกาซ 

2. Single strength lauryl sulfate broth (S-TSB) ปริมาตร 10 ml. พรอมหลอดดักกาซ 

3. Brilliant green lactose bile broth (BGLBB) ปริมาตร 10 ml. พรอมหลอดดักกาซ

78 




1 เตรียมตัวอยางตาม SOP การเตรียมตัวอยางอาหารเพื่อการตรวจคุณภาพทางจุลชีววิทยา 

2 เจือจางเชื้อตาม SOP การเจือจางตัวอยาง 

3 ใช Pipette ดูดตัวอยางเริ่มตนปริมาตร 10 ml. ใสลงใน D-LSB จํานวน 3 หลอด 

4 ใช Pipette ดูดตัวอยางเริ่มตนปริมาตร 1 ml. ใสลงใน S-LSB จํานวน 3 หลอด 

5 ใช Pipette ดูดตัวอยางที่มีความเขมขนลดลง 10 เทา ปริมาตร 1 ml. ใสลงใน S-LSB จํานวน 3 หลอด 

6 ใช Pipette ดูดตัวอยางที่มีความเขมขนลดลง 100 เทา ปริมาตร 1 ml. ใสลงใน S-LSB จํานวน 3 หลอด 

7 ใช Pipette ดูดตัวอยางที่มีความเขมขนลดลง 1,000 เทา ปริมาตร 1 ml. ใสลงใน S-LSB จํานวน 3 หลอด 

8 บมเชื้อที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 48 ชั่วโมง 

9 อานผลโดยนับจํานวนหลอดที่ใหผลบวก คือ หลอดที่เกิดกาซในหลอดดักกาซของแตละความเขมขน 

10 ทดสอบเชื้อขั้นยืนยันโดยใชหวงเขี่ยเชื้อถายเชื้อจากหลอดที่ใหผลบวกทุกหลอดลงสู BGLBB หลอดตอ 

หลอด 

11 บมเชื้อที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส นาน 48 ชั่วโมง ในอางน้ําควบคุมอุณหภูมิ 

12 อานผลโดยนับจํานวนหลอดที่ใหผลบวก คือ หลอดที่เกิดกาซในหลอดดักกาซของแตละความเขมขน 

13 อานคา MPN coliform จากตาราง MPN 

15. วิธีการตรวจนับปริมาณ Fecal coliform bacteria และ E. coli โดยวิธี Most Probable Number 

(MPN) 

อุปกรณเครื่องมือ 


2. ลูกยางสามทาง หรือ Pipette aid 

3. อางน้ําควบคุมอุณหภูมิ (Water bath) อุณหภูมิ 45 องศาเซลเซียส 

4. ตูบมเชื้อ (Incubator) อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส 

5. หลอดดักกาซ (Durham tube) 

6. ที่ใสหลอดทดลอง 



9. หลอดทดลองขนาด 16 x 150 มม.พรอมฝาปดหลอดทดลอง 

10. หลอดทดลองขนาด18 x 150 มม.พรอมฝาปดหลอดทดลอง 

11. เครื่องผสมสารในหลอดทดลอง 


1. Single strength lauryl sulfate broth (S-TSB) ปริมาตร 10 ml. พรอมหลอดดักกาซ 

2. Double strength lauryl sulfate broth (D-TSB) ปริมาตร 10 ml. พรอมหลอดดักกาซ 

3. EC broth (EC) ปริมาตร 10 มล. พรอมหลอดดักกาซ 

4. Eosin methylene blue agar (EMB) 

5. Tryptone water (TW) ปริมาตร 10 มล. 

6. Kovac’s reagent

79 




1. เตรียมตัวอยางตาม SOP การเตรียมตัวอยางอาหารเพื่อการตรวจคุณภาพทางจุลชีววิทยา 

2. เจือจางเชื้อตาม SOP การเจือจางตัวอยาง 

3. ใช Pipette ขนาด 10 มล. ดูดตัวอยางเริ่มตนปริมาตร 10 ml. ใสลงใน D-LSB จํานวน 3 หลอด 

4. ใช Pipette ขนาด 1 มล. ดูดตัวอยางเริ่มตนปริมาตร 1 ml. ใสลงใน S-LSB จํานวน 3 หลอด 

5. ใช Pipette ขนาด 1 มล. ดูดตัวอยางที ่มีความเขมขนลดลง 10 เทา ปริมาตร 1 ml. ใสลงใน S-LSB จํานวน 3 

หลอด 

6. ใช Pipette ขนาด 1 มล. ดูดตัวอยางที่มีความเขมขนลดลง 100 เทา ปริมาตร 1 ml. ใสลงใน S-LSB จํานวน 

3 หลอด 

7. ใช Pipette ขนาด 1 มล. ดูดตัวอยางที่มีความเขมขนลดลง 1,000 เทา ปริมาตร 1 ml. ใสลงใน S-LSB 

จํานวน 3 หลอด 

8. บมเชื้อที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 48+6 ชั่วโมง 

9. อานผลโดยนับจํานวนหลอดที่ใหผลบวก คือ หลอดที่เกิดกาซในหลอดดักกาซของแตละความเขมขน 

10. ทดสอบเชื้อขั้นยืนยันผลโดยใชหวงเขี่ยเชื้อถายเชื้อจากหลอดที่ใหผลบวกลงสู EC หลอดตอหลอด 

11. บมเชื้อที่อุณหภูมิ 44.5+1 องศาเซลเซียส นาน 48+6 ชั่วโมง ในอางน้ําควบคุมอุณหภูมิ 

12. อานผลโดยนับจํานวนหลอดที่ใหผลบวก คือ หลอดที่เกิดกาซในหลอดดักกาซของแตละความเขมขน 

13. อานคา MPN Fecal coliform จากตาราง MPN 

14. ถายเชื้อจากหลอดที่ใหผลบวกใน EC ลงใน EMB agar โดยใชหวงเขี่ยเชื้อ โดยเขี่ยใหเปนโคโลนีเดี่ยว 

(Streak for isolation) 

15. บมเชื้อที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 24+6 ชั่วโมง ในตูบมเชื้อ 

16. ทดสอบเชื้อขั้นยืนยันผล โดยเขี่ยเชื้อจากโคโลนีสีเขียววาวเหมือนโลหะ (Green metallic sheen) ลงใน TW 

17. บมเชื้อที่อุณหภูมิ 45 องศาเซลเซียส นาน 24+6 ชั่วโมง ในอางน้ําควบคุมอุณหภูมิ 

18. หยด Kovac’s reagent ลงใน TW ถาเกิดวงแหวนสีแดงขึ้นที่ดานบน อานเปนผลบวก 

19. อานผลโดยนับจํานวนหลอดที่ใหผลบวก ในแตละความเขมขน 

20. อานคา MPN E. coli จากตาราง MPN

80 

การใชครุภัณฑ 








4. เปด iris diaphragm ใหกวางที่สุด แลวคอยๆปดเพื่อใหแสงสวางลดลงและเห็นวัตถุชัด จึงเริ่มทําการตรวจ 

และทําอยางนี้ทุกครั้งที่มีการเปลี่ยนหัว objective lens 

5. ถาตองการจะตรวจดูดวย objective lens ที่มีกําลังขยายมาก (X 40) จะตองดูดวย Objective lens (X10) กอน 

เสมอ และเลื่อนจุดที่ตองการขยายใหมาอยูตรงกลาง แลวหมุน Objective lens (X40) มาแทนที่ และปรับ 

ภาพใหชัดดวยการปรับ fine adjustment เทานั้น 










5. เวลาใสหรือนําของออกจากตูแช ไมควรเปดฝาทิ้งเปนเวลานาน 

3. การใชงานเครื่อง centrifuge EBA 12 

1. เสียบปลั๊ก แลวเปด switch ที่บริเวณฐานของเครื่อง Centrifuge EBA 12 

2. รอใหมีสัญญาณเสียงดังเตือน 1 ครั้ง และไฟแสดงสัญลักษณเปดฝาเครื่องติดกอน แลวจึงสามารถเปดฝา 


3. เปดฝาเครื่อง แลวใสหลอดทดลองลงไป โดยดานตรงขามของแตละแขนของเครื่องจะตองมีน้ําหนักเทากัน 

(Balance) แลวปดฝาเครื่อง 

4. ตั้งเวลาในการปนโดยการกด > < แลวจะมีตัวเลขแสดงเวลา จากนั้นกด หรือ 

จนไดเวลาที่ตองการ 

5. ตั้งความเร็วในการปน โดยการกด > < แลวจะมีตัวเลขแสดงความเร็ว จากนั้นกด 

หรือ จนไดความเร็วที่ตองการ 

6. กด ST OP เพื่อตั้งโปรแกรมการทํางาน

81 



7. กด START เพื่อเริ่มการทํางานตามโปรแกรมที่ตั้งไว รอจนกวาเครื่องทํางานเสร็จ จะมีเสียงดัง 1 ครั้ง และ 

มีไฟที่แสดงสัญลักษณเปดฝาเครื่องติดกอน แลวจึงเปดฝาเครื่องได 


ทํางาน แลวรอใหสัญญาณเสียงดัง 1 ครั้ง และมีไฟที่แสดงสัญลักษณเปดฝาเครื่องติดกอน แลวจึงเปดฝา 


9. เมื่อเลิกใชงาน ใหปด switch ที่บริเวณฐานของเครื่อง และถอดปลั๊กออกทุกครั้งหลังการใชงานเสร็จ 

4. Hematocrit centrifuge 

1. เสียบปลั๊กแลว เปดฝาเครื่อง 

2. เปดฝาครอบจานออก 

3. ใส capillary tube ลงไปโดยการวางหลอดเลือดควรวางดานที่มีดินน้ํามันชิดขอบจานและควรวางหลอดโดย 

ใหมีอีกอันอยูดานตรงขามเพื่อใหเกิดการสมดุลย (Balance) 

4. ปดฝาครอบจานใหแนน และปดฝาเครื่อง 

5. ตั้งเวลาในการปน โดยการหมุนปุมปรับเวลา 5 นาที สัญญาณไฟที่ pilot lamp จะติด มอเตอรจะเริ่มทํางาน 

6. เมื่อครบเวลาเครื่องจะหยุดการทํางานเองโดยอัตโนมัติ รอใหเครื่องหยุดสนิทแลวจึงสามารถเปดฝาเครื่องได 

7. เปดฝาครอบเครื่อง 

8. เปดฝาครอบจาน นําหลอดเลือดที่ปนไดมาอานคา % hematocrit จาก Scale ทันที 

9. เมื่อเลิกใชงานใหถอดปลั๊กออกทุกครั้งหลังการใชงานเสร็จ 

10. หากตองการหยุดการทํางานของเครื่องกอนหมดเวลาที่ตั้งโปรแกรมไว ใหปรับปุมหมุนตั้งเวลามาที่ 0 

เครื่องจะหยุดการทํางาน แลวรอใหเครื่องหยุดสนิทกอนแลวจึงสามารถเปดฝาเครื่องได 

ปุมตั้งเวลา (นาที) pilot lamp 

รูปแสดงปุมการทํางานของเครื่อง Hematocrit centrifuge 


1. กอนใชงานทุกครั้งใหศึกษาการทํางานของ Autopipette ที่เลือกใชงาน เพราะบางชนิดอาจทํางานได 2 

จังหวะ ซึ่งกําหนดปริมาตรไว แตบางชนิดมี overshoot หรือจังหวะที่ 3 

2. การใช overshoot มีวิธีการใช สองวิธีคือ forward mode และ reverse mode 

3. forward mode คือการกดลูกสูบลง(จังหวะที่ 1) แลวปลอยลูกสูบดูดของเหลวขึ้นมา(จังหวะที่ 2) แตตอน 

เอาของเหลวออก ตองกดลูกสูบชวง overshoot (จังหวะที่ 3) เพื่อไลของเหลวออกใหหมด

82 



4. reverse mode คือกดลูกสูบชวง overshoot (จังหวะที่ 3)แลวปลอยลูกสูบดูดของเหลวจนสุด เมื่อเอา 

ของเหลวออกก็กดลูกสูบลง (จังหวะที่ 1) จะเห็นวาจะมีของเหลวเหลืออยูที่ Tip 

5. ตรวจดูความสะอาดของตัว pipette ตลอดจนสวนปลายซึ่งใชสวม Tip อยาใหมีซีรั่ม หรือน้ํายาติดอยู 

6. พรอมของ Autopipette ที่จะใชทํางาน คือหลังจากดูดของเหลวเขาไปใน Tip แลว ใหยกขึ้นดูในอากาศ 

ประมาณ 1 นาที ถาหากของเหลวนั้นไมหยดออกมาที่ปลาย Tip แสดงวาพรอมที่จะใชงาน 

7. การใช Autopipette ในการดูดและปลอยของเหลว 

8. ปรับปริมาตร Autopipette ตามตองการ ใส tip ที่ปลาย Autopipette ใหแนบสนิทพอดี ใหสังเกต Tip ดวยวา 

สะอาดและไมมีรอยบุเยิน 

9. จับ Autopipette ตั้งตรงเวลาดูดของเหลว ดูดของเหลวโดยใหปลาย Tip แตะที่ผิวของของเหลว ไมควรจุม 

ลงในของเหลวที่ลึกจนเกินไป เพราะจะทําใหเกิดการติด ที่ภายนอกของตัว Tip และไมควรใชกระดาษซับ 

ที่ปลาย Tip ภายหลังดูดของเหลวแลว 

10. เมื่อดูดของเหลวเขาไปใน Tip แลว หามวาง Autopipette ในแนวนอน เพราะจะทําใหของเหลวไหลยอน 

เขาไปในตัว Autopipette ได 

11. การปลอยของเหลว ใหใชปลาย tip แตะขางภาชนะ แลวปลอยของเหลวลงอยางชาๆ 

12. เปลี่ยน Tip ใหมทุกครั้ง เมื่อจะทําการดูดของเหลวชนิดอื่น 

6. Autoclave 

1. เติมน้ําลงในกรวย หมายเลข 15 โดยเปดวาลวหมายเลข 4 และวาลวหมายเลข 1 สังเกตดูระดับน้ําที่เติมได 

จากหลอดแกวดูระดับน้ําหมายเลข 17 ใหเติมประมาณ 24 ลิตร ใชน้ํากรองเติม เมื่อเติมไดระดับแลวใหปด 

วาลวหมายเลข 1 และ 4 

2. ใสของที่ตองการนึ่งเขาในหองนึ่ง แลวปดประตูเครื่องนึ่งใหสนิท โดยผลักคันล็อกหมายเลข 7 ไปทางขวา 

มือใหสุด (ซึ่งจะอยูที่ตําแหนง 12 นาฬิกา) แลวหมุนพวงมาลัยล็อกหมายเลข 8 ไปทางขวามือเชนกันให 

แนน 

3. ตรวจดูวาลวทุกตัวตั้งแตหมายเลข 1 ถึง 6 ใหอยูในตําแหนงปด 

4. ปรับอุณหภูมินึ่ง (Sterilizing temperature) ที่เครื่องควบคุมอุณหภูมิหมายเลข 29 (Termostat) ใหอยู 

ตําแหนงที่ตองการ ปรับไดตั้งแต 110-130 องศาเซลเซียส 

5. ตั้งเวลานึ่ง (Sterilize timer) ที่นาฬิกาตั้งเวลาหมายเลข 28 ใหอยูในตําแหนงที่ตองการ (หามปรับตั้งเวลาใน 

ขณะที่เครื่องกําลังทํางานอยู) 

6. เปดสวิทชไฟ (Main) ใหอยูในตําแหนง ON เครื่องนึ่งจะเริ่มทํางาน สังเกตที่หลอดไฟสีเขียว (Power) 

หมายเลข 24 และหลอดไฟสีแดง (Heater) หมายเลข 25 

7. พอแรงดันไอน้ําขึ้นถึง 28 ปอนด/ตารางนิ้ว สังเกตที่มาตรวัดแรงดันหมายเลข 9 ซึ่งเปนมาตรวัดแรงดันไอ 

น้ําของผนังชั้นนอก จึงคอยเปดวาลวหมายเลข 3 และ 4 เพื่อทําระบบสุญญากาศ โดยสังเกตจากมาตรวัด 

แรงดันหมายเลข 10 เข็มชี้จะคอยๆลดต่ําลงมาจนถึงขีด -10 นิ้วปรอท จากนั้นใหปดวาลวหมายเลข 3 และ 4 


8. เปดวาลวหมายเลข 2 เพื่อใหไอน้ําในผนังชั้นนอกเขาในหองนึ่ง โดยคอยๆเปด สังเกตที่มาตรวัดความดัน 

หมายเลข 10 เข็มที่ชี้จะคอยๆขยับขึ้น แลวกดปุม Drying time เพื่อจับเวลา

83 



9. จากนั้นเครื่องนึ่งจะทํางานเองโดยอัตโนมัติจนถึงเวลาที่ตั้งไว เมื่อทําการนึ่งเสร็จแลวสัญญาณออดก็จะดัง 

เตือนและจะหยุดเองโดยอัตโนมัติ 

10. คอยๆเปดวาลวหมายเลข 2 และหมายเลข 3 ชาๆ เพื่อปลอยไอน้ําในหองนึ่งทิ้ง จนเข็มของมาตรวัดแรงดัน 

หมายเลข 10 ลดลงจนถึง 0 

11. การเปดประตูเครื่องนึ่งใหเปดวาลวหมายเลข 6 เพื่อใหอากาศเขาไปแทนที่สุญญากาศภายในหองนึ่ง จึงจะ 

เปดประตูเครื่องนึ่งได 

7. Larminar flow 

1. เสียบปลั๊กเขากับเตาเสียบไฟฟา จะมีไฟสีแดงที่ timer ของ UVH ติดสวาง 2 จุด (ปกติจะเสียบปลั๊กทิ้งไวอยู 

แลว) 

2. เช็ดดานในของ working chamber ดวยแอลกอฮอล 70% 

3. เลื่อนบานกระจกดานหนา chamber ลงมาใหปดสนิท 

4. เปดแสง UV ที่สวิทช UVC เพื่อฆาเชื้อที่ตกคางอยูใน working chamber ใชเวลา 15-20 นาที 

5. ปดแสง UV เมื่อครบเวลา ลงบันทึกการเปดแสง UV ทุกครั้งที่แบบฟอรมขางตู 

6. 6. เปดสวิทช blower ทํางาน (ดันสวิทชขึ้น ไฟสีแดงดานบนสวิทชจะติดสวาง มีเสียงพัดลมของเครื่องกําลัง 

ทํางาน) เช็คดูที่ปุม speed control ควรชี้ที่ตําแหนงเลข 1 และเช็คดูที่ magnehelic gauge เข็มควรชี้ที่ 

ประมาณ 0.5 inch of water 

7. เปด blower ทิ้งไวประมาณ 5 – 10 นาที เพื่อใหความเร็วลมใน chamber คงที่ที่ประมาณ 100 ฟุตตอ 

นาที หรือ 0.5 เมตรตอวินาที และดูดเอาอากาศที่มีฝุนและ particle อื่นๆซึ่งตกคางอยูออกไปจาก clean 

working chamber 

8. นําอุปกรณที่จะใชในการทํางานเขาไปไวใน chamber โดยเลื่อนประตูกระจกดานหนาขึ้นควรวางอุปกรณ 

ใหลึกเขาไปโดยหางจากชองลมอยางนอย 4 นิ้ว 

9. เลื่อนประตูกระจกปดลงมา ทิ้งไวให blower ทํางานอีก 5 – 10 นาที 

10. 10. เปดสวิทช light ของหลอด fluorescent ใหแสงสวางในการทํางาน 

11. ผูปฏิบัติงาน ควรสวมเสื้อกาวนที่สะอาด สวม mask ปดปาก ลางมือและแขนใหสะอาด สวมถุงมือยาง 

และพนแอลกอฮอล 70% ฆาเชื้อบริเวณมือและแขน กอนปฏิบัติงาน 

12. ผูปฏิบัติงาน ควรนั่งใหมีระดับความสูงพอเหมาะคือระดับคางจะตองอยูสูงจากขอบลางของประตูกระจก 

ไมต่ํากวา 2 นิ้ว 

13. ควรระวังอยาใหของเหลวหก ตก กระเด็น ในบริเวณ working chamber โดยเฉพาะดานบนที่เปนสวน 

หลังของ hepa filter และชองลมซึ่งมี prefilter รองอยูดานลาง 

14. เมื่อเสร็จงานแลวนําอุปกรณออกจาก chamber เปด blower ทิ้งไวอีก 5 – 10 นาที 

15. เช็ดทําความสะอาด ดานใน chamber ดวย แอลกอฮอล 70% 

16. ปดประตูกระจกใหสนิท 

17. ตั้งเวลาการทํางานของ U V H เพื่อใชแสง U V ฆาเชื้อที่ตกคางอยูภายใน hepa filter ซึ่งจะหยุดการ 

ทํางานโดยอัตโนมัติเมื่อครบเวลาที่ตั้งไว โดยหมุนปุมตั้งเวลาไวที่ 2 ชั่วโมง สําหรับการทํางานตลอดทั้ง 

วัน และ 1 ชั่วโมงสําหรับการทํางานครึ่งวัน 

18. กดปุม reset สีแดงดานบน timer ของ U V H ไฟสีแดงดานซายจะดับลง

8. อางน้ําควบคุมอุณหภูมิ 

84 



1. ใหเติมน้ํากรองจนถึงขีดที่กําหนดในอาง 


3. เปด main switch 



6. ถาอุณหภูมิไมถึงจุดที่กําหนดและไฟที่ตําแหนง alarm ติดใหกดปุม reset เครื่องใหม (ปุม reset อยูดานหลัง 

เครื่อง) 

7. เมื่อใชเสร็จใหปดฝาเครื่องและ main switch 

9. เครื่องเขยาผสมสารละลายรุน G-560E 

1. วางเครื่องบนพื้นโตะพื้นราบเรียบสม่ําเสมอ เสียบปลั๊ก 

2. สําหรับการใชงานที่ตองการใหมีการผสมสารตลอดเวลา ใหปรับสวิทชไปที่ตําแหนง “ON” 

3. สําหรับการใชงานที่ตองการใหมีการผสมสารเปนชวงๆ ใหปรับสวิทชไปที่ตําแหนง “ TOUCH ” 

4. นําสิ่งที่ตองการเขยาผสมสารวางตรงแทนเขยาที่อยูดานบนเครื่อง 

5. ปรับความเร็วของการเขยาตามความตองการโดยใชปุมที่กําหนดความแรงของ Mixer 

6. เมื่อใชงานเสร็จใหปรับสวิทชกลับไปที่ตําแหนง “ OFF “ 


10. ตูบมเพาะเชื้อ (Incubator) 


2. เปดเครื่อง โดยหมุนปุม main switch ไปที่ตําแหนง I ไฟสีเขียวที่ตําแหนง Power และไฟสีเหลืองที่ 


3. ปรับอุณหภูมิที่ตองการโดยกดปุม set คางไวแลวหมุนปรับอุณหภูมิโดยใชปุมปรับที่อยูขางปุม set 

4. รอใหอุณหภูมิถึงจุดที่กําหนดไวไฟสีเหลืองที่ตําแหนง heat จะดับลง ถึงจะนําของที่จะบมเขาเก็บในตู ปด 

ฝาตูใหสนิททั้ง 2 ชั้น 

5. เมื่อใชงานเสร็จแลวใหปดเครื่องโดยหมุนปุม main switch ไปที่ตําแหนง O ไฟสีเขียวจะที่ตําแหนง Power 

จะดับลง

85 












12. ตูอบฆาเชื้อโดยใชความรอน (Hot air oven) 

1. นําของที่ตองการอบเขาวางในตู 

2. เปดเครื่อง โดยหมุนปุม main switch ไปที่ตําแหนง ไฟสีเขียวที่ตําแหนง Power และไฟสีเหลืองที่ 


3. หมุนปุมปรับเวลาตั้งเวลาตามที่ตองการจะใช 

4. หมุนปุมปรับอุณหภูมิปรับอุณหภูมิที่ตองการจะใช 

5. ถาอุณหภูมิถึงจุดที่กําหนดไฟสีเหลืองที่ตําแหนง heat จะดับลง 




1. เปดเครื่องทิ้งไว เพื่อปรับการทํางานของเครื่องใหเขากับสภาวะแวดลอม 30 นาที จอแสดง 0.00 g (หรือ 

0.000 g หรือ 0.0 g) 









8. เมื่อใชงานเสร็จกดปุม OFF ตัวเลขบนจอจะหายไป

14. เครื่องตีผสมสารตัวอยาง 

86 



1. เสียบปลั๊ก เปด main switch 

2. ตั้งเวลาในการใชตีผสมตัวอยาง ปกติจะใชเวลาประมาณ 30 วินาที 

3. ใสตัวอยางและสวนผสมลงในถุงสําหรับใชตีผสม (ไมควรใสเกิน 400 มิลลิลิตร) 

4. ใสถุงตัวอยางลงไปในตําแหนงตีผสม ใหปากถุงพาดกับขอบฝาเครื่อง 

5. ปดฝาเครื่อง ขอบถุงตัวอยางจะถูกปดโดยฝาเครื่องจะหนีบไวกับตัวเครื่อง 

6. ปดล็อกฝาเครื่องโดยคันโยกปดดานขาง เครื่องจะเริ่มตีผสมตัวอยางหลังจากปดฝาเครื่องใหมิดชิดแลว 

7. พอครบเวลาตามที่กําหนดเครื่องจะปดเองอัตโนมัติ ใหเปดล็อกแลวเอาถุงตัวอยางออก 

8. ถอดปลั๊ก ปด main switch 

15. เครื่องนับโคโลนี 

การดูโคโลนี 

1. วางจาน petri dish ที่จะใชกอนเสียบสายไฟ 

2. ปรับระดับความเอียงของเครื่องใหไดตามตองการ 

3. เปดไฟโดยกดปุมเปด-ปด 

วิธีการนับ ทําได 2 วิธี คือ 

1. วิธีการใชปากกา 

1. เสียบปากกาเขากับชองสําหรับตอปากกา 


3. หากเสียบปากกาแลวจะไมสามารถนับดวยการกดปุมบนตัวเครื่อง 


5. จิ้มปากกาลงไปบนฝาจานเพื่อนับโคโลนี 

2. วิธีการใชปุมบนตัวเครื่อง 

1. หากเสียบปากกาอยูใหถอดออก 



4. กดปุมบนตัวเครื่องเพื่อนับ

87 

หองปฏิบัติการคุณภาพอาหารสัตว 

ชื่อหองปฏิบัติการ : หองปฏิบัติการคุณภาพอาหารสัตว (E405, D402) 

นักวิทยาศาสตรประจําหองปฏิบัติการ : นางสาวเสาวรัชรี รินอุตย 

แผนผังหองปฏิบัติการคุณภาพอาหารสัตว 

E402 

E404 

E405 

ทางเดิน 

E411 

E412 


E401 

E403 

E406 

E407 

E410 


1. การวิเคราะหเยื่อใยโดยรวม (Crude Fiber) 

FIBERTEC 

warm เครื่อง fibertec โดยการตมน้ํา กดปุม H 2 O รอจนไฟเขียวติด พรอมใชงาน ประมาณ 1 ชั่วโมง 

เมื่อไฟเขียวติดที่ H 2 O ใหทําการ warm R1 รอไดเลย โดยกดที่ปุม R1 รอจนไฟเขียวติดที่ R1 พรอมใชงาน 

วิเคราะหไดครั้งละ 6 ตัวอยาง ถานอยกวานั้นใหใส crucible เปลา 

ชั่งตัวอยาง 1 กรัม และ celite 1 กรัม ลงใน crucible (celite ชวยในการกรอง) 

label ตัวอยาง ใหตรงกับตัวเลขที่ crucible 

นํา crucible บรรจุลงเครื่อง filter unit ปรับคันโยกใหญเพื่อกด crucible ลง จากนั้นปรับคันบังคับอันเล็ก 

จาก rest มายัง close จนครบทุกอัน 

เติม acetone 25 c.c. ประมาณตัวเลขขาง crucible (acetone ชวย defat บรรจุในขวดพลาสติกสีแดง) 

ทิ้งไว 5 นาที กรองออก โดยปรับคันบังคับเล็กมายัง vac ทีละอันจนครบ (แรงดูดสุญญากาศ จะแบงกันทุก 

หลอด ดังนั้น ถาตัวอยางไหนกรองเสร็จแลว ควรปดมาที่ close จะทําใหแรงสุญญากาศเพิ่มขึ้น ตัวอยางที่เหลือจะ 

กรองเร็วขึ้น) 

เมื่อไมใช filter unit แลวใหปรับคันบังคับเล็กมาที่ rest ทุกครั้ง 

ยก crucible มาใสเครื่อง fibertec โยกคันบังคับใหญดานซายลง เพื่อล็อค crucible ใหติดกับเครื่อง 

เปดปมน้ํา กดปุม H2O จากนั้นสังเกตปุม R! ถาไฟติดแลว พรอมใชงาน โยกคันบังคับดานบนในแตละ 

column มาที่ R1 และเติม R1 จํานวน 150 c.c. (ประมาณขีดกลางของ column) เมื่อครบตามปริมาณตองการปรับคัน 

บังคับกลับที่เดิม 

เติม octanol 3 – 5 หยด ลงในแตละ column (octanol เปน antifoaming) โดยเปดฝาดานบน

88 


เปดน้ําหลอเย็นดานหลังเครื่อง (ทอ PVC) 

ปรับปุมความรอนมาที่ระดับสูงสุด (10) 

ปด reflector ใหสนิท โดยดูรูปสามเหลี่ยมใหตรงกัน 

รอจนเดือดพรอมกันทุก column แลวปรับปุมความรอนลงมาที่ระดับ 7 – 8 จากนั้นกดปุม timer เครื่องจะ 

count down ให 30 min. 

ระหวางนี้ ให warm R2 รอไว โดยกดปุม R2 รอจนไฟเขียวติด 

ครบ 30 min. ปดปุมความรอนมาที่ระดับต่ําสุด (0) 

กดปุม V และปรับคันบังคับดานลาง มาที่ V เพื่อดูดกรอง reagent ทิ้งไป จนครบทุก column (แรงดูด 

สุญญากาศ จะแบงกันทุกหลอด ดังนั้น ถาตัวอยางไหนกรองเสร็จแลว ควรปด จะทําใหแรงสุญญากาศเพิ่มขึ้น 

ตัวอยางที่เหลือจะกรองเร็วขึ้น) 

ถาพบวามีตัวอยางใด มีการอุดตันกรองผานไมได ใหทําการ pressure เพื่อไลตัวอยางไมใหอัดกันแนน โดย 

กดปุม P และปรับคันบังคับดานลาง มาที่ P 

เติมน้ําลาง โดยการกดปุม H2O เพื่อเปดปมน้ํา จากนั้นใหกดที่ปุมจายน้ํา ดานบนสุดของ column ปุมจายน้ํา 

สามารถโยกไปมา ซาย-ขวา เพื่อเติมน้ําไดทุก column ปริมาณน้ําสูงประมาณตัวเลข ขาง crucible แชไวสักครู 

เมื่อเติมน้ําลางแลว ใหกดปุม V พรอมกับปรับคันบังคับลางมาที่ V เพื่อดูดกรองน้ําออกไป 

จากนั้นปรับคันบังคับมาที่ตําแหนงปกติ ทําการลางดวยน้ําทั้งหมด 3 รอบ (เปนการลางกรดที่เหลือ) 

ถาระหวางการเติมน้ํา มีเสียงปมน้ําดัง พรอมไฟสีแดงติดที่ REF ใหหยุดเติมน้ําชั่วคราว เพราะเครื่องกําลัง 

refill น้ําเขาหมอตมน้ําอยู 

อยาลืมปรับคันบังคับมายังตําแหนงปกติ กอนเติมน้ํา หรือ reagent ทุกครั้ง 

หลังจากลางน้ําแลว 3 รอบ และ warm R2 จนไฟเขียวติดแลวใหทําการเติม R2 โดยขั้นตอนเหมือน R1 ทุก 

ประการแตใหปรับคันบังคับดานบนมาที่ R2 

เมื่อยอยดวย R2 เสร็จแลวใหยกชุด crucible ออก โดยปลดล็อกคันบังคับใหญดานซายขึ้น แลวนํามาใสที่ 

filter unit 

ลางดวย acetone อีกครั้งหนึ่ง (เปนการ dehydration) โดยขั้นตอนเหมือนการลางขั้นตอนแรกทุกประการ 

นํา crucible เขาเตาอบที่ 150 องศา เปนเวลา 3 ชั่วโมง 

เขาพักใน desiccator 

นําออกมาชั่งน้ําหนัก ทั้ง crucible พรอมทั้งจดน้ําหนักที่ได 

นํา crucible เขาเตาเผาที่ 525 องศา เปนเวลา 5 ชั่วโมง รอจนเย็นลง 

เขาพักใน desiccator 

นําออกมาชั่งน้ําหนัก ทั้ง crucible พรอมทั้งจดน้ําหนักที่ได 

หลังใชงาน fibertec แลว ใหทําการลาง column โดยใหใส crucible เปลาเขาไป 

กดปุม H 2 O เพื่อเปดปมน้ํา จากนั้นใหกดที่ปุมจายน้ําดานบนของ column ประมาณ150 c.c. (ประมาณขีด 

กลางของ column) ตมใหเดือดโดยการปรับปุมความรอนมาที่ระดับสูงสุด (10) พรอมกับปด reflector ปลอยใหเดือด 

สักครู 

ปรับปุมความรอนมาที่ระดับต่ําสุด (0) ถอด reflector ออก กดปุม V พรอมทั้งปรับคันบังคับดานลางมายัง 

V เพื่อดูดกรองออก 

ปรับดันบังคับมายังระดับปกติ 

อยาลืมปดน้ําหลอเย็นดานหลังเครื่อง (ทอ PVC) และถอดปลั๊ก เมื่อใชงานเสร็จ

89 


Maintenance 

ใชผาชุบน้ําหมาด เช็ดทําความสะอาดตัวเครื่อง 

ใชน้ําลางคราบ acetone 

มีถาดดานลางสุด สามารถชักออกมาลางทําความสะอาดได 

2. การวิเคราะหไขมัน (Crude Fat) 

SOXTEC 

ควรสวมถุงมือทุกครั้งกอนวิเคราะหไขมัน และ thimble หามจับดวยมือเปลา 

อบ aluminum cups และ thimble ในตูอบ 105 องศา ขามคืนกอน ทําการวิเคราะห 

นําออกมาพักรอ ใน desiccator 

ทําการ warm hot plate โดยกดปุม warm ที่สวน control unit มีรูป * ขึ้น รอใหอุณหภูมิขึ้นถึง 135 องศา 

และรูป * กระพริบ พรอมใชงาน 

นํา thimble มาใส adaptor และ tube support 

นํามาชั่งใสตัวอยาง 1 กรัม และ celite 1 กรัม 

วิเคราะหไดครั้งละ 6 ตัวอยาง ถานอยกวานั้นใหใสแต aluminum cups 

นํา aluminum cups เปลา มาชั่งน้ําหนักทีละอัน label พรอมจดบันทึกแตละอัน ระมัดระวังเรื่องฝุน ใหมาก 

เพราะทําใหน้ําหนักผิดพลาด 

ที่สวน extraction unit มีคันบังคับทางดานซายเปนตัวบังคับสวน thimble และคันบังคับทางดานขวาจะเปน 

ตัวบังคับสวน aluminum cups ตําแหนงปกติจะอยูที่ระดับสูงสุด 

นํา thimble ที่ใส ตัวอยาง และ celite แลว เขาสวนextraction unit ที่สวน extraction unit จะมีแมเหล็กไวดูด 

adaptor ไว แลวถอดเอา tube support ออกมา 

ใส aluminum cups สวมทับดานลางของ thimble จากนั้นโยกคันบังคับดานขวาลง ในระดับกลาง เพื่อล็อค 

aluminum cups เอาไว 

โยกคันบังคับคานซายลง ในระดับกลาง ใหแกนของ extraction unit เปดเพื่อเติม solvent 

เติม petroleum benzene / ether 70 – 90 c.c. (80 c.c.) ในทุกตัวอยาง โดยใช dispenser เติมลงในแตละ 

ตัวอยาง จากทางดานบน (มีฝาปดอยู) 

เปดน้ําหลอเย็น อยูดานขางสวน control unit (ทอ PVC) 

กดคันบังคับทั้งสองขางลง เพื่อกดปด extraction unit และ ให aluminum cups แนบติดกับ hot plate 

ดูที่หนาจอของ control unit อุณหภูมิไดที่ 135 องศา และ * หยุดกระพริบ 

กดปุม start จะมีตัว R ขึ้นที่มุมซายบน เริ่ม reaction 

กด timerใหเครื่องเริ่มการ count down ใน step 1 เวลาจะเริ่มเดินถอยหลัง 

เมื่อเสร็จสิ้นในแตละขั้นตอน จะมีเสียงดังเตือนขึ้น ใหปรับคันบังคับในแตละขั้นตอน ตามตาราง จากนั้น 

กดปุม timer เพื่อเริ่มการทํางานแตละขั้น และ count down ให

90 


ขั้นตอนในการวิเคราะหไขมัน 

Step processing min. ตําแหนงคันบังคับ 

Step 1 Boiling 15 ซาย-ขวา ลาง 

Step 2 Rinsing 30 ซาย-กลาง ขวา-ลาง 

Step 3 Recovery 10 ซาย-บน ขวา-ลาง 

Step 4 Pre-drying 5 ซาย-บน ขวา-กลาง 

เมื่อเสร็จขั้นตอนสุดทาย ใหนํา aluminum cups เขาเตาอบที่ 105 องศาเซลเซียส อีก 1 ชั่วโมง 

นํามารอชั่งน้ําหนักใน desiccator 

ชั่งน้ําหนัก aluminum cups จดบันทึกไว แลวนําไปหักลบกับน้ําหนัก aluminum cups เปลา 

เลื่อนคันโยกซายลงเพื่อนําเอา thimble ออก จากนั้นแยกสวน adaptor ออก เทเศษอาหารที่เหลือทิ้ง และลาง 

ทําความสะอาดโดย solvent (petroleum benzene / ether) หามลางดวยน้ํา 

โดยการลางใหทําในตูดูดควัน สุดทายกอนนําไปใชใหอบไลความชื้นอีกครั้ง 

ภายหลังใชสวน extraction unit เสร็จ ใหถาย solvent (petroleum benzene / ether) เก็บใสในขวดสีชา เพื่อ 

นํากลับไป recycle ในสัดสวน 1 : 1 กับ solvent ใหม 

3. การวิเคราะหโปรตีนโดยรวม (Crude Protein) 

Kjeltec 

digestion unit 

Warm เครื่องสวน digestion unit ใหไดอุณหภูมิ 420 องศาเซลเซียส 

ชั่ง ตัวอยาง โดยใชเทคนิค negative weight จากนั้นนําตัวอยางใสใน digestion tube 

ชุด digestion unit มีทั้งหมด 8 tubes ตองทําหลอด blank (ไมใสตัวอยาง) อยางนอย 1 หลอด ตอหนึ่งชุด 

และ digestion tube 1 หลอดตอตัวอยาง 

ใส copper catalyst หลอดละ 2 เม็ด 

เติม conc. Sulfuric (H2SO4) หลอดละ 12 c.c. โดยทําการเติมภายใน hood เทานั้น 

scrabble unit 

เช็คระดับน้ําในขวดน้ําลนดานขาง ไมใหมีน้ําคางอยู และเช็คดูวาขวดปดสนิทแนน 

เปดสวน scrabble unit ในระดับแรงสุดในชวง 10 นาทีแรก โดยกดปุมเรงปมดายบนสุด 

หลังจากนั้นใหเบาปมลง โดยทําการกดปุมรูปมือ และกดรูปลูกศรลง ใหสัมพันธกับขั้นตอนการ digestion 

สังเกตจากปริมาณไอที่ digestion tube 

ยก digestion tube ลง กดปุมสตารท เริ่มปฏิกิริยา ใชเวลา 1 ชั่วโมง 

ถาการยอยสมบูรณภายในหลอดจะเปนสีเขียว ถาปลอยทิ้งใหเย็นจะเปนสีฟา 

distillation unit

91 


เปดน้ําหลอเย็นดานขางของเครื่อง 

เปดเครื่อง แลวใชโปรแกรมที่ 2 ทําการ stream น้ํารอนกอนใช 3 ครั้ง ดวยการใชหลอดเปลา 

เปลี่ยน flash อันใหมเขาเครื่อง 

นําหลอด blank เขาเครื่องกอน 

ปรับใชโปรแกรมที่ 3 พรอมกับเปลี่ยน flash เปลี่ยนทุกตัวอยาง ตัวอยางละ flash 

จากนั้นนําหลอดที่เปนตัวอยางเขาทีละหลอด โดยเปลี่ยนหลอด และยกฝาครอบขึ้นลงเทานั้น โดยไมตอง 

ปรับคาใด ๆ อีก 

นํา flash ที่เปน blank ที่ไดมา titrate ดวย HCl จนกระทั่งเปลี่ยนเปนสีชมพูออน เปนจุด end point จด 

บันทึกปริมาตรที่ใชไว 

นํา flash ที่เปนตัวอยางมา titrate ตอ โดยเทียบสีที่จุด end point กับสี blank และจดบันทึกปริมาตรที่ใชไว 

สีน้ําเงินเปนสีชมพู 

นําปริมาตรไปแทนคาในสูตรเพื่อหาคาไนโตรเจน และโปรตีนตามลําดับ 

การลางทําความสะอาด ใหใชโปรแกรมที่ 2 เหมือนเดิม 

เปดเครื่อง แลวใชโปรแกรมที่ 2 ทําการ stream น้ํารอนลางอีก 3 ครั้ง ดวยการใชหลอดเปลา 

ใชผาชุบน้ําเช็ดทําความสะอาด บริเวณถาดรองใหสะอาด 

ปดน้ําหลอเย็น ปดเครื่อง และถอดปลั๊กใหเรียบรอย 

หยด 

HCl Standardization / Normality 

อบสาร Na 2 CO 3 ในตูอบ 200 องศาเซลเซียส 

นําใสใน desiccator เก็บโดยใชแผน paraffin ปดทับปากขวด 

นําออกมาชั่งใส flash 0.13 กรัม ทํา duplscation 3 flash 

ละลายดวยน้ํากลั่น flash ละ 20 ml 

ใส mixed indicators (0.1 gm of methyl red + 0.1 gm of bromocresol diluted in 100 ml. of ethanol) 5-6 

ไดสีของสารละลาย ออกสีเขียว ซึ่งภายหลังการ titrate แลวจะออกสีชมพู 

นําไป titrate กับ HCl เพื่อหา end point 2 จุด 

End point จุดแรกใหสีเขียวจางหายไป บันทึกเปน volume 1 

นําสารละลายไป heat จนเดือด ทิ้งไวใหเย็นเล็กนอย จะไดสีกลับมาเขียวเหมือนเดิม 

นํามา titrate กับ HCl อีกครั้ง 

End point จุดที่สอง จะไดสารละลายสีอมชมพู บันทึกเปน volume 2 

ถาเกิน end point จะเปนสีสม ถึงแดง 

แทนคาในสูตร 

Conc. HCl (N) = 2,000 x weight of Na2CO3 

MW of Na2CO3 x (volume 1 - volume 2) 

= 2,000 x 0.13_ _ 

105.9 x (volume 1 - volume 2)

92 


Maintenance 

เครื่อง scrabble unit 

ดูความขุนของสารที่ใช ถาขุนใหเปลี่ยนใหม 

ชอง NaOH เติมสารละลาย NaOH 1 สวน ตอ H 2 O 2 สวน ใสพอทวมแผน 

ชอง H 2 O ใหใสน้ํากอกธรรมดา 

การทําความสะอาดหมอน้ําสีฟา ดานบน 

ใช acetic acid 25 ml + H 2 O 25 ml 

เลือกเขาสู manual mode และทําการ stream ลางเครื่อง ประมาณ 4-5 รอบ 

การทําความสะอาดหมอน้ํา Stream 

เปดกอก ดานหลังเครื่อง เพื่อถายน้ําเกาทิ้งไป 

ใช citric acid 100 gm + H 2 O 800 ml 

กรอกยอนเขาทางสายยาง จากนั้นปดกอกไวอยางเดิม 

Stream กรดใหเดือด 

ระบายกรดทิ้ง โดยการเปดกอก 

เติมน้ําใหม พรอมกับ stream อีก 3 รอบ 

การดูแลรายสัปดาห 

ตรวจสอบระดับน้ํายาที่อยูในถัง หมด หรือลน 

ตรวจสอบอุปกรณเครื่องแกว มีรอยแตกหรือบิ่น ความดันในเครื่องอาจทําใหหลอดเสียหายได 

ลาง Safety door 

การดูแลรายเดือน 

ทําการลางถัง และปมทุกตัว 

ตมน้ําอุน อุณหภูมิที่ 50 – 60 องศาเซลเซียสใสในทุกถัง 

เปดเครื่อง ไปที่ manual mode 

กด add ดูดน้ําไลตามปมทีละถัง 

เช็คปริมาณการ feed น้ําของปมทีละครั้ง วาไดที่ 10 ml หรือไม 

สารเคมีในถังทั้งหมด 4 ถัง ประกอบดวย 

Alkali ใช 40 % NaOH 

Receiver solution ใช 4 % boric acid + indicator 

Waste ถังบรรจุของเสีย 

Water ใช H 2 O + NaCl 

ทั้งหมดสามารถเตรียมไวใชได ไมเกิน 1 – 2 เดือน

93 


4. การวิเคราะหความชื้น (Moisture content) 

การวิเคราะหความชื้นตัวอยางแหง 

ตัวอยางที่มีวัตถุแหงมากกวา 85% สามารถนํามาบดผานตะแกรงละเอียด และนํามาหาคาวัตถุแหงที่แทจริงได 

โดยใชวิธีการแบบขั้นตอนเดียว คืออบในตูอบแบบ forced air oven โดยอาจใชอุณหภูมิสูง 135 องศาเซลเซียส ใน 

ระยะเวลา 2 ชม. ความชื้นจะระเหยไปในระหวางการอบแหง การหาคาวัตถุแหงทําโดยชั่งสารที่เหลือแลวนํามาหัก 

ลบกับน้ําหนักเริ่มตน 

วิธีการ 

1. อบถวยแกวพรอมฝาที่อุณหภูมิ 105 องศาเซลเซียล เปนเวลา 1 ชั่วโมง 

2. ปดฝาถวย นํามาใสในโถดูดความชื้น ปดฝาโถทันที ทิ้งใหเย็นที่อุณหภูมิหองไมเกิน 2-3 ชม. 

3. ชั่งน้ําหนักถวยพรอมฝา(W1) โดยเอาออกทีละใบ และตองปดโถทุกครั้งที่เอาถวยออก 

4. ใสตัวอยางอาหารประมาณ 2 กรัม ลงในถวย บันทึกน้ําหนักถวยพรอมฝา และตัวอยาง (W2) 

5. เขยาถวยเล็กนอยเพื่อใหอาหารกระจาย อยางสม่ําเสมอ และกระจายเต็มพื้นถวย 

6. นําถวยพรอมตัวอยางเขาตูอบที่ไดเตรียมใหมีอุณหภูมิ 105 องศาเซลเซียลแลว วางฝาไวขางๆถวย อบเปน 

เวลา 12 ชม.นับจาก อุณหภูมิ 105 องศาเซลเซียล 

7. เอาตัวอยางออกจากตูโดยปดฝาถวยใหสนิททุกใบ ใสในโถดูดความชื้น ปดฝาโถใหสนิท ทิ้งใหเย็นที่ 

อุณหภูมิหองไมเกิน 2-3 ชม. 

8. ชั่งน้ําหนักถวยพรอมฝาและตัวอยางแหง (W3) 

การคํานวณ 

%วัตถุแหง (total DM) = น้ําหนักถวยพรอมตัวอยางหลังอบ (W3) – น้ําหนักถวยเปลา (W1) X 100 

น้ําหนักถวยพรอมตัวอยางกอนอบ(W2) – น้ําหนักถวยเปลา (W1) 

% ความชื้น(Moisture) = 100 - %วัตถุแหง 

การวิเคราะหความชื้นตัวอยางเปยก 

ตัวอยางที่มีความชื้นสูงกวา 15%หรือวัตถุแหงต่ํากวา 85 % การวิเคราะหหาความชื้นทําในตูอบแหงโดยใช 

อุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียส เพื่อใหกระทบตอองคประกอบทางเคมีนอยที่สุด เวลาที่ใชอบขึ้นอยูกับชนิดของตัวอยาง 

อยูในชวง 24-48 ชั่วโมง. 

วิธีการ

94 


1. ชั่งภาชนะที่ใชบรรจุเชน ถุงผา ถุงตาขาย หรือถาด (W1) 

2. ใสตัวอยางลงในภาชนะที่ใชบรรจุ บันทึกน้ําหนักภาชนะ และตัวอยาง (W2) 

3. ใสตูอบที่อุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียส เปนเวลา 24-48 ชม. 

4. ปลอยทิ้งใหเย็นที่อุณหภูมิหองเปนเวลา 2-4 ชม. เพื่อปรับความชื้นใหเปนไปตามสภาพหอง 

5. ชั่งน้ําหนักภาชนะและตัวอยางแหง (W3) 

ขอควรระวัง 

• อยากองตัวอยางสุมกัน หรืออัดแนนในตูอบ มิฉะนั้นอากาศจะผานไมสะดวก 

• อุณหภูมิตูอบตองไมเกิน 60 องศาเซลเซียส มิฉะนั้นจะเกิดการแข็งตัวของภายนอกตัวอยางแตภายในยังมี 

ความชื้นอยู 

การคํานวณ 

%วัตถุแหง (total DM) = น้ําหนักถวยพรอมตัวอยางหลังอบ (W3) – น้ําหนักถวยเปลา (W1) X 100 

น้ําหนักถวยพรอมตัวอยางกอนอบ(W2) – น้ําหนักถวยเปลา (W1) 

ขั้นตอนการเตรียมสาร 

Kjeltec 

1. Alkali 40 % NaOH w / w 

2. Reciver solution Boric acid sol. 4 % w / v 

400 gm boric acid in hot deionized water 5 liters 

add more hot deionized water until 9 liters 

cool down 

100 ml. bromocresol green sol. (100 mg + 100 ml methanol) 

70 ml. methyl red sol. (100 mg + 100 ml methanol) 

make final volume until 10 liters 

adjust end point 

25 ml. Boric acid + 100 ml. H 2 O 

titrate 0.1 M NaOH (มวง เปน เทาอมเขียว) 

จดปริมาณที่ได X 40 = ปริมาณที่เติม 1 M NaOH คืนลงใน receiver sol. 

40 % NaOH diluted 10 X = 1 M 

1M diluted 10 X = 0.1 M 

3. Titrate HCl 0.1 N conc. HCl = 8.2 ml + 1,000 ml H2O 

4. Scrubber unit 

40 % NaOH 1/3 : H 2 O 2/3 (พอทวมแผน) 

H2O = tap water (พอทวมแผน)

95 


Fibertec 

R1 

R2 

1.25 % H 2 SO 4 (sulphuric acid) = conc. sulphuric acid 7.27 ml + 1,000 ml H 2 O 

1.25% NaOH (sodium hydroxide) = 12.5 gm NaOH + 1,000 ml H 2 O 

Prepare 2 liter for each R1 and R2

96 

หองปฏิบัติการอณูชีวโมเลกุล 

ชื่อหองปฏิบัติการ : หองปฏิบัติการอณูชีวโมเลกุล (E406, E407, E410, E411, E412) 

นักวิทยาศาสตรประจําหองปฏิบัติการ : นายพัลลพ ตันแกว 

แผนผังหองปฏิบัติการอณูชีวโมเลกุล 

E402 

E404 

E405 


E411 

E411 

E412 

E412 


E401 

E403 

E406 E407 E410 

E406 

E407 

E410 


1. การสกัดสารพันธุกรรม (DNA) ดวยวิธี CTAB 

1.1 เติม TE buffer pH 8.0 570 µl 

1.2 เติม 10% SDS 30 µl 

1.3 เติม 20 mg/ml Proteinase K 3 µl ผสมสารละลายดวยเครื่อง vortex 

1.4 นําไป Incubate ใน waterbath ที่อุณหภูมิ 37 ๐ c เปนเวลา 1 ชั่วโมง 

1.5 เติม 5M NaCl 100 µl, ผสมสารละลายดวยเครื่อง vortex 

1.6 เติมสารละลาย CTAB/NaCl 80 µl, ผสมสารละลายดวยเครื่อง vortex 

1.7 นําไป Incubate ใน waterbath ที่อุณหภูมิ 65 ๐ c เปนเวลา 10 นาที 

1.8 เติม Chloroform/isoamyl alcohol (24:1) 700 µl, ผสมสารละลายดวยเครื่อง vortex 

1.9 นําไปปนที่ 13,000 rpm 5 นาที 

1.10 ดูด supernatant ใส Microcentrifuge tube ใหม 

1.11 เติม Phenol/Choloform/isoamyl alcohol (25:24:1) ในปริมาณที่เทากัน 

1.12 ผสมสารละลายดวยเครื่อง vortex แลวปนที่ 13,000 rpm 5 นาที 

1.13 ดูด supernatant ใส Microcentrifuge tube ใหม 

1.14 เติม isopropanol ปริมาณ 0.6 เทา, ผสมสารละลายดวยการ invert 


1.16 เท supernatant ทิ้ง แลวเติม 70% EtOH 500 µl 


1.18 เท supernatant ทิ้ง แลวตากใหแหง 

1.19 เติม TE buffer pH 8.0 75 µl ลงใน DNA ที่สกัดไว, ผสมสารละลายดวยเครื่อง vortex 

1.20 เก็บที่อุณหภูมิ 4 ๐ c

97 


2. เทคนิคการเพิ่มปริมาณ DNA ดวยปฏิกิริยาลูกโซโพลีเมอเรส (PCR) 

2.1 เตรียม master mix โดยเติมสารตางๆ ลงใน microcentrifuge tube ดังตาราง 

สวนประกอบ หนวย 

Taq DNA polymerase 

Unit 

Buffer 

X 

MgCl 2 

mM 

dNTPs 

mM 

Primer 

mM 

Distill water µl 

ตารางแสดงสวนประกอบที่ใชในปฏิกิริยาลูกโซโพลีเมอเรส 

แตละการทดสอบจะใชปริมาณของสารแตละตัวแตกตางกันไป เนื่องจากการทดสอบชนิดใดชนิดหนึ่งนั้น 

จะตองมีการปรับสภาพที่เหมาะสมสําหรับงาน PCR นั้นๆ เพื่อใหเกิดประสิทธิภาพสูงสุด 

2.2 ดูด master mix ใส PCR tube จากนั้นเติม DNA template ที่เตรียมไวลงใน PCR tube 

2.3 นํา PCR tube ใสลงในเครื่องเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม (Thermocycle) จากนั้นทําการตั้งอุณหภูมิและ 

เวลาที่ใชในขั้นตอน Primer annealing, Primer extension และ Denaturation โดยตั้งอุณหภูมิและเวลาที่เหมาะสม 

ที่สุดสําหรับงาน PCR นั้นๆ 

2.4 เมื่อครบเวลานํา PCR tube ออกจากเครื่อง เก็บที่อุณหภูมิ 4 ๐ c 

3. วิธี Gel electrophoresis 

3.1 เตรียมเจลที่ใชในการทํา electrophoresis 

สําหรับเจลที่ใชกันทั่วไปสําหรับการแยก DNA ที่มีขนาด > 500-1000 base pairs คือ Agarose gel ที่มีความ 

เขมขนต่ํา โดยเตรียมใหมีความเขมขนประมาณ 1-2% มีวิธีการเตรียมดังนี้ 

-ชั่งผง agarose แลวนําไปละลายใน electrophoresis buffer โดยทั่วไปนิยมใช 1x TBE buffer 

-ทําการตมโดยใชความรอนจากไมโครเวฟประมาณ 2-3 นาที (ตองผสมผง agarose กับ bufferใหเขากันดี 

กอนนําไปละลายในความรอน) 

-เมื่อตมใหละลายดีแลวนํา agarose ไปอุนที่อุณหภูมิประมาณ 45-60 ๐ c แลวเติม ethidium bromide ลงไป 

-เทเจลลงบนชุดเตรียมเจลที่ทําการปรับสมดุลไวแลวและมีแผน comb เสียบอยู แลวปลอยใหเจลแข็งตัว 

3.2 วางแผนเจลลงใน electrophoresis chamber แลวเท 1x electrophoresis buffer (ตองเปนชนิดเดียวกับที่ 

ใชเตรียมเจล) ลงไปใน chamber ใหทวมแผนเจล 

3.3 ตอ chamber เขากับเครื่องจายกระแสไฟฟา (power supply) ดวยสายไฟฟา โดยใหชองใสเจลอยู 

ทางดานขั้วลบ ขณะนี้ยังไมเปด power supply 

3.4 กอนนํา DNA ไปทํา gel electrophoresis จะตองผสม DNA sample กับ loading dye กอนดวยอัตราสวน 

ที่เหมาะสมสําหรับวิธีการตรวจนั้นๆ 

3.5 หยอด DNA sample (ที่เติม loading dye แลว) ลงในชองเจล โดยใช micropipet ในปริมาณที่พอเหมาะ 

และทําดวยความระมัดระวัง เพื่อไมใหเกิดการฟุงกระจาย บันทึกการหยอด DNA sample ลงในชอง เจลตามลําดับ

98 


3.6 ปดฝา chamber แลวเปด power supply ตั้งคาตางๆที่ตองการทั้งปริมาณกระแสไฟฟาและเวลาที่ใช แลว 

กดปุม RUN เพื่อเริ่มทํางาน 

3.6 เมื่อจบการทํา gel electrophoresis ปด power supply ถอดสายไฟฟา แลวนําแผนเจลไปตรวจดู DNA 

band ดวยเครื่องวิเคราะหคุณภาพเจล 


1. เครื่องปนเหวี่ยง Spectrafuge 16 M 

1. เสียบปลั๊กเขากับเตาเสียบที่มีกําลังไฟฟาขนาด 220 โวลต 

2. กดปุม Lid ดานขางเพื่อเปดฝาเครื่องและดึงเปดฝาดานใน 

3. ใสหลอดทดลองขนาด 1-2 มล.โดยตองใหมีปริมาตรหรือน้ําหนักสมดุลกันทั้ง 2 ดาน 

4. ตั้งโปรแกรมการทํางานของเครื่อง โดยใชปุมปรับระดับความเร็วของการปนเหวี่ยง (round per minute) 

และเลือกระยะเวลาของการปนโดยใชปุมปรับระดับเวลา (Timer) 

5. ปดฝาหัวปนและฝาเครื่องใหเรียบรอย เมื่อปดฝาดานนอกเครื่องจะเริ่มทํางานทันที 

6. เมื่อครบเวลาที่กําหนดเครื่องจะหยุดเองโดยอัตโนมัติ 

7. เมื่อสัญญาณไฟสีเขียวดานหนาดับลงและฝาเครื่องเปด ใหเปดฝาเครื่องได 

8. เปดฝาหัวปน นําหลอดที่ปนออกมา แลวปดฝาเครื่อง 


2. เครื่องเขยาผสมสารละลาย (VORTEX MIXER Genie -2) 

1. วางเครื่องบนพื้นโตะพื้นราบเรียบสม่ําเสมอ 

2. เสียบปลั๊กกับเตาเสียบที่มีกําลังไฟฟา 220 โวลต เทานั้น 

3. สําหรับการใชงานที่ตองการใหมีการผสมสารตลอดเวลา ใหปรับสวิทชไปที่ตําแหนง ON (I) 

4. สําหรับการใชงานที่ตองการใหมีการผสมสารเปนชวงๆ ใหปรับสวิทชไปที่ตําแหนง TOUCH 

5. นําสิ่งที่ตองการเขยาผสมสารวางตรงแทนเขยาที่อยูดานบนเครื่อง ปรับความเร็วของการเขยาตาม 

ความตองการโดยใชปุมที่กําหนดความแรงของ Mixer เมื่อใชงานเสร็จ ใหปรับสวิทชกลับไปที่ 

ตําแหนง OFF (O) 


3. เครื่องดูดจายสารละลายอัตโนมัติ (Autopipette) 

1. เลือกขนาดของ Autopipette ใหเหมาะสมกับปริมาณสารที่ตองการดูด โดยพิจารณาที่ขนาดของ 

Autopipette แตละอัน ซึ่งจะมีปายขนาดปริมาตรบอกไวดานขาง 

2. เลือก tip ใหเหมาะสมกับ Autopipette ที่ใช

99 


3. ปรับปริมาตรที่ตองการดูดโดยหมุนปุมปรับปริมาตรของ Autopipette และหามปรับปริมาตรสูงกวา 

ปริมาตรที่กําหนดไวบนตัว Autopipette 

4. เสียบ tip ใหแนนพอดีกับปลาย Autopipette แลวกดปุมเพื่อดูดสารละลายพรอมจะใชงาน 

5. จุมปลาย tip ลงไปในสารละลาย ใหแตะสารละลายระดับที่จะดูดได อยาใหโคน Autopipette จุมลงใน 

สารละลายดวย 

6. ดูดสารละลายขึ้นมาแลวปลอยลงในภาชนะที่เตรียมไว ใหปลาย tip แตะกับภาชนะนั้น 

7. กดปุมดานขางเพื่อปลอย tip ทิ้ง 

8. เมื่อใชงานเสร็จใหเก็บในที่แขวน Autopipette 

4. เครื่องเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม รุน PTC-200 

1. ใส PCR tube ลงใน block ที่ตองการ ปดฝาสีดําลงมา แลวหมุนตัวล็อคสีฟาไปทาง tight ใหพอดี 

2. เปดเครื่อง UPS รอใหกระแสไฟคงที่ กดสวิสซหลังเครื่อง หลังจากนั้นประมาณ 1 นาที หนาจอจะ 

แสดงเมนูหลัก 

3. ใชปุม Selection key เพื่อเลื่อน CURSOR ไปที่เมนู RUN กดปุมProceed 

4. เลือกโปรแกรมและ test ที่ตองการ ดวยปุม Proceed 

5. หนาจอแสดงสถานะวาทํางานที่ Block ใด เลือก block ที่ใสหลอด PCR tube โดยใชปุม block key 

(กด A ซาย, B ขวา) กด Proceed 

6. หนาจอจะถามวาใหเลือกใช tubes หรือ plate ใหเลือก tube, กด Proceed 

7. หนาจอจะถามปริมาณ Volume ใหปอนจํานวน Volume ตอ 1 Reaction เชน 25 µl, 50 µl, กด Proceed 

8. หนาจอจะถามวาใช heated lid หรือไม ใหเลือก Yes, กด Proceed 

9. ขณะที่โปรแกรมกําลังทํางาน จอจะแสดงดังนี้ 

Run: 2-STEP 

1 = 92.0 ๐ for 0:05 

Block: 62.1 

Calc: 68.0 ๐ 

ถากดปุม เครื่องจะแสดงเวลาที่ใชไป (Total time….) และเวลาที่เหลือกอนโปรแกรมจะเสร็จ 

(Est remain……..) 

10. หลังจากเครื่องทํางานเสร็จ บรรทัดสุดทายที่หนาจอจะแสดงอุณหภูมิ 4 ๐ C, กด Cancel เพื่อ stop 

program , ปดสวิสซหลังเครื่อง, ปด UPS 

11. เปดฝาเครื่องทิ้งไว 

5. เครื่องเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม รุน PTC-200 

การถายรูปเจล 

1. เปดสวิทซปลั๊กไฟ 

2. เปดสวิทซดานหลังเครื่อง

100 


3. เปด drawer/วางเจลลงบน UV illuminator โดยไมใหมีฟอง 

4. ปด drawer โดยดันใหสุด แลวบิดตัวล็อกตามเข็มนาฬิกาแลวพับลง 

5. เปดคอมพิวเตอร/เลือกโปรแกรม Quantity One/เขาเมนู file/เลือก chemi Doc 

6. เปด Epi-White/ เปดฝาดานหนาเพื่อเลื่อนเจลใหอยูในตําแหนงที่ตองการ 

7. ปรับภาพโดยใช function Zoom และ Focus จากเมนูคอมพิวเตอร 

8. เมื่อไดขนาดและตําแหนง gel ที่ตองการ ปดฝาดานหนา โดยบิดตัวล็อกตามเข็มนาฬิกาแลวพับลง 

9. ปดปุม Epiwhite และเปด trans UV 

10. ปรับความเขมของแสงโดยใช iris และปรับความชัดของภาพโดยใช Zoom และ Focus 

11. เมื่อไดภาพที่ตองการ กดเมนู Freeze 

12. ปด Trans UV/save ภาพที่ได และสามารถ Print ภาพ โดย Video Print 

13. ปด Printer, ปดคอมพิวเตอร 

14. เปด Drawer เพื่อเก็บ gel ไปทิ้งในถังใตซิงคน้ํา แลวเช็ด UV illuminatorโดยใช 70% alcohol 

15. เปด drawer ทิ้งไว จากนั้นปดสวิทซและปดปลั๊ก 

6. ตูเพาะเชื้อแบบเขยา HT MINITRON 

1. เสียบปลั๊ก/เปด MAIN SWITCH ดานขางตัวเครื่อง 

2. ตั้งคา RPM ที่ตองการโดยกดปุม จนเครื่องหมาย RPM ปรากฏ/กดปุม 

3. ตั้งอุณหภูมิที่ตองการโดยกดปุม จนเครื่องหมาย ๐ C ปรากฏ/กดปุม 

4. ตั้งเวลาที่ตองการโดยกดปุม จนเครื่องหมาย ปรากฏ/กดปุม 

5. หลังใชงานเสร็จปด MAIN SWITCH /ถอดปลั๊ก 

7. เครื่องวัดการดูดกลืนแสง (Spectrophotometer : Spectronic Genesys 8) 

F 

F 

F 

1. เปดเครื่อง ทิ้งไว 30 นาที 

2. ใชปุมลูกศรทางซายหรือขวา เพื่อเลือก xxx nm กดปุม Enter 

3. ปอนคาความยาวคลื่นแสง กดปุม Enter 

4. กดปุมลูกศรซายหรือขวา เพื่อเลือก “Abs” 

5. วาง “Blank” ในชองใสตัวอยาง/ปดฝา 

6. กดปุม ZERO จอแสดงคาจะแสดง“dAr” แลวเปลี่ยนเปน “ZEro” ในขณะที่กําลังวัดคา 

7. วาง cuvette ที่บรรจุสารละลายตัวอยางในชองใสตัวอยาง/ปดฝา คาการดูดกลืนแสงของสารละลาย 

ตัวอยางเทียบกับสารละลาย Blank จะแสดงทางจอ LCD

101 


8. เครื่องอุลตราโซนิค UP100H 

1. เสียบปลั๊ก, ไฟสีแดงขึ้น 

2. ตั้งคาความแรงเริ่มตนที่ 20% 

3. จุมหัว Sonotode ลงในของเหลว (ระวังไมใหระดับของเหลวสูงเกินระดับที่กําหนด) 

4. กดปุม start ไฟสีเขียวจะปรากฏตลอดเวลาที่เครื่องทํางาน 

5. ปลอยมือจากปุม start เมื่อตองการหยุดการทํางาน (เมื่อตองการเปลี่ยนเปนการทํางานแบบตอเนื่อง ให 

กดปุม locking ในระหวางที่ทํางาน) 

9. เครื่องจายกระแสไฟฟา (Power Pac 300/200) 

1. ตอเครื่อง Power Pac 300/200 เขากับชุดแยกวิเคราะหสารพันธุกรรม (Electrophoresis) 

2. เสียบปลั๊กและเปดสวิทซดานขางตัวเครื่อง Power Pac 300/200 

3. หนาจอจะแสดง 0 Volt และสัญญาณไฟตรงกับ V ตั้ง Voltage ที่ตองการโดยปุม Scroll key (ปุม 

ลูกศร) 

4. กดปุม Parameter key ใหสัญญาณไฟตรงกับ mA (Power Pac 300) หรือ A (Power Pac 200)เพื่อตั้งคา 

กระแสไฟฟา, ใชปุม Scroll key (ปุมลูกศร) เพื่อปอนคาที่ตองการ 

5. กดปุม Parameter ใหสัญญาณไฟตรงกับสัญลักษณรูปนาฬิกาเพื่อตั้งเวลา, ใชปุม Scroll key (ปุม 

ลูกศร) เพื่อตั้งเวลาเปนนาที สามารถตั้งเวลาไดสูงสุด 999 นาที (ในขณะกําลัง RUN เครื่องจะแสดง 

เวลาที่เหลือ) 

6. กดปุม RUN เพื่อเริ่มการทํางาน 

7. เมื่อครบเวลาเครื่องจะหยุดการทํางานโดยอัตโนมัติและหนาจอแสดง OFF (กรณีที่ตองการหยุดการ 

ทํางานของเครื่องกอนครบเวลาใหกดปุม RUN เพื่อหยุดการทํางาน) 

8. ปดสวิทซ/ถอดปลั๊ก 

10. ตูแชแข็ง - 80°C 

1. การปรับแตงอุณหภูมิการใชงาน 

- กดปุม Mode ใหไฟสีเขียวติดที่หนา setting 

- กดปุมลูกศรชี้ของ จนกระทั่งหนาจอแสดงคําวา SET PT = -XX 

- กดปุมชี้ขึ้น σ หรือลง 

τ 

หรือตั้งอุณหภูมิที่ตองการใชงาน 

- กดปุม Enter เมื่อไดคาอุณหภูมิตามที่ตองการแลว

102 


- กดปุม Mode จนกระทั่งไฟสีเขียวติดที่หนาคําวา “ RUN” หนาจอจะแสดง 

คําวา System OK 

2. การปรับแตงคา High Temperature Alarm และ Low TemperatureAlarm Limit เพื่อเปนการเตือนวาอุณหภูมิ 

ภายในตูสูง หรือต่ํากวาที่กําหนดไว โดยปกติจะตั้งที่ +/- 10°C จากอุณหภูมิใชงานโดย 

-กดปุม ใหไฟสีเขียวติดที่หนาคําวา Setting 

-กดปุมลูกศรชี้ขวา Mode จนคําวา HI ALM = -XX ขึ้นที่หนาจอ หรือขึ้น 

LO ALM = -XX 

ถาตองการตั้งคา Low Alarm 

-กดปุมชี้ขึ้น σ หรือลง τ เพื่อตั้งคาอุณหภูมิ High Alarm หรือ 

Low Alarm ที่ตองการ 

-กดปุม Enter เพื่อยอมรับคาอุณหภูมิที่ตั้ง 

-กดปุม Mode จนกระทั่งไฟสีเขียวติดที่หนาคําวา RUN หนาจอจะแสดง 

คําวา System OK 



2. เขียน ชื่อสารเคมี วันเดือนป ผูเตรียมสารเคมีชนิดนั้นหรือเจาของ ติดไว 

ขางขวดทุกขวด 


4. ไมควรใสของในตูแชมากเกินไป และควรใหมีชองวางเพื่อใหความเย็น 

กระจายไดทั่วถึง 





3. ถาตองการกวนสารใหเปดปุมควบคุมหมวด stirrer ปรับตามความแรงตามที่ตองการไฟแสดงการ 


4. ถาตองการความรอนใหเปดปุมควบคุมหมวด heater ปรับตามความรอนตามที่ตองการ ไฟแสดงการ 




103 

หองปฏิบัติการฮอรโมน 

ชื่อหองปฏิบัติการ : หองปฏิบัติการฮอรโมน (E401, D410) 

นักวิทยาศาสตรประจําหองปฏิบัติการ : นายพัลลพ ตันแกว 

แผนผังหองปฏิบัติการฮอรโมน 

E402 

E404 

E405 


E411 

E412 


E401 

E403 

E406 

E407 

E410 


1. การตรวจหา Creatinine 

1. วัตถุประสงค 

เพื่อตรวจหา Creatinine จาก Urine 

2. ขอบขาย 

- 

3. ความรับผิดชอบ 

นักวิทยาศาสตรประจําหองปฏิบัติการฮอรโมน มีหนาที่ จัดเก็บตัวอยางเพื่อทําการ ตรวจวิเคราะห ตอบ 

ผลการตรวจวิเคราะห จัดเตรียมสารเคมี อุปกรณและลางอุปกรณ ของงานหองปฏิบัติการฮอรโมน 

4. อุปกรณและเครื่องมือ 

1. Nung plate 

2. plate sealer 

3. เครื่อง ELISA reader 

4. Repeater Pipette 

5. Repeater tips 

6. Micro pipette 

7. Beaker 

8. Tips (200,1000 ul)

104 


9. pipette boy 

10. กระดาษทิชชู 

11. กระบอกฉีดสารเคมี 

12. ซองซิป 

13. คอมพิวเตอรและโปรแกรมประเมินผล 

5. วิธีการปฏิบัติงาน 

5.1 การตรวจ Creatinine จาก urine 

5.1.1 เตรียม creatinine standard โดย นํา stock creatinine มา dilute แบบ 2-fold dilution ใหได 

ความเขมขนที่ 100, 50, 25, 12.5 และ 6.25 ul/ml 

5.1.2 ใช Microplate Dynatech (flat bottom) 96 หลุม 

5.1.3 หยอด standard หลุมละ 50 ul ตาม plate map 

5.1.4 หยอด sample หลุมละ 50 ul ตาม plate map 

5.1.5 เมื่อหยอด standard และ sample หมดแลว เติมน้ํากลั่นหลุมละ 50 ul 

5.1.6 หยอด 0.75 NaOH หลุมละ 50 ul 

5.1.7 หยอด 0.4 M Picric acid หลุมละ 50 ul 

5.1.8 เคาะ plate เบา ๆ ตั้งทิ้งไวที่อุณหภูมิหองเปนเวลา 30 นาที 

5.1.9 นําไปอานผลดวยเครื่อง ELISA reader ที่ความยาวคลื่นแสง 490 nm 

5.2 วิธีการเตรียม neat สําหรับการทํา parallelism 

5.2.1 เลือกปสสาวะของชางที่ทราบวาอยูในชวงของการตั้งทองมา 5 ตัวอยาง 

5.2.2 เลือกปสสาวะของชางที่ทราบวาไมตั้งทองมา 5 ตัวอยาง 

5.2.3 และสุมเลือกปสสาวะจากชางหลาย ๆ ตัวมาอีก 10 ตัวอยาง ตัวอยางละ 50 ul 

5.2.4 นําตัวอยางมารวมกันใน tube และ vortex ใหเขากัน 

6. บันทึกและเอกสารประกอบ 

2. การตรวจ Luteinizing hormone 


1.1 เพื่อตรวจวัดระดับ Luteinizing hormone ในซีรั่มของชาง 

1.2 เพื่อนําคาฮอรโมนที่ไดไปคํานวณวันตกไขของชางเพศเมีย 


ตรวจวัดระดับ Luteinizing hormone ของชางในโครงการวิจัยการตรวจวงรอบการเปนสัดและการตรวจ 

ทองของชางเอเชียเพศเมียเพื่อจัดทําแผนพัฒนาระบบผสมพันธุ 


นายสัตวแพทยและนักวิทยาศาสตรประจําโครงการวิจัย 

4. อุปกรณและเครื่องมือ

105 


1. Microtitre plate 

2. Microtitre plate sealer 

3. Automatic micro-pipette 

4. Automatic micro-pipette tip 

5. Repeater pipette 

6. Repeater pipette tip 




10. Pipette 

11. Vortex 

12. เครื่องดูดสารละลาย (pipette boy) 



5.1 การพัฒนากราฟมาตรฐาน 

โดยการเคลือบแอนติบอดี้ทุติยภูมิ (second antibody,anti-mouse IgG) อัตราเจือจางที่เลือกไวแลว ปริมาณ 

250 ไมโครลิตร ลงในไมโครเพลท ชนิด 96 หลุม ทิ้งไวที่อุณหภูมิหองขามคืน วันที่ 2 ใหเทและสลัดสารละลายใน 

ไมโครเพลททิ้ง จากนั้นจึงเติมสารละลายที่จะไปอุดชองวาของเพลท ปริมาณ 300 ไมโครลิตรในแตละหลุม ทิ้งไวที่ 

อุณหภูมิหองขามคืน วันที่ 3 ใหลางดวยสารละลายสําหรับลางเพลท จํานวน 3 ครั้ง หลังจากนั้นเติมสารละลาย 

มาตรฐานที่มี Luteinizing hormone 0.156, 0.312, 0.625, 1.25, 2.5, 5 และ 10 นาโนกรัม/มล. หลุมละ 50 ไมโครลิตร 

หลังจากนั้นใสแอนติบอดี้ปฐมภูมิในอัตราเจือจางที่เลือกไวแลว หลุมละ 100 ไมโครลิตร ทิ้งไวที่อุณหภูมิหอง 

ขามคืน วันที่ 4 เติม Biotinylate label ภูมิในอัตราเจือจางที่เลือกไวหลุมละ 50 ไมโครลิตร ทิ้งไวที่อุณหภูมิหอง 4 

ชั่วโมง เทและสลัดสารละลายในไมโครเพลททิ้ง ลางดวยสารละลาย 

สําหรับลางเพลท จํานวน 4 ครั้ง หลังจากนั้นเปนการเติมสาร Strepatividin-peroxidase 200 ไมโครลิตร ทิ้ง 

ไวที่อุณหภูมิหอง 40 นาที เทและสลัดสารละลายในไมโครเพลททิ้ง ลางดวยสารละลายสําหรับลางเพลท จํานวน 4 

ครั้ง จากนั้นเปนการเติมสารละลาย TMB 200 ไมโครลิตร ทิ้งไวประมาณ 10-15 นาที จากนั้นจึงเติมสารละลายเพื่อ 

หยุดปฏิกิริยา 50 ไมโครลิตร อานคาการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 450 นาโนเมตร นําผลไปสรางกราฟมาตรฐาน 

5.2 ขั้นตอนการวิเคราะหระดับฮอรโมนโปรเจสเตอโรน 

โดยการเคลือบแอนติบอดีทุติยภูมิ (second antibody, anti-mouse IgG) อัตราเจือจางที่เลือกไวแลว ปริมาณ 

250 ไมโครลิตร ลงในไมโครเพลทชนิด 96 หลุม ทิ้งไวที่อุณหภูมิหองขามคืน วันที่ 2 ใหเทและสลัดสารละลายในไม 

โครเพลททิ้ง จากนั้นจึงเติมสารละลายที่จะไปอุดชองวาของเพลท ปริมาณ 300 ไมโครลิตรในแตละหลุม ทิ้งไวที่ 

อุณหภูมิหองขามคืน วันที่ 3 ใหลางดวยสารละลายสําหรับลางเพลท จํานวน 3 ครั้ง หลังจากนั้นเติมสารละลาย 

มาตรฐานที่มี Luteinizing hormone 0.156, 0.312, 0.625, 1.25, 2.5, 5 และ 10 นาโนกรัม/มล. สารละลายควบคุม 

(Control) และสารตัวอยาง (Sample) หลุมละ 50 ไมโครลิตร หลังจากนั้นใส แอนติบอดี้ปฐมภูมิในอัตราเจือจางที่ 

เลือกไวแลว หลุมละ 100 ไมโครลิตร ทิ้งไวที่อุณหภูมิหองขามคืน วันที่ 4 เติม Biotinylate label ภูมิในอัตราเจือจางที่ 

เลือกไวหลุมละ 50 ไมโครลิตร ทิ้งไวที่อุณหภูมิหอง 4 ชั่วโมง เทและสลัดสารละลายในไมโครเพลททิ้ง ลางดวย 

สารละลายสําหรับลางเพลท จํานวน 4 ครั้ง หลังจากนั้นเปนการเติมสาร Strepatividin-peroxidase 200 ไมโครลิตร

106 


ทิ้งไวที่อุณหภูมิหอง 40 นาที เทและสลัดสารละลายในไมโครเพลททิ้ง ลางดวยสารละลายสําหรับลางเพลท จํานวน 

4 ครั้ง จากนั้นเปนการเติมสารละลาย TMB 200 ไมโครลิตร ทิ้งไวประมาณ 10-15 นาที จากนั้นจึงเติมสารละลาย 

เพื่อหยุดปฏิกิริยา 50 ไมโครลิตร อานคาการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 450 นาโนเมตร นําผลที่ไดเปรียบเทียบกับ 

กราฟมาตรฐาน เพื่อหาระดับความเขมขนในระดับ นาโนกรัม/มล.ของตัวอยาง 

5.3 ขั้นตอนการแปลผล 

ระดับของ Luteinizing hormone ที่สูงขึ้นกวา Baseline ถือวาจะสูงขึ้นทันทีภายใน 1 วันและตกลงทันที 

(LH surge) โดยจะพบ 2 ครั้งในชวงที่ฟอลลิเคิลมีการทํางาน หรือ Follicular phase 

6. บันทึกและเอกสารประกอบ 

6.1 เอกสารอางอิง 

Brown JL, Walker S and Steinman K. Endocrine manual for reproductive assessment of domestic and nondomestic 

species. Conservation and Research Center, Smithsonian’s National Zoological Park. 

Endocrine workshop on reproductive assessment of domestic and non-domestic species. January 13-17, 

2003. Faculty of Veterinary Medicine, Chiang Mai University. 

3. การตรวจวัด Cortisal 

1.วัตถุประสงค 

เพื่อตรวจหาฮอรโมน cortisal จากมูลชาง 


นํามูลชางมาสกัดแลวตรวจหาฮอรโมน cortisal ในชางที่เราตองการทราบผล 


3.1 นายสัตวแพทย 

3.2 นักวิทยาศาสตร 










9. เครื่อง ELISA reader

107 


10. Pipette 

11. Vortex 




5.1 สกัดมูล ( Fecal extraction ) 

5.1.1 ชั่งมูลชาง 0.2 กรัม ผสมกับ 90% Ethanol ( ก ) 5 มล. 

5.1.2 เขยาใหเขากันโดย vortex 

5.1.3 ตมใน water bath 90 องศาเซลเซียสนาน 20 นาที โดยมีการเติม Ethanol เพื่อไมใหแหง 

5.1.4 ปนเหวี่ยง ( Centrifuge ) 1500 rpm นาน 20 นาที 

5.1.5 ดูด supernatant จาก หลอด 1 ไปหลอด 2 

5.1.6 เติม 90% Ethanol 5 มล. ในหลอดแรก 

5.1.7 Vortex นาน 30 วินาที 

5.1.8 ปนเหวี่ยง 1500 rpm นาน15 นาที 

5.1.9 ดูด supernatant จากหลอด 1 ไปหลอด 2 อีกครั้ง 

5.1.10 นําไปทําใหแหง โดยใชเครื่องมือ หรือตม 

5.1.11 เติม Methanol 1 มล. ลงไปแลวเขยา ( Vortex ) 15วินาที 

5.1.12 ดูดสารใสใน Eppendorf 1มล. เก็บไวที่ –20 องศาเซลเซียส 

5.2 

5.2.1 ทํา Parallism โดยใชชางที่ทอง , ไมทอง , เปนสัด ผสมกัน เรียกวา neat ตัวอยางละ 50 ul 

จํานวน 30 ตัวอยาง 

5.2.2 dilute neat โดยทํา Two fold 11 หลอด คือ 1:2,1:4,1:8,1:16,1:32,1:64,1:128, จนถึง 1:1024 

นําตัวอยางแตละความเจือจางไปวัดวิเคราะหหาระดับฮอรโมน cortisal 

นําผลที่ไดไปสรางกราฟเปรียบเทียบกับกราฟมาตรฐาน โดยจะใชคาที่มี% binding เทากับ 50% 

5.2.3 นํามูลที่เตรียมตรวจมาเจือจางตามคาที่เราทํา parellism 

5.2.4 เตรียม Plate coating โดยใช 50ul antibody stock ( 1:85 ) ผสมกับ 5ml coating buffer แลว 

หยอดใส plate ( NUNC Maxisorb plates ) หลุมละ 50 ul ไมหยอดหลุม A1,B1 ปดดวย acetate 

plate sealer แลวเก็บไวที่4องศาเซลเซียส 1คืน 

5.2.5 เตรียม Standards 1000,500,250,125,62.5,31.2,15.6,7.8,3.9pg cortisol/ well โดยวิธี Two fold 

จะใช200ul stock ผสมกับ 200 ul assay buffer 

5.2.6 ลาง plate 5 ครั้ง โดยใช Wash solution ( ข ) ตบบนผาใหแหง 

5.2.7 เตรียม HRP label โดยใช25ul stock ( 1: 100 ,4 องศาเซลเซียส ) ผสมกับ 5ml EIA buffer 

5.2.8 หยอด Standards, Samples, controls ( ค ) ,HRP หลุมละ50ul ภายใน10 นาที 

5.2.9 นําไปไวที่ 25 องศาเซลเซียส นาน1 ชั่วโมง 

5.2.10 ลาง plate 5 ครั้ง หยอด Substrate ( ง ) นําไปไวที่มืด นาน10-60 นาที 

5.2.11 นําไปอานที่ 405 nm ( Measuring Filter ) , 620 nm ( Reference Filter ) 

หมายเหตุ

108 


( ก ) หมายถึง Absolute Ethanol 950 ml ผสม น้ํากลั่น 50ml 

( ข ) “ NaCl 43.83 g ผสมกับ Tween 20 2.5 ml ผสมกับ น้ํากลั่น 500 มล.ล. 

( ค ) “ dilute controls to the appropriate dilution, if necessary 

( ง ) “ เตรียม 40ul 0.5 ไฮโดรเยนเปอรออกไซด , 125 ul 40 mM ABTS และ 

12.5 ml citrate buffer 

4. การตรวจวัดฮอรโมนโปรเจสเตอโรน ดวยวิธี direct, single antibody competitive EIA 


1. เพื่อตรวจวัดระดับฮอรโมนโปรเจสเตอโรน ในซีรั่มของชาง 

2. เพื่อนําคาฮอรโมนที่ไดไปคํานวณระยะเปนสัดของชางเพศเมีย 


ตรวจวัดระดับฮอรโมนโปรเจสเตอโรน ของชางในโครงการวิจัยการตรวจวงรอบการเปนสัดและการตรวจ 

ทองของชางเอเชียเพศเมียเพื่อจัดทําแผนพัฒนาระบบผสมพันธุ 

3. หนาที่ความรับผิดชอบ 

นายสัตวแพทยและนักวิทยาศาสตรประจําโครงการวิจัย 











10. Pipette 

11. Vortex 



5. วิธีปฏิบัติการ

109 


1) ขั้นตอนการหาปริมาณแอนติบอดีและปริมาณเอนไซมที่เหมาะสม 

โดยการเคลือบแอนติบอดีตอตานฮอรโมนโปรเจสเตอโรน อัตราเจือจางแตกตางกัน ปริมาณ 50 

ไมโครลิตร ลงในไมโครเพลทชนิด 96 หลุม ทิ้งไวที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสขามคืน เทและสลัดสารละลายในไม 

โครเพลททิ้ง ลางดวยสารละลายสําหรับลางเพลท จํานวน 5 ครั้ง หลังจากนั้น เติมสารตัวอยางที่มีปริมาณฮอรโมนโป 

รเจสเตอโรนต่ํา หรือนอยกวา 0.1 นาโนกรัม/มล. หลุมละ 50 ไมโครลิตร หลุมละ 50 ไมโครลิตร หลังจากนั้นใสสาร 

HRP-labeled progesterone ในอัตราเจือจางที่เลือกไวแลว หลุมละ 50 ไมโครลิตร ทิ้งไวในอุณหภูมิหอง นาน 2 

ชั่วโมง ลางดวยสารละลายสารละลายสําหรับลางเพลท จํานวน 5 ครั้ง หลังจากนั้นเปนการเติมสาร ABTs 100 

ไมโครลิตร ทิ้งไวประมาณ 30–60 นาที อานคาการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 405 นาโนเมตร นําผลไปสรางกราฟ 

คัดเลือกอัตราการเจือจางแอนติบอดีและเอนไซมที่ใหคาการดูดกลืนแสงที่ประมาณ 1.0 

2) การพัฒนากราฟมาตรฐาน 

โดยการเคลือบแอนติบอดีตอตานฮอรโมนโปรเจสเตอโรน อัตราเจือจางที่เลือกไวแลว ปริมาณ 50 


โครเพลททิ้ง ลางดวยสารละลายสําหรับลางเพลท จํานวน 5 ครั้ง หลังจากนั้น เติมสารละลายมาตรฐานที่มีฮอรโมน 

โปรเจสเตอโรน 0.78, 1.56, 3.12, 6.25, 12.5, 25,50,100 และ 200 พิโคกรัม/มล. หลุมละ 50 ไมโครลิตร หลังจากนั้น 

ใสสาร HRP-labeled progesterone ในอัตราเจือจางที่เลือกไวแลว หลุมละ 50 ไมโครลิตร ทิ้งไวในอุณหภูมิหอง นาน 

2 ชั่วโมง ลางดวยสารละลายสารละลายสําหรับลางเพลท จํานวน 5 ครั้ง หลังจากนั้นเปนการเติมสาร ABTs 100 

ไมโครลิตร ทิ้งไวประมาณ 30–60 นาที อานคาการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 405 นาโนเมตร นําผลไปสรางกราฟ 

มาตรฐาน 

3) ขั้นตอนการทดสอบวิธีวิเคราะห (assay validation) 

Parallelism 

เปนการตรวจหาความสอดคลองของคาที่วัดไดกับคาปกติตามชวงของวงจรการเปนสัดและการตั้งทอง 

ตลอดจนตรวจสอบอัตราความเขมขนที่ควรใชในการตรวจวัดจากตัวอยาง นําตัวอยาง ปริมาตร 100 ไมโครลิตร มา 

รวมกัน หลังจากนั้นนําไปเจือจาง เปน 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512, 1:1024, 1:2048, 1:4096, 

1:8192 โดยการใสสารละลายบัฟเฟอร 200 ไมโครลิตรลงไปกอนในแตละหลอด หลังจากนั้นนําตัวอยางที่รวมกัน 

แลว 200 ไมโครลิตร ใสลงไปในหลอดที่ 1:2 ปนใหเขากันดี แลวดูดสารละลายที่ได 200 ไมโครลิตร ไปใสในหลอด 

1:4 ทําเหมือนเดิมจนครบทุกหลอด นําตัวอยางแตละความเจือจางไปวัดวิเคราะหหาระดับฮอรโมนโปรเจสเตอโรน 

แลวนําคาที่ไดไปสรางกราฟเปรียบเทียบกับกราฟมาตรฐาน คาเจือจางที่ใชในการวัดวิเคราะหตัวอยางสกัด คือ คาที่มี 

เปอรเซ็นต binding เทากับ 50 เปอรเซ็นต 

Recovery or Accuracy check 

เปนการตรวจสอบผลที่อาจจะผิดพลาดเนื่องจากปจจัยอื่น พรอมทั้งตรวจดูชวงของระดับสารที่ตองการวัด 

โดยการนําตัวอยางปริมาตร 100 ไมโครลิตร (เปนตัวอยางที่อยูในชวงที่มีระดับฮอรโมนโปรเจสเตอโรนต่ํา เชน 

ในชวงที่เปนสัด) มารวมกันเปนตัวอยางรวม หลังจากนั้น นําฮอรโมนโปรเจสเตอโรนมาตรฐานแตละคา 100 

ไมโครลิตร มาใสลงไปตัวอยางรวม ปริมาตร 100 ไมโครลิตร นําไปวิเคราะหหาระดับฮอรโมนโปรเจสเตอโรน แลว 

นําไปคํานวณหาคาเปอรเซ็นตความถูกตองจากสูตร 

เปอรเซ็นตความถูกตอง = (ปริมาณฮอรโมนที่วัดได/ปริมาณฮอรโมนที่ควรจะเปน) x 100 

ปริมาณฮอรโมนที่วัดได = ปริมาณที่วัดไดจากการวิเคราะห – คาเฉลี่ยของคาที่แตกตางจาก

110 


ปริมาณฮอรโมนที่ควรจะเปน 

ปริมาณฮอรโมนที่ควรจะเปน = ปริมาณของฮอรโมนมาตรฐาน/2 

4) ขั้นตอนการวิเคราะหระดับฮอรโมนโปรเจสเตอโรน 

โดยการเคลือบแอนติบอดีตอตานฮอรโมนโปรเจสเตอโรน อัตราเจือจางที่เลือกไวแลว ปริมาณ 50 


โครเพลททิ้ง ลางดวยสารละลายสําหรับลางเพลท จํานวน 5 ครั้ง หลังจากนั้น เติมสารละลายมาตรฐานที่มีฮอรโมน 

โปรเจสเตอโรน 0.78, 1.56, 3.12, 6.25, 12.5, 25, 50,100 และ 200 พิโคกรัม/มล. สารละลายควบคุม (Control) และ 

สารตัวอยาง (Sample) หลุมละ 50 ไมโครลิตร หลังจากนั้นใสสาร HRP-labeled progesterone ในอัตราเจือจางที่เลือก 

ไวแลว หลุมละ 50 ไมโครลิตร ทิ้งไวในอุณหภูมิหอง นาน 2 ชั่วโมง ลางดวยสารละลายสารละลายสําหรับลางเพลท 

จํานวน 5 ครั้ง หลังจากนั้นเปนการเติมสาร ABTs 100 ไมโครลิตร ทิ้งไวประมาณ 30–60 นาที อานคาการดูดกลืน 

แสงที่ความยาวคลื่น 405 นาโนเมตร นําผลที่ไดเปรียบเทียบกับกราฟมาตรฐาน เพื่อหาระดับความเขมขนในระดับ 

นาโนกรัม/มล.ของตัวอยาง 

ในกรณีการตรวจระดับของฮอรโมนในปสสาวะใหทําเปรียบเทียบกับคา Creatinine ในปสสาวะ โดยการ 

ทําสารละลาย Creatinine มาตรฐานที่ 6.25, 12.5, 25, 50 และ 100 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร จากนั้นเจือจางตัวอยาง 

แลวใสสารมาตรฐานและตัวอยางลงไปในหลุม หลุมละ 50 ไมโครลิตร เติมน้ํา 0.75 N NaOH 0.4 N picric acid อยาง 

ละ 50 ไมโครลิตรตามลําดับ ทิ้งไวในอุณหภูมิหอง นาน 30 นาที อานคาการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 490 นาโน 

เมตร 

5) ขั้นตอนการแปลผล 

ระดับของฮอรโมนโปรเจสเตอโรนของชางในกระแสเลือดที่สูงกวา 0.1 นาโนกรัม/มล.ของตัวอยาง ถือวา 

คอรปสลูเทียมมีการทํางาน (active corpus luteum) โดยอยูในชวง Luteal phase หรือตั้งทอง โดยที่ถาระดับฮอรโมน 

โปรเจสเตอโรนสูงกวา 0.1 นาโนกรัม/มล. เปนเวลานานมากกวา 20 สัปดาห และไมมีการตกลงถือวาอยูในชวงการ 

ตั้งทอง สวนถาระดับของฮอรโมนโปรเจสเตอโรนของชางในกระแสเลือดที่ต่ํากวา 0.1 นาโนกรัม/มล.ของตัวอยาง 

ถือวาอยูในชวงที่ฟอลลิเคิลมีการทํางาน โดยจะอยูในชวง Follicular phase 

ในกรณีการตรวจระดับของฮอรโมนในปสสาวะใหทําเปรียบเทียบกับคา Creatinine ในปสสาวะ โดยมี 

หนวยเปน ตอ มิลลิกรัม Creatinine 

6. เอกสารอางอิง 

Brown JL, Walker S and Steinman K. Endocrine manual for reproductive assessment of domestic and nondomestic 

species. Conservation and Research Center, Smithsonian’s National Zoological Park. Endocrine 

workshop on reproductive assessment of domestic and non-domestic species. January 13-17, 2003. Faculty of 

Veterinary Medicine, Chiang Mai University.

111 

หองปฏิบัติการสัตวน้ํา 

ชื่อหองปฏิบัติการ : หองปฏิบัติการสัตวน้ํา (F109, F110, F111) 

นักวิทยาศาสตรประจําหองปฏิบัติการ : นายธีระพงศ โปธา 

แผนผังหองปฏิบัติการสัตวน้ํา 


ทางเดิน F109 F110 



F111 

F109 หองปฏิบัติการสัตวน้ํา 

F110 หองเก็บของ 

F111 หองตรวจวิเคราะหคุณภาพน้ํา 


1. การขอใชหองปฏิบัติการสัตวน้ําใหเปนไปตามระเบียบการขอใชหองปฏิบัติการสัตวน้ํา 

2. แตงกายใหสุภาพเรียบรอยทุกครั้งที่เขาปฏิบัติงานในหองปฏิบัติการ 

3. นักศึกษาตองทําความเขาใจกับวิธีการทดลองกอนเขาหองปฏิบัติการทุกครั้ง 

4. เขาหองปฏิบัติการใหตรงตอเวลา 

5. การเขา – ออก นักศึกษาใหใชประตูหอง F109 

6. การเปด – ปดหองจะเปดเปนเวลา ไมอนุญาตใหปฏิบัติงานนอกเหนือเวลาที่กําหนด 

7. หามนําหรือเคลื่อนยายอุปกรณ ยา สารเคมี และวัสดุอื่นๆ ภายในหองปฏิบัติการไปโดยไมไดรับอนุญาต 

8. การเบิกอุปกรณ นักศึกษาตัวแทนแตละกลุมเบิกรับและตรวจสอบอุปกรณกอนปฏิบัติการทุกครั้งหากมีความ 

เสียหายใหแจงเจาหนาที่ประจําหอง 

9. หามนําอาหารและเครื่องดื่มเขามารับประทานในหองปฏิบัติการ โดยเด็ดขาด 

10. ชวยกันรักษาความสะอาด ดูแลเครื่องมือ อุปกรณ และไมสงเสียงดังในหองปฏิบัติการ 

11. หากพบอุปกรณหรือครุภัณฑใดๆ ชํารุดใหแจงเจาหนาที่ประจําหองปฏิบัติการทันที 

12. อุปกรณในการเลี้ยงปลา หาม ใชรวมกัน 

13. ในขณะปฏิบัติงานใหนักศึกษาตระหนักถึงความสําคัญของการทําการทดลองอยางจริงจัง 

14. การใชอุปกรณและเครื่องมือในหองปฏิบัติการตองแจงใหเจาหนาที่ทราบทุกครั้ง

112 


15. ทุกครั้งที่ปฏิบัติงานเสร็จสิ้นลงแลว นักศึกษาแตละกลุมจะตองรับผิดชอบความเปนระเบียบของโตะและ 

บริเวณที่ตนใชหองปฏิบัติการ 

16. หลังจากเสร็จสิ้นจากการปฏิบัติงานแลว ตองคืนอุปกรณที่เบิกไปทุกชิ้นในสภาพที่สะอาด เรียบรอย 

17. หากปลาปวยหรือตาย ใหรีบแจงเจาหนาที่หรืออาจารยผูควบคุม 

18. ซากสัตวที่ตายและอวัยวะใหเก็บใสถุงพลาสติกแชตูเย็นไว เพื่อรอการทําลายซาก หาม ทิ้งลงในถัง 

ขยะหรืออางน้ําโดยเด็ดขาด 

19. การปฏิบัติอื่นๆ ขึ้นอยูกับการควบคุมและสั่งการของอาจารยผูควบคุมการปฏิบัติการ 

20. ปฏิบัติตามขอปฏิบัติการใชหองปฏิบัติการสัตวน้ําอยางเครงครัด 

21. ทรัพยสินมีคาสวนตัวใหเก็บรักษาไวกับตัวนักศึกษา หรือเก็บไวในตูล็อกเกอรที่หองปฏิบัติการจัดให ขอ 

เบิกกุญแจไดที่เจาหนาที่ประจําหองปฏิบัติการ หากเกิดการเสียหายหรือสูญหายใดๆ ทางหองปฏิบัติการไม 

รับผิดชอบกรณีใดทั้งสิ้น 


1. การทําความสะอาดอุปกรณ 

การทําความสะอาด – ฆาเชื้อ ตูปลาและอุปกรณเลี้ยงปลา 

กรณีที่ใชแบบฉีดพน 

1. ทําความสะอาดตูปลาหรือภาชนะพลาสติกดวยน้ําเปลา ดูดเอาตะกอนออก แลวเช็ดดวยผาขนหนูใหแหง 

2. ฉีด 40% Formaldehyde ใหทั่วตูปลาเพื่อฆาเชื้อ ทิ้งไวนาน 24 ชั่วโมง 

3. ฉีดน้ําลางใหทั่วแลวปลอยน้ําทิ้ง 

4. เปดน้ําใหเต็มตูปลา ทิ้งไวนาน 24 ชั่วโมง แลวปลอยน้ําทิ้ง 

5. เปดน้ําพักสําหรับการใชงานครั้งตอไป 

กรณีที่ใชแบบผสมลงในตูปลา 

1. ทําความสะอาดตูปลาหรือภาชนะพลาสติกดวยน้ําเปลา ดูดเอาตะกอนออก แลวเช็ดดวยผาขนหนูใหแหง 

2. เปดน้ําใหเต็มตู ผสม 40% Formaldehyde ลงไปในตูปลาความเขมขนที่ใช คือ 100 ppm เพื่อฆาเชื้อ ทิ้งไว 

นาน 24 ชั่วโมง 

3. ปลอยน้ําทิ้ง ฉีดน้ําลางใหทั่ว 

4. เปดน้ําใหเต็มตูปลา ทิ้งไวนาน 24 ชั่วโมง แลวปลอยน้ําทิ้ง 

5. เปดน้ําพักสําหรับการใชงานครั้งตอไป 

• สายยางอากาศ และหัวทรายตองเปลี่ยนทุกครั้งที่ทําความสะอาด 

• ผูที่ฉีด Formaldehyde ตองใสถุงมือและหนากากปดจมูกทุกครั้ง 

การทําความสะอาดอุปกรณเลี้ยงปลา (กระชอนตักปลา,สายยาง, หัวทราย) 

1. ลางดวยน้ําเปลา และขัดทําความสะอาด 

2. แชอุปกรณดวยน้ํายาฆาเชื้อที่เขมขน ทิ้งไว 24 ชั่วโมง 

3. ลางดวยน้ําเปลาใหสะอาดตากใหแหงแลวนําเก็บเขาที่ใหเรียบรอย

113 


การลาง ทําความสะอาดอุปกรณ และการกําจัดขยะ 

1. นักศึกษาตองรับผิดชอบอุปกรณในสวนที่ตนเองไดปฏิบัติงาน 

2. ภาชนะพลาสติก และเครื่องแกว ลางทําความสะอาด และตากที่ชั้นตากอุปกรณ 

3. โตะปฏิบัติการ หลังจากเสร็จสิ้นการปฏิบัติงาน ลางและเช็ดใหเรียบรอย 

4. อุปกรณผาตัดและอุปกรณสแตนเลส ลางแลวเช็ดใหแหง แลวตากที่ชั้นตากอุปกรณ 

5. อุปกรณเลี้ยงปลาใหแชน้ํายาฆาเชื้อ 24 ชั่วโมงแลวจึงลางทําความสะอาด 

6. สไลดและแผนปดสไลด ลางใหสะอาดและตากที่ชั้นตากอุปกรณ 

7. อุปกรณที่ประจําหอง F109 หรือ F111 หลังจากใชงานเสร็จแลวลาง ทําความสะอาด และจัดเก็บใหตรงกับ 

ตําแหนงเดิม (หยิบจากหองไหนเก็บไวที่หองนั้น) 

8. การกําจัดขยะ ใหแยกขยะตามชนิด ขยะ คือ ขยะทั่วไป ขยะติดเชื้อ และ ซากสัตว 

- ขยะทั่วไป ทิ้งลงในถังขยะทั่วไป 

- ขยะติดเชื้อ ทิ้งลงในถังขยะติดเชื้อ สวนเข็ม และใบมีด ทิ้งลงในภาชนะที่จัดให 

- ซากสัตว เก็บไวในชองแชแข็ง “ตูแชซาก” หามทิ้งลงในถังขยะหรืออางน้ํา 

โดยเด็ดขาด 

2. เทคนิคการใชปเปต 

1. การใชปเปตดูดสารละลายนั้น ตองใชลูกยางชวยในการดูด ดังรูป 1-3 ไมควรใชปากดูด 

2. เสียบลูกยางที่ปลายเปดของปเปตดานบน แลวไลอากาศออก ดังรูป 1

114 


3. จุมปลายปเปตลงในสารละลายโดยใหปลายปเปตอยูต่ํากวาผิวของสารละลายเสมอ 

4. คอยๆ ผอนแรงบีบลูกยางเพื่อใหสารละลายเขาไปในปเปต ดังรูป 2 

5. เมื่อระดับสารละลายในปเปตสูงเลยขีดบอกปริมาตรแลวใหเอาลูกยางออกจากปลายปเปต พรอมกับใชนิ้วชี้ปด 

ปลายปเปตดานบนทันที ดังรูป 3 นิ้วและปลายปเปตตองแหงมิเชนนั้นจะทําใหการขยับนิ้วลําบาก 

6. ในการปรับระดับของสารละลายใหขยับนิ้วชี้เล็กนอย ดังรูป 4 เพื่อใหสารละลายไหลลงอยางชาๆ จนถึงขีดบอก 

ระดับปริมาตรของปเปต ใหสวนเวาลางอยูตรงขีดเครื่องหมายบอกปริมาตรพอดี และในการดูขีดของปริมาตร 

ควร ใหอยูตรงระดับสายตา 

7. ปลอยสารละลายลงในภาชนะที่ตองการ ควรใหสารละลายไหลออกจนหมด ไมควรใชปากหรือลูกยางเปา 

สวนบนของปเปต เพราะจะทําใหปริมาตรที่แทจริงคลาดเคลื่อนได 

8. เมื่อสารละลายไหลออกจนหมดแลว จึงแตะปลายปเปตกับกนหรือดานขางภาชนะ ตรงสวนที่ไมมีสารละลาย 

ดังรูป 5 ก็จะไดปริมาตรของสารละลายที่ถูกตองตามตองการ 

3. เทคนิคการไทเทรต 

1. จัดตั้งเครื่องมือดังรูปที่ 1 ในขณะที่ไทเทรต ควรจะนั่งทํา โดยปรับระยะใหนั่งไทเทรตไดถนัดไมใกลหรือ 

ไกลตัวเกินไป 

2. ในการไทเทรตทุกครั้งควรจะหากระดาษสีขาวมารองไวที่กนขวดรูปกรวย จะทําใหเห็นการเปลี่ยนแปลงสี 

ของจุดยุติไดชัดเจน 

3. สําหรับการจับบิวเรต และขวดรูปกรวยในขณะไทเทรตนั้นให จับบิวเรตดวยมือซาย โดยใชนิ้วหัวแมมือและ 

นิ้วชี้บังคับกอกบิวเรตหรือที่ปด-เปดบิวเรตใหสารละลายไหลเร็วหรือชาตามตองการ ขณะเดียวกันให จับ 

ขวดรูปกรวยดวยมือขวา และเขยาสารละลายในขวดรูปกรวยในลักษณะที่หมุนเปนวงกลมทุกครั้งที่หยด 

สารละลายจากบิเรต ดังรูปที่ 2 

4. ถามีสารละลายติดอยูที่ปากหรือขางๆ ขวดรูปกรวย ใหใชน้ํากลั่นชะลางสารละลายนั้นลงไปทําปฏิกิริยากัน 

ใหหมด ดังรูปที่3

115 


5. การไทเทรต ทั่วไปจะตองทําอยางนอย 2 ครั้ง ถาปริมาตรของทั้ง 2 ครั้ง ใกลเคียงกันมากก็นําไปเฉลี่ยแลวนํา 

ปริมาตรเฉลี่ยไปคํานวณ แตถาผลทั้ง 2 ครั้ง ตางกันมาก (มากกวา 0.2 cm 3 )ใหไทเทรตครั้งที่ 3 แลวนํา 

ปริมาตร 2 ครั้ง ที่ใกลเคียงกันมาเฉลี่ยแลวนําปริมาตรเฉลี่ยไปคํานวณ 

6. เมื่อหยุดพักการทดลองควรจะมีภาชนะมารองไวที่ปลายบิวเรตเพื่อปองกันการหยดของสารละลาย 

7. เมื่อไทเทรตเสร็จเรียบรอยแลว สารละลายที่เหลืออยูในบิวเรตใหไขทิ้งไป ไมควรเทกลับคืนในขวด 

8. ไมควรทิ้งสารละลายคางไวในบิวเรตหลายๆ วันโดยเฉพาะถาเปนสารละลายโซเดียมไฮดรอกไซด (NaOH) 

จะทําใหจุกติดแนน 

9. ทุกครั้งที่เสร็จสิ้นการทดลองควรลางและทําความสะอาดบิวเรตใหเรียบรอย โดยเฉพาะจุกแกว 

4. เทคนิคการใชบิวเรต 

1. กอนนําบิวเรตมาใชตองทําความสะอาดกอนโดยลางดวยน้ํายาลางแกวแลวลางดวยน้ําสะอาดจากนั้นตามดวยน้ํา 

กลั่น สําหรับจุกปด-เปด ก็ตองทําความสะอาดและทาดวยกรีส เพื่อใหหมุนไดคลอง 

2. กอนนําไปใชงานตองทดสอบกอนวาบิวเรตไมรั่ว โดยใชน้ํากลั่นใสลงไปในบิวเรตและปลอยสารออก 

3. บิวเรตควรจะลางดวยสารละลายที่จะบรรจุในบิวเรตกอนทุกครั้ง โดยใสสารละลายลงไปประมาณ 5-6 cm 3 แลว 

เอียงบิวเรตพรอมกับหมุนไปมา เพื่อทําใหสารละลายเปยกผิวแกวจนทั่วแลวไขทิ้ง 

4. เทสารละลายลงในบิวเรตใหเกินขีดศูนยเล็กนอย แลวไขจุกใหสารละลายไหลออกอยางรวดเร็วเพื่อใหไลอากาศ 

ที่อยูปลายบิวเรตออกใหหมด 

5. เมื่อไมมีฟองอากาศแลวปดจุกทิ้งไวสักครู เพื่อใหสารละลายที่ติดอยูขางแกวไหลลงใหหมดแลวจึงปรับระดับ 

สารละลายในบิวเรตใหไดตามตองการ บันทึกปริมาตรสารละลายเริ่มตนไว 

6. เมื่อทําการทดลองเสร็จใหอานระดับปริมาตรของสารละลายอีกครั้งแลวบันทึกไว ปริมาตรของสารละลายที่ใช 

ในการทดลองคือ ผลตางของระดับปริมาตรเริ่มตนกับปริมาตรสุดทาย 

7. การตั้งบิวเรตเพื่อการไทเทรตควรตั้งใหตรงและการอานปริมาตรควรอยูในระดับสายตา 

5. เทคนิคการยอมสีโดยวิธี WRIGHT STAIN 

อางอิงวิธีการยอมจากเอกสารที่แนบมาพรอมกับสียอม 


Fixative Solution (Absolute Methyl Alcohol) 

Wright Stain A 

Wright Stain B 

วิธีการยอม 

1. ทํา Smear และทําใหแหงโดยการผึ่งลม 

2. จุม Slide ลงใน Fixative Solution ที่ใสใน Coplin jar 5 ครั้งๆ ละ 1 วินาที 

3. จุม Slide ลงใน Wright Stain A ที่ใสใน Coplin jar 5 ครั้งๆ ละ 1 วินาที 

4. จุม Slide ลงใน Wright Stain B ที่ใสใน Coplin jar 5 ครั้งๆ ละ 1 วินาที

116 


5. ลาง Slide ดวยน้ํากลั่น แลวทิ้งไวใหแหง หรือซับใหแหงดวยกระดาษซับ 

6. นําไปสองดูดวยกลองจุลทรรศน 

ผลการยอมสี 

ERYTHOCYTES 

ติดสีชมพู หรือแดงเหลือง 

PLATELETS 

ติดสีมวง หรือมวงแดง 

POLYMORPHONUCLEAR NEUTROPHILS 

Nucleus ติดสีน้ําเงินเขม 

Cytoplasm ติดสีชมพูออน 

Glanules 

ติดสีแดงออน 

EOSINOPHILS 

Nucleus ติดสีน้ําเงิน 

Cytoplasm ติดสีน้ําเงิน 

Glanules 

ติดสีแดง หรือแดงสม 

BASOPHILS 

Nucleus ติดสีมวงแดง หรือ น้ําเงินเขม 

Glanules 

ติดสีมวงเขม 

MONOCYTES 

Nucleus 

ติดสีมวง 

Cytoplasm ติดสีฟาเขม 

BACTERIA ติดสีน้ําเงิน 

6. เทคนิคการยอมสีโดยวิธี GIEMSA STAIN 

อางอิงวิธีการยอมจากเอกสารที่แนบมาพรอมกับสียอม 


Wright Giemsa 

Phosphate Buffer 


1. ทํา smear และทําใหแหงโดยการผึ่งลม 

2. หยดสีลงบนสไลด ใหทั่วรอย smear ทิ้งไว 3 นาที 

3. คอยๆ หยด Buffer ในปริมาณเดียวกับสี ผสมใหเขากันเบาๆ ทิ้งไว 5 นาที 

4. ลางออกดวยน้ํากลั่น แลวทิ้งใหแหง หรือซับใหแหงดวยกระดาษซับ 

5. นําไปสองดูดวยกลองจุลทรรศน

117 


7. เทคนิคการยอมสีโดยวิธี GRAM’S STAIN 


Crystal violet 

Iodine solution 

Decolourizer 

Safranin 


1. เขี่ยเชื้อลงบนแผนสไลด smear ทิ้งใหแหงในอากาศ (Air dry) แลวผานเปลวไฟออนๆ (Heat Fix) 

เพื่อตรึงเชื้อ 

2. ยอมดวยสี Crystal violet ใหทวมรอย smear นาน 1-2 นาที หลังจากนั้นเทสีทิ้ง 

3. หยด Iodine solution ใหทวมรอย smear ทิ้งไวนาน 1 นาที 

4. เท Iodine solution ทิ้งแลวลางดวยกระแสน้ําเบาๆ แลวใช Decolourizer หยดใหไหลผานสไลด จน 

น้ํายาที่หยดไมมีสีติดออกมา ใชเวลาประมาณ 3-10 วินาที 

5. ลางออกดวยน้ําอยางรวดเร็ว สลัดน้ําออกจากสไลดจนหมด 

6. ยอมดวยสี Safranin โดยหยดสีใหทวมรอย smear ทิ้งไวนาน 30-60 วินาที 

7. ลางออกดวยกระแสน้ําเบาๆ แลวซับน้ําออกดวยกระดาษทิชชู แลวปลอยใหสไลดแหงสนิท 

8. นําไปตรวจดูดวยกลองจุลทรรศน 

ผลการยอมสี 

ติดสีมวง : Gram positive bacteria 

ติดสีแดง : Gram negative bacteria 


1. การใชงานกลองจุลทรรศน (ALPHAPHOT-2 YS2) 

1. ทําการศึกษาสวนประกอบตางๆ ของกลองจุลทรรศนเพื่อจะไดใชสวนประกอบตางๆ ใหเกิดประโยชนรวมกัน 

และใชงานไดอยางถูกตอง 

2. ปรับเลนสใกลวัตถุ (Objective lens) ไปที่กําลังขยายต่ําสุด (4X) แลวเลื่อนแทนวางสไลดลงจนสุด 

3. เช็ดสไลดที่ตองการดูใหแหงเพราะอาจเกิดความเสียหายแกตัวกลองได จากนั้นวางสไลดลงบนแทนวางสไลด 

เลื่อนแทนวางสไลดขึ้นจนสุด มองในกลองโดยพยายามลืมตาทั้ง 2 ขาง ปรับเลนสใกลตาใหเหมาะสมกับชวงตา 

ของผูใช คอยๆ ปรับเลื่อนปุมปรับหยาบ ( Course Focus Knob) แทนวางสไลดจะเลื่อนลง จนมองเห็นภาพใน 

กลองจุลทรรศนไดชัดเจน อาจปรับปุมปรับละเอียด (Fine Focus Knob) เพื่อใหภาพชัดเจนขึ้น

118 


4. การเพิ่มกําลังขยาย ใหเปลี่ยนจากกําลังขยายต่ําไปยังกําลังขยายสูงขึ้นตามลําดับ คือ (4X) ไปเปน (10X), (40X) 

และ (100X) ตามลําดับ โดยจะปรับภาพใหชัดเจนขึ้นดวยปุมปรับละเอียดเทานั้น จะไมมีการใชปุมปรับหยาบ 

อีกเปนอันขาด เพราะปองกันไมใหเลนสกระทบกับสไลดจนอาจเกิดความเสียหายได 

หาม เปลี่ยนกําลังขยายจาก (4X) ไปเปน (100X) เลย โดยเด็ดขาด เพราะเลนสอาจชนสไลด แลวเกิดความ 

เสียหายได 

5. เมื่อใชกําลังขยาย (100X) ตองใช Immersion oil เพื่อชวยในการหักเหของแสง โดยหยด Immersion oil ลงบน 

สไลดที่ตองการดู แลวหมุน Objective lens กําลังขยายสูงสุด (100X) ใหเขาที่ มองดูภาพ ปรับภาพใหชัดเจนขึ้น 

ดวยปุมปรับละเอียด 

6. ตองปด Cover slide ทุกครั้ง เมื่อสองตรวจตัวอยางที่เปนของเหลว 

7. หาม ใชกําลังขยาย (100X) สงดูตัวอยางที่ปด Cover slide เพราะเลนสจะชนกับ Cover slide 

8. เมื่อใชกลองจุลทรรศนเสร็จ ใหปรับกําลังขยายไปที่กําลังขยายต่ําสุด (4X) แลวเลื่อนแทนวางสไลดลงจนสุด เอา 

สไลดออก เลื่อนเลนสใกลตาใหมาชิดกัน เช็ดตัวกลองใหสะอาดเมื่อเห็นวาสกปรก 

กรณีที่ใชกําลังขยายสูงสุด ตองทําความสะอาดเลนส โดยใชกระดาษเช็ดเลนสชุบ Xylene เช็ด oil ออกให 

สะอาดกอนแลวใชกระดาษเช็ดเลนสที่สะอาดเช็ดตามใหแหง 

9. พันสายไฟและคลุมกลองดวยผาคลุมกลองจุลทรรศน 

10. ลงบันทึกการใชกลองจุลทรรศนทุกครั้งเมื่อมีการใชกลองจุลทรรศน 

11. หากเกิดปญหาหรือสงสัยเกี่ยวกับการใชงานกรุณาเรียกเจาหนาที่หองปฏิบัติการ อยาพยายามแกไขดวยตัวเอง 

2. การใชงานเครื่องวัดความเปนกรด – ดาง (pH meter : Cyber Scan pH 500) 

1. การเปดเครื่อง 

กดปุม ON/OFF เครื่องจะปรับเปน MODE การวัด pH โดยอัตโนมัติ ที่หนาจอบรรทัดบนสุดจะแสดง 

ขอความ “MEAS” ควรอุนเครื่องกอนการใชงานประมาณ 15 นาที 

2. การ Calibration 

เมื่อเปดเครื่องทํางานใหม จะตองทําการคาลิเบรทคา pH กับ standard buffer กอนใชวัดคา pH ของตัวอยางทุก 

ครั้ง โดยทําการคาลิเบรทคา standard pH 3 จุด (4.01, 7.00 และ 10.01) โดยทําตามขั้นตอนดังนี้ 

1. ลาง electrode ดวยน้ํากลั่น แลวใชทิชชูซับน้ําบริเวณพลาสติกที่ครอบดานนอกเทานั้น หามเช็ดที่ 

electrode โดยตรง 

2. จุม electrode ลงใน standard buffer solution pH 7.00 

3. กดปุม CAL/MEAS ใหหนาจอแสดงขอความ “CAL” ที ่บรรทัดบนสุด (เปลี่ยน Mode เปนการคาลิ 

เบรท) และคา standard pH 7.00 จะเปนคาแรกที่แสดงบนหนาจอ 

4. รอจนกระทั่งคา pH ที่วัดไดคงที่ (ปรากฏขอความ “READY” แสดงบนมุมซาย) 

5. กดปุม CON เพื่อยืนยันการคาลิเบรท หนาจอจะแสดงขอความ “CON” 1 วินาทีจากนั้นหนาจอจะ 

แสดงคา standard pH คาตอไปโดยอัตโนมัติ

119 


6. ถาคา standard pH ที่แสดงอยูไมใชคาที่ตองการใหกดปุม หรือ เพื่อเลือกคา standard pH ที่ 

จะคาริเบรท คาถัดไป 

7. จากนั้นทําซ้ําขอ 2, 4และ5 โดยใช standard buffer solution 4.01 และ 10.00 ตามลําดับ 

ตองลาง electrode ดวยน้ํากลั่นทุกครั้งที่เปลี่ยนสารละลาย 

3. การวัดคา pH ของตัวอยาง 

1. ลาง electrode ดวยน้ํากลั่นจาก โดยฉีดลางบริเวณที่จะตองสัมผัสกับสารละลายตัวอยางใหสะอาดมาก 

ที่สุด แลวใชกระดาษทิชชูซับใหแหง หามเช็ดตัว electrode โดยตรง 

2. กดปุม CAL/MEAS ใหเครื่องเปลี่ยน MODE การทํางานเปนการวัด pH ที่หนาจอจะ แสดงขอความ 

“MEAS” ที่บรรทัดบนสุด 

3. จุม electrode ลงในสารละลายตัวอยาง ใหสารละลายทวมตัว electrode กวนสารละลายเบาๆ เพื่อให 

ความเขมขนของสารละลายตัวอยางเปนเนื้อเดียวกัน 

4. รอจนกระทั่งเครื่องอานคา pH ไดคงที่ แลวปรากฏขอความ “READY” แสดงบนมุมซายของหนาจอ 

5. เมื่อเสร็จสิ้นการวัดคา pH ของตัวอยางแตละครั้ง ควรลาง electrode ดวยน้ํากลั่น แลวแช electrode 

ลงในสารละลายที่เตรียมไวให หาม ปลอยใหสัมผัสอากาศจนแหงโดยเด็ดขาด 

3. การใชงานเครื่องวัดการดูดกลืนแสง (Spectrophotometer : Spectro 23) 

*** กอนใชงาน ใหปรับสวิตซเลือกกระแสไฟ (อยูดานหลังของเครื่อง) ใหตรงกับกระแสไฟที่เขาเครื่อง 

เปน 220V หรือ 110V เพื่อปองกันความเสียหายกับตัวเครื่อง ซึ่งทางหองปฏิบัติการไดปรับเรียบรอยแลว 

*** เปดสวิตซเครื่อง (อยูดานหลังของเครื่อง) หลอดไฟจะสวางขึ้น ใหอุนเครื่องกอนใชงานประมาณ 20 

นาที 

*** สามารถใสเซลล (Cuvette) ได 4 เซลลพรอมกัน 

*** หมายเลข 1 จอแสดงตัวเลข 

หมายเลข 2 ปุมเลือกโหมดการวัดคา 

หมายเลข 3 ปุมลดคาแฟคเตอรของความเขมขน 

หมายเลข 4 ปุม 100%,0Abs. และปุมเพิ่มคาแฟคเตอรของความเขมขน 

หมายเลข 5 จอแสดงคาความยาวคลื่น 

หมายเลข 6 ปุมปรับคาความยาวคลื่น 

1. การวัดคาแสงที่ผาน (TRANSMISSION) 

1. กดปุมเลือกโหมดการวัด ใหไฟบนหนาจออยูในตําแหนง T (TRANSMISSION) เมื่อปดฝาชองใส 

ตัวอยางคาที่อานไดควรเปน 100%T ในกรณีคาที่อานไดไมเปนไปตามที่กลาวขางตนใหกดปุม 

100%,0Abs 

2. ใสเซลล (Cuvette) ที่บรรจุสารอางอิง (Blank) และสารตัวอยางลงในชองใสตัวอยาง 

3. ปรับคาความยาวคลื่นที่ตองการใช

120 


4. เลือกโหมดการวัดเปนโหมด 100% T แลวปดฝาชองใสตัวอยาง เลื่อนตําแหนงเซลลใหแสงสองผาน 

สารอางอิงและกดปุม 100% T คอยคาที่อานไดแสดง 100.00 

5. เลื่อนดามจับใหแสงสองผานสารตัวอยางที่ตองการวัด แลวอานคาแสงสองผาน (Transmission) ของ 

ตัวอยางนั้นๆ บันทึกคาที่อานได 

2. การวัดคาการดูดกลืนแสง (ABSORPTION) 

1. กดปุมเลือกโหมดการวัดใหไฟบนหนาจออยูในตําแหนง Abs. (ABSORPTION) 

2. ปรับคาความยาวคลื่นที่ตองการใช 

3. ใสเซลล (Cuvette) ที่บรรจุสารอางอิง (Blank) และสารตัวอยางลงในชองใสตัวอยางโดยจับเซลลดาน 

ที่ขุนและหันดานใสเขาหาแหลงกําเนิดแสง 

4. เลื่อนตําแหนงเซลลใหแสงสองผานสารอางอิง และกดปุม 0Abs. (หมายเลข 4) 

5. รอคาที่อานไดแสดงเปน 0.000 

6. เลื่อนดามจับใหแสงสองผานสารตัวอยางที่ตองการวัด อานคาการดูดกลืนแสง บันทึกคาที่อานได 

3. การวัดความเขมขน (CONCENTRATION) 

*** กอนทําการวัดใหเลือกความยาวคลื่นที่เหมาะสมกับการวัดคาสารมาตรฐานและเช็คคา 0.000 และ 

100%T กอนทุกครั้ง 

1. กดปุมเลือกโหมดการวัดใหอยูในโหมด C (CONCENTRATION) 

2. ใสเซลลที่บรรจุสารละลายที่ทราบคาความเขมขนและสารละลายตัวอยาง ลงในชองใสตัวอยาง 

3. เลือกโหมดการวัดใหอยูในโหมด F (FACTOR) และกดปุมเพิ่ม-ลด คาแฟคเตอร (หมายเลข 3,4) ให 

ไดคาความเขมขนเทากับคาความเขมขนที่ทราบคา 

4. เลื่อนสารละลายตัวอยางใหอยูในตําแหนงทางเดินแสงแลวเลือกโหมดการวัดเปน C คาความเขมขน 

ของสารตัวอยางจะแสดงบนหนาจอตัวเลข บันทึกคาที่อานได 

*** เมื่อมีการเปลี่ยนคาความยาวคลื่นจะตองรอประมาณ 2-3 นาที กอนที่จะทําการวัด 

4. การใชงานเครื่องวัดการดูดกลืนแสง (Spectrophotometer : Genesys 10 VIS) 

*** เปดอุนเครื่องกอนการใชงาน 15- 20 นาที 

1. เปดเครื่อง สวิตซ อยูทางดานหลังของเครื่อง 

2. เลือกฟงกชันที่ตองการใชงาน โดยกดปุม Change Mode (ปุม D) หนาจอจะแสดงฟงกชันทางมุมซาย ดานบน 

(Absorption, Transmission, Concentration) 

3. เลือกความยาวคลื่นที่ตองการวัด โดยกดปุม Set Mode (ปุม C) แลวปอนตัวเลขตามความยาวคลื่นที่ตองการ 

จากนั้นกดปุม Enter เพื่อยืนยัน 

4. ใสเซลล (Cuvette) ที่บรรจุสารอางอิง (Blank) ลงในชองใสตัวอยาง โดยจับเซลลดานที่ขุนและหันดานที่ใสเขา 

หาแหลงกําเนิดแสง 

5. กดปุม Measure Blank (ปุม A) เพื่อตั้งคาเปน 0.000 A 

6. ใสเซลล (Cuvette) ที่บรรจุสารตัวอยางลงในชองใสตัวอยาง คาที่อานไดจะแสดงที่หนาจอ จดบันทึกคาที่อานได 

7. ควรใชความระมัดระวังในการเทสารลงในเซลล ควรเช็ดเซลลใหแหงกอนที่จะใสเซลลลงในชองใสตัวอยาง

121 


8. เมื่อเสร็จสิ้นการทํางาน ปดสวิตซดานหลังเครื่อง 

*** เมื่อตองการเปลี่ยนความยาวคลื่นทําตามขอ 3. 

5. การใชงานเครื่องวัดความเค็ม (Refractometer) 

การปรับสเกล (Scale Adjustment) 

*** กอนการใชงานตองตรวจเช็คกอน เพราะดัชนีหักเหจะแปรผันกับอุณหภูมิเสมอ โดยพื้นฐานแลว 

เครื่องมือออกแบบมาเพื่อใชงานที่อุณหภูมิ 20 o C ดังนั้นถาการใชงานที่อุณหภูมิสูงหรือต่ํากวานี้ตองมีการปรับสเกล 

ซึ่งสามารถปฏิบัติไดดังนี้ 

1. มองผาน eyepiece lens และปรับโฟกัสใหชัดเจน โดยหันเครื่องมือไปทางดานที่มีแสงสวาง 

2. เปดฝาปดปริซึมออกและหยดน้ํากลั่น 2-3 หยด ลงบนผิวหนาปริซึมดานบน แลวปดฝาปดปริซึมให 

สนิท พยามอยาใหเกิดฟองอากาศ 

3. มองผาน eyepiece lens จะเห็นเสนแบงเขตระหวางสวนที่เปนสีฟากับสวนที่เปนสีขาวถาเสนแบงเขต 

นั้นอยูที่สเกล 0% แสดงวาสเกลอยูในตําแหนงที่เหมาะสมแลว 

4. ถาเสนแบงเขตนั้นไมไดอยูที่ 0% ใหหมุนปุมปรับสเกล (Scale Adjust Screw) จะเห็นเสนแบงนั้นขยับ 

ขึ้น-ลง จากนั้นปรับใหอยูในระดับสเกล 0% 

5. สามารถนําไปใชงานวัดคาความเค็มตอไป 

การวัดคาความเค็ม (Measurement) 

1. เปดฝาปดปริซึมออกและหยดสารตัวอยางที่ตองการวัด 2-3 หยด ลงบนผิวหนาปริซึมดานบน แลวปด 

ฝาปดปริซึมใหสนิท พยายามอยาใหเกิดฟองอากาศ 

2. มองผาน eyepiece lens อานและจดบันทึกคาที่วัดได 

3. ถาเปลี่ยนสารตัวอยางที่วัดตองทําความสะอาดปริซึมและฝาปดปริซึมดวยน้ํากลั่นทุกครั้ง โดยฉีดน้ํา 

กลั่นจากกระบอกน้ํากลั่นลางสารตัวอยางออกใหหมด แลวเช็ดปริซึมและฝาปดปริซึมดวยกระดาษ 

ชําระหรือผานุมๆ ใหแหง พยายามอยาใหปริซึมมีรอยขีดขวน 

4. หลังจากใชงานเสร็จสิ้นแลว ลางทําความสะอาดและเก็บเครื่องมือใหเรียบรอย 

6. การใชงานเครื่องวัดคาการนําไฟฟา (Conductivity : Cyber Scan CON100) 

*** ตอพวงอุปกรณตางๆ เขากับเครื่องมือใหเรียบรอยกอนการใชงาน 

การคาลิเบรทเครื่อง (Calibration) 

1. เตรียมสารละลายบัพเฟอร (Conductivity Solution) ที่ใชในการคาลิเบรท ใสในบีกเกอร 2 อัน 

สารละลายนี้ควรเก็บไวที่อุณหภูมิหอง (25 o C) 

*** เลือกใช Conductivity Solution ที่ครอบคลุมคาการนําไฟฟาของสารละลายตัวอยางที่จะวัด 

2. จุม probe ลงไปใน Conductivity Solution ที่บรรจุในบีกเกอรอันแรก เพื่อกําจัดสิ่ง สกปรกที่อาจติด 

อยูที่ probe ซึ่งจะมีผลตอการคาลิเบรท

122 


3. จุม probe ลงไปใน Conductivity Solution บีกเกอรที่สอง จากนั้นเปดเครื่องโดยกดปุม 

ON/OFF หนาจอจะแสดงสถานของเครื่อง 

4. เลือกสถานะของเครื่องใหอยูในฟงกชัน COND โดยกดปุม MODE หนาจอจะแสดงคาการนํา 

ไฟฟา (µS) และอุณหภูมิของ Conductivity Solution บันทึกคาอุณหภูมินี้ไว 

5. กดปุม CAL/MEAS เพื่อเขาสูฟงกชันการคาลิเบรท หนาจอจะแสดง CAL 

6. ทําการคาลิเบรทเครื่องโดยใชปุม MI/ หรือ MR/ เพื่อเพิ่มหรือลดคา µS ตามลําดับ ปรับ 

เพิ่ม-ลด คา µS ใหไดคาตรงตามคาของ Conductivity Solution ที่ใช 

*** หากอุณหภูมิของ Conductivity Solution มีคาไมเทากับ 25 o C ใหปรับคา µS ใหตรงกับคา ณ อุณหภูมิ 

ของ Conductivity Solution นั้น (รายละเอียดระบุขางขวดสารละลาย) 

7 กดปุม ENTER/RANGE เพื่อยืนยันการคาลิเบรท จากนั้นเครื่องจะกลับเขาสูฟงกชัน COND เอง 

โดยอัตโนมัติ 

การวัดคาการนําไฟฟา (Measurement) 

1. ลาง probe ดวยน้ํากลั่นกอนการใชงานทุกครั้ง โดยจุม probe ลงในบีกเกอรที่บรรจุน้ํากลั่นและคน 

เบาๆ 

2. เปดเครื่องโดยกดปุม ON/OFF 

3. เช็คหนาจอเครื่องใหแนใจวาเครื่องอยูในฟงกชัน COND 

4. จุม probe ลงไปในสารละลายตัวอยางที่ตองการวัด และคนเบาๆ ใหเนื้อสารเขากัน 

5. ตองแนใจวา probe ที่จุมลงไปนั้นไมมีฟองอากาศเขาไปติดอยูขางใน probe 

6. อานคาบนหนาจอและจดบันทึกคาเมื่อบนหนาจอปรากฏคําวา READY 

7. ทุกครั้งที่เปลี่ยนสารตัวอยางที่วัดตองลาง probe ดวยน้ํากลั่นทุกครั้ง 

8. หลังจากเสร็จสิ้นการใชงานลาง probe ดวยน้ํากลั่นทุกครั้งและเช็ดดวยกระดาษชําระใหแหง 

9. ปดเครื่องโดยกดปุม ON/OFF หรือเครื่องจะปดเองโดยอัตโนมัติหลังจากที่ไมมีการใชงานเปนเวลา 

10 นาที 

10. ถอดเก็บอุปกรณไวในกลองเครื่องมือใหเรียบรอย 

7. การใชงานเครื่องวัดปริมาณแอมโมเนียในน้ํา (HI 93715) 

1. เปดเครื่องโดยกดปุมสวิตซ ON เมื่อหนาจอแสดงเครื่องหมาย “ - - - ” แสดงวาเครื่องพรอมใชงาน 

2. เติมสารละลายตัวอยางที่ยังไมไดใสน้ํายาลงไปใน cuvette 10 มิลลิลิตร ซึ่งตําแหนงจะอยูที่ระดับขีด โดยระดับ 

ขีดนี้จะอยูต่ํากวาขอบของ cuvette 1.5 ซม. จากนั้นจึงปดฝา cuvette 

3. วาง cuvette ลงไปในชองใส cuvette แลวปดใหตรงชอง 

4. กด ZERO แลวหนาจอจะแสดงเครื่องหมาย “ SIP ” รอประมาณ 2-3 วินาที หนาจอจะแสดง “ -0.0- ” แสดงวา 

เครื่องพรอมที่จะใชงาน 

5. ถอด cuvette แลวเติมน้ํายา (First reagent) ลงไปใน cuvette 4 หยด (6 หยด ในกรณีวิเคราะหน้ําทะเล) 

6. ปดฝาแลวแกวง/กวน cuvette ใหสารละลายกับน้ํายาเขากัน 

7. เติมน้ํายา (Second reagent) ลงไปใน cuvette 4 หยด (6 หยดในกรณีวิเคราะหน้ําทะเล) 

8. ปดฝาแลวแกวง/กวน cuvette ใหสารละลายกับน้ํายาเขากัน

123 


9. ใส cuvette เขาไปยังชองอีกครั้ง 

10. กดปุม READ TIMED แลวเครื่องจะเริ่มนับถอยหลังจนกระทั่งแสดงคา หรือรอประมาณ 3.30 นาที แลวกดปุม 

READ DIRECT (ทั้งสองวิธีหนาจอจะแสดงเครื่องหมาย “ SIP ” ระหวางทําการวัด) 

11. เครื่องจะแสดงคาความเขมขนของแอมโมเนียไนโตรเจน ในหนวยเปน mg/l 

12. ในการอานคาเปน mg/l ของแอมโมเนีย ใหคูณตัวเลขที่แสดงบนหนาจอดวย 1.214 

8. การใชงานเครื่องวัดปริมาณคลอรีน, ความกระดางในน้ํา (HI 93745) 

1. เปดเครื่องโดยกดปุมสวิตซ ON เมื่อหนาจอแสดงเครื่องหมาย “ C101 ” กดปุม SET คางไวจนกระทั่ง 

Parameter ที่ตองการปรากฏ 

Parameters 

• Total chlorine measurement : Cl t 

• Hardness measurement : Hrd 

2. ปลอยปุม หนาจอจะแสดงเครื่องหมาย “ - - - ” แสดงวาเครื่องพรอมใชงาน 

3. Total chlorine measurement 

3.1 เติมสารละลายตัวอยางที่ยังไมไดใสน้ํายาลงไปใน cuvette 10 มิลลิลิตร ซึ่งตําแหนงจะอยูที่ระดับขีด 

โดยระดับขีดนี้จะอยูต่ํากวาขอบของ cuvette 1.5 ซม. จากนั้นจึงปดฝา cuvette 

3.2 วาง cuvette ลงไปในชองใส cuvette แลวบิดใหตรงชอง 

3.3 กด ZERO แลวหนาจอจะแสดงเครื่องหมาย “ SIP ” รอประมาณ 2-3 วินาที หนาจอจะแสดง “ - 

0.0- ” แสดงวาเครื่องพรอมที่จะใชงาน 

3.4 เติมน้ํายา HI 93711 จํานวน 1 ซอง ลงใน cuvette ปดฝาแลวเขยาเบาๆ 

3.5 ใส cuvette ลงไปยังเครื่อง รอประมาณ 2 นาทีครึ่ง 

3.6 กดปุม READ หนาจอจะแสดงเครื่องหมาย “ SIP ” ระหวางที่กําลังวัดคา 

3.7 เครื่องจะแสดงคาความเขมขนของคลอรีนรวมบนหนาจอ ในหนวย mg/l 

4. Hardness measurement 

4.1 เติมสารละลายที่ยังไมไดใสน้ํายาลงไป 50 มิลลิลิตร ในบีกเกอร 

4.2 เติมสารละลาย HI 93719 A ลงในบีกเกอร 0.5 มิลลิลิตร แลวผสมใหเขากัน 

4.3 เติมสารละลาย HI 93719 B ลงในบีกเกอร 0.5 มิลลิลิตร แลวผสมใหเขากัน 

4.4 เติมสารละลายที่ผสมลงใน cuvette 3 อัน อันละ 10 มิลลิลิตร 

4.5 หยดสารละลาย HI 93719 C 1 หยด ลงใน cuvette 1 อัน ปดฝาแลวเขยา จะไดสารตัวอยาง ZERO 1 

4.6 หยดสารละลาย HI 93719 D 1 หยด ลงใน cuvette ที่ 2 ปดฝาแลวเขยา จะไดสารตัวอยาง ZERO 2 

4.7 สําหรับ cuvette ที่ 3 ไมตองเติมน้ํายา 

4.8 วางสารตัวอยาง ZERO 1 ลงในชองใส cuvette แลวบิดใหตรงชอง 

4.9 กด ZERO แลวหนาจอจะแสดงเครื่องหมาย “ SIP ” ในระหวางการวัด รอจนกระทั่งหนาจอแสดง 

เครื่องหมาย ZERO 2 

4.10 เอาสารตัวอยาง ZERO 1 ออก แลวใสสารตัวอยาง ZERO 2 ลงในชองใส cuvette แลวบิดใหตรง 

ชอง

124 


4.11 กด ZERO แลวหนาจอจะแสดงเครื่องหมาย “ SIP ” ในระหวางการวัด จากนั้นหนาจอเครื่องจะ 

แสดงระดับของความกระดางของแมกนีเซียมในหนวยเปน ppm CaCO 3 (ลงทายดวยสัญลักษณ 

“n”) 

4.12 เอาสารตัวอยาง ZERO 2 ออกแลวใส cuvette ที่ 3 ลงในชองใส cuvette แลวบิดใหตรงชอง 

4.13 กด READ แลวหนาจอจะขึ้นเครื่องหมาย “ SIP ” ในระหวางการวัด เครื่องจะแสดงความเขมขน 

ของ Calcium ในหนวย ppm CaCO 3 (ลงทายดวย “ C ”) 

4.14 กด READ อีกครั้ง แลวหนาจอจะขึ้นเครื่องหมาย “ SIP ” ในระหวางการวัด เครื่องจะแสดงความ 

เขมขนของ ความกระดาง ในหนวย ppm CaCO 3 (ลงทายดวย “ t ”) 

4.15 กด READ ครั้งสุดทาย เครื่องจะแสดงคาของความเขมขนของความกระดางในหนอย mg/l (ppm) 

โดยคาแรกจะแสดงคาของ magnesium (n) แลวเปนคา calcium (C) จากนั้นเปนคารวมทั้งหมด (t) 

4.16 โดยการกด ZERO เครื่องจะ reset แลวพรอมที่จะทําการทดสอบการกระดางของสารตัวอยางอื่น 

ตอไป 

9. การใชงานเครื่องวัดปริมาณออกซิเจนที่ละลายในน้ํา (ภาคสนาม) (YSI#550A) 

1. ตรวจสอบหัววัดใหอยูในชองเก็บหัววัด และมีฟองน้ําเปยกหมาดๆ อยูภายในชองเก็บวัดดวย 

2. กดปุม ON/OFF เพื่อ เปดเครื่องไวประมาณ 10 นาที ใหคาที่แสดงบนหนาจอนิ่ง (Stable) 

3. กดปุม MODE จนกระทั่งหนาจอแสดงผลการวัดเปน % 

การปรับมาตรฐาน (Calibration) 

1. กดปุมลูกศรขึ้นและลงพรอมกัน เพื่อปรับมาตรฐานเครื่อง กดปุม ENTER เพื่อยืนยัน 

คาความสูงเปน 0 หนาจอจะแสดงดังรูป 

ALTx100 ft. 

0 

2. กดปุม ENTER เพื่อยืนยันการ CAL ที่ 100% 

3. กดปุม ENTER เพื่อยืนยันคาความเค็มเปน 0 หนาจอจะแสดงดังรูปขางลาง 

SAL PPT 

0.0 

4. วัดเปน mg/l กดปุม MODE จนหนาจอแสดง mg/l 

กรณีนําไปวัดแหลงน้ําที่ไมมีความเค็ม Salinity = 0 ppt 

- นําหัววัดไปวัดตามแหลงน้ําหรือตัวอยางที่ตองการทราบคาออกซิเจนที่ละลายน้ําไดเลย กรณี 

นําไปแหลงน้ําที่มีความเค็ม 

- กดปุม MODE ใหหนาจอแสดงหนวยของความเค็ม คือ ppt กดลูกศรขึ้นหรือลง เพื่อใสคาความ 

เค็มแลวกด ENTER จากนั้นนําหัววัดไปวัดไดเลย

125 


- ตองการทราบความเค็มของน้ํา ใชเครื่องมือสําหรับวัดความเค็มกอนใสคาความเค็มในเครื่อง 

การดูแลรักษาหัววัดและตัวเครื่อง 

- หมั่นดูแลและสังเกตที่ชองเก็บหัววัดใหมีฟองน้ําที่เปยกชุมดวยน้ําเสมอ 

- กรณีวัดในบอหรือแหลงน้ําทั่วไป ตองกวนหัววัดใหความเร็วสม่ําเสมอ 

- กรณีในบอหรือที่ที่มีการหมุนเวียนของน้ําตลอดเวลานําหัววัดผูกติดกับไมหรือแทงเหล็ก แตให 

หัววัดชี้เขาหาตัวเอง แลวหยอนวัดตามปกติ 

หมายเหตุ : แถบสีบอกถึงระดับความยาวของสายเคเบิลถึงปลาย probe 

สีเหลือง = 50 เซนติเมตร 

สีสม = 100 เซนติเมตร 

สีแดง = 150 เซนติเมตร 

สีน้ําเงิน = 200 เซนติเมตร 

10. การใชงานเครื่องวัดปริมาณออกซิเจนในน้ํา inoLab Oxi level 2 (แบบตั้งโตะ) 

*** เปดอุนเครื่องกอนการใชงาน 10-15 นาที 

การเปรียบเทียบการวัดคาออกซิเจนที่เจือปนในน้ํา (Calibration) 

ตองทําการคาลิเบรททุกครั้งที่เปดเครื่อง สัญลักษณของหัววัด (Probe) จะแสดงกระพริบบนหนาจอ เมื่อยัง 

ไมไดคาลิเบรท 

1. ใสหัววัด (Probe) ลงใน Oxical – SL 

2. กดปุม CAL เพื่อเขาไปในโหมดการเปรียบเทียบดวยอากาศ 

3. กดปุม RUN/ENTER จะปรากฏอักษร AR กระพริบ ที่จอแสดงผล 

4. รอจนกวาอักษร AR จะหยุดกระพริบ แลวเครื่องมือวัดจะแสดงคา Relative Slope เพื่อตรวจสอบใช 

แสดงภาวะของสายวัด วายังอยูในสภาพที่ใชงานไดอยูหรือไมเทียบไดกับคูมือการใชงาน 

ขั้นตอนการวัดคาออกซิเจนที่เจือปนในน้ํา 

1. กดปุม M เพื่อเขาสูโหมดการวัด 

2. นําหัววัด (Probe) ไปจุมในตัวอยางที่ตองการวัด 

3. กดปุม M เพื่อวัดปริมาณออกซิเจน (mg/l) 

4. กดปุม M เพื่อวัดเปอรเซ็นตออกซิเจน (%) 

5. กดปุม M เพื่อวัดความดันออกซิเจนในบรรยากาศ (mbar) 

6. กดปุม AR เพื่อเขาสูฟงกชันการอานคาอัตโนมัติ 

7. กดปุม RUN/ENTER เพื่อเริ่มทําการวัด 

8. รอจนกวาอักษร AR จะหยุดกระพริบ เครื่องมือวัดจะแสดงคาที่อานได 

9. วัดตัวอยางตอไปโดยการลางหัววัด (Probe) ดวยน้ํากลั่นแลวนําไปจุมในตัวอยางที่ตองการวัด ทําซ้ํา 

ตามขอ 7-8 

10. เมื่อเสร็จสิ้นการใชงานลางหัววัด (Probe) ดวยน้ํากลั่น เช็ดใหแหง แลวเก็บเขาที่ใหเรียบรอย 

11. ขอควรระวังในขณะปฏิบัติงาน พยายามอยาใหมีลมพัด เพราะจะทําใหคาที่อานไดไมคงที่

126 


การชดเชยคาความเค็มของการวัดคาออกซิเจนที่เจือปนในน้ํา (Salinity) 

เนื่องจากความเค็มของน้ําในระดับที่มีสวนของเกลือมากกวา 1 กรัม / ลิตร จะมีผลตอการวัดคาออกซิเจนที่ 

เจือปนในน้ํา ดังนั้นจึงตองมีการชดเชยคาความเค็มของน้ํา เพื่อใหเครื่องวัดสามารถอานคาออกซิเจนที่เจือปนในน้ํา 

ไดอยางถูกตอง 

1. กดปุม CAL จนกวาจะมีคําวา Sal ปรากฏขึ้น 

2. กดปุมลูกศรขึ้น - ลง เพื่อเลือกคาการชดเชยคาความเค็ม 

3. กดปุม M เพื่อเขาสูโหมดของการวัด 

11. การใชงานเครื่องชั่งดิจิตอลทศนิยม 2 และ 4 ตําแหนง 

*** ขณะใชงานเครื่องชั่ง ควรปดพัดลม เครื่องปรับอากาศ และแหลงกําเนิดลม เพราะลมจะทําให 

คาที่ชั่งนั้นไมคงที่ 

*** เครื่องชั่งทศนิยม 2 ตําแหนงสามารถรับน้ําหนักไดสูงสุด 1020 กรัม 

*** เครื่องชั่งทศนิยม 4 ตําแหนง (เครื่องที่มีฝากระจกครอบ) สามารถรับน้ําหนักไดสูงสุด 220 กรัม 

*** หามเคลื่อนยายเครื่องชั่งโดยเด็ดขาด 

1. ตรวจเช็คระดับของลูกน้ํา ใหอยูในวงกลมตรงกลาง โดยปรับไดจากฐานดานหลังของเครื่อง 

(ซาย-ขวา) 

2. เปดเครื่อง กดปุม “ON/OFF” เปดอุนเครื่องกอนการใชงาน 10-15 นาที 

3. วางภาชนะลงบนแทนชั่ง และกดปุม “T” เพื่อปรับน้ําหนักเปน 0.00 กรัม 

4. ใชความระมัดระวังในการชั่ง พยายามอยาใหสารที่ชั่ง หกลงบนเครื่องชั่ง 

5. เมื่อใชงานเสร็จแลวทําความสะอาดเครื่องชั่งใหเรียบรอย 

6. หากยังมีการใชงานตอ ยังไมตองปดเครื่อง โดยกดปุม “T” ใหหนาจอแสดง “0.00 g” 

7. หามวางภาชนะหรือสิ่งของใดๆ คางไวที่แทนชั่ง โดยเด็ดขาด 

8. ปดเครื่อง กดปุม “ON/OFF” ถอดปลั๊กและจัดเก็บเครื่องใหเรียบรอยทุกครั้งหลังใชงานเสร็จ 

9. มีปญหาการใชงานหรือเครื่องเกิดการชํารุดรีบแจงเจาหนาที่ทันที 

12. การใชงานเครื่องกวนสารละลายพรอมแผนใหความรอน (Hotplate stirrer : SLR) 

*** กอนใชงานควรอานวิธีการใชงานใหละเอียด และใชงานใหถูกตอง 

• ปุมซายมือ ควบคุมการทํางาน การกวน (Stirrer) 

• ปุมขวามือ ควบคุมการทํางานการใหความรอน (Heater) 

เครื่องหมาย การกวน แสดงวา Stirrer พรอมทํางาน 

เครื่องหมาย ความรอน แสดงวา Heater พรอมทํางาน 

เครื่องหมาย ความรอนคาง แสดงวาเครื่องยังรอนอยู หามสัมผัสแผนใหความรอน

127 


กราฟรูปโคง 

แสดงการควบคุมการทํางานของ Heater และ Stirrer 

การใชงานเครื่องกวนสารละลาย (Stirrer) 

1. เตรียมอุปกรณที่จะใชงานใหพรอม 

2. กดปุมซายมือคางไวประมาณ 2 วินาที จนกระทั่งสัญลักษณตางๆ ปรากฏขึ้นบนหนาจอ ระดับ 

ความเร็วรอบเมื่อเปดเครื่องจะอยูที่ระดับ 0 (ศูนย) 

3. หมุนปุมซายมือตามเข็มนาฬิกาเพื่อเลือกระดับความเร็วรอบที่ตองการ ไมควรปรับระดับความเร็วรอบ 

มากเกินไป อาจทําความเสียหายใหกับเครื่องได 

4. หนาจอจะแสดงการเพิ่มขึ้นของระดับความเร็วรอบจนถึงระดับที่ตองการ ระดับความเร็วรอบสามารถ 

ปรับไดทีละ 10 และสามารถปรับไดที่ระดับความเร็วรอบ 100 ถึง 1100 รอบตอนาที 

5. การปดเครื่อง เมื่อเสร็จสิ้นการทํางาน กดปุมซายมือคางไวประมาณ 2 วินาที สัญลักษณบนหนาจอจะ 

หายไป 

6. กรณีทํางานพรอมกับเครื่องใหความรอน หามถอดปลั๊กออกทันที เพราะวาเครื่องยังทํางาน ระบาย 

ความรอนใหกับตัวเครื่อง สังเกตสัญลักษณ “HOT” ยังแสดง 

7. เมื่อสัญลักษณ “HOT” หายไป สามารถถอดปลั๊กออกได และทําความสะอาดเครื่องกรณีเกิดความ 

สกปรก 

8. หากมีปญหาการใชงานหรือเกิดการชํารุดรีบแจงเจาหนาที่หองปฏิบัติการทันที 

การใชงานเครื่องทําความรอน (Heater) 

1. เตรียมอุปกรณที่จะใชงานใหพรอม 

2. กดปุมขวามือคางไวประมาณ 2 วินาที จนกระทั่งสัญลักษณตางๆ ปรากฏขึ้นบนหนาจอ ระดับความ 

รอนเมื่อเปดเครื่องจะอยูที่ระดับ 0 (ศูนย) 

3. หมุนปุมขวามือตามเข็มนาฬิกาเพื่อเลือกระดับความรอนที่ตองการภายใน 30 วินาที มิฉะนั้นเครื่องจะ 

ปดโดยอัตโนมัติ 

4. หนาจอจะแสดงการเพิ่มขึ้นของระดับอุณหภูมิจนถึงระดับที่ตองการ มี 24 ระดับ และแสดงสัญลักษณ 

“HOT” ซึ่งแสดงวาเครื่องเริ่มทํางาน และยังคงแสดงไปตลอดระยะเวลาที่แผนใหความรอนยังรอนอยู 

5. หลังจากเปดเครื่อง และใชระดับความรอนที่ระดับ 24 นานติดตอกัน 3 ชั่วโมง เครื่องจะปรับลดระดับ 

เปน 18 โดยอัตโนมัติเพื่อปองกันอันตรายจากความรอนสูง 

6. การปดเครื่อง เมื่อเสร็จสิ้นการทํางาน กดปุมขวามือคางไวประมาณ 2 วินาที สัญลักษณบนหนาจอจะ 

หายไป 

7. หามถอดปลั๊กออกทันที เพราะวาเครื่องยังทํางาน ระบายความรอนใหกับตัวเครื่อง สังเกตสัญลักษณ 

“HOT” ยังแสดง 

8. เมื่อสัญลักษณ “HOT” หายไป สามารถถอดปลั๊กได และทําความสะอาดเครื่องกรณีเกิดความสกปรก 

9. หากมีปญหาการใชงานหรือเกิดการชํารุดรีบแจงเจาหนาที่หองปฏิบัติการทันที

128 


ตารางแสดงความสัมพันธระหวางระดับความรอนกับอุณหภูมิของแผนใหความรอนโดยประมาณ 

ระดับความ 

รอน 

อุณหภูมิ 

C 


รอน 


C 


รอน 


C 


รอน 


C 

1 65 7 230 13 400 19 487 

2 93 8 255 14 415 20 505 

3 130 9 287 15 430 21 520 

4 160 10 330 16 444 22 533 

5 186 11 360 17 456 23 544 

6 207 12 380 18 473 24 555 

13. การใชงานเครื่องปมสุญญากาศ (Vacuum pump : ME 2) 

1. เสียบปลั๊กและติดตั้งอุปกรณใหเรียบรอย 

2. วางกระดาษกรองลงบนกรวยกรอง ฉีดน้ํากลั่นเล็กนอยเพื่อใหกระดาษกรองสัมผัสกับพื้นผิวกรวยกรอง 

3. เปดสวิตซ อยูดานขาง คอยๆ เทสารผานกรวยกรอง 

4. สามารถกรองสารไดครั้งละประมาณ 200 มิลลิลิตร 

5. ขอควรระวัง ถาสารที่กรองมีตะกอนมาก คอยๆ เทสารทีละนอยๆ เพื่อใหสารคอยๆ ผานกระดาษกรอง หากใส 

ลงไปครั้งเดียวเต็มกรวยกรอง จะทําใหกระดาษกรองอุดตัน ทําใหการกรองหยุดชะงัก 

6. ขอควรระวัง โปรดใชความระมัดระวังในการใชงาน อยาใหสารที่กรองไหลผานเขาไปยังเครื่องกรอง 

7. อยาเปดเครื่องนานติดตอกันเกิน 1 นาที ควรปดและเปดใหมเปนระยะๆ 

8. เปลี่ยนกระดาษกรองเมื่อเห็นวาการกรองไมมีประสิทธิภาพ 

9. ทุกครั้งที่เปลี่ยนสารตัวอยางในการกรอง ตองลางชุดกรอง ดวยทุกครั้ง 

10. เมื่อใชงานเสร็จแลวลางอุปกรณใหสะอาด และถอดปลั๊กเก็บใหเรียบรอย 

11. มีปญหาการใชงานหรือเครื่องเกิดการชํารุดรีบแจงเจาหนาที่ทันที

129 

หองปฏิบัติการซีรั่มวิทยา 

ชื่อหองปฏิบัติการ : หองปฏิบัติการซีรั่มวิทยา 

นักวิทยาศาสตรประจําหอง : นางสาวกนกกาญจน แกวพรม 

แผนผังหองปฏิบัติการซีรั่มวิทยา 

ประตูทางเขา 

Dx 4 Dx 6 

Dx 1 


Dx 12 Dx 13 Dx 14 หองน้ํา Dx 5 Dx3 

Dx 2 

ลําดับ หองปฏิบัติการ หมายเลขหอง นักวิทยาศาสตรผูรับผิดชอบ 

1 หอง autoclave Dx 1 

2 หองลางและเตรียมเครื่องแกว Dx 2 

3 หองปฏิบัติการระบบสืบพันธุ Dx 3 

นางสาวกนกกาญจน แกว 

พรม 

นายณภัทร ไกรฤกษ 

4 หองรวมเครื่องมือและหองเตรียมตัวอยาง Dx 4 

5 หองปฏิบัติการซีรั่มวิทยา 1 Dx 5 



7 หองเครื่อง Lamina flow Dx 14 

8 หองเครื่องกรองน้ํา Dx 13 

9 หองเครื่องแชแข็ง Dx 12

130 



อาคารชันสูตรโรคสัตว 

1. แตงกายใหสุภาพเรียบรอยทุกครั้งที่เขาปฏิบัติงาน 

2. ลางมือทุกครั้งทั้งกอนและหลังปฏิบัติงาน 

3. สวมเสื้อกาวน ถุงมือทุกครั้งที่ปฏิบัติงาน 

4. หามกิน ดื่ม สูบบุหรี่ แตงหนา ถอด/ใสคอนแทคเลนส และเก็บอาหารไวในหองที่อนุญาตใหเก็บเทานั้น 

5. หามรับโทรศัพทขณะปฏิบัติงาน 

6. เช็ดพื้นผิวที่ทํางานดวยน้ํายาฆาเชื้อทันที หลังสิ่งติดเชื้อหกและหลังปฏิบัติงานทุกครั้ง 

7. ทิ้งของมีคมในภาชนะที่จัดไวใหเทานั้น 

8. หามเคลื่อนยายหรือนําอุปกรณ สารเคมี และวัสดุอื่นๆ ภายในหองปฏิบัติการไปโดยไมไดรับอนุญาต 


10. การใชอุปกรณและเครื่องมือในหองปฏิบัติการตองแจงใหเจาหนาที่ทราบทุกครั้ง 

11. หากพบอุปกรณหรือครุภัณฑใดๆชํารุด มีความเสียหายใหแจงเจาหนาที่ประจําหองปฏิบัติการทันที 

12. ทิ้งขยะในที่ที่จัดไวเทานั้น (แยกขยะกอนทิ้ง ขยะติดเชื้อตองนําไปนึ่งฆาเชื้อกอนทิ้ง) 

13. หลังจากเสร็จสิ้นจากการปฏิบัติงานแลว ตองคืนอุปกรณที่เบิกไปทุกชิ้นในสภาพที่สะอาด เรียบรอย 

14. ปฏิบัติตามขอปฏิบัติการใชหองปฏิบัติการอยางเครงครัด 

ระเบียบการเรียกเก็บคาเสียหายกรณีทําของชํารุดเสียหาย 

1. กรณีของที่ชํารุดเสียหายเปนครุภัณฑ นักวิทยาศาสตรประจําหองทําบันทึกชี้แจงรายการที่ชํารุดเสียหาย 

ตอรองผูอํานวยการสถานบริการสุขภาพสัตว ทําเรื่องขออนุมัติซอม ถาคาความเสียหายเปนจํานวนเงิน จะเรียกเก็บ 

จากผูที่ทําชํารุดเสียหาย 

2. กรณีของที่ชํารุดเสียหายเปนวัสดุ นักวิทยาศาสตรประจําหองจะคิดคาความเสียหายเปนจํานวนเงิน จะ 

เรียกเก็บจากผูที่ทําชํารุดเสียหาย

131 



1. การตรวจ ADV (Aujeszky Disease Virus or Pseudorabies Virus) โดยวิธี ELISA 

1.1 นําซีรั่มที่ตองการตรวจและชุดตรวจ ของ IDEXX PRV-g1 ELISA Kit ออกมาจากตูเย็นวางไวที่ 

อุณหภูมิหองใหอุณหภูมิเทากับอุณหภูมิหอง และทําบันทึกตําแหนงของตัวอยางที่จะทําการทดสอบ 

1.2 ทําการเจือจางซีรั่มตัวอยางที่ตองการทดสอบ รวมทั้ง Positive Control และ Negative Control 

อัตราสวน 1:2 โดยเติม Sample Diluent Buffer 100 ul ลงใน Uncoated 96-wells microtiter plate แต 

ละหลุมใหเทากับจํานวนตัวอยางทดสอบที่ตองการตรวจ รวมถึง Positive Control 2 หลุม และ 

Negative Control 3 หลุม ในการเติม Sample Diluent Buffer ลงไปควรหลีกเลี่ยงการเกิดฟองอากาศ 

1.3 เติมซีรั่ม 100 ul ของแตละตัวอยางทดสอบลงใน Uncoated 96-wells microtiter plate แตละหลุม ใน 

การเติมซีรั่มของตัวอยางลงไปตองเปลี่ยนทิป ทุกครั้ง 

1.4 เติม Positive Control และ Negative Control 100 ul ลงใน Uncoated 96-wells microtiter plate โดยเติม 

Negative Control หลุม A1,A2,A3 และเติม Positive Control หลุม A4,A5 ในการเติม Positive Control 

และ Negative Control ลงไปตองเปลี่ยนทิปทุกครั้ง 

1.5 ดูดปลอย Sample Diluent ที่ผสมกับซีรั่มของแตละตัวอยาง และที่ผสมกับ Positive Control, Negative 

Control ใน Uncoated 96 well microtiter plate ผสมใหเขากัน ประมาณ 10-15 ครั้ง แลวดูดไปเติมลง 

ใน IDEXX ADV Elisa Plate 100 ul โดยหลีกเลี่ยงการเกิดฟองอากาศ ตองเปลี่ยนทิป ทุกตัวอยาง 

1.6 Incubate ณ อุณหภูมิ 20 - 27 o C เปนเวลา 60 นาที หรืออุณหภูมิ 2 - 7 o C ทั้งคืน 

1.7 เทสวนที่เปนน้ําใน IDEXX ADV Elisa Plate ทิ้ง แลวลางดวย Wash solution (เตรียมจาก 10X Wash 

concentrate เจือจางดวยน้ํากลั่นในอัตราสวน 1 : 10 ใน Cylinder 500 ml เชน ใชน้ํากลั่น 450 ml 

ตอ 10X Wash Concentrate 50 ml) จํานวน 150 ul เติมลงในแตละหลุมๆ ละ 2 ครั้ง (รวมปริมาตร 

ทั้งสิ้น 300 ul ตอหลุม) หลังจากนั้นเท Wash solution ทิ้ง และตบ IDEXX ADV Elisa Plate ลงบน 

ผาสะอาด หลายๆ ครั้งจนแหง ไมมีหยดน้ําติดอยูขางใน กอนจะเติม Wash solution ใหมตามขั้นตอน 

เดิม โดยทําการลาง 3 - 5 ครั้ง 

1.8 เติม Anti–PRV-gpΙ: HRPO conjugate จํานวน 100 ul ลงใน IDEXX PRRSV ELISA Plate แตละ 

หลุม หลีกเลี่ยงการเกิดฟองอากาศ และตองเปลี่ยนทิปทุกครั้ง 

1.9 Incubate ณ อุณหภูมิ 20 - 27 o C เปนเวลา 20 นาที 

1.10 ทําการลาง IDEXX ADV Elisa Plate ตามขั้นตอนที่ 1.7 

1.11 เติม TMB Substrate จํานวน 100 ul เติมลงใน IDEXX ADV Elisa Plate โดยหลีกเลี่ยงการเกิด 

ฟองอากาศ ตองเปลี่ยนทิปทุกครั้ง 


1.13 เติม Stop solution จํานวน 50 ul ลงใน IDEXX ADV Elisa Plate โดยหลีกเลี่ยงการเกิดฟองอากาศ 

ตองเปลี่ยนทิป ทุกครั้ง 

1.14 อานคา Optical Density (OD) ของ IDEXX ADV ELISA Plate แตละหลุม ดวยเครื่อง Tecan 

Spectra Classic ELISA Plate Reader โดยใช Filter ที่มีความยาวคลื่น 650 nm

132 


2. การตรวจ PRRS (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome) โดยวิธี ELISA 

2.1 นําซีรั่มที่ตองการตรวจและชุดตรวจ ของ IDEXX PRRSV ELISA Test Kit ออกมาจากตูเย็นวางไวที่ 

อุณหภูมิหองใหมีอุณหภูมิเทากับอุณหภูมิหอง (20 - 27 o C) และทําบันทึกตําแหนงของตัวอยางที่จะทํา 

การทดสอบ 

2.2 ทําการเจือจางซีรั่มตัวอยางที่ตองการทดสอบ อัตราสวน 1:40 โดยเติม Sample Diluent Buffer 273 ul 

โดยดูด Sample Diluent Buffer เติมลงใน Uncoated 96 well microptiter plate แตละหลุมใหเทากับ 

จํานวนตัวอยางทดสอบ ทิ้ง tip ที่ใชแลวลงในกระปองทิ้ง tip ที่มีน้ําประปาผสมน้ํายาไฮเตอร 

2.3 เติม ซีรั่ม 7.0 ul ของแตละตัวอยางเติมลงใน Uncoated 96 well microptiter plate แตละหลุมตาม 

ตําแหนง ในการเติมซีรั่มของตัวอยางลงไปตองเปลี่ยนทิปทุกครั้ง 

2.4 เติม Positive Control และ Negative Control ลงไปใน IDEXX PRRSV ELISA Plate ลงในหลุม 

PRRSV และ หลุม Normal Host Cell (NHC) จํานวนหลุมละ 100 ul โดยเติม Positive Control ลงใน 

หลุม A1,A2,B1,B2 และเติม Negative Control ลงในหลุม C1,C2,D1,D2 หลีกเลี่ยงการเกิด 

ฟองอากาศ ในการเติม Positive Control และ Negative Control ลงไปตองเปลี่ยนทิปทุกครั้ง 

2.5 ดูดปลอย Sample Diluent ที่ผสมกับซีรั่มของแตละตัวอยาง ใน Uncoated 96 well microtiter plate 

ผสมใหเปนเขากัน ประมาณ 10-15 ครั้ง แลวจึงดูดไปเติมลงใน IDEXX PRRSV ELISA Plate ลงใน 

หลุม PRRSV และ หลุม Normal Host Cell (NHC) หลุมละ 100 ul โดยหลีกเลี่ยงการเกิดฟองอากาศ 

และตองเปลี่ยนทิปทุกครั้ง สวนทิปที่ใชแลวทิ้งลงในกระปองทิ้งทิป 


2.7 เทสวนที่เปนน้ําใน IDEXX PRRSV Elisa Plate ทิ้ง แลวลางดวย Wash solution (เตรียมจาก 10X 

Wash concentrate เจือจางดวยน้ํากลั่นในอัตราสวน 1 : 10 ใน Cylinder 500 ml เชน ใชน้ํากลั่น 450 

ml ตอ 10X Wash Concentrate 50 ml) จํานวน 150 ul เติมลงในแตละหลุมๆ ละ 2 ครั้ง (รวม 

ปริมาตรทั้งสิ้น 300 ul ตอหลุม) หลังจากนั้นเท Wash solution ทิ้ง และตบ IDEXX PRRSV Elisa 

Plate ลงบนผาสะอาด หลายๆ ครั้งจนแหง ไมมีหยดน้ําติดอยูขางใน กอนจะเติม Wash solution ใหม 

ตามขั้นตอนเดิม โดยทําการลาง 3 - 5 ครั้ง และหลีกเลี่ยงไมให IDEXX ADV Elisa Plate แหง 

ระหวางรอขั้นตอนตอไป 

2.8 เติม Anti–Porcine: HRPO conjugate จํานวน 100 ul ลงใน IDEXX PRRSV ELISA Plate หลีกเลี่ยง 

การเกิดฟองอากาศ และตองเปลี่ยนทิปทุกครั้ง 


2.10 ทําการลาง IDEXX PRRSV Elisa Plate ตามขั้นตอนที่ 1.7 

2.11 เติม TMB Substrateจํานวน 100 ul ลงใน IDEXX PRRSV ELISA Plate หลีกเลี่ยงการเกิดฟองอากาศ 

และตองเปลี่ยนทิปทุกครั้ง 


2.13 เติม Stop solution จํานวน 100 ul ลงใน IDEXX PRRSV ELISA Plate หลีกเลี่ยงการเกิดฟองอากาศ 

และตองเปลี่ยนทิปทุกครั้ง สวนทิปที่ใชแลวทิ้งลงในกระปองทิ้งทิป 

2.14 อานคา Optical Density (OD) ของ IDEXX PRRSV ELISA Plate แตละหลุม ดวยเครื่อง Tecan 


133 


3. การตรวจ M.hyo (Mycoplasma hyopneumoniae) โดยวิธี ELISA 

3.1 นําซีรั่มที่ตองการตรวจและชุดตรวจ ของ IDEXX M.hyo ELISA Test Kit ออกมาจากตูเย็นวางไวที่ 

อุณหภูมิหอง (20 - 27 o C) ) และทําบันทึกตําแหนงของตัวอยางที่จะทําการทดสอบ 

3.2 ทําการเจือจางซีรั่มตัวอยางที่ตองการทดสอบ อัตราสวน 1:40 โดยเติม Sample Diluent Buffer 234 ul 

ลงใน Uncoated 96 well microptiter plate แตละหลุมใหเทากับจํานวนตัวอยางทดสอบ ทิ้ง tip ที่ใช 

แลวลงในกระปองทิ้ง tip ที่มีน้ําประปาผสมน้ํายาไฮเตอร 

3.3 เติม ซีรั่ม 6.0 ul ของแตละตัวอยางลงแตละหลุมตามตําแหนง ในการเติมซีรั่มของตัวอยางลงไปตอง 

เปลี่ยนทิปทุกครั้ง 

3.4 เติม Negative Control และ Positive Control ลงไปใน IDEXX M.hyo ELISA Test Kit หลุม A1, B1 

และ C1, D1 จํานวน 100 ul หลีกเลี่ยงการเกิดฟองอากาศ ในการเติม Positive Control และ Negative 

Control ลงไปตองเปลี่ยนทิปทุกครั้งในแตละหลุม 

3.5 ดูดปลอย Sample Diluent ที่ผสมกับซีรั่มของแตละตัวอยาง ใน Uncoated 96 well microtiter plate 

ผสมใหเปนเขากัน ประมาณ 10-15 แลวจึงดูดไปเติมลงใน IDEXX M.hyo ELISA Test Kit ละ 100 

ul โดยหลีกเลี่ยงการเกิดฟองอากาศ และตองเปลี่ยนทิปทุกครั้ง 


3.7 เทสวนที่เปนน้ําใน IDEXX M.hyo ELISA Test Kit ทิ้ง แลวลางดวย Wash solution (เตรียมจาก 10X 


ml ตอ 10X Wash Concentrate 50 ml) จํานวน 150 ul เติมลงในแตละหลุมๆ ละ 2 ครั้ง (รวม 

ปริมาตรทั้งสิ้น 300 ul ตอหลุม) หลังจากนั้นเท Wash solution ทิ้ง และตบ IDEXX M.hyo ELISA 

Plate ลงบนผาสะอาด หลายๆ ครั้งจนแหง ไมมีหยดน้ําติดอยูขางใน กอนจะเติม Wash solution ใหม 

ตามขั้นตอนเดิม โดยทําการลาง 3 - 5 ครั้ง และหลีกเลี่ยงไมให IDEXX M.hyo ELISA Test Kit แหง 

ระหวางรอขั้นตอนตอไป 

3.8 เติม Anti–Porcine: HRPO conjugate โดยใช Multichannel Autopipette ขนาด 25 – 200 ul พรอม 

ทิป ขนาด 10 – 250 ul จํานวน 100 ul จาก Reagent reservior ไปปลอยลงใน IDEXX M.hyo ELISA 

Test Kit หลีกเลี่ยงการเกิดฟองอากาศ และตองเปลี่ยนทิปทุกครั้ง สวนทิปที่ใชแลวทิ้งลงในกระปอง 

ทิ้งทิป 


3.10 ทําการลาง IDEXX M.hyo Elisa Plate ตามขั้นตอนที่ 3.7 

3.11 เติม TMB Substrate จํานวน 100 ul ลงใน IDEXX M.hyo ELISA Test Kit หลีกเลี่ยงการเกิด 

ฟองอากาศ และตองเปลี่ยนทิปทุกครั้ง 


3.13 เติม Stop solution จํานวน 100 ul ลงใน IDEXX M.hyo ELISA Test Kit หลีกเลี่ยงการเกิด 

ฟองอากาศ และตองเปลี่ยนทิปทุกครั้ง สวนทิปที่ใชแลวทิ้งลงในกระปองทิ้งทิป 

2.15 อานคา Optical Density (OD) ของ IDEXX M.hyo ELISA Test Kit แตละหลุม ดวยเครื่อง Tecan 


134 


4. การตรวจ APP (Actinobacillus pseudopneumoniae) โดยวิธี ELISA 

4.1 นําตัวอยางซีรั่มที่ตองการตรวจและชุดตรวจ CHECKIT-APP-ApxIV EIA Kit ออกมาจากตูเย็นวางไวที่ 

อุณหภูมิหอง และทําบันทึกตําแหนงของตัวอยางที่จะทําการทดสอบ 

4.2 เจือจางตัวอยางซีรั่มที่ตองการทดสอบ อัตราสวน 1:10 โดยเติม sample diluent 90 ul ลงใน APP- 

ApxIv Microtiter plate แตละหลุมใหเทากับจํานวนตัวอยางทดสอบ และทิ้ง tip ที่ใชแลวลงใน 

กระปองทิ้ง tip ที่มีน้ําประปาผสมน้ํายาไฮเตอร 

4.3 เติม APP-ApxIV-Control-Serum(Positive และ Negative) จํานวน 10 ul โดยเติม Negative Control ลง 

ในหลุม A1,B1 และเติม Positive Control ลงในหลุม C1,D1 และตัวอยางซีรั่ม 10 ulลงในแตละหลุม 

ตามตําแหนง ในการเติมซีรั่มของตัวอยางลงไปตองเปลี่ยนทิปทุกครั้ง 

4.4 Incubate ในสภาวะชื้น ณ อุณหภูมิ 37 o C (+ 2 o C) เปนเวลา 60 นาที ( + 5 นาที) หรืออาจสามารถ 

incubate ในชวงอุณหภูมิ 2- 8 o C เปนเวลา 14 -18 ชั่วโมง 

4.5 เทสวนที่เปนของเหลวใน APP-ApxIV Microtiter plate ทิ้ง แลวลางดวย Washing solution (เตรียม 

จาก 10X concentrate เจือจางดวยน้ํากลั่นในอัตราสวน 1 : 10 เชน ใชน้ํากลั่น 180 ml ตอ 10X 

Concentrate 20 ml ) จํานวน 150 ul เติมลงในแตละหลุมๆ ละ 2 ครั้ง (รวมปริมาตรทั้งสิ้น 300 ul ตอ 

หลุม) แลวเทออก ในการเติมแตละหลุม หลีกเลี่ยงไมใหปลายทิปสัมผัสกนหลุม รวมทั้งการเกิด 

ฟองอากาศ และทิ้งทิปที่ใชแลวลงในกระปองทิ้งทิป ทําการลาง 3 - 5 ครั้ง ตามขั้นตอนเดิม โดยครั้ง 

สุดทายตบ APP-ApxIV Microtiter plate หลายๆ ครั้งกับผาสะอาด จนแหง ไมมีหยดน้ําติดอยูขางใน 

4.6 เติม Anti-Swine-IgG-PO-Conjugate จํานวน 100 ul ลงใน APP-ApxIV Microtiter plate หลีกเลี่ยง 

การเกิดฟองอากาศ และ ทิปที่ใชแลวทิ้งลงในกระปองทิ้งทิป 

4.7 Incubateในสภาวะชื้น ณ อุณหภูมิ 37 o C (+ 2 o C ) เปนเวลา 60 นาที ( + 5 นาที) 

4.8 ทําการลาง APP-ApxIV Microtiter plate ตามขั้นตอนขอ 4.5 

4.9 เติม TMB-Substrate solution จํานวน 100 ul ลงใน APP-ApxIV Microtiter plate หลีกเลี่ยงการเกิด 

ฟองอากาศ และ ทิปที่ใชแลวทิ้งลงในกระปองทิ้งทิป 

4.10 Incubate ณ อุณหภูมิ 25 o C เปนเวลา 15 นาที ( + 5 นาที) 

4.11 เติม Stop TMB solution จํานวน 100 ul ลงใน APP-ApxIV Microtiter plate หลีกเลี่ยงการเกิด 

ฟองอากาศ และทิปที่ใชแลวทิ้งลงในกระปองทิ้งทิป 

4.12 อานคาดวยเครื่อง Tecan Spectra Classic Elisa Reader ที่ Optical Density 450 nm

135 


5. การตรวจ IBV (Infectious Bronchitis Virus) โดยวิธี ELISA 

5.1 นําซีรั่มที่ตองการตรวจและชุดตรวจ CHECKIT-APP-ApxIV EIA Kit IBV antigen coated plate, 

IBV positive control serum, Normal control serum และ Dilution buffer ออกมาจากตูเย็นวางไวที่ 

อุณหภูมิหองใหมีอุณหภูมิเทากับอุณหภูมิหอง หากในการตรวจวิเคราะหมีจํานวนตัวอยางรวมทั้ง 

control serum ไมครบ 96 หลุม ใหใชกระดาษกาวปดทับหลุมที่ไมไดใชงานเพื่อไมใหของเหลว หรือ 

เกิดความชื้นภายในหลุมนั้น 

5.2 ทําการเจือจางซีรั่มตัวอยางที่ตองการทดสอบ และ control serum ( Normal serum, positive control) 

อัตราสวน 1:50 โดยเติม Dilution Buffer 300 ul โดยใช Autopipette ขนาด 100 -1,000 ul และ tip 

ขนาด 100 – 1,000 ul ดูด Dilution buffer ที่เทลง ใน Reagent reservior ตามปริมาตรที่จะใชงาน 

ปลอยลงใน Uncoated 96 well plate แตละหลุมใหเทากับจํานวนตัวอยางทดสอบ และทิ้ง tip ที่ใชแลว 

ลงในกระปองทิ้ง tip ที่มีน้ําประปา ถาเกิดการผิดพลาดในขั้นตอนนี้ หรือขั้นตอนใดๆ ตอจากนี้ การ 

แกไขโดยตองไปเริ่มทําที่ขั้นตอน ขอ 5.2 ใหม 

ตัวอยางความผิดพลาด เชน มีฟองอากาศใน Pipette tip, ระยะเวลาในการ Incubate Plate มากกวาหรือ 

นอยกวา, อุณหภูมิในการ Incubate Plate สูงกวาหรือต่ํากวา, สับสนกับจํานวนตัวอยางซีรั่มหรือ 

จํานวนหลุมตัวอยาง เปนตน 

5.3 เติม ซีรั่ม 6.0 ul ของแตละตัวอยางลงแตละหลุมของ Uncoated 96 well microtiter plate โดยใช 

Autopipette ขนาด 0.5 – 10.0 ul พรอมทิป ขนาด 1.0 -10.0 ul ในการเติมซีรั่มของตัวอยางลงไปตอง 

เปลี่ยนทิปทุกครั้ง และทิ้งทิปที่ใชแลวลงในกระปองทิ้งทิป ที่มีน้ําประปา 

ซีรั่มตัวอยางที่เจือจางไวตามขั้นตอนนี้ ควรรอทิ้งไวไมต่ํากวา 5 นาทีกอนจะเติมลงใน IBV antigen 

coated plate ตามขั้นตอนที่ 5.5 โดยสามารถใชตรวจวิเคราะหตามวิธีการนี้ ภายใน 24 ชั่วโมง 

ตัวอยางซีรั่มที่เหลือจากการตรวจวิเคราะห จะนําไปเก็บที่ตูเย็น –20 o C ประมาณ 1 ป 

5.4 เติม Dilution buffer 50 ul ลงใน IBV antigen coated plate ในแตละหลุมที่จะตรวจวิเคราะห โดยใช 

Multichannel autopipette ขนาด 50 -200 ul และ tip ขนาด 10 – 250 ul ดูด Dilution buffer ที่เทลง 

ใน Reagent reservior ตามปริมาตรที่จะใชงาน และทิ้ง tip ที่ใชแลวลงในกระปองทิ้ง tip ที่มีน้ําประปา 

5.5 เติม Positive control serum ที่เจือจางแลว ลงไปใน IBV antigen coated plate ลงในหลุม A1, A3, H11 

และ เติม Normal control serum ลงในหลุม A2, H10, H12 จํานวนหลุมละ 50 ul โดยใช Autopipette 

ขนาด 10 - 100 ul พรอมทิป ขนาด 10 - 250 ul หลีกเลี่ยงการเกิดฟองอากาศ ในการเติม Positive 

Control และ Negative Control serum ลงไปตองเปลี่ยนทิปทุกครั้ง และทิ้งทิปที่ใชแลวลงในกระปอง 

ทิ้งทิป 

ตําแหนงหลุมการเติม Positive control และ Normal control serum ที่ไดระบุตามขั้นตอนที่ 5.5 นี้ อาจ 

เปลี่ยนแปลงไดตามความเหมาะสม หากมีจํานวนซีรั่มตัวอยางไมครบทั้งเพลท 

5.5 ดูด-ปลอยซีรั่มแตละตัวอยาง ใน Uncoated 96 well microtiter plate ที่เจือจางแลว ประมาณ 10-15 ครั้ง 

โดยใช Multichannel Autopipette ขนาด 25 - 200 ul พรอมทิป ขนาด 10 - 250 ml แลวจึงดูดยายไป 

ปลอยลงใน MG antigen coated plate หลุมละ 50 ul โดยหลีกเลี่ยงการเกิดฟองอากาศ และตองเปลี่ยน 

ทิปทุกครั้ง สวนทิปที่ใชแลวทิ้งลงในกระปองทิ้งทิปที่มีน้ําประปา ในขั้นตอนนี้ควรกระทําโดยใชเวลา 

ใหนอยที่สุด

136 



5.7 เคาะเทสวนที่เปนน้ําใน IBV antigen coated plate ทิ้ง แลวลางดวย Wash solution (เตรียมจาก 20X 


ml ตอ 20X Wash Concentrate 20 ml ซึ่งเปนปริมาตรเพียงพอสําหรับ 96 well test plate 1 เพลท) โดย 

ใช Multichannel autopipette ขนาด 50 – 250 ul พรอมทิป ขนาด 10 – 250 ul ดูด Wash solution 

จํานวน 150 ul เติมลงในแตละหลุมๆ ละ 2 ครั้ง (รวมปริมาตรทั้งสิ้น 300 ul ตอหลุม) ให Wash 

solution แชใน IBV antigen coated plate แตละหลุมเปนเวลา 3 นาที หลังจากนั้นเท Wash solution 

ทิ้ง และตบ IBV antigen coated plate ลงบนผาสะอาด หลายๆ ครั้งจนแหง ไมมีหยดน้ําติดอยูขางใน 

กอนจะเติม Wash solution ใหมตามขั้นตอนเดิม โดยทําการลาง 3 - 5 ครั้ง 

5.8 เติม Diluted Goat anti-Chicken IgG PO conjugate solution โดยใช Multichannel Autopipette ขนาด 

25 – 200 ul พรอม ทิป ขนาด 10 – 250 ul จํานวน 100 ul ไปปลอยลงใน IBV antigen coated plate 

(Diluted Goat anti-Chicken IgG PO conjugate solution เตรียมจาก Goat anti-Chicken IgG PO 

conjugate solution (stock) 100 ul เจือจางดวย Dilution Buffer 10 ml ใน Reagent reservior ซึ่งเปน 

ปริมาตรที่เพียงพอใชสําหรับ 96 well test plate 1 เพลท) 


5.10 เคาะเทสวนที่เปนน้ําใน IBV antigen coated plate ทิ้ง แลวทําการลางเพลทตามขั้นตอนขอที่ 5.7 

5.11 เติม ABTS Hydrogen PO substrate solution จํานวน 100 ul โดยใช Multichannel Autopipette ขนาด 

25 – 200 ul พรอมทิป ขนาด 10 – 250 ul ดูด ABTS Hydrogen PO substrate solution จาก Reagent 

reservior ไปปลอยลงใน IBV antigen coated plate แตละหลุม หลีกเลี่ยงการเกิดฟองอากาศ และทิปที่ 

ใชแลวทิ้งลงในกระปองทิ้งทิปที่มีน้ําประปา 


5.13 เติม Diluted Stop solution จํานวน 100 ul โดยใช Multichannel Autopipette ขนาด 50 – 250 ul 

พรอมทิป ขนาด 10 – 250 ul ดูด Stop solution จาก Reagent reservior ไปปลอยลงใน IBV antigen 

coated plate แตละหลุม (Diluted Stop solution เตรียมจาก 5X Stop solution 2.5 ml ผสมดวย RO 

water 10 ml ใน Reagent reservior ซึ่งเปนปริมาตรที่เพียงพอใชสําหรับ 96 well test plate 1 เพลท) 

หลีกเลี่ยงการเกิดฟองอากาศ และทิ้งทิปที่ใชแลวทิ้งลงในกระปองทิ้งทิป 

อนึ่ง 5X Stop solution ควรนํามาวาง ณ อุณหภูมิหอง หรือ ที่ 37C กอนนําไปเจือจาง 

5.14 อานคา Optical Density (OD) ของ IBV antigen coated plate แตละหลุม ดวยเครื่อง Tecan Spectra 

Classic ELISA Plate Reader โดยใช Filter ที่มีความยาวคลื่น 405 – 410 nm

137 


6. การตรวจ IBD (Infectious Bursal Disease) โดยวิธี ELISA 

6.1 นําซีรั่มที่ตองการตรวจ IBD antigen coated plate, IBD positive control serum, Normal control 

serum และ Dilution buffer ออกมาจากตูเย็นวางไวที่อุณหภูมิหองใหมีอุณหภูมิเทากับอุณหภูมิหอง 

หากในการตรวจวิเคราะหมีจํานวนตัวอยางรวมทั้ง control serum ไมครบ 96 หลุม ใหใชกระดาษกาว 

ปดทับหลุมที่ไมไดใชงานเพื่อไมใหของเหลว หรือเกิดความชื้นภายในหลุมนั้น 




ปลอยลงใน Uncoated 96 well microtiter plate แตละหลุมใหเทากับจํานวนตัวอยางทดสอบ และทิ้ง 

tip ที่ใชแลวลงในกระปองทิ้ง tip ที่มีน้ําประปา ถาเกิดการผิดพลาดในขั้นตอนนี้ หรือขั้นตอนใดๆ ตอ 

จากนี้ การแกไขโดยตองไปเริ่มทําที่ขั้นตอน ขอ 5.2 ใหม 




6.3 เติม ซีรั่ม 6.0 ul ของแตละตัวอยางลงแตละหลุมของ Uncoated 96 well microtiter plate โดยใช 

Autopipette ขนาด 0.5 – 10.0 ul พรอมทิป ขนาด 1.0 -10.0 ul ในการเติมซีรั่มของตัวอยางลงไปตอง 

เปลี่ยนทิปทุกครั้ง และทิ้งทิปที่ใชแลวลงในกระปองทิ้งทิป ที่มีน้ําประปา 

ซีรั่มตัวอยางที่เจือจางไวตามขั้นตอนนี้ ควรรอทิ้งไวไมต่ํากวา 5 นาทีกอนจะเติมลงใน IBD antigen 

coated plate ตามขั้นตอนที่ 6.5 โดยสามารถใชตรวจวิเคราะหตามวิธีการนี้ ภายใน 24 ชั่วโมง 

ตัวอยางซีรั่มที่เหลือจากการตรวจวิเคราะห จะนําไปเก็บที่ตูเย็น –20 o C ประมาณ 1 ป 

6.4 เติม Dilution buf fer 50 ul ลงใน IBD antigen coated plate ในแตละหลุมที่จะตรวจวิเคราะห โดยใช 



ถาเกิดการผิดพลาดในขั้นตอนนี้ หรือขั้นตอนใดๆ ตอจากนี้ การแกไขโดยตองไปเริ่มทําที่ขั้นตอน ขอ 

5.1 และ 5.4 ใหม 

6.5 เติม Positive control ที่เจือจางแลว ลงไปใน IBD antigen coated plate ลงในหลุม A1, A3, H11 และ 

เติม Normal control serum ลงในหลุม A2, H10, H12 จํานวนหลุมละ 50 ul โดยใช Autopipette 


Control และ Negative Control ลงไปตองเปลี่ยนทิปทุกครั้ง และทิ้งทิปที่ใชแลวลงในกระปองทิ้งทิป 



ปลอยลงใน IBD antigen coated plate หลุมละ 50 ul โดยหลีกเลี่ยงการเกิดฟองอากาศ และตองเปลี่ยน 

ทิปทุกครั้ง สวนทิปที่ใชแลวทิ้งลงในกระปองทิ้งทิปที่มีน้ําประปา ในขั้นตอนนี้ควรกระทําโดยใชเวลา 

ใหนอยที่สุด 

ถาเกิดการผิดพลาดในขั้นตอนนี้ การแกไขโดยตองไปเริ่มทําที่ขั้นตอน ขอ 5.1 ใหม 

6.7 Incubate ณ อุณหภูมิ 21- 24 o C เปนเวลา 30 นาที

138 


6.8 เคาะเทสวนที่เปนน้ําใน IBD antigen coated plate ทิ้ง แลวลางดวย Wash solution (เตรียมจาก 20X 


ml ตอ 20X Wash Concentrate 20 ml ซึ่งเปนปริมาตรเพียงพอสําหรับ 96 well test plate 1 เพลท) โดย 

ใช Multichannel autopipette ขนาด 50 – 250 ul พรอมทิป ขนาด 10 – 250 ul ดูด Wash solution 

จํานวน 150 ul เติมลงในแตละหลุมๆ ละ 2 ครั้ง (รวมปริมาตรทั้งสิ้น 300 ul ตอหลุม) ให Wash 

solution แชใน IBD antigen coated plate แตละหลุมเปนเวลา 3 นาที หลังจากนั้นเท Wash solution 

ทิ้ง และตบ IBD antigen coated plate ลงบนผาสะอาด หลายๆ ครั้งจนแหง ไมมีหยดน้ําติดอยูขางใน 

กอนจะเติม Wash solution ใหมตามขั้นตอนเดิม โดยทําการลาง 3 - 5 ครั้ง ทิปที่ใชแลวทิ้งลงใน 

กระปองที่ใสน้ําประปาไว 


50 – 250 ul พรอม ทิป ขนาด 10 – 250 ul จํานวน 100 ul ไปปลอยลงใน IBD antigen coated plate 



ปริมาตรที่เพียงพอใชสําหรับ 96 well test plate 1 เพลท) ในการเติมฯ หลีกเลี่ยงการเกิดฟองอากาศ 

และ สวนทิปที่ใชแลวทิ้งลงในกระปองทิ้งทิปที่มีน้ําประปา 


6.11 เคาะเทสวนที่เปนน้ําใน IBD antigen coated plate ทิ้ง แลวทําการลางเพลทตามขั้นตอนขอที่ 6.8 โดย 

ทําการลาง 3 - 5 ครั้ง ทิปที่ใชแลวทิ้งลงในกระปองที่ใสน้ําประปาไว 

6. 12 เติม ABTS Hydrogen PO substrate solution จํานวน 100 ul โดยใช Multichannel Autopipette 

ขนาด 50 – 200 ul พรอมทิป ขนาด 10 – 250 ul ดูด ABTS Hydrogen PO substrate solution จาก 

Reagent reservior ไปปลอยลงใน IBD antigen coated plate แตละหลุม หลีกเลี่ยงการเกิดฟองอากาศ 

และทิปที่ใชแลวทิ้งลงในกระปองทิ้งทิปที่มีน้ําประปา 



พรอมทิป ขนาด 10 – 250 ul ดูด Stop solutionจาก Reagent reservior ไปปลอยลงใน MG antigen 




อนึ่ง 5X Stop solution ควรนํามาวาง ณ อุณหภูมิหอง หรือ ที่ 37 o C กอนเจือจาง 



139 


7. การตรวจ MG (Mycoplasma gallisepticum) โดยวิธี ELISA 

7.1 นําซีรั่มที่ตองการตรวจ MG antigen coated plate, MG positive control serum, Normal control 

serum และ Dilution buffer ออกมาจากตูเย็นวางไวที่อุณหภูมิหองใหมีอุณหภูมิเทากับอุณหภูมิหอง 

หากในการตรวจวิเคราะหมีจํานวนตัวอยางรวมทั้ง control serum ไมครบ 96 หลุม ใหใชกระดาษกาว 

ปดทับหลุมที่ไมไดใชงานเพื่อไมใหของเหลว หรือเกิดความชื้นภายในหลุมนั้น 




ปลอยลงใน Uncoated 96 well plate แตละหลุมใหเทากับจํานวนตัวอยางทดสอบ และทิ้ง tip ที่ใชแลว 

ลงในกระปองทิ้ง tip ที่มีน้ําประปา ถาเกิดการผิดพลาดในขั้นตอนนี้ หรือขั้นตอนใดๆ ตอจากนี้ การ 

แกไขโดยตองไปเริ่มทําที่ขั้นตอน ขอ 5.2 ใหม 




7.3 เติม ซีรั่ม 6.0 ul ของแตละตัวอยางลงแตละหลุมของ Uncoated 96 well plate โดยใช Autopipette 

ขนาด 0.5 – 10.0 ul พรอมทิป ขนาด 1.0 -10.0 ul ในการเติมซีรั่มของตัวอยางลงไปตองเปลี่ยนทิปทุก 

ครั้ง และทิ้งทิปที่ใชแลวลงในกระปองทิ้งทิป ที่มีน้ําประปา ซีรั่มตัวอยางที่เจือจางไวตามขั้นตอนนี้ 

ควรรอทิ้งไวไมต่ํากวา 5 นาทีกอนจะเติมลงใน MG antigen coated plate ตามขั้นตอนที่ 7.5 โดย 

สามารถใชตรวจวิเคราะหตามวิธีการนี้ ภายใน 24 ชั่วโมง 

ตัวอยางซีรั่มที่เหลือจากการตรวจวิเคราะห จะนําไปเก็บที่ตูเย็น –20 องศาเซลเซียส ประมาณ 1 ป 

7.4 เติม Dilution buffer 50 ul ลงใน MG antigen coated plate ในแตละหลุมที่จะตรวจวิเคราะห โดยใช 




5.1 และ 5.4 ใหม 

7.5 เติม Positive control ที่เจือจางแลว ลงไปใน MG antigen coated plate ลงในหลุม A1, A3, H11 และ 

เติม Normal control serum ลงในหลุม A2, H10, H12 จํานวนหลุมละ 50 ul โดยใช Autopipette 


Control และ Negative Control ลงไปตองเปลี่ยนทิปทุกครั้ง และทิ้งทิปที่ใชแลวลงในกระปองทิ้งทิป 



ปลอยลงใน MG antigen coated plate หลุมละ 50 ul โดยหลีกเลี่ยงการเกิดฟองอากาศ และตองเปลี่ยน 

ทิปทุกครั้ง สวนทิปที่ใชแลวทิ้งลงในกระปองทิ้งทิปที ่มีน้ําประปา ในขั้นตอนนี้ควรกระทําโดยใชเวลา 

ใหนอยที่สุด 

ถาเกิดการผิดพลาดในขั้นตอนนี้ การแกไขโดยตองไปเริ่มทําที่ขั้นตอน ขอ 5.1 ใหม 

7.7 Incubate ณ อุณหภูมิ 18 - 25 o C เปนเวลา 30 นาที

140 


7.8 เทสวนที่เปนน้ําใน MG antigen coated plate ทิ้ง แลวลางดวย Wash solution (เตรียมจาก 20X Wash 

concentrate เจือจางดวยน้ํากลั่นในอัตราสวน 1 : 20 ใน Cylinder 500 ml เชน ใชน้ํากลั่น 380 ml ตอ 

20X Wash Concentrate 20 ml ซึ่งเปนปริมาตรเพียงพอสําหรับ 96 well test plate 1 เพลท) โดยใช 

Multichannel autopipette ขนาด 25 – 200 ul พรอมทิป ขนาด 10 – 250 ul ดูด Wash solution 

จํานวน 150 ul เติมลงในแตละหลุมๆ ละ 2 ครั้ง (รวมปริมาตรทั้งสิ้น 300 ul ตอหลุม) และทิ้งทิปที่ 

ใชแลวลงในกระปองทิ้งทิป ทําการลาง 3 - 5 ครั้ง ตามขั้นตอนเดิม ครั้งสุดทายตบ MG antigen 

coated plate หลายๆ ครั้งกับผาสะอาด จนแหง ไมมีหยดน้ําติดอยูขางใน 


50 – 250 ul พรอม ทิป ขนาด 10 – 250 ul จํานวน 100 ul ไปปลอยลงใน MG antigen coated plate 



ปริมาตรที่เพียงพอใชสําหรับ 96 well test plate 1 เพลท) ในการเติมฯ หลีกเลี่ยงการเกิดฟองอากาศ 

และ สวนทิปที่ใชแลวทิ้งลงในกระปองทิ้งทิปที่มีน้ําประปา 


7.11 เทสวนที่เปนน้ําใน MG antigen coated plate ทิ้ง แลวทําการลางเพลทตามขั้นตอนขอ 7.8 

7.12 เติม ABTS Hydrogen PO substrate solution จํานวน 100 ul โดยใช Multichannel Autopipette 

ขนาด 50 – 200 ul พรอมทิป ขนาด 10 – 250 ul ดูด ABTS Hydrogen PO substrate solution จาก 

Reagent reservior ไปปลอยลงใน MG antigen coated plate แตละหลุม หลีกเลี่ยงการเกิดฟองอากาศ 

และทิปที่ใชแลวทิ้งลงในกระปองทิ้งทิปที่มีน้ําประปา 



พรอมทิป ขนาด 10 – 250 ul ดูด Stop solutionจาก Reagent reservior ไปปลอยลงใน MG antigen 




อนึ่ง 5X Stop solution ควรนํามาวาง ณ อุณหภูมิหอง หรือ ที่ 37 o C กอนเจือจาง 



141 


8. การตรวจ CSFV (Classical Swine Fever Virus) โดยวิธี ELISA 

8.1 นําตัวอยางซีรั่มที่ตองการตรวจและชุดตรวจ CSF-SERO EIA Kit ออกมาจากตูเย็นวางไวที่ 

อุณหภูมิหองใหมีอุณหภูมิเทากับอุณหภูมิหอง( 18 – 25 o C) 

8.2 เจือจางตัวอยางซีรั่มที่ตองการทดสอบ อัตราสวน 1:2 โดยเติม sample diluent 50 ul โดยใช 

Multichannel autopipette ขนาด 25 -200 ul และ tip ขนาด 10 – 250 ul ดูด sample diluent จาก 

Reagent Reservior ลงใน CSF-SERO-Microtiter plate แตละหลุมใหเทากับจํานวนตัวอยางทดสอบ 

และทิ้ง tip ที่ใชแลวลงในกระปองทิ้ง tip ที่มีน้ําประปา ถาเกิดการผิดพลาดในขั้นตอนนี้ การแกไข 

โดยตองไปเริ่มทําที่ขั้นตอน ขอ 5.2 ใหม 




8.3 เติม CSF-SERO-Control-Serum (Positive และ Negative) และตัวอยางซีรั่ม 50 ul ลงแตละหลุม โดย 

ใช Autopipette ขนาด 10 - 100 ul พรอมทิป ขนาด 10 - 250 ul ในการเติมซีรั่มของตัวอยางลงไปตอง 

เปลี่ยนทิปทุกครั้ง หลีกเลี่ยงการเกิดฟองอากาศ และทิ้งทิปที่ใชแลวลงในกระปองทิ้งทิปที่มีน้ําประปา 

8.4 Incubate ในสภาวะชื้น ณ อุณหภูมิ 18 – 25 o C เปนเวลา 120 นาที ( + 5 นาที) หรืออาจสามารถ 

incubate ในชวงอุณหภูมิ 2- 8 o C เปนเวลา 14 -18 ชั่วโมง 

8.5 เคาะเทสวนที่เปนของเหลวใน CSF-SERO-microtiter plate ทิ้ง แลวลางดวย Washing solution 

(เตรียมจาก 10X concentrate เจือจางดวยน้ํากลั่นในอัตราสวน 1 : 10 ( เชน ใชน้ํากลั่น 450 ml ตอ 

10X Concentrate 50 ml) โดยใช Multichannel autopipette ขนาด 25 – 200 ul พรอมทิป ขนาด 10 – 

250 ul ดูด Washing solution จํานวน 150 ul เติมลงในแตละหลุมๆ ละ 2 ครั้ง (รวมปริมาตรทั้งสิ้น 

300 ul ตอหลุม) แลว Washing solution เทออก ในการเติมแตละหลุม หลีกเลี่ยงไมใหปลายทิปสัมผัส 

กนหลุม รวมทั้งการเกิดฟองอากาศ และทิ้งทิปที่ใชแลวลงในกระปองทิ้งทิปที่มีน้ําประปา 

ทําการลาง 3 - 5 ครั้ง ตามขั้นตอนเดิม โดยครั้งสุดทายตบ CSF-SERO-microtiter plate หลายๆ ครั้ง 

กับผาสะอาด จนแหง ไมมีหยดน้ําติดอยูขางใน 

8.6 เติม Anti-CSF-SERO-PO-Conjugate โดยใช Multichannel Autopipette ขนาด 25 – 200 ul พรอม ทิป 

ขนาด 10 – 250 ul จํานวน 100 ul ไปปลอยลงใน CSF-SERO-microtiter plate หลีกเลี่ยงการเกิด 

ฟองอากาศ และ ทิปที่ใชแลวทิ้งลงในกระปองทิ้งทิปที่มีน้ําประปา 


5.2 ใหม 

8.7 Incubateในสภาวะชื้น ณ อุณหภูมิ 18 – 25 o C เปนเวลา 20 นาที 

8.8 เทสวนที่เปนของเหลวใน CSF-SERO-microtiter plate ทิ้ง แลวทําการลางเพลทตามขั้นตอนที่ 8.5 

8.9 เติม TMB-Substrate solution โดยใช Multichannel Autopipette ขนาด 25 – 200 ul พรอมทิป ขนาด 10 

– 250 ul ดูด TMB Substrate จํานวน 100 ul ไปปลอยลงใน CSF-SERO-microtiter plate หลีกเลี่ยง 

การเกิดฟองอากาศ และ ทิปที่ใชแลวทิ้งลงในกระปองทิ้งทิปที่มีน้ําประปา 

8.10 Incubate ณ อุณหภูมิ 18 – 25 o C เปนเวลา 10 นาที ในที่มืด

142 


8.11 เติม Stopping solution จํานวน 50 ul โดยใช Multichannel Autopipette ขนาด 25 – 200 ul พรอมทิป 

ขนาด 10 – 250 ul ดูด Stop solution ไปปลอยลงใน CSF-SERO-microtiter plate หลีกเลี่ยงการเกิด 

ฟองอากาศ และทิปที่ใชแลวทิ้งลงในกระปองทิ้งทิป 

8.12 อานคา Optical Density ดวยเครื่อง Tecan Spectra Classic ELISA Plate Reader ที่ความยาวคลื่น 

450 nm 

9. การตรวจ EIA (Equine Infectious Anemia) โดยวิธี Agar Gel Immunodiffusion 

สารเคมีประกอบดวย 

Idexx Equine Infectious Anemia Antigen 

Idexx Equine Infectious Anemia Positive control 

Noble agar (Difgo) 

Buffer (Boric acid + Sodium Hydroxide) 

Boric acid (H 3 BO 3 ) 

Sodium Hydroxide (NaOH) 

การเตรียม Buffer 

1. ผสม Sodium Hydroxide (NaOH) 2 g และ Boric acid (H 3 BO 3 ) 9 g ในน้ํากลั่น 1 Litre 

2. ปรับคาความเปนกรดดาง ใหมี pH 8.5 - 8.7 

การเตรียม AGID plate (1% Nobel agar) 

1. ชั่ง Nobel Agar 0.5 g บนเครื่องชั่ง 2 ตําแหนงขึ้นไป โดยตักลงบนกระดาษสะอาด แลวเทสารลงใน 

Erlernmayer Flask ขนาด 100 ml 

2. เท Buffer ลงใน cylinder 100 ml ในปริมาตร 50 ml แลวเทลงใน Erlernmayer Flask ที่มี Nobel agar 

3. อุน Nobel Agar บน Hot plate Stirrer โดยใส magnetic stirrer 1 อัน ตั้งอุนประมาณ 7 นาที หรือ 

จนกระทั่งสารละลายใส 

4. เทสารละลายลงใน100 mm diameter petri dish 15 ml โดยใช glass pipette 20-25 ml และ pipette 

controller 

5. ทิ้ง Petri dish ที่เทสารละลายแลวใหเย็นในอุณหภูมิหอง จากนั้นเก็บไวที่ 2-8 o C ในสภาวะมีความชื้น 

สูง จนกวาจะใชงาน (เก็บไวใชงาน ไมเกิน 2 สัปดาหหลังจากเตรียม) 

การตรวจตัวอยาง 

1. นํา AGID plate ออกมา จากนั้นเจาะรูกลมที่เนื้อ AGID Plate ตามผัง โดยใชสวนกนของ Pasteur 

Pipette แลวดูดเนื้อ agar ออกดวย เครื่องดูดสุญญากาศ รูกลมที่ไดตองมีเสนผานศูนยกลาง 5.3 mm 

และควรเจาะรูขณะที่ยังเย็นจาก 2- 8 o C การเจาะรูใหเจาะเปนวงดังแผนผัง โดยใน 1 จาน สามารถเจาะ 

ไดทั้งหมด 4 วงๆ ละ 7 รู คือ ตรงกลาง 1 รู และโดยรอบ 6 รู 

2. นํา Idexx EIA Antigen, Idexx EIA Positive Control และซีรั่มตัวอยาง ออกมาทิ้งไวใหมีอุณหภูมิ 

เทากับอุณหภูมิหอง

143 


3. เขียนวัน เวลาที่จะเริ่มทําการตรวจลงดานขางของจานเพาะเลี้ยง และเขียนหมายเลข หรือชื่อของ 

ตัวอยาง / EIA Positive Control โดยที่ 1 วงที่เจาะ รูตรงกลางวงจะใชหยอด EIA Antigen และรู 

โดยรอบสามารถลงตัวอยางตรวจไดจํานวน 3 รู และที่เหลือ 3 รูจะหยอด EIA Positive Control ซึ่งจะ 

มีการหยดสลับกันระหวางรูของตัวอยางและ EIA Positive Control 

4. ดูด EIA Positive Control จํานวน 50 ul โดยใช Autopipette ขนาด 10-100 ul และ Pipette tip ขนาด 10 

- 250 ul ลงในรูโดยรอบในแตละวง จํานวน 3 รู สลับกัน ดังแผนผัง Pipette Tip ใชแลวทิ้งลงใน 

กระปองที่บรรจุน้ําผสมกับน้ํายาลางจานและไฮเตอร 

5. ดูดซีรั่มตัวอยาง จํานวน 50 ul โดยใช Autopipette ขนาด 10-100 ul และ Pipette tip ขนาด 10 - 250 ul 

ลงในรูโดยรอบในแตละวง จํานวน 3 รู ที่เหลือดังแผนผัง Pipette Tip ใชแลวทิ้งลงในกระปองที่บรรจุ 

น้ําผสมกับน้ํายาลางจานและไฮเตอร 

6. ดูด EIA Antigen จํานวน 50 ul โดย Autopipette ขนาด 10-100 ul และ Pipette tip ขนาด 10 - 250 ul 

ลงในรูตรงกลางแตละวง Pipette Tip ใชแลวทิ้งลงในกระปองที่บรรจุน้ําผสมกับน้ํายาลางจานและไฮ 

เตอร 

7. ตั้ง AGID plate ทิ้งไว โดยไมเคลื่อนยาย เปนเวลา 24 ชม. จากนั้นเก็บไวในกลองที่มีความชื้นโดยใช 

กระดาษชําระชุบน้ําและปดฝาสนิท เปนเวลา 18 – 24 ชม. 

8. อานผล โดยการสังเกตเสนสีขาว (Precipitin Line) ที่เกิดบริเวณเนื้อวุนระหวางรูที่หยอด EIA Antigen 

และ EIA Positive Control 

หากพบวาเสนสีขาวที่เกิดบริเวณเนื้อวุนระหวางรูที่หยอด EIA Antigen และรูที่หยอด EIA 

Positive Control สวนปลายเกิดการหักโคงตามวง ไปทางดานหนาของรูซีรั่ม ถือวา รูนั้นใหผลเปน Weak 

Positive 

หากเกิดเสนสีขาวบริเวณเนื้อวุนระหวางรูที่หยอด EIA Antigen และรูที่หยอดซีรั่มตัวอยาง โดย 

เสนสีขาวนั้นโคงเชื่อมตอกับเสนสีขาวที่เกิดบริเวณเนื้อวุนระหวางรู EIA Antigen และ EIA Positive ใหผล 

เปน Positive 

หากพบเสนสีขาวบริเวณเนื้อวุนระหวางรูที่หยอด EIA Antigen และ EIA Positive Control โดยที่ 

ไมเกิดการหักโคงสวนปลายใดๆ ใหผลเปน Negative 

หากไมพบเสนสีขาวบริเวณเนื้อวุนระหวางรูที่หยอด EIA Antigen และ EIA Positive Control จะ 

ไมสามารถรายงานได ใหทําการตรวจวิเคราะหใหม 

10. การตรวจ Brucellosis โดยวิธี Rose Bengal Plate Agglutination 

อุปกรณในการตรวจ 

1. แผนกระจกที่ตีตารางไวเปนชองๆ หรือกระเบื้องเคลือบสีขาว 

2. autopipette ขนาด 10 - 250 ul และ tip ขนาด 10 – 250 ul 

3. ซีรั่ม และแอนติเจน Rose Bengal Plate Test 

4. Timer 

5. ไมจิ้มฟน

144 


วิธีการตรวจ 

1. นําซีรั่มและแอนติเจนมาตั้งทิ้งไวที่อุณหภูมิหอง 

2. หยอดแอนติเจนลงบนแผนกระจก 30 ul โดยใช autopipette ขนาด 10 - 250 ul และ tip ขนาด 10 – 250 ul 

3. หยอดซีรั่มลงบนแผนกระจก 30 ul โดยหยอดหางจากแอนติเจนเล็กนอย 

4. ใชไมจิ้มฟนคนใหเปนรูปวงกลม ใหมีเสนผานศูนยกลางประมาณ 2 ซม. 

5. ยกกระจกเอียงไปมา ( rotating movement ) เพื่อใหสวนผสมเขาเปนเนื้อเดียวกัน 

6. ครบ 4 นาที อานผลทันที 

7. วิธีการอานผล ถา ไมมีการจับกลุมเลย ถือวา Negative (-) และถาเกิดการจับกลุมแมแตเพียงเล็กนอยขึ้นไป 

ถือวา Positive (+) 

11. การตรวจ MG (Mycoplasma gallisepticum) โดยวิธี Plate Agglutination 

อุปกรณในการตรวจ 

1. แผนกระจกที่ตีตารางไวเปนชองๆ หรือกระเบื้องเคลือบสีขาว 

2. autopipette ขนาด 10 - 250 ul และ tip ขนาด 10 – 250 ul 

3. ซีรั่ม และแอนติเจน 

4. Timer 

5. ไมจิ้มฟน 

วิธีการตรวจ 

1. นําซีรั่มและแอนติเจนมาตั้งทิ้งไวที่อุณหภูมิหอง 

2. หยอดแอนติเจนลงบนแผนกระจก 50 ul โดยใช autopipette ขนาด 10 - 250 ul และ tip ขนาด 10 – 250 ul 

3. หยอดซีรั่มลงบนแผนกระจก 50 ul โดยหยอดหางจากแอนติเจนเล็กนอย 

4. ใชไมจิ้มฟนคนใหเปนรูปวงกลม ใหมีเสนผานศูนยกลางประมาณ 2 ซม. 

5. ยกกระจกเอียงไปมา ( rotating movement ) เพื่อใหสวนผสมเขาเปนเนื้อเดียวกัน ประมาณ 30 วินาที 

6. วางทิ้งไวครบ 2 นาที อานผลทันที 

7. วิธีการอานผล ถา ไมมีการจับกลุมเลย ถือวา Negative (-)และถาเกิดการจับกลุมแมแตเพียงเล็กนอยขึ้นไป 

ถือวา Positive (+)

145 


12. การตรวจ NDV (New Cassle Disease Virus)โดยวิธี Hemaglutination 

วิธีการตรวจประกอบดวยขั้นตอน ดังตอไปนี้ 

1.การกําจัดปจจัยไมจําเพาะในซีรั่ม ( Serum treatment ) 

2.การเตรียมเม็ดเลือดแดง 

3.การเตรียม Virus – Suspension 

4. การทดสอบกลับ (Back titration) 

5.การทดสอบโดยวิธี Hemagglutination inhibition test และประเมินผล 

1. การกําจัดปจจัยไมจําเพาะในซีรั่ม ( Serum treatment ) 

1. ถาไมสามารถนําตัวอยางมาทดสอบไดทันที ตองนําตัวอยางนั้นมาแชเย็นที่ 4 O C 

2. Inactivated ที่ 56 องศาเซลเซียส นาน 30 นาที 

2. การเตรียมเม็ดเลือดแดง ( Erythrocyte Suspension ) 

1. เจาะเลือดจากไก ที่ตําแหนง wing vein แลวผสมกับ Alsever’s solution ในอัตราสวน 1:1 ระหวาง 

เดินทาง หรือเก็บรักษาหลังเจาะเก็บ ใหแชในกระติกน้ําแข็ง อุณหภูมิ 2 – 8 O C 

2. ลางเม็ดเลือดแดงดวย PBS โดยใช Glass pipette ขนาด 10 ml รวมกับ Pipette controller โดยการเติม 

เม็ดเลือดแดงใน centrifuge tube และใส PBS ใหครบตามขนาดของ centrifuge tube เชน เลือด 3 ml 

เติมลงใน centrifuge tube ขนาด 15 ml ดังนั้นตองเติม PBS ลงใน centrifuge tube 12 ml หลังจากนั้น 

ใชวิธีการดูดเม็ดเลือดแดงที่ผสม PBS ขึ้น-ลงอยางชาๆ ประมาณ 15 ครั้ง หรือจนเม็ดเลือดแดง 

กระจายทั่ว centrifuge tube สวน Glass pipette ที่ใชแลวใหแชในกระปองที่มีน้ําประปาผสมกับ Dettol 

ในอัตราสวน 1 : 10 อยู 

3. ปนเม็ดเลือดแดงดวยเครื่อง centrifuge ใชรอบปน 2000 รอบตอนาที (RPM) นาน 5 นาที 

4. ดูดสวน supernatant ทิ้งไป โดยใช Glass pipette ขนาด 10 ml รวมกับ Pipette controller และลางเม็ด 

เลือดแดงตามวิธี ขอ 2 

5. ปนเม็ดเลือดแดงดวยเครื่อง centrifuge ใชรอบปน 2000 RPM นาน 5 นาที 

6. ดูดสวน supernatant ทิ้งไป และลางเม็ดเลือดแดงตามวิธี ขอ 2 

7. ปนเม็ดเลือดแดงดวยเครื่อง centrifuge ใชรอบปน 2000 RPM นาน 15 นาที 

8. ดูดสวน supernatant ทิ้งไป หาปริมาตรของเม็ดเลือดแดงที่ได โดยใช Glass pipette หรือ Autopipette 

9. เตรียมเม็ดเลือดแดงเปน 10% stock suspension โดยเจือจางดวย PBS และเก็บที่ 4 O C จนกระทั่งใชแต 

ไมควรเก็บนานเกินกวา 1 สัปดาห 

เมื่อจะนําไปทดสอบ HA test และ HI test ตองเตรียมเม็ดเลือดแดงเปน 1% 

3. การไตเตรท Hemagglutinin ( Virus-Suspension ) ซึ่งก็คือ Hemagglutination test 

1. เติม PBS 25 ul โดยใช Multichannel Micropipette และทิป ขนาด 10 – 100 ul ลงในหลุมของไมโครเพลท 

ตั้งแตแถว A-D ( ใน plate มีแถว A-H ) หลุม 1-12 ( 1 แถว เติม 12 หลุม ) โดยทั่วไปสําหรับไวรัส 1

146 


ตัวอยาง ( หากตองการคาที่แนนอนอาจใช ไมโครเพลท 2 แถว หรือมากกวา ) และทิ้งทิป ที่ใชแลวลงใน 

กระปองทิ้งทิป ที่มีน้ําประปาผสม Dettol ในอัตราสวน 1 : 10 

2. เติมไวรัส 25 ul ลงในหลุม 1 ของแถว A-D จะไดความเจือจางของไวรัสเปน 1:2 

3. ทํา 2 fold serial dilution โดยใช Multichannel Micropipette และทิป ขนาด 10 – 100 ul ปริมาตร 25 ul 

ตั้งแตแถว A-D หลุม 1-11 แลวทิ้งไป 25 ul สวนหลุม 12 ทําเปน diluent control และทิ้งทิป ที่ใชแลวลงใน 

กระปองทิ้งทิป ที่มีน้ําประปาผสม Dettol ในอัตราสวน 1 : 10 

4. เติม 1% เม็ดเลือดแดง 25 ul ในหลุมของไมโครเพลท ตั้งแตแถว A-D หลุม 1-12 ควรเติมเม็ดเลือดแดงจาก 

หลุม 12 มาหลุม 11 และเติมมาเรื่อยๆ จนถึง 1 ตามลําดับโดยใช Multichannel Micropipette 20 – 250 ul 

และทิป ขนาด 10 – 100 ul จากนั้นเขยาใหเม็ดเลือดแดงกระจายทั่วกัน โดยการใชมือเคาะตามดานทั้ง 4 

ของไมโครเพลท หรือใช Microplate shaker และตั้งไวบนพื้นระนาบที่อุณหภูมิหองนาน 35 นาที และทิ้ง 

ทิป ที่ใชแลวลงในกระปองทิ้งทิป ที่มีน้ําประปาผสม Dettol ในอัตราสวน 1 : 10 

5. การอานผลไตเตอรโดยดูจากความเจือจางสูงของไวรัสที่แสดง complete hemagglutination โดยนับเปน 1 

hemagglutination unit ( 1 HAU )= HA - titer 

หลุมที่มีการจับกลุมตกตะกอนของเม็ดเลือดแดง เนื่องจากมองเห็นเปนเม็ดเล็กๆ สีแดงกระจายที่กนหลุม 

อยางสม่ําเสมอ สวนหลุมที่ไมมีการจับกลุมตกตะกอนของเม็ดเลือดแดงรวมทั้งหลุม control จะเห็นเม็ด 

เลือดแดงตกตะกอนดวยแรงโนมถวงของโลกรวมกันที่กนหลุมเปนวงกลมขอบเรียบสีแดงเขมอยางชัดเจน 

การเตรียมไวรัสที่ใชในการทดสอบ 

สมมุติวาตองการใชไวรัส 4 HA units ตอ 25 ul นั้นคือ จากไวรัสมีคาไตเตอร 1 : 256 ( ไวรัสมีปริมาณ 

ความเขมขน 256 HA units ตอ 25 ul ) ของ stock virus แลวทําใหเจือจางลงเปน 4 HA units เพื่อใชทดสอบโดยหาร 

256 ดวย 4 คือ 64 ดังนั้นทํา stock virus ใหเจือจางลงเปน 1:64 โดยใช stock virus 1 สวน ผสมใน PBS 63 สวน 

4. การทดสอบกลับ ( Back titration ) 

เพื่อพิสูจนวาไวรัสมีความเขมขน 4 HA units รวมถึงควบคุมความผิดพลาดในการทํา dilution หรือความ 

แตกตางเนื่องจากเม็ดเลือดแดงแตละชุด 

1. เติม PBS 25 ul โดยใช Multichannel Micropipette 20 – 250 ul และทิป ขนาด 10 – 100 ul ใสในไม 

โครเพลท 96 well V shape ตั้งแตแถว E- H หลุม 2-12 โดยใช Multichannel Micropipette 20 – 250 ul 

และทิป ขนาด 10 – 100 ul 

2. หลุม 1 และหลุมที่ 2 เติม 25 ul ของ test dilution ที่มี 4 HA-units 

3. ทํา 2 fold serial dilution โดยใช Multichannel Micropipette 20 – 250 ul และทิป ขนาด 10 – 100 ul 

ปริมาตร 25 ul ตั้งแตแถว E-H หลุม 2-7 และทิ้งไป 25 ul สวนหลุม 8-12 ใชเปน dilution control ใช 

เพื่อดูผลของตัวเจือจางคือ PBS ที่มีตอเม็ดเลือดแดงซึ่งเปนเครื่องชี้ในระบบนี้ และเพื่อประมาณเวลา 

การตกตะกอน ( sedimentation ) ของเม็ดเลือดแดง 

4. เติม PBS 25 ul โดยใช Multichannel Micropipette 20 – 250 ul และทิป ขนาด 10 – 100 ul ใสในไม 

โครเพลท 96 well U shape ตั้งแตแถว E- H หลุม 1-12 ทําใหสารละลายแตละหลุมมีจํานวน 50 ul 

สวนนี้ เติมเพื่อทดแทนปริมาตรของซีรั่มที่ใชใน HI test เพื่อใหรูปแบบการทดสอบเหมือนกัน

147 


5. เติม 1% เม็ดเลือดแดง 25 ul ในหลุมไมโครเพลท โดยใช Multichannel Micropipette 20 – 250 ul และ 

ทิป ขนาด 10 – 100 ul ควรเติมเม็ดเลือดแดงจากหลุม 12 มาหลุม 11 เติมมาเรื่อยๆ จนถึงหลุมที่ 1 


6. เขยาใหเม็ดเลือดแดงกระจายทั่วกัน โดยการใชมือเคาะตามดานทั้ง 4 ของไมโครเพลท หรือใช 

Microplate shaker และตั้งไวบนพื้นระนาบที่อุณหภูมิหองนาน 35 นาที 

7. ควรเกิด hemagglutination เฉพาะ 3 หลุมแรก ซึ่งหมายถึงไวรัสที่ใชในการทดสอบมี 4 HA units ตอ 

25 ul จริง 

8. ถาเกิด hemagglutination มากกวาหลุมที่ตองการ ควรปรับความเขมขนของไวรัสใหนอยลง และถา 

เกิด hemagglutination นอยกวาหลุมที่ตองการ ควรปรับความเขมขนของไวรัสใหเขมขนขึ้น 

5. Hemagglutination inhibition test 

1. เติม PBS 25 ul ลงในหลุมของไมโครเพลท 1 แถว หลุม 1-12 สําหรับซีรั่ม 1 ตัวอยาง โดยใช 

Multichannel Micropipette 20 – 250 ul และทิป ขนาด 10 – 100 ul 

2. เติมซีรั่ม 25 ul ลงในหลุม 1 ของแถวและหลุมสุดทาย ( หลุมที่ 12 ซึ่งจะเปน serum control ) โดยใช 

Multichannel Micropipette 20 – 250 ul และทิป ขนาด 10 – 100 ul 

3. ทํา 2 fold serial dilution ปริมาตร 25 ul โดยใช Multichannel Micropipette ขนาด 10 – 100 ul และทิป 

ขนาด 10 – 100 ul ตั้งแตหลุม 1-11 แลวทิ้งไป 25 ul โดยในการผสมซีรั่มกับ PBS ในแตละ diluent ควรดูด 

ปลอย 15 ครั้งตอ dilution 

4. เติมไวรัสที่มี 4 HA units 25 ul ในหลุมของไมโครเพลท จากหลุม 11 มาหลุม 10 และเติมมาเรื่อยๆ จนถึง 

หลุม 1 ตามลําดับ โดยใช Multichannel Micropipette 20 – 250 ul และทิป ขนาด 10 – 100 ul ผสมไวรัส 

และซีรั่มใหเขากัน ดวยการใชมือเคาะตามดานทั้ง 4 ของไมโครเพลท หรือใช Microplate shaker และตั้งไว 

บนพื้นระนาบที่อุณหภูมิหองนาน 35 นาที 

5. เติม 1% เม็ดเลือดแดง 25 ul ในหลุมของไมโครเพลททั้งหมด โดยใช Multichannel Micropipette 20 – 250 

ul และทิป ขนาด 10 – 100 ul ควรเติมเม็ดเลือดแดงจาก หลุม 12 มาหลุม 11 และเติมมาเรื่อยๆ จนถึงหลุมที่ 

1 ตามลําดับ และเขยาใหเม็ดเลือดแดงกระจายทั ่วกัน โดยการใชมือเคาะตามดานทั้ง 4 ของไมโครเพลท 

หรือใช Microplate shaker และตั้งไวบนพื้นระนาบที่อุณหภูมิหองนาน 35 นาที 

6. การอานผลซีรั่ม คือ สวนกลับของความเจือจางสูงสุดของซีรั่มที่ยับยั้งการเกิด Hemagglutination ของไวรัส 

การประเมินผล 

การอานผลเพื่อหาสวนกลับของความเจือจางสูงสุดของซีรั่มที่ยับยั้งการเกิด Hemagglutination ของ NDV 

โดยถือเอาคาการเจือจางของซีรั่มตัวอยาง ณ หลุมสุดทายในแตละแถวที่เม็ดเลือดแดงจะตกตะกอนดวยแรงโนม 

ถวงของโลกรวมกันที่กนหลุมเปนวงกลมขอบเรียบสีแดงเขม ไมมีการจับกลุมตกตะกอนของเม็ดเลือดแดง หรือ 

มีการจับกลุมฯเล็กนอย และเมื่อเอียงเพลททํามุมตั้งฉากกับพื้นโลก กลุมเม็ดเลือดแดงจะไหลลงเกิดรูปรางคลาย 

หยดน้ ํา (Tear-shaped steaming) 

คํานวณสวนกลับของคาความเจือจาง ณ หลุมนั้น เปนคาระดับภูมิคุมกัน หรือคา Titer ตอ NDV ของ 

ตัวอยางนั้น โดยตาม OIE manual 2000 ไดระบุวา กรณีที่ใช ไวรัส 4 HA units หากตัวอยางซีรั่มนั้นมีคาความ

148 


เจือจางสูงสุดที่สามารถยับยั้งการเกิด hemagglutination ตั้งแต 1/16 หรือ 2 4 ขึ้นไป อาจพิจารณาแปลผลเปน 

positive ได 

การตรวจวิเคราะห NDV นี้จะกระทําเปนระดับกลุม ฝูง หรือฟารม การรายงานผลเปนสวนใหญนิยมอาน 

คาเลขยกกําลังของเลขฐาน ตาง ๆ เชน 128 หรือ 7 [ log 2 ] หมายถึง Serum นี้สามารถยับยั้ง Antigen 

(NDV)ได 128 HA units คํานวณหาคา Geometric Mean Titer(GMT), คา SD, คา %CV และคาสูงสุด คา 

ต่ําสุด ของ Titer ในรูป [ log 2 ] ในกลุมตัวอยางที่สงตรวจมาพรอมกัน แจงในการรายงานผล 


1. เครื่องนึ่งฆาเชื้อ (Autimatic Autoclave sterilizer) ยี่หอ STURDY 

1. ปรับตั้งเวลาการ sterilize 20 นาที 

2. ปรับตั้งเวลาการ dry 15 นาที 

3. เปดประตูเครื่องนิ่งฆาเชื้อและใสของที่ตองการ sterilize เขาไปในตัวตูแลวปดประตูโดยหมุน door hand 

จนสุด 

4. เปดสวิทต ON 

5. เปดทางน้ําเขาโดยผานเครื่องกรองนาตัวที่ 1 , 2 ,3 

6. พอน้ําเต็ม boiler สวิทตจะตัดไปเปนการเริ่มนึ่งฆาเชื้อ 

7. ปดทางน้ําเขาเครื่อง 

8. เครื่องจะเริ่มทํางานตามขั้นตอน 

9. หลังจากเสร็จทุกขั้นตอน buzzer จะดังขึ้นเพื่อบอกวาเครื่องจบการทํางาน 

10. ปดสวิทต OFF 

11. ใหนําของที่ sterilize ออกจากตู 

กําหนดการนึ่งฆาเชื้อวัสดุอุปกรณ ของหนวยชันสูตรโรคสัตว สถานบริการสุขภาพสัตว 

รายการ วันและเวลา สงของ นึ่งฆาเชื้อ รับของ 

ของใช บาย วันจันทร 

บาย วันพฤหัสบดี 

กอน 14.00 น. 14.30 น. หลังเวลา 09.00 น. 

ของวันถัดไป 

ของทิ้ง เชา วันอังคาร 

เชา วันศุกร 

กอน 09.30 น. 10.00น. หลังเวลา 15.00 น. 

หมายเหตุ 

1. อุปกรณทุกชิ้นที่จะทําการนึ่งฆาเชื้อ ผูสงตองบรรจุในภาชนะที่เหมาะสม ระบุชื่อใหเรียบรอย 

2. ลงบันทึก การสง-รับอุปกรณ ในสมุดบันทึกการนึ่งฆาเชื้อทุกครั้ง 

3. หากไมมีรายการใดลงบันทึกในสมุด เจาหนาที่จะไมทําการนึ่งฆาเชื้อ 

4. ถาสงหลังเวลาที่กําหนด ใหถือเปนการสงฆาเชื้อในรอบถัดไป

149 


2. ตูอบเครื่องแกวยี่หอ Memmert 

1 นําของที่ตองการอบเขาวางในตู 

2 เปดเครื่อง โดยหมุนปุม main switch ไปที่ตําแหนง ไฟสีเขียวที่ตําแหนง Power และไฟสีเหลืองที่ 


3 หมุนปุมปรับเวลาตั้งเวลาตามที่ตองการจะใช 

4 หมุนปุมปรับอุณหภูมิปรับอุณหภูมิที่ตองการจะใช 

5 ถาอุณหภูมิถึงจุดที่กําหนดไฟสีเหลืองที่ตําแหนง heat จะดับลง 

6 เมื่อใชงานเสร็จแลวใหปดเครื่องโดยหมุนปุม main switch ไปที่ตําแหนง O ไฟสีเขียวจะที่ตําแหนง Power 


3. เครื่องชั่งไฟฟาความละเอียดทศนิยม 3 ตําแหนงยี่หอ OHAUS 

1. เปดเครื่อง จอแสดง 0.000 g (หรือ 0.00 g หรือ 0.0 g) 









8. เมื่อใชงานเสร็จกดปุม OFF ตัวเลขบนจอจะหายไป 

4. เครื่องปนแยกซีรั่ม Centrifuge UNIVERSAL 320 

Display screen 

RCF 

SELECT 

START 

IMPULS 

STOP 

OPEN 

E 

A B C D 

1. เปดสวิตชปด/เปดที่ดานหลังเครื่อง 

2. รอจนสัญญาณไฟที่ปุม STOP/OPEN (D) ติด จึงสามารถเปดฝาเครื่องได โดยกดปุม D 

3. เลือกโปรแกรมที่ตองการใชงาน โดยกดปุม SELECT (B) คางไว แลวหมุนปุม E ทวน/ตามเข็มนาฬิกาไป 

ยังโปรแกรมที่ตองการ แลวกดปุม START/IMPULS (C) เพื่อเลือกโปรแกรม

150 


4. ใสหลอดใสตัวอยางลงไปโดยปรับสมดุลซาย/ขวาใหใกลเคียงกัน 

5. ปดฝาเครื่องแลวกดเบาๆ จากนั้นกดปุม C เครื่องจะทํางานตามโปรแกรมที่ตั้งไว 

6. รอจนเครื่องหยุดทํางานและไฟติดที่ปุม D จึงสามารถเปดฝาเครื่องแลวนําเอาหลอดใสตัวอยางออกมาได 

7. เช็ดทําความสะอาดเครื่อง ปดฝาเครื่องหลัง และปดสวิตชที่ดานหลังของตัวเครื่องทุกครั้งหลังใชงาน 

8. ลงบันทึกการใชงานทุกครั้งที่ใชงาน 

การตั้งโปรแกรม 

1. กดปุม B แลวหมุนปุม E ไปยังโปรแกรมที่ตองการตั้งคา แลวกดปุม B อีกครั้ง เพื่อเขาสู mode การตั้งคา 

2. ตั้งเวลา (min) โดยหมุนปุม E จนไดเวลาที่ตองการ แลวกดปุม B เพื่อเขาสู mode ตอไป 

3. ตั้งเวลา (sec) โดยหมุนปุม E จนไดเวลาที่ตองการ แลวกดปุม B เพื่อเขาสู mode ตอไป 

4. ตั้งความเร็วรอบ (RPM) โดยหมุนปุม E จนไดความเร็วรอบที่ตองการ (คาสูงสุดเปน 4000 rpm) แลวกดปุม 

B เพื่อเขาสู mode ตอไป 

5. ตั้งความเร็วที่เพิ่มขึ้น โดยหมุนปุม E จนไดความเร็วที่ตองการ (คาสูงสุดเปน 9) แลวกดปุม B เพื่อเขาสู 

mode ตอไป 

6. ตั้งความเร็วที่ลดลง โดยหมุนปุม E จนไดความเร็วที่ตองการ (คาสูงสุดเปน 9) 

7. กดปุม C เครื่องจะจําโปรแกรมที่ตั้งคาไว แลวใชงานไดตามวิธีการใชงาน 

5. อางน้ําควบคุมอุณหภูมิยี่หอ Memmert 

1. การใชงานอางน้ําควบคุมอุณหภูมิ 

2. เติมน้ําใหอยูระหวางขีดที่กําหนดทางผนังดานขวาของอาง (ควรเปนน้ํา demineral) 


4. กดปุม on/off 

5. ตั้งคาอุณหภูมิที่ตองการใช โดยกดปุม set คางไวแลวหมุนปุมปรับอุณหภูมิตามที่ตองการโดยหมุนไปทางขวาเพื่อ 

เพิ่ม6. 6. อุณหภูมิ หรือหมุนไปทางซายเพื่อลดอุณหภูมิ 


8. ถาอุณหภูมิไมถึงจุดที่กําหนดและไฟที่ตําแหนง alarm ติดใหกดปุม reset เครื่องใหม (ปุม reset อยูดานหลังเครื่อง) 

9. เมื่อใชเสร็จใหปดฝาเครื่องและ กดปุม on/off 

6. ตูแชสารเคมียี่หอ SANYO 

1. เสียบปลั๊กไฟ(ปกติเครื่องจะเปดไวอยูแลว) 




5. ไมควรใสของในตูแชมากเกินไป และควรใหมีชองวางเพื่อใหความเย็นกระจายไดทั่วถึง

151 



7. ตูแชแข็งเย็นจัด (– 70°C) ยี่หอ Harris 

1. เสียบปลั๊กไฟ(ปกติเครื่องจะเปดไวอยูแลว และอุณหภูมิของตูจะอยูที่ – 70°C) 

2. ไขกุญแจโดยบิดไปที่ตําแหนง Power on เพื่อเปดการทํางานของตู ไฟจะสวางที่ตําแหนง Power on พรอมมีตัวเลข 

แสดง3. คาอุณหภูมิปรากฏที่ชอง Digital Temperature Display Window 

4. เขียนชื่อตัวอยาง สาขาวิชา โครงการวิจัย ติดไวทุกตัวอยาง 

5. ตูแชนี้ใชไฟ 220 V ไมควรเสียบปลั๊กรวมกับปลั๊กของเครื่องใชไฟฟาอื่นๆ ในเตาเสียบเดียวกัน 



วิธีการ Set อุณหภูมิภายในตู 

1. กดปุม Control Set Point คางไว ซึ่งจะปรากฏไฟสวางพรอมกับตัวเลขแสดงคาอุณหภูมิหายไป 

2. กดปุม Control Set Point พรอมกับปุม ∗ เพื่อเพิ่มอุณหภูมิ หรือกดปุม + เพื่อลดอุณหภูมิ 

3. เมื่อตั้งอุณหภูมิตามที่ตองการแลวจึงปลอยมือจากลูกศรขึ้น- ลง และปุม Control Set Point 

วิธีการ Set Cold Alarm 

1. เช็คดูวามีการบิดกุญแจไปตําแหนง Power on โดยที่ Set Point ยังไมไดถูกล็อค 

2. กดปุม Cold Alarm Set Point จะปรากฏไฟสวางพรอมกับจอภาพแสดงคาอุณหภูมิ Cold Alarm 

3. กดปุม Cold Alarm Set Point พรอมกับปุม ∗ หรือปุม + เพื่อ Set ใหไดคาที่ตองการ 

วิธีการ Set Warm Alarm 

1. เช็คดูวามีการบิดกุญแจไปตําแหนง Power on โดยที่ Set Point ยังไมไดถูกล็อค 

2. กดปุม Warm Alarm Set Point จะปรากฏไฟสวางพรอมกับจอภาพแสดงคาอุณหภูมิ Warm Alarm 

3. กดปุม Warm Alarm Set Point พรอมกับปุม ∗ หรือปุม + เพื่อ Set ใหไดคาที่ตองการ 

4. ทันทีที่อุณหภูมิภายในตูลดลงต่ํากวาคาอุณหภูมิ Warm Alarm ที่ตั้งไว ใหบิดกุญแจไปที่ตําแหนง ALARM ON 

หมายเหตุ หากมีเหตุการณไฟดับเกิดขึ้น ไฟที่ตําแหนง Power on จะดับ หลังจากนั้นประมาณ 30 วินาที ไฟจะสวาง 

ที่ตําแหนง Power failure พรอมกับจอภาพแสดงอุณหภูมิกระพริบ 

ระบบสัญญาณเตือน 

จะมีระบบสัญญาณเตือนในกรณีตางๆดังตอไปนี้ 

ไฟติดที่ Power Failure : เมื่อกรณีไฟดับ 

ไฟติดที่ Temperature Failure : เมื่อกรณีที่อุณหภูมิภายในตูสูงกวา หรือต่ํากวาคาที่ไดตั้งเพื่อเตือนการ Alarm ไว 

ไฟติดที่ Voltage Low : เมื่อกรณีเกิดกระแสไฟตก 

ไฟติดที่ Extreme Alert : เมื่อกรณีที่อุณหภูมิแวดลอมสูงขึ้นเกินกวาที่เครื่องจะทํางานได 

หมายเหตุ ระหวางที่มีสัญญาณเตือน ไฟที่ติดเหลานี้จะกระพริบดวยความถี่ประมาณ 90 ครั้ง/นาที เมื่อสภาวะ 

ผิดปกติตางๆนี้หายไป และกลับเขาสูสภาวะปกติดังเดิม ไฟที่ติดเหลานี้จะกระพริบดวยความถี่ที่ชาลง เปน 15 ครั้ง/ 

นาที และแมวาสภาวะนี้จะไมไดเกิดขึ้นอีกแตไฟที่ติดนี้ ก็ยังคงกระพริบดวยความถี่นี้อยู จนกวาผูใชงานจะกดปุม 

Alarm Reset

152 


8. ตูแชแข็ง – 20°C ยี่หอ Whirlpool 

1. เสียบปลั๊กไฟ(ปกติเครื่องจะเปดไวอยูแลว) 

2. กดสวิทตเปด 

3. ตูแชนี้ใชไฟ 220 V ไมควรเสียบปลั๊กรวมกับปลั๊กของเครื่องใชไฟฟาอื่นๆ ในเตาเสียบเดียวกัน 

4. ควรตั้งอุณหภูมิที่เลข 3 ขึ้นไป เพื่อใหอุณหภูมิเย็นพอสําหรับการแชโดยทั่วไปและเก็บไดเปนเวลานาน 


6. เลื่อนชั้นตะกราไปชิดผนังดานใดดานหนึ่ง เพราะเปนตําแหนงที่มีความเย็นสูงสุด 



9. Hot plate stirrer ยี่หอ MyLab 



3. ถาตองการกวนสารใหเปดปุมควมคุมหมวด stirrer ปรับตามความแรงตามที่ตองการ ไฟแสดงการทํางานจะติด 

4. ถาตองการความรอนใหเปดปุมควมคุมหมวด heater ปรับตามความรอนตามที่ตองการ ไฟแสดงการทํางานจะติด 




1. เลือกขนาดของ Autopipette ใหเหมาะสมกับปริมาณสารที่ตองการดูด โดยพิจารณาที่ขนาดของ 

Autopipette แตละอัน ซึ่งจะมีปายขนาดปริมาตรบอกไวดานขาง 

2. เลือกทิปที่จะใชใหเหมาะสมกับ Autopipette 

3. การปรับปริมาตรของ Autopipette โดยคอยๆ หมุนปุมปรับปริมาตรที่หัวดานบนของ Autopipette จน 

สามารถปรับปริมาตรไดตามที่ตองการ 

4. เสียบทิปกับสวนปลายของ Autopipette ใหแนน 

5. การดูดของเหลว กดตรงปลายสวนหัวของ Autopipette ลงไป 1 จังหวะ แลวกดคางไว ( Autopipette 

สามารถกดได 2 จังหวะ ) จุมปลายทิปลงไปในของเหลวที่ตองการดูดประมาณ 1/4 ของทิป แลวปลอย 

ปลายสวนหัวของ Autopipette ที่กดคางไวชาๆ จนสุดและของเหลวถูกดูดขึ้นมาแลว 

6. เมื่อไดของเหลวตามปริมาตรที่ตองการแลว 

7. การปลอยของเหลว ใชปลายทิปแตะขางภาชนะเอียงทํามุมประมาณ 45 องศา แลวกดตรงปลายสวนหัว 

ของ Autopipette ลงไป ( ตําแหนงเดียวกันกับจังหวะการดูด ) จนของเหลวไหลลงจากทิปจนหมด 

8. ทิ้งทิปที่ใชแลวลงในกระปองที่มีน้ําประปาผสม Dettol ในอัตราสวนประมาณ 1:10 ( ใช Dettol 1 สวนตอ 

น้ําประปา 9 สวน ) โดยกดลงไปที่ดานขางของสวนหัว Autopipette ทิปจะหลุดออก

153 


9. เปลี่ยนทิปใหมทุกครั้ง เมื่อจะใชดูดของเหลว และทําตามขั้นตอนเดิม 

11. เครื่อง Larminar flow 

1. เสียบปลั๊กเขากับเตาเสียบไฟฟา จะมีไฟสีแดงที่ timer ของ UVH ติดสวาง 2 จุด (ปกติจะเสียบปลั๊กทิ้งไวอยู 

แลว) 

2. เช็ดดานในของ working chamber ดวยแอลกอฮอล 70% 

3. เลื่อนบานกระจกดานหนา chamber ลงมาใหปดสนิท 

4. เปดแสง UV ที่สวิทต UVC เพื่อฆาเชื้อที่ตกคางอยูใน working chamber ใชเวลา 15-20 นาที 

5. ปดแสง UV เมื่อครบเวลา ลงบันทึกการเปดแสง UV ทุกครั้งที่แบบฟอรมขางตู 

6. เปดสวิทต blower ทํางาน (ดันสวิทตขึ้น ไฟสีแดงดานบนสวิทตจะติดสวาง มีเสียงพัดลมของเครื่องกําลัง 

ทํางาน) เช็คดูที่ปุม speed control ควรชี้ที่ตําแหนงเลข 1 และเช็คดูที่ magnehelic gauge เข็มควรชี้ที่ประมาณ 0.5 

inch of water 

7. เปด blower ทิ้งไวประมาณ 5 – 10 นาที เพื่อใหความเร็วลมใน chamber คงที่ที่ประมาณ 100 ฟุตตอนาที 

หรือ 0.5 เมตรตอวินาที และดูดเอาอากาศที่มีฝุนและ particle อื่นๆซึ่งตกคางอยูออกไปจาก clean working 

chamber 

8. นําอุปกรณที่จะใชในการทํางานเขาไปไวใน chamber โดยเลื่อนประตูกระจกดานหนาขึ้นควรวางอุปกรณ 

ใหลึกเขาไปโดยหางจากชองลมอยางนอย 4 นิ้ว 

9. เลื่อนประตูกระจกปดลงมา ทิ้งไวให blower ทํางานอีก 5 – 10 นาที 

10. เปดสวิทต light ของหลอด fluorescent ใหแสงสวางในการทํางาน 

11. ผูปฏิบัติงาน ควรสวมเสื้อกาวนที่สะอาด สวม mask ปดปาก ลางมือและแขนใหสะอาด สวมถุงมือยาง 

และพนแอลกอฮอล 70% ฆาเชื้อบริเวณมือและแขน กอนปฏิบัติงาน 

12. ผูปฏิบัติงาน ควรนั่งใหมีระดับความสูงพอเหมาะคือระดับคางจะตองอยูสูงจากขอบลางของประตูกระจกไม 

ต่ํากวา 2 นิ้ว 

13. ควรระวังอยาใหของเหลวหก ตก กระเด็น ในบริเวณ working chamber โดยเฉพาะดานบนที่เปนสวน 

หลังของ hepa filter และชองลมซึ่งมี prefilter รองอยูดานลาง 

14. เมื่อเสร็จงานแลวนําอุปกรณออกจาก chamber เปด blower ทิ้งไวอีก 5 – 10 นาที 

15. เช็ดทําความสะอาด ดานใน chamber ดวย แอลกอฮอล 70% 

16. ปดประตูกระจกใหสนิท 

17.ตั้งเวลาการทํางานของ U V H เพื่อใชแสง U V ฆาเชื้อที่ตกคางอยูภายใน hepa filter ซึ่งจะหยุดการ 

ทํางานโดยอัตโนมัติเมื่อครบเวลาที่ตั้งไว โดยหมุนปุมตั้งเวลาไวที่ 2 ชั่วโมง สําหรับการทํางานตลอดทั้งวัน 

และ 1 ชั่วโมงสําหรับการทํางานครึ่งวัน 

18. กดปุม reset สีแดงดานบน timer ของ U V H ไฟสีแดงดานซายจะดับลง

154 


12. เครื่อง Tecan Spectra Classic Elisa Reader 

1 การอานผลอีไลซาดวยวิธีปกติ 

1.1 กดสวิตซเปดเครื่องทางดานทายเครื่อง เพื่ออุนหลอดกําเนิดแสง กอนอานคา 10 นาที 

1.2 อานคา โดยกดปุมตามแผนภาพตอไปนี้ 

Wed 05.Mar 14:55 

< measure > 

หนาจอปกติพรอมใชงาน (Standby mode) 

Select test 1 

< 1 > 

Plate ID : 

/ ABCD / EFGHI 

Plate exists 

< overwrite > 

กดปุม Enter 




Insert plate 

Please any key 

Printing 

Please wait 

กดปุมใดๆก็ได 


จะมีถาดวางไมโครเพลท ยื่นออกมาแลว ใหวาง ไม 

โครเพลทอีไลซาที่ตองการอานบนถาดวาง 

ขอมูลจะถูกพิมพออกมาทางเครื่องพิมพ และ ถาด 

วางยื่นออกมา เมื่อนําไมโครเพลทอีไลซาออกแลวกด 

ปุมลูกศรบน เพื่อเก็บถาดวาง 

Wed 05.Mar 14:57 

< measure > 

เครื่องจะกลับมาอยูใน Standby Mode อีกครั้ง

155 


2. การอานคาและแปลผลดวยโปรแกรม X-CHECK สําหรับชุดตรวจ ELISA Kitของ บริษัท IDEXX 

2.1 เปดโปรแกรม X-CHECK IDEXX ( ลูกศรชี้ ) 

2.2 ใสชื่อเปนตัวอักษรไมเกิน 4 ตัวอักษรเพื่อเปดโปรแกรม X-CHECK IDEXX 

แลว ENTER ( ลูกศรชี้ ) 

2.3 เลือก TEMPLATE แลว ENTER ( ลูกศรชี้ ) 

2.4 เลือก การทดสอบที่ทําการตรวจ แลว ( ลูกศรชี้ทางดานซาย ) 

เลือก NEW แลว ENTER ( ลูกศรชี้ทางดานขวา )

156 


2.5 ลง CASE NUMBER แลว( ลูกศรชี้ทางดานซาย ) 

จํานวนตัวอยางของ CASE แลว ENTER( ลูกศรชี้ทางดานขวา ) 

2.6 เลือก DONE แลว Enter ( ลูกศรชี้ ) 

2.7 เลือก READ PLATE แลว ENTER ( ลูกศรชี้ ) 

2.8 เลือก C แลว ENTER ( ลูกศรชี้ )

157 


2.9 เลือกขอมูลที่ตองการ( ลูกศรชี้ ) 

2.10 สั่งพิมพขอมูลที่ตองการทางเครื่องพิมพ ( ลูกศรชี้ ) 

2.11 ปดกรอบขอมูล ( ลูกศรชี้ทางดานซายกอน ) 

กดปดกรอบโปรแกรม ( ลูกศรชี้ทางดานขวา ) 

ถาเกิดการผิดพลาดในขั้นตอนนี้ ตองไปติดตอกับทางตัวแทนจําหนาย บริษัท CHAKMARTIN 

INTERVIRONTECH จํากัด เลขที่ 211/195 ซอย 25 เมืองทอง 2/2 ถ.พัฒนาการ เขตประเวศ กรุงเทพฯ 10205 โทร 

0-2714-9161-2 โทรสาร 0-2714-9963

158 


3. การเปลี่ยนความยาวคลื่นในการอานคา เครื่องอานคา ELISA Plate Reader TECAN Spectra นี้ มี 

ความสามารถอานคา Optical Density ไดทั้งหมด 4 ความยาวคลื่น คือ 405, 450, 650 nm สามารถทําการปรับเปลี่ยน 

ความยาวคลื่นไดโดย 

Wed 05.Mar 14:55 

< measure > 

กดปุม 2 ครั้ง 

Wed 05.Mar 14:55 

< Test data > 


test data 

< Define > 


select test 1 

< 1 > 


define test 

< test name > 


Name : 1 

/ ABCD .. /.. EFGHI 


define test 

< filter > 

Meas. Flt. 

< A: 405 > 


กดปุมลูกศรซาย หรือขวาเปลี่ยนความยาวคลื่นที่ตองการใช แลวกดปุม Enter

159 


Ref. Flt. 

< none > 

define test 

< 3wave > 

กดปุมลูกศรซายหรือขวา เปลี่ยนความยาวคลื่นอางอิงที่ตองการใช แลวกด 

ปุม Enter (หากไมใช ปรับเปน none แลวกดปุม Enter) 

กดปุมลูกศรซายหรือขวาเพื่อปรับเปลี่ยนความยาวคลื่นที่ 3 หรือการเขยา แลวกด 

ปุม Enter (หากไมใช กดปุมลูกศรซายหรือขวาหา < EXIT> ) 

define test 

< EXIT > 


Test data 

< define > 

กดปุมลูกศรซาย 1 ครั้ง จนพบ < EXI T > 

Test data 

< EXIT > 


Wed 05.Mar 14:55 

< Test data > 

กดปุมลูกศรซาย 2 ครั้ง จนพบ < measure > 

Wed 05.Mar 14:55 

< measure > 

4. จากนั้นจึงทําการอานผลอีไลซาตามวิธีในขอที่ 1

160 

หองปฏิบัติการไวรัสวิทยา 

ชื่อหองปฏิบัติการ : หองปฏิบัติการไวรัสวิทยา 

นักวิทยาศาสตรประจําหอง : นางสาวธัญปถย จารุปาลี 

แผนผังหองปฏิบัติการไวรัสวิทยา 


Dx 10 

Dx9 


Dx6 Dx4 Dx7 Dx8 

ลําดับ หองปฏิบัติการ หมายเลขหอง นักวิทยาศาสตรผูรับผิดชอบ 

1 หอง autoclave Dx 1 นางสาวกนกกาญจน พรมแกว 

2 หองลางและเตรียมเครื่องแกว Dx 2 นางสาวกนกกาญจน พรมแกว 

3 หองรวมเครื่องมือและหองเตรียมตัวอยาง Dx 4 นางสาวกนกกาญจน พรมแกว 

4 หองปฏิบัติการซีรั่มวิทยา 2 Dx 6 นางสาวกนกกาญจน พรมแกว 

5 หอง PCRและ Real time PCR Dx 7 นางสาวนิภา จารุปาลี 

6 หองอุปกรณและวิเคราะหขอมูล Dx 8 นางสาวนิภา จารุปาลี 

7 หองฟกไข Dx 9 นางสาวนิภา จารุปาลี 

8 หองP2+ (เชื้อรุนแรง) Dx 10 นางสาวนิภา จารุปาลี

161 


ระเบียบการใชหองปฏิบัติการหองP2+ (เชื้อรุนแรง) 

1. การขอใชหองปฏิบัติการหองP2+ (เชื้อรุนแรง) ใหเปนไปตามระเบียบการขอใชหองปฏิบัติการ คณะสัตว 

แพทยศาสตร 


3. ตองทําความเขาใจกับวิธีการทดลองกอนเขาหองปฏิบัติการทุกครั้ง 

4. ศึกษาวิธีการใชหอง ใหเขาใจกอนเขาหองปฏิบัติการ 

5. การเปด – ปดหองจะเปดเปนเวลา ไมอนุญาตใหปฏิบัติงานนอกเหนือเวลาที่กําหนด 

6. หามนําหรือเคลื่อนยายอุปกรณ ยา สารเคมี และวัสดุอื่นๆ ภายในหองปฏิบัติการไปโดยไมไดรับอนุญาต 




10. ลางมือทุกครั้งทั้งกอนและหลังปฏิบัติงาน 

11. สวมเสื้อกาวน, ถุงมือ และหมวกทุกครั้งที่ทํางาน 

12. เปลี่ยนรองเทาทุกครั้งกอนเขาหองปฏิบัติการ 

13. สวม mask และถุงมือเมื่อตองสัมผัสตัวอยาง 

14. ปดฝาภาชนะและมัดปากถุงทุกครั้งกอนเอาออกจาก Hood 

15. ทิ้งขยะในที่ที่จัดไวใหเทานั้น (แยกขยะกอนทิ้ง ขยะที่ติดเชื้อตองนําไปนึ่งฆาเชื้อกอนทิ้ง) 


1. ขั้นตอนการรับและเก็บตัวอยางเพื่อสงตรวจตัวอยาง ไขหวัดนก (Avain influenza virus) 

ขั้นตอนการรับตัวอยาง 

1. เจาหนาที่ผูรับผิดชอบทําการรับตัวอยางจากผูที่สงตรวจ 

2. ลงขอมูล/รายละเอียดของตัวอยางลงในแฟมขอมูล 

3. เขียน CODE ของตัวอยางที่ไดรับที่หลอดตัวอยางเพื่อรอการตรวจตอไป 

ขั้นตอนการเก็บตัวอยาง 

1. การเก็บตัวอยางจากสัตวปกที่มีชีวิต 

1.1 สิ่งคัดหลั่ง, อุจจาระ 

- ใชไมพันสําลีที่ปลอดเชื้อปายสิ่งคัดหลั่งใหสัมผัสกับเยื่อเมือกของรองเพดานปาก จมูก หลอดลม 

หรือทวารรวม 

- จุมไมพันสําลีในน้ํายาเก็บรักษาเชื้อปริมาตร 6 ml (PBS+ Antibiotic) 

- นําหลอดเก็บตัวอยางมาดึงไมพันสําลีออก (Aseptic technique) แลวนําไปปนดวยเครื่อง 

refrigerator centrifuge ที่ความเร็ว 9,000 rpm/10 นาที อุณหภูมิ 4 º c 

- ดูดสวนใสดานบน (supernatant) ปริมาตร 1.5 ml ใสใน microcentrifuge 1หลอด/1ตัวอยาง 

- นําไปปนอีกครั้งที่ความเร็ว 12,000 rpm/10 นาทีอุณหภูมิ 4 º c 

- นําไปเก็บที่ตูเย็น 4 º c (เก็บไมเกิน3 วัน) หากยังไมทําการตรวจนําไปเก็บที่ -20º c

162 


2. การเก็บตัวอยางจากซากสัตว 

2.1 ตัวอยางอวัยวะภายใน 

- ทําการผาซากสัตวที่ไดรับมา โดยสังเกตลักษณะอาการภายนอกกอน อาทิ 

• ซากผอมแหง 

• มีการบวมน้ําใตผิวหนังที่สวนหัวและคอ 

• ตาอักเสบบวมแดง และอาจมีจุดเลือดออก 

• หลอดลมอักเสบรุนแรงมีเมือกมาก 

• มีจุดเลือดออกที่กระเพาะแท โดยเฉพาะตรงรอยตอกับกึ๋น 

• มีการลอกหลุดและจุดเลือดออกที่ผนังของกึ๋น 

• ไตบวมแดงและอาจพบยูเรียที่ทอไต 

- เก็บอวัยวะภายใน เชน หลอดลม ปอด ตับออน มาม ลําไสสวนปลาย ไต หัวใจและสมอง เปนตน 

- นํามาตัดเปนชิ้นเล็กๆ ประมาณ 5-10 mg บดในโกรงที่ฆาเชื้อแลว 

- เติม PBS+ Antibiotic 5 ml ผสมใหเขากันกับของเหลวจากชิ้นเนื้อ 

- นําของเหลวที่ไดไปปนดวยเครื่อง refrigerator centrifugeที่ความเร็ว 9,000 rpm/10 นาที อุณหภูมิ 4 

ºc 

- ดูดสวนใสดานบน (supernatant) ปริมาตร 1.5 ml ใสใน micro centrifuge 1หลอด/1ตัวอยาง 

- นําไปปนอีกครั้งที่ความเร็ว 12,000 rpm/10 นาทีอุณหภูมิ 4 º c 

- นําไปเก็บที่ตูเย็น 4 º c (เก็บไมเกิน3 วัน) หากยังไมทําการตรวจนําไปเก็บที่ -20º c 

2. การตรวจตัวอยาง ไขหวัดนก (Avain influenza virus) โดยใชวิธี Cell culture 

อุปกรณ/สารเคมี 

1. MEM (Hyclone cat no. SH30008.02) 

2. Fetal bovine serum 

3. MDCK cells ที่-70 º c 

4. 96 well TC plate sterile (corning no.3599) 

5. Pipette aid 

6. ปเปตพลาสติก ขนาด 5 mlและ 10 ml (corning no.4487/4488) 

7. Flask T75 (corning no.430720) 

8. Freezer box 

9. microcentrifuge tube 1.5 ml 

10. นาฬิกาจับเวลา 

11. reservoir 

12. Green cap 

13. Glove size S ,M 

14. CO 2 incubator 

15. เครื่อง refrigerator centrifuge 

16. Water bath 

17. Inverted Microscope

163 



19. Blue tip 

20. Yellow tip 

21. Haemocytometer 

22. Trypan blue 0.1% 

23. ถุงขยะ 

24. Clorox สําหรับฆาเชื้อ 

การตรวจวินิจฉัยโรคไขหวัดสัตวปก 

2.1 การนําเซลลลง plate 

1. นํา MDCK cell ที่ไดเพาะเลี้ยงไวใน flask T 75 จนโตเต็มที่แลว 

2. เท media เดิมออกจากขวดเพาะเลี้ยงเซลล ลางดวย PBS 2 ครั้ง ครั้งละ 15 ml 

3. ใส 2.5% trypsin-versence solution ลงขวดเพาะเลี้ยงเซลล 5 ml แลวนําไป incubate ที่ 37 º c 5% CO 2 

incubator นานประมาณ 10 นาที 

4. นํามาสองดูดวยกลอง Inverted Microscope เพื่อดูวาเซลลมีการแยกตัวเปนเซลลเดี่ยวๆหรือมีการหลุดลอก 

ออกจากผิวขวดเพาะเลี้ยงเซลลหรือยัง ถายังนําขวดเพาะเลี้ยงเซลลมาเคาะกับฝามือเบาๆ หรือใชปเปตดูด 

พนเพื่อใหแยกเปนเซลลเดี่ยวๆ 

5. เติม 5 ml ของ MEM ที่ผสม FCS 10% เพื่อเปนการหยุดปฏิกิริยาของ trypsin-versence 

6. ใส MEM ที่ผสม FCS 10% และสารละลายเซลลที่ไดจากขอ 5 มาผสมรวมกันใน reservoir โดยปรับ 

ปริมาตรใหไดความเขมขนตามที่ตองการ (1 plate ใชประมาณ 10 ml) 

7. จากนั้นนํามาใส 96 well plate หลุมละ 100 ul ตั้งแตแถว A-H หลุม 1-12 

8. นําไป incubate ที่ 37 º c 5% CO 2 incubator นาน 24 ชั่วโมง (1 plateตรวจได 10 ตัวอยาง) 

9. ใช multichanel Pipette ดูดอาหารเลี้ยงเซลลออกทุกหลุม 

10. ใส MEM ที่ผสม tripsin 0.05% ลงไปทุกหลุม หลุมละ 100 ul 

11. นําไป incubate ที่ 37 º c 5% CO 2 incubator นาน 5 นาที 

12. ดูด MEM ที่ผสม tripsin 0.05% ออกทุกหลุม 

2.2 การนําตัวอยางลง plate 

13. ใสตัวอยาง 50 ul + MEM (ไมตองผสม FCS) 50 ul ในแถว A-D หลุม 1-10 

14. ใสตัวอยาง 25 ul + MEM (ไมตองผสม FCS) 75 ul ในแถว E-H หลุม 1-10 

15. ใส positive AI ความเขมขน 10 -4 ลงแถวA-H หลุมที่ 11 หลุมละ 100 ul (control positive) 

16. ใส MEM ลงแถวA-H หลุมที่ 12 หลุมละ 100 ul (control negative) 

17. นําไป incubate ที่ 37 º c 5% CO 2 incubator นาน 1 ชั่วโมง 

18. ดูดอาหารเลี้ยงเซลลออกยกเวนแถว A-H หลุมที่11และแถว A-H หลุมที่12 

19. ใส MEM (ไมตองผสม FCS) แถว A-H หลุมที่1-10 หลุมละ100 ul 


21. ดูดอาหารเลี้ยงเซลลแถวA-H หลุมที่ 11ออก 

22. ใส MEM (ไมตองผสม FCS) แถว A-H หลุมที่11 หลุมละ100 ul

164 



2.3 การติดตามดูผล/รายงานผล 

24. ตรวจดูการเกิด CPE ทุกวันเปนเวลา 3 วัน 

25. ถาตรวจพบวามีการตายของเซลลเกิดขึ้นดูดเก็บตัวอยางจากทุกหลุม (1 ตัวอยาง= 8หลุม)ไวทํา HA เพื่อ 

ตรวจดู HA titer ตอไป 

26. ถาตรวจไมพบการเกิด CPE ดูเก็บตัวอยางจากทุกหลุม (1 ตัวอยาง= 8หลุม) มาตรวจซ้ําอีกครั้ง (passage 2) 

27. ถาตรวจพบวามีการตายของเซลลเกิดขึ้นใหรายงานผลเปนบวก 

28. ถาตรวจไมพบการเกิด CPEใหรายงานผลเปนลบ 

ภาพแสดง การนําตัวอยางลง plate 

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 

A pos neg 

sample 50 ul + B pos neg 

MEM 50 ul C pos neg 

D pos neg 

E pos neg 

sample 25 ul + F pos neg 

MEM 75ul G pos neg 

H pos neg 

2.4 วิธีการเพาะเลี้ยง MDCK cells (Madin-Darby Canine Kidney Cells) 

1. นํา MDCK cells ที่แชแข็ง -70 º c ออกมาแกวงใน Water bath ที่ตั้งไวที่อุณหภูมิ 37 º c แกวงนานประมาณ 

30 วินาที พยายามแกวงใหเร็วที่สุดเพื่อปองกันเซลลถูกทําลาย 

2. อุนอาหารเลี้ยงเซลล MEM, trypsin-versence 2.5 % solution และ PBS ใน water bath ที่ 37 ºc เวลา 

ประมาณ 15 นาที 

3. เมื่อเซลลละลายหมดแลว นําไปปนดวยเครื่องปนเหวี่ยงที่ความเร็ว 1,000 รอบ/นาที นาน5 นาที ที่ 

อุณหภูมิ 4 º c 

4. เช็ด cryovial ดวย 70% แอลกอฮอลใหทั่ว 

5. ดูดสารละลายสวนใสทิ้ง แลวเติมอาหารเลี้ยงเซลล MEM ที่เย็น (ไมตองผสม FCS) ลงไป 1 ml ในหลอดที่ 

มีตะกอนเซลลเหลืออยู ใช Autopipette ดูดขึ้นลงเพื่อ ใหสวนผสมรวมเปนเนื้อเดียวกัน 

6. นําไปปนดวยเครื่องปนเหวี่ยงที่ความเร็ว 1,000รอบ / นาที นาน 5 นาทีที่อุณหภูมิ 4 º c 

7. เช็ด cryovial ดวย 70% แอลกอฮอลใหทั่ว 

8. ดูดสารละลายสวนใสทิ้งแลว เติมอาหารเลี้ยงเซลล MEM ที่เย็น (ไมตองผสมFCS) ลงไป 1 ml ดูดขึ้นลง 

เพื่อ ใหสวนผสมรวมเปนเนื้อเดียวกัน

165 


9. ใช Autopipette ดูดสารละลายเซลลทั้งหมดลงในขวดเพาะเลี้ยงเซลล T75 เติมอาหารเลี้ยงเซลล MEM ที่ 

ผสมFCS 10% ลงไปในขวดเพาะเลี้ยงเซลล T75 ปริมาตร 15 ml (คลายเกลียวฝาขวดเล็กนอย) 

10. นําไปบมที่อุณหภูมิ 37 º c คารบอนไดออกไซด 5% คลายฝาเกลียวเล็กนอย 

11. สังเกตการเจริญเติบโตของเซลล 

ภาพแสดงลักษณะการเลี้ยง MDCK cells 

2.5 วิธีการ Splitting cell cultures 

1. นําขวดเพาะเลี้ยงเซลล MDCK มาสองดูดวยกลอง Inverted Microscope เพื่อดูการเจริญเติบโตของเซลล ดู 

จากการขุนของอาหารและลักษณะเซลลวามีชีวิตหรือเกิดการปนเปอนหรือไม 


3. ใส 2.5% trypsin-versence solution ลงขวดเพาะเลี้ยงเซลล 5 ml แลวนําไป incubate ที่ 37% CO 2 incubator 

นานประมาณ 10 นาที 

4. นํามาสองดูดวยกลอง Inverted Microscope เพื่อดูวาเซลลมีการแยกตัวเปนเซลลเดี่ยวๆหรือมีการหลุดลอก 

ออกจากผิวขวดเพาะเลี้ยงเซลลหรือยัง ถายังนําขวดเพาะเลี้ยงเซลลมาเคาะกับฝามือเบาๆหรือใชปเปตดูด 



6. นับเซลลใหไดตามปริมาณตามที่ตองการ ( flask T75 2 x10 7 cell/ml , flask T25 5x10 6 cell/ml ) 

7. เมื่อนับเซลลไดตามปริมาณที่ตองการแลว แบงเซลลใสขวดเพาะเลี้ยงแลวเติม MEM ที่ผสม FCS 10% 

ปรับปริมาตรใน flask T75 ใหได 15 ml 

8. นํา flask T75 ที่ splitting cell แลวไป incubate ที่ 37% CO 2 incubator คลายฝาเกลียวเล็กนอย

166 


2.6 Cell counting 

Accurate numbers in a cell suspension can be calculated by counting the cells in a haemocytometer (e.g. improved 

Neubauer); it is important to disperse the cells thoroughly by pipetting up and down. A typical method for 

enumerating cell concentration using “improved Neubauer” haemocytometers is given below. 

1) Dilute 0.2 ml of the cell suspension in 0.2 ml of trypan blue (N.B. use 0.1% w/v trypan blue in PBS 

solution); non-viable cells are stained blue. 

2) Immediately mix well with a fine Pasteur pipette and aspirate sufficient volume to fill both sides of the 

haemocytometer chamber. 

3) Count viable cells in each of the four corner squares bordered by triple lines, omitting cells lying on these 

lines (see Figure 4.2). This is repeated for the second side of the chamber. N.B. cell counts of less than fifty 

cells are unlikely to be reliable. 

4) If a marked degree of cell “clumping” (aggregation) is observed, discard and re-suspend the original cell 

suspension. 

5) Calculate the mean count of the total viable cells per four corner squares (N.B. viable cells are not stained 

by Trypan blue). 

6) Count and calculate the mean count of the other half of the counting chamber. For a valid test, the results 

of the two counts should be within 20% of the mean value. 

7) Calculate the viable cell concentration per ml using the following formula: 

calculations:Cells/ml = average cell count per square x dilution factor x 10 4 ; 

Total cells = cells/ml x the original volume of fluid from which the cell sample was removed 

% Cell viability = total viable cells (unstained)/total cells x 100. 

Figure 4.2: Cell counting using a haemocytometer (based on Freshney)

167 


Important variables in these counting chambers are: 

a) the depth of the chamber. In the example above this is 0.1 mm; in some counting chamber types, 

however, this is 0.2 mm. 

b) the number of smallest squares per cm 2 . In the example above, there are 25 squares per cm 2 , each 0.2 

mm long and 0.2 mm wide; in some counting chambers, however, there are 16 squares per cm 2 , each 0.25 mm 

long and 0.25 mm wide. 

When counting chambers with different specifications are used, different algorithms have to be followed 

for the correct calculation of the number of cells per ml. It is important to check the specifications of the counting 

chamber in use and follow the calculation instructions that go with individual counting chambers. 

2.7 Freezing cell cultures 

1. ขวดเพาะเลี้ยงเซลล MDCK cells ที่มีการเจริญเติบโตมากกวา 90% 


3. ใส 2.5% trypsin-versence solution ลงขวดเพาะเลี้ยงเซลล 5 ml แลวนําไป incubateที่ 37% CO 2 incubator 

นานประมาณ 10 นาที 

4. นํามาสองดูดวยกลอง Inverted Microscope เพื่อดูวาเซลลมีการแยกตัวเปนเซลลเดี่ยวๆ หรือมีการหลุดลอก 

ออกจากผิวขวดเพาะเลี้ยงเซลลหรือยัง ถายังนําขวดเพาะเลี้ยงเซลลมาเคาะกับฝามือเบาๆ หรือใชปเปตดูด 



6. ดูดเซลลใสใน centrifruge tube ขนาด 15 ml ปริมาตร 10 ml 

7. นําไปปนดวยเครื่องปนเหวี่ยงที่ความเร็ว 1,000รอบ / นาที นาน 5 นาทีที่อุณหภูมิ 4 º c 

8. คอยๆ ดูดสวนใสทิ้งระวังอยาใหเซลลหลุด 

9. เตรียม media ที่ใชเก็บรักษาเซลล โดยใช 90% fetal bovine serum + 10% DMSO

168 


10. ดูด media จากขอ 9 ที่เตรียมได ใสในขอ 8 ดูดพนเพื่อใหเซลลมีการกระจายตัว 

11. นับเซลลใหไดตามปริมาณตามที่ตองการ 

12. ใชปเปตดูดสารละลายเซลลที่ไดใสใน cryovial หลอดละ 1 ml 

13. พันดวยพาราฟน เขียนระบุวัน/เดือน/ป, passage, จํานวนเซลล, ชื่อผูทํา ที่ขางหลอด 

14. นําไปเก็บที่ ตู -70 º c หรือใน liquid nitrogen -196 º c 

2.8 การเตรียมสารเคมีที่ใชในการเพาะเลี้ยงเซลล 

การเตรียม PBS 1X (phosphate buffer saline) 

1. NaCl 8 g 

2. KCL 0.2 g 

3. KH 2 PO 4 0.2 g 

4. Na 2 HPO 4 1.15 g 

ละลายในน้ํากลั่น 1000 ml นําไปนึ่งฆาเชื้อ เก็บที่อุณหภูมิหอง 

การเตรียมสารละลาย 2.5% tripsin 

1. ละลาย tripsin 2.5 g ใน PBS 100 ml 

2. นําไปปน 1800 rpm / 10 นาที ที่ 4 º c 

3. กรองดวยหัวกรองมิลลิพอร ขนาด 0.22 ไมครอน 

4. ดูดแบงใส tube tubeละ 5 ml 

5. เก็บไวในตูเย็นที่ -20 º c 

การเตรียมสารละลาย versence (stock versence EDTA 1%) 

1. ละลาย EDTA 1 g ในน้ํากลั่น 100 ml 

2. นึ่งฆาเชื้อและ เก็บที่อุณหภูมิหองหรือตูเย็น 4 º c 

การเตรียมสารละลาย 2.5% tripsin - versence 

1. นําสารละลาย 2.5% tripsin 5 ml มาละลายกับสารละลาย versence 2.5 ml 

2. ใสลงใน PBS 100 ml ผสมใหเขากัน 

3. แบงใสหลอดละ 5 ml 

4. เก็บไวในตูเย็นที่ -20 º c 


การเตรียม Modified Eagle’s Medium {MEM (Hyclone cat no. SH30008.02)} สําหรับเลี้ยงเซลล 

• MEM 9.5 g 

• NaHCO 3 2.2 g 

• Pennicilin G sodium salt 100 IU/ml 

• Streptomysin 100 mg/ml 

• Ciprofloxcin 100 µเ/ml

169 


• Amphotericin B 0.25 µl/ml 

• น้ํากรอง( reverse osmosisi ) ที่นึ่งฆาเชื้อแลว 1 L 

ขั้นตอนการเตรียม 

1. ชั่ง MEM 9.5 g และ NaHCO 3 2.2 g 

2. ใสลงในน้ํากลั่นที่นึ่งฆาเชื้อแลว 1L (ทําใน Hood ) 

3. ใส magnetic stirrer bar ลงในขวด 

4. นําไปปนเพื่อใหสารละลายเขากันประมาณ 10 นาทีโดยไมตองใหความรอน 

5. นําไปเขาเครื่องกรองโดยกรองผานกระดาษกรองขนาด 0.22 ไมครอน 

6. แบงใสขวด Duran ขวดละ 90 ml เก็บที่อุณหภูมิ 4 º c ( เก็บไดไมเกิน 3 เดือน ) 

7. เมื่อนําออกมาใชจึงผสมยาปฏิชีวนะตามความเขมขนที่กําหนด 

การเตรียมน้ํายา Swab (เก็บรักษาตัวอยาง) 


• PBS ที่นึ่งฆาเชื้อแลว 

• Pennicilin G sodium salt 1000 IU/ml 

• Streptomysin 1000 mg/ml 

• Ciprofloxcin 1000 µเ/ml 

• Amphotericin B 2.5 µเ/ml 

ขั้นตอนการเตรียม 

ผสมAntibiotic ตามที่กําหนดลงใน PBS 1 L 

1. แบงใส transport tube ขนาด 10 ml หลอดละ 6 ml 

2. เก็บในตูเย็น 4 º c 

3. การตรวจเชื้อไขหวัดสัตวปกโดยวิธีไขไกฟก 

อุปกรณ/สารเคมี 

1. ไขไกฟกอายุ 9-11 วัน 

2. tuberculin ติดเข็มขนาด 1 ml 

3. syring ขนาด 3ml 

4. เข็มเบอร 18 ขนาด1½ นิ้ว 

5. เข็มเจาะไข 

6. microcentrifuge tube 1.5 ml 

7. เครื่อง refrigerator centrifuge 

8. ถาดไขพลาสติก 

9. Petri dish 


11. เครื่องสองไข 

12. 70% alcohol

170 


13. ทิงเจอรไอโอดีน 

14. กระดาษกาวใส 

15. forcep 

16. Micropipette 

17. เจนตาไมซินความเขมขน 50 µg / ml 

3.1 การเตรียมสารละลายยาปฏิชีวนะความเขมขน 50 µg / ml 

1. น้ํากลั่นที่นึ่งฆาเชื้อแลวปริมาตร 100 ml 

2. เติมเจนตาไมซิน ความเขมขน 0.05g / ml 100 µl 

3. เขียนวันที่เตรียม -ชื่อ 

4. เก็บรักษาไวที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส 

3.2 การตรวจตัวอยาง ไขหวัดนก (Avain influenza virus) โดยใชวิธี ไขไกฟก 

1. คัดเลือกไขไกฟกที่มีอายุ 9 – 11 วัน โดยคัดแยกไขที่เปอนอุจจาระ ดิน ไขแตก ทิ้งไป 

2. นําไขไกที่มีอายุ 9 – 11 วัน มาสองโดยการคัดแยกไขลม ไขลาย ไขราวและไขตายทิ้ง แลวทํา 

เครื่องหมายบริเวณ Air sac สําหรับไขไกมีชีวิต 

3. เช็ดทําความสะอาดไขดวย 70 % Alcohol 

4. จัดใสถาดไขพลาสติกที่สะอาด 

5. พน Alcohol กอนนําไขเขาตู Laminar flow 

6. ใชเข็มเจาะไข เจาะเหนือบริเวณที่ทําเครื่องหมาย Air sac ไวประมาณ 4 mm. 

7. ฉีดยาปฏิชีวนะ 0.02 ml. ที่ความเขมขน 50 ug / ml. เขาไปในไขไกฟกเหนือบริเวณ air sac 

8. ฉีดของเหลวที่ไดจากการเตรียมตัวอยาง (Antigen) ปริมาตร 0.2 ml. เขาใน Allantoic cavity ของไข 

ไกฟกที่มีอายุ 9 – 11 วัน จํานวน 3 – 5 ฟอง ตอตัวอยาง 

9. ใชกาวหรือเทปใสแปะบริเวณรูที่เจาะ นําไขที่ฉีดเชื้อแลวไปไวตูฟกไขที่อุณหภูมิ 35 – 39 องศา 

เซลเซียส เปนเวลา 5 วัน 

10. สองตรวจดูการมีชีวิตของไขไกฟกวันละครั้งเปนเวลา 5 วัน 

11. คัดแยกไขที่ตายออกนําเก็บไวที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส 

12. เมื่อครบกําหนด 5 วัน ใหนําไขที่มีชีวิตมาเก็บไวที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส ทิ้งไว 1 -24 ชั่วโมง จะ 

ทําใหสามารถดูด Allantoic fluid ไดงายขึ้น 

13. กะเทาะเปลือกไขดวย forcep เหนือชอง air sac ใช Syringe 3 ml. กับเข็มเบอร 18 ดูด Allantoic fluid 

มา 3 ml. แลวแบงใส vial tube (ทําเหมือนกันทั้งไขตายและไขมีชีวิต ) 

14. นําไปเก็บที่อุณหภูมิ – 20 องศาเซลเซียส 

15. ไขที่ตายจะนําไปทดสอบ โดยวิธี hemagglutination test (HA) และ Hemagglutination Inhibition test ( 

HI ) 

16. Allantoic fluid จากไขมีชีวิต จะถูกนําไปฉีดเขาไขไกฟกใน Passage ที่ 2 อีกครั้ง

171 


4. การตรวจตัวอยาง ไขหวัดนก (Avain influenza virus) โดยใชวิธี Polymerase chain reaction 

4.1 ขั้นตอนการสารเคมี 

- การเติม carrier RNA ลงไปใน buffer AVL (ชุดสกัด QIAamp viral RNA mini) 

1. เติม 310 ul buffer AVE ลงในหลอดฝาสีแดงที่มี 310 ug lyophilized carrier RNA จะทําใหไดปริมาณ 

ของ carrier RNA 1 ug/ul 

2. พลิกหลอดขึ้นลงจนละลายเปนเนื้อเดียวกัน แบงปริมาณตามความเหมาะสมที่จะใชในแตละครั้ง (*ในแล็ป 

ไขหวัดนกแบงใส microcentrifuge tube หลอดละ 22.4 ul หรือ สําหรับ 4 ตัวอยาง ) 

3. นําไปเก็บไวที่ - 20 องสาเซลเซียส ( ไมควรนํา carrier RNA มา freeze - thaw เกิน 3 ครั้ง ) 

4. นํา buffer AVL มาเช็คดูวามีการตกตะกอนหรือไม หากมี ใหนําไป incubate ที่อุณหภูมิ 80 องศาเซลเซียส 

จนกวาจะละลาย ( ทําการพลิกหลอดไปมาก็ไดเชนกัน ) 

ตารางที่ใชคํานวณปริมาณที่จะใชในการสกัด RNA แตละครั้ง 

Table. Volume of buffer AVL and carrier RNA buffer AVE mix 

No 

sample 

Vol. buffer 

AVL ( ml) 

Vol. carrier RNA 

buffer AVE ( ul ) 

No. 

sample 

Vol. buffer 

AVL ( ml) 

Vol. carrier RNA 

buffer AVE ( ul ) 

1 0.56 5.56 13 7.28 72.8 

2 1.12 11.2 14 7.84 78.4 

3 1.68 16.8 15 8.40 84.0 

4 2.24 22.4 16 8.96 89.6 

5 2.80 28.0 17 9.52 95.2 

6 3.36 33.6 18 10.08 100.8 

7 3.92 39.2 19 10.64 106.4 

8 4.48 44.8 20 11.20 112.0 

9 5.04 50.4 21 11.76 117.6 

10 5.60 56.0 22 12.32 123.2 

11 6.16 61.6 23 12.88 128.8 

12 6.72 67.2 24 13.44 134.4 

Note 

buffer AVL + carrier RNA ควรเตรียมใหมทุกครั้ง สามารถเก็บไวในอุณหภูมิ 2 - 8 องศาเซลเซียส 

ประมาณ 48 ชั่วโมง สารละลายจะตกตะกอน เมื่อเก็บที่ 2 - 8 องศาเซลเซียสซึ่งสามารถละลายไดที่ 80 องศาเซลเซียส 

กอนใช แตไมควรนํามาอุนเกิน 6 ครั้ง และแตละครั้งไมควรเกิน 5 min และการอุนนานเกินไปจะทําให carrier 

RNA เกิดการdegradation 

- การเตรียม buffer AW1 + buffer AW2 

กอนใชครั้งแรกเติม Absolute ethanol (96-100%) เก็บไดประมาณ 1 ป ที่อุณหภูมิหอง เตรียมตามคูมือ 

4.2 ขั้นตอนการสกัด RNA 

สําหรับการสกัด RNA virus จากตัวอยาง 140 ul (plasma, serum, cell culture media or ของเหลวใน 

รางกายตางๆ)

172 


สิ่งที่ตองทํากอนการสกัด RNA 

- นําตัวอยาง+ buffer AVE มาอุนไวที่อุณหภูมิหอง 

1. pipette buffer AVL ( ที่ใส carrier RNA แลว ) มาจํานวน 560 ul ใสลงใน Microcentrifuge tube 1.5 ml 

2. เติมตัวอยาง 140 ul ลงไป และmix + vortex 15 sec. ( ถาตัวอยางเกินกวา 140 ul ใหเพิ่มจํานวน buffer 

AVL ตามสัดสวน) 

3. ทิ้งไวที่อุณหภูมิหอง ประมาณ 10min 

4. ปนเหวี่ยงสักครูใหของเหลวที่ติดตามขอบตกมาดานลาง 

5. เติม Absolute ethanol 560 ul ลงไปในตัวอยาง และ mix + vortex 15 sec. 

6. นําของเหลวจากขอ5 ปริมาณ 630 ul ลงใน QIAamp mini spin column ปดฝาใหแนนและปนเหวี่ยงที่ 8000 

rpm 1 min จนของเหลวใน columnลงไปอยูในหลอดดานลางหมด 

7. เปลี่ยนหลอดดานลางเปนอันใหมและดูดของเหลวที่เหลือทําซ้ําเหมือนขอ6 

8. เปลี่ยนหลอดดานลางและเติม buffer AW1 ลงไปใน spin column 750 ul ปดฝาใหแนนและปนเหวี่ยงที่ 8000 

rpm 1 min จนของเหลวใน columnลงไปอยูในหลอดดานลางหมด 

9. เปลี่ยนหลอดดานลางและเติม buffer AW2 ลงไปใน spin column 750 ul ปดฝาใหแนนและปนเหวี่ยงที่ 

14000 rpm 3 min จนของเหลวใน columnลงไปอยูในหลอดดานลางหมด 

10. ใส QIAamp mini spin columnลงใน Microcentrifuge tube 1.5 ml เปดฝา column และเติม buffer AVE (ที่ 

อุณหภูมิหอง) ลงไป 60 ul ทิ้งไวที่อุณหภูมิหอง ประมาณ 1min นําไปปนเหวี่ยงที่ 8000 rpm 1 min 

11. หลังจากนั้นปดฝาและเก็บไวที่ -20 หรือ -70 องศาเซลเซียส (เก็บไดประมาณ 1 ป) 

4.3 การตรวจวิเคราะห Realtime PCR โดยใช SYBR Green I Dye (ABI 7300) 

เปนการทํา PCR ที่สามารถคํานวณหาปริมาณของ PCR product ได โดยวัดปริมาณการเรืองแสงของสาร 

fluorescent (SYBR Green I Dye ) ที่ติดอยู ในสายคูของ DNA โดย SYBR Green I Dye เปนสารเรืองแสงที่จับกับ 

DNA สายคูซึ่งจะมีการเพิ่มปริมาณตามรอบของการทํา PCR และจะเรืองแสงเมื่อถูกกระตุนดวยแสง UV 

Realtime PCR master mix for SYBR green RT-PCR 

*single primer 

Component stock conc. final conc. Vol / 1 Rxn Vol / Rxn 

2 x SYBR buffer 

( Qiagen) 10 µl 

Rnase free water 2.2 µl 

primer H - for 10 mM 10 mM 1 µl 

primer H - re 10 mM 10 mM 1 µl 

enzyme mix 0.8 µl 

mastermix total 15 µl 

template 5 µl 

total 20 µl

173 


Realtime PCR master mix for SYBR green RT-PCR 

*multiplex primer 


2x SYBR buffer 

( Qiagen) 10 µl 

Rnase free water 3 µl 

primer H - for 10 mM 10 mM 1 µl 

primer H - re 10 mM 10 mM 1 µl 

primer N - for 10 mM 10 mM 1 µl 

primer N - re 10 mM 10 mM 1 µl 

primer M - for 10 mM 10 mM 1 µl 

primer M - re 10 mM 10 mM 1 µl 

enzyme mix 1 µl 



total 25 µl 

Realtime PCR master mix for taqman RT-PCR 

* single 


2x taqman one step RT-PCR master mix ( ABI ) 10 µl 

Rnase free water 1.7 µl 

primer - forward 10 mM 0.5 mM 1 µl 

primer - reverse 10 mM 0.5 mM 1 µl 

probes 6 mM 0.25 mM 0.8 µl 

40x Multiscr 1 µl 



total 25 µl 

Cycling Temperature for SYBR 

Reverse transcription 50 ºC 30 min 

Initial PCR activation step 95 ºC 15 min 

3-step cycling 

Denaturation 94 ºC 30 sec 

Annealing 50 ºC 30 Sec

174 


Extension 72 ºC 1 min 

Number of Cycles: 40 Cycles 

Final extension 72 ºC 10 min 

Cool down at 4 ºC 

Cycling Temperature for Taqman 

Reverse transcription 48 ºC 45 min 

Initial PCR activation step 95 ºC 10 min 

3-step cycling 

Denaturation 94 ºC 15 sec 

Annealing 55 ºC 30 Sec 

Extension 72 ºC 40 Sec 


1. เครื่อง Larminarflow (TELSTAR ® ) 

1. ตรวจสอบแผงกั้นสีเทาใหอยูในตําแหนงที่ถูกตอง 

2. บิด Key switch #1 มาที่ตําแหนง 2 จะสังเกตเห็นคําวา Exhaust flow ขึ้นที่หนาจอ #7 

3. กดปุม UV Lamp #6 แลวกดปุม STOP #10 เพื่อปดเสียงสัญญาณเตือน รอใหแสง UV ทําการฆาเชื้อ 

ประมาณ 15 นาที จากนั้นกดปุม UV Lamp #6 เพื่อปด UV Lamp 

4. บิด Key switch #1 มาที่ตําแหนง 1 แลวกดปุม STOP #10 เพื่อปดเสียงสัญญาณเตือน 

5. นําแผงกั้นสีเทาออก แลวรอไฟ #11 เปลี่ยนจากสีแดงเปนสีเขียว จากนั้นกดปุม STOP#10 เพื่อปดเสียง 

สัญญาณเตือน 

6. ติดตั้งหัว Gas และเปดวาลว Gas จากนั้นกดปุม #3 และ #4 เพื่อเปดหลอดไฟและ Electrical socket 

7. ทําความสะอาดพื้นที่ปฏิบัติงานดวยแอลกอฮอล จากนั้นจึงพรอมใชงาน 

8. ภายหลังใชงานเสร็จใหปดวาลว Gas และนําหัวGas ออก 

9. ทําความสะอาดพื้นที่ปฏิบัติงานดวยแอลกอฮอล จากนั้นกดปุม #3 และ #4 เพื่อปดหลอดไฟและ Electrical 

socket 

10. ปดแผงกั้นสีเทา จากนั้นกดปุม STOP#10 เพื่อปดเสียงสัญญาณเตือน 

11. บิด Key switch #1 มาที่ตําแหนง2 จากนั้นกดปุม UV Lamp #6 แลวกดปุม STOP #10เพื่อปดเสียงสัญญาณ 

เตือนรอใหแสง UVทําการฆาเชื้อประมาณ 15 นาที 

12. กดปุม UV Lamp #6เพื่อปด UV Lamp แลวบิด Key switch #1 ไปที่ตําแหนง 0 เพื่อเสร็จสิ้นการใชงาน

175 


2. เครื่อง Realtime PCR (7300 ABI) 

1. กอนการใชงานเปดเครื่องเพื่อเปนการ warm กอน 15 นาที 

2. เปด UPS 

3. เปดเครื่อง Realtime PCR 

4. เปด computer 

5. พิมพ CODE 7300 จากนั้นคลิกที่ไอคอน “ 7300 system software” 

6. เลือก File กด New จะเขาสูเมนู “ New document wizard “ 

7. คลิกที่ Instrument (ดานบน) เลือก Function test เลือก All test เพื่อเปนการเช็ควาเครื่องพรอมใช 

งานหรือยัง 

8. ถาหนาจอปรากฏคําวา “ PASS ” แสดงวาเครื่องสามารถใชงานได คลิก OK 

9. คลิก Tool (ดานบน) เลือก Detect manager เพื่อเลือก detector ที่ตองการ 

10. คลิกAdd to plate document คลิก OK -----Done 

11. ถาไมมี detector ที่เราตองการ คลิก New detector 

12. เลือก Tool คลิก Detect ors manager เลือก File---New จากนั้นพิมพรายละเอียดของ detector ที่เรา 

ตองการจะสราง เสร็จแลวเลือก OK 

13. จากที่ทําขอ 9,10 แลว นั้นกลับมาที่ Tool (ดานบน) มาที่หนาจอ View –well inspector เลือก use 

14. จากนั้นตั้งชื่อ sample ที่เราตองการโดยคลิกเลือกไปที่ชองที่เราตองการ (หนาจอจะปรากฏเปนหนา 

เพลท 96 well) 

15. เลือก Passive ถาใช SYBR เลือก None / Taqman เลือก ROX 

16. เสร็จแลวคลิก close จากนั้นคลิกเลือก Instrument (ดานลาง) เพื่อตั้งเวลา, อุณหภูมิ (กรณี ที่ใช SYBR 

ตองเลือก Add dissociation stage ดวย), จํานวนรอบที่เราจะใช โดยเราสามารถที่จะเพิ่มหรือลด 

ขั้นตอนตางๆ ไดโดยคลิกที่ Add cycle, Add hold, Add step 

17. - ตั้งชื่อ profile 

- ตั้งคา sample volume ใช 25µl 

- ตั้งคา Data collection เปนการตั้งวาจะใหอานคา product ที่ไดที่stepไหน เครื่องจะทําการอานคา 

เมื่อดําเนินการมาถึงstep นั้น สวนใหญจะเลือกที่ step extention 

18. เสร็จแลวตรวจทานขอมูลที่ไดลงไปทุกอยางวาถูกตองหรือยังจากนั้นคลิก save as ระบบจะทําการ 

บันทึกขอมูลใหเปน .SDS files 

19. จากนั้นไปทําการเตรียม reaction (ใส master mix กอนแลวคอยตามดวย template อยาใหมี 

ฟองอากาศ ถามีใหดีดที่กนหลอดหรือสะบัดหามดูดขึ้นลง) 

20. นําแผนฟลมมาแปะทับที่ plateแลวทําการรีดและกรีดทับรอยที่แปะลงไปใหแนนพยายามอยาใหมือ 

สัมผัสกับแผนฟลมโดยเด็ดขาด จับไดแคสวนปลายของแผนฟลมเทานั้นเพราะเครื่องจะมีความรอน 

สูงถามือที่มีแปงติดอยูไปสัมผัสติดบนแผนฟลมเมื่อแผนฟลมโดนความรอนก็จะละลายทําใหมีการ 

อานคาผิดพลาดได 

21. นํา plate ที่ไดเตรียมไวใสลงในเครื่อง (วางใหถูกมุม) คลิก start เครื่องจะทําการประมวลผลออกมา 

วาจะใชเวลานานเทาไหรในการวิเคราะห

176 


22. หากตองการดูผลระหวางการวิเคราะห คลิก Result โดยจะมีผลอยู 4 แบบ คือ plate, spectra, 

component, amplification plot 

23. ตองการprint ผลการวิเคราะหออกมาเลือก Tool---print --- report setting เลือกรายการที่เราตองการ 

คลิก print

177 

หองปฏิบัติการระบบสืบพันธุ 

ชื่อหองปฏิบัติการ : หองปฏิบัติการระบบสืบพันธุ (Dx3) 

นักวิทยาศาสตรประจําหองปฏิบัติการ : นายธีระพงศ โปธา 

แผนผังหองปฏิบัติการระบบสืบพันธุ 

ประตูทางเขา 

Dx4 Dx6 Dx1 


Dx2 

Dx3 

Dx12 Dx13 Dx14 หองน้ํา Dx5 Dx3 


1. การขอใชหองปฏิบัติการระบบสืบพันธุใหเปนไปตามระเบียบการขอใชหองปฏิบัติการคณะสัตว- 

แพทยศาสตร 


3. นักศึกษาตองทําความเขาใจกับวิธีการทดลองกอนเขาเรียนปฏิบัติการทุกครั้ง 

4. เขาหองปฏิบัติการใหตรงตอเวลา 

5. หามเคลื่อนยายหรือนํา อุปกรณ สารเคมีและครุภัณฑ ภายในหองปฏิบัติการไปโดยไมไดรับอนุญาต 




9. เปลี่ยนรองเทาทุกครั้งกอนเขาใชหองปฏิบัติการ 

10. ในขณะปฏิบัติงานใหนักศึกษาตระหนักถึงความสําคัญของการทําการทดลองอยางจริงจัง 

11. การใชอุปกรณและเครื่องมือในหองปฏิบัติการตองแจงใหเจาหนาที่ทราบทุกครั้ง 

12. ทุกครั้งที่ปฏิบัติงานเสร็จสิ้นลงแลว นักศึกษาตองรับผิดชอบทําความสะอาดของอุปกรณ เครื่องมือ ที่ตนใช 

ปฏิบัติการ 

13. การปฏิบัติอื่นๆ ขึ้นอยูกับการควบคุมและสั่งการของอาจารยผูควบคุม 

14. ปฏิบัติตามขอปฏิบัติการใชหองปฏิบัติการสัตวน้ําอยางเครงครัด 

15. ทรัพยสินมีคาสวนตัวใหเก็บรักษาไวกับตัวนักศึกษา หากเกิดการเสียหายหรือสูญหายใดๆ ทาง 

หองปฏิบัติการไมรับผิดชอบกรณีใดทั้งสิ้น

178 



1. เทคนิคการยอมสีเชื้ออสุจิ 

1. นําสีที่จะใชยอมมาอุนที่อุณหภูมิ 34 -35 องศาเซลเซียส 

2. เตรียมสไลดที่ลางและเช็ดใหสะอาดไว 2 แผน ตองลางใหสะอาดมิเชนนั้นสีที่ยอมจะไมติดหรือจะ 

ขาดหายเปนชวงๆ 

3. ใชดรอปเปอรดูดสวนผสมของสียอมที่อุนไวแลว หยดลงในหลอดทดลองประมาณ 5-6 หยด 

4. ใชดรอปเปอรอีกอันดูดน้ําเชื้อของพอสุกรที่ยังไมไดเจือจางหรือที่รีดมาใหมๆ ใสลงไปในหลอด 

ทดลองที่มีสียอมอยูแลว จํานวน 1 หยด แตถาน้ําเชื้อมีความเขมขนนอย หรือสีใสอาจจะใช 3-4 หยด 

จะทําใหมีตัวอสุจิมากขึ้น ควรระวังในการหยดน้ําเชื้อลงบนสียอมคือ จะตองใหอุณหภูมิของสี 

ยอมเทากับอุณหภูมิของน้ําเชื้อเสมอ 

5. เขยาสวนผสมใหเขากันดี อาจจะทิ้งไวประมาณ 1 นาที หรือนํามาใชยอมเลยก็ได 

6. ใชดรอปเปอรดูดสวนผสมของสีกับน้ําเชื้อจากหลอดทดลองหยดลงบนแผนสไลดที่เตรียมไว ที่ปลาย 

ขางหนึ่ง 

7. ใชปลายขางหนึ่งของสไลดอันที่ 2 ปดทับลงบนหยดของสวนผสมของสีและน้ําเชื้อที่อยูบนสไลดอัน 

แรก โดยใหทํามุมประมาณ 30-40 องศา แลวลากสไลดอันที่ 2 ไปบนสไลดอันที่ 1 จนไดฟลมสีที่ 

บางๆ 

8. ทําใหฟลมสีบางๆ แหงเร็วที่สุดอาจแกวงใหสัมผัสกับอากาศ เมื่อยอมสีติดสไลดดีแลวก็ทํา 

เครื่องหมายไวที่ปลายสไลด โดยเขียนวัน เดือน ป ที่เก็บน้ําเชื้อ เบอรพอสุกรและพันธุลงไป 

9. นําไปสองดูดวยกลองจุลทรรศน ที่กําลังขยาย 1,000 เทา ถาหากไดฟลมที่หนาอาจจะเนื่องมาจากหยด 

สวนผสมน้ําเชื้อกับสียอมลงไปมากเกินไป จะทําใหการดูภาพลําบากควรจะทําใหม 

10. อุปกรณที่ใชในการยอมสี เมื่อใชเสร็จแลวใหรีบลางเลยทันที ถาทิ้งใหแหงจะลางออกลําบาก 

2. การเจือจางน้ําเชื้อเพื่อหาความเขมขนของตัวอสุจิโดยใช Red Cell pipette 

1. ตรวจสอบไปเปตเม็ดเลือดแดง ซึ่งควรจะสะอาดและแหง 

2. ตอทอยางและปากดูดเขากับไปเปตเม็ดเลือดแดง 

3. กวนน้ําเชื้อเขากันใหทั่ว 

4. สุมดูดน้ําเชื้อตอนกลางของภาชนะที่เขาไปในไปเปตเม็ดเลือดแดง ดูดน้ําเชื้อเขาไปถึงขีด 0.5 

5. จุมปลายไปเปตเม็ดเลือดแดงลงในน้ํายาจนถึงขีด 101 ซึ่งจะไดอัตราเจือจาง 1:200 

6. พับสายยางรัดหัวและทายไปเปตเม็ดเลือดแดงไวแลวเขยาประมาณ 1 นาที เพื่อใหสวนผสมน้ําเชื้อและ 

น้ํายาเจือจางเขากัน

179 


3. การเจือจางน้ําเชื้อเพื่อหาความเขมขนของตัวอสุจิโดยใช Micropipette 

1. ใช Micropipette จํานวน 5 ไมโครลิตร ใสลงไปใน Eppendorf 

2. ใช Micropipette ดูดน้ํายาเจือจาง จํานวน 1,000 ไมโครลิตร ใสลงใน Eppendrof ในขอ 1 ซึ่งจะได 

อัตราสวนการเจือจาง 1:200 

3. ทําการปดฝา Eppendrof แลวเขยาใหน้ําเชื้อและน้ํายาเจือจางผสมเขากัน 

4. นําสวนผสมนี้ไปหยดลงในตารางสําหรับนับอสุจิ 

4. การเตรียมน้ําเชื้อที่จะนับจํานวนอสุจิ 

1. วาง cover chamber ปดทับบริเวณตารางสําหรับนับตัวอสุจิ (Counting chamber) 

2. เปาน้ําเชื้อที่เจือจางในไปเปตเม็ดเลือดแดงทิ้ง 4 - 5 หยด แลวใหใชปลาย ไปเปตเม็ดเลือดไปแตะที่ cover 

chamber เพื่อใหสวนผสมของน้ําเชื้อและน้ํายาเจือจางไหลเขาไปจนเต็มบริเวณตารางที่เราจะนับทั้ง 2 ดาน 

3. ถาใชการเจือจางน้ําเชื้อของตัวอสุจิโดยใช Micropipette ก็นําไปแตะที่ cover chamber เพื่อใหสวนผสม 

ของน้ําเชื้อและน้ํายาเจือจางไหลเขาไปจนเต็มบริเวณตารางที่เราจะนับทั้ง 2 ดาน เชนเดียวกับขอ 2 

4. ทิ้งไว 1 นาที นําไปตรวจดวยกลองจุลทรรศน 

5. วิธีนับตัวอสุจิโดยใชกลองจุลทรรศน 

1. ปรับที่กรองแสง (Diaphragm) ของกลองจุลทรรศนใหแสงเขานอยที่สุด 

2. เปดไฟที่กลองจุลทรรศน 

3.นํา Counting chamber ที่เตรียมไวแลวมาวางบนแทนวางสไลดของกลอง จุลทรรศน 

4. ปรับแสงสวางใหเขาไปในกลองจนเห็นไดพอดี 

5. ใชกําลังขยาย 10x, 20x และ 40x ตามลําดับ 

6. จะเห็นตารางทั้งหมด 25 ชอง ซึ่งสี่เหลี่ยมจัตุรัสใหญแตละชองจะมีเสนเล็กๆ 3 ขีดแบงเอาไวและภายใน 

สี่เหลี่ยมจัตุรัสใหญจะมีสี่เหลี่ยมจัตุรัสเล็ก 16 ชอง สุมนับสี่เหลี่ยมใหญทั้งหมด 5 ชอง อยาใหซ้ําตาราง 

เดิม นับจํานวน 4 ครั้งและหาคาเฉลี่ย 

7. การนับอสุจิใหปรับโฟกัสของกลองจุลทรรศนโดยใหเห็นเสนแบงชองสี่เหลี่ยมจัตุรัสใหญใหชัดที่สุด 

เริ่มสุมนับชวงแรก หามปรับโฟกัสอีกหลังจากนับชองแรก นับตัวอสุจิที่เห็นชัดเทานั้น นับทั้งตัวที่ปกติ 

และผิดปกติ อาจจะเริ่มตนจากสี่เหลี่ยมจัตุรัสเล็กมุมซายดานบนแถวแรกกอน แลวไลมาทางขวา 

8.โดยจะนับตัวอสุจิที่อยูในชองสี่เหลี่ยมจัตุรัสใหญและตัวอสุจิที่สวนหัวทับอยูบนเสนกลางของเสนแบง 

เหลี่ยมจัตุรัสใหญทางดานลางกับดานซาย สวนดานบนและดานขวาจะไมนับรวม

180 


6. วิธีคํานวณความเขมขนของตัวอสุจิ 

Neubauer Haemocytometer แบบ Bright line ประกอบดวยสี่เหลี่ยมจัตุรัสใหญ 25 ชอง ซึ่งมีพื้นที่เทากับ 1 

ตารางมิลลิเมตร แตละ 1 ชองสี่เหลี่ยมจัตุรัสใหญจะประกอบดวยสี่เหลี่ยมจัตุรัสเล็ก 16 ชอง ดังนั้นในแตละชอง 

สี่เหลี่ยมจัตุรัสเล็กจะมีพื้นที่เทากับ 1/400 ตารางมิลลิเมตร (1/16*1/25) เมื่อปด Cover chamber สูง 0.1 มิลลิเมตร 

ดังนั้นปริมาตรของแตละตารางสี่เหลี่ยมจัตุรัสเล็ก 1 ชองจะมีคา เทากับ 1/400*0.1 = 1/4,000 ลูกบาศกมิลลิเมตร นับ 

ทั้ง 5 ชองสี่เหลี่ยมจัตุรัสใหญ หรือ 80 ชอง สี่เหลี่ยมจัตุรัสเล็ก ดังนั้นปริมาตรที่นับทั้งหมด 1/4,000*80 เทากับ 1/50 

ลูกบาศกมิลลิเมตร 

1/50 ลูกบาศกมิลลิเมตร ตัวอสุจิที่นับได = N ตัว 

1 ลูกบาศกมิลลิเมตร จะมีอสุจิที่นับได = 50*N ตัว 

เจือจางน้ําเชื้อในอัตราสวน = 1:200 

จํานวนอสุจิตอ 1 ลูกบาศกมิลลิเมตร = N*50*200 ตัว 

ทําใหเปนมิลลิลิตร = N*50*200*1,000 

= 10,000,000 N ตัว/มิลลิลิตร 

ความเขมขนของตัวอสุจิในพอสุกรโดยทั่วไปจะมีคาประมาณ 200-300 ลานตัว/มิลลิลิตร 

7. วิธีเตรียมสียอม Eosin-Nigrosin 


1. สี Eosin 

2. สี Nigrosin 

3. โซเดียมซิเตรท 

วิธีการ 

1. ละลายสี Eosin 1 กรัม ในน้ํา 50 มิลลิลิตร 

2. ละลายสี Nigrosin 5 กรัม และโซเดียมซิเตรท 3 กรัม ในน้ําอุน 50 มิลลิลิตร พรอมกับคนใหสี Nigrosin 

ละลายจนหมด สี Nigrosin นี้ละลายยากในน้ําธรรมดา จึงตองละลายในน้ําอุนหรือน้ํารอน 

3. นําสวนผสมในขอ 1 และ 2 มาผสมรวมกัน แลวคนใหเขากัน 

4. นําสวนผสมที่ไดไปกรองดวยกระดาษกรองอยางนอย 1 ครั้ง เนื่องจากสวนผสมที่ไดยังมีตะกอนของเม็ด 

สี 

5. นําสียอมที่ผานการกรองแลวบรรจุขวดเก็บไวในตูเย็นเพื่อเก็บไวใชตอไป สามารถเก็บไวไดนาน 

มากกวา 1 ป

181 



1. การใชงานเครื่องวัดความเขมขนของน้ําเชื้อ (Spermacue) 

1. เปดสวิทซดานบนซายมือ อุนเครื่องเปนเวลา 10 – 15 นาที 

2. กรณีที่ใชไฟฟากระแสสลับ ตอหมอแปลงเขากับเครื่อง แลวเสียบปลั๊กไฟฟา จากนั้นจึงเปดสวิทซ 

3. ดึงแทนวาง Microcuvette สีดํา ออกจากตัวเครื่องทางดานขวาชาๆ จนลงล็อค 

4. บนหนาจอจะปรากฏ “READY” แสดงสถานะของเครื่องที่พรอมใชงาน 

5. จับ Microcuvette แตะลงไปในน้ําเชื้อที่ตองการวัดความเขมขนในทิศทางตั้งฉากกับผิวน้ําเชื้อ เพื่อให 

น้ําเชื้อถูกดึงดูดขาไปในชองของ Microcuvette จนเต็ม หรือหลีกเลี่ยงการจุมลงไปในน้ําเชื้อโดยตรง ใช Pipette ดูด 

น้ําเชื้อแลวหยดลงในชอง Microcuvette หากมีน้ําเชื้อบางสวนติดดานนอกของ Microcuvette ควรใชกระดาษซับเช็ด 

ออกใหหมด เพื่อผลลัพธที่ถูกตอง 

6. นํา Microcuvette ที่บรรจุน้ําเชื้อวางบนแทนวัดแลวดันเขาหาตัวเครื่องเบาๆ จนเขาล็อค เครื่องจะทํางาน 

โดยอัตโนมัติ ซึ่งจะปรากฏ “MEASURING” บนหนาจอ ผลลัพธจะระบุเปนตัวเลขบนจอมีหนวยเปน 106 (ลานตัว) 

ตอซีซี ถาปรากฏ “HHH” บนจอแสดงวาน้ําเชื้อมีความเขมขนสูงเกินกวาที่เครื่องจะวัดได (มากกวา 1,500 x 106 ตัว 

ตอ ซีซี) ซึ่งตองเจือจางดวยสารละลายน้ําเชื้อกอนในอัตราสวน 1:2 แลวนํามาวัดอีกครั้ง ผลลัพธที่ไดตองคูณตาม 

อัตราสวนการเจือจางกอน จึงเปนผลลัพธที่แทจริง 

7. หลังการวัดใหดึงแทนวาง Microcuvette ออกมาทางขวา เครื่องจะเซ็ตตัวเองไปที่คาศูนยในเวลาไมเกิน 6 

วินาที ซึ่งจะปรากฏ “READY” ที่หนาจออีกครั้งและพรอมสําหรับการวัดครั้งตอไป 

การตรวจสอบเครื่องโดยใชตัวควบคุมมาตรฐาน (CONTROL CUVETTE) 

ชวงการใชงานภายใน 1 สัปดาหควรตรวจสอบคามาตรฐานของเครื่อง 1 ครั้งโดยใช Control cuvette สีแดง 

ซึ่งใหมาพรอมเครื่องทุกเครื่อง วิธีการใชเหมือน Microcuvette ทุกประการยกเวนไมตองบรรจุน้ําเชื้อ กอนการใช 

Control cuvette ใหทําความสะอาดพื้นผิวสวนที่เปนกระจกของ Control cuvette ใหสะอาด ผลลัพธที่ไดควรอยู 

ระหวางคาที่กําหนด 583 ±5 ถาปรากฏคานอกเหนือจากนี้ใหงดใชเครื่องแจงใหเจาหนาที่ดูแลเครื่องทราบเพื่อติดตอ 

บริษัทผูแทนจําหนาย

182 


รหัส สาเหตุ วิธีแกไข 

900 สถานะเครื่องไมแนนอน, cuvette ผิดปกติ เปลี่ยน cuvette ตัวใหม, ใชตัวอยางใหม 

902 ความเขมแสงต่ําเกินไป ทําความสะอาดแหลงกําเนิดแสง, ติดตอบริษัทผูแทน 

จําหนาย 

903 กระแสไฟฟาไมสม่ําเสมอ ใชแบตเตอรี่แทนไฟฟาจากหมอแปลง 

905 ความเขมแสงสูงเกินไป ติดตอบริษัทผูแทนจําหนาย 

906 คาศูนยเริ่มตนไมแนนอน เครื่องอาจเย็นเกินไปใหปดเครื่องปลอยใหอุณหภูมิ 

ลดลงเทากับอุณหภูมิหองแลวเปดอีกครั้ง หรือติดตอ 

บริษัทผูแทนจําหนาย 

907 แบตเตอรี่ออน ปดเครื่องเปลี่ยนแบตเตอรี่ใหม 

HHH ความเขมขนน้ําเชื้อสูงกวา 1,500 x 106 ใหเจือจางน้ําเชื้อกอนการวัด 

2. การใชงานอางน้ําควบคุมอุณหภูมิ (Water bath รุน WB-22 ยี่หอ MEMMERT) 

1. ดูระดับน้ําทุกครั้งกอนเริ่มใชงาน 

2. เติมน้ําในอางใหถึงระดับที่กําหนดไว ซึ่งสังเกตไดที่ผนังอางดานใน โดยตองใชน้ํากลั่น หรือน้ํากรอง 

เพื่อปองกันการเกิดตะกรัน 

3. เสียบปลั๊ก เปดสวิทซ (ON) 


5. การตั้งคาตางๆ ในโปรแกรมที่ตองการ โดยกดปุม set คางไวแลวหมุนปุมเปลี่ยนตําแหนงและปรับตาม 

คาที่ตองการโดย 

Step 1 = การตั้ง h Delay (หนวงเวลา) 

2 = การตั้ง h Hold (การตั้งเวลา) 

3 = การตั้ง LP. (ทําซ้ํา) 

LP.0 ไมทําซ้ํา 

LP.1 ทําซ้ํา 

4 = การตั้ง SP. (เวลาจะทํางานเมื่อถึงอุณหภูมิที่ SET) 

SP.0 เวลาเริ่มนับ หลังจากตั้งเวลาแลว โดยไมคํานึงถึงอุณหภูมิ 

SP.1 เวลาเริ่มนับ หลังจากที่อุณหภูมิถึงจุดที่ SET 

6. รอจนคาอุณหภูมิถึงจุดที่กําหนดแลวนําของที่ตองการอุนมาอุนในอางน้ําควบคุมอุณหภูมิ 

7. ถาอุณหภูมิไมถึงจุดที่กําหนดและมีไฟ Alarm เกิดขึ้น ตองรอใหน้ําเย็นกอนแลวเติมน้ําใหไดระดับ แลว 

กดปุม Reset ดานหลังเครื่องใหดัง คลิ๊ก ไฟ Alarm จะหายไป 

8. เมื่อเสร็จสิ้นการใชงานให ปดสวิทซ (OFF) กรณีที่ไมใชงานเครื่องเปนเวลานาน ปลอยน้ําทิ้งใหหมด 

วาลวอยูทางดานขางของเครื่อง เช็ดใหแหงและปดฝาเครื่อง 

9. หากเครื่องมีปญหากรุณาเรียกเจาหนาที่ที่ดูแลเครื่องมือ เพื่อแกไขปญหาในขั้นตน บันทึกการใชงาน 

เครื่องทุกครั้ง

183 


3. การใชงานกลองปรับอากาศสําหรับเก็บน้ําเชื้อ 

รายละเอียดผลิตภัณฑ 

ความจุ 40 ลิตร 

ขนาด/ปริมาตรภายใน 

44(38) x 30 x 32.5 cm (สูง x กวาง x ยาว) 

ขนาด/ปริมาตรภายนอก 

54 x 39 x 42 (สูง x กวาง x ยาว) 

กระแสไฟ 

12 โวลต กระแสตรง 

กระแสไฟ 

5 แอมแปร 

อุณหภูมิสูงสุด 

40 องศาเซลเซียส 

อุณหภูมิต่ําสุด 10 องศาเซลเซียส 

วิธีการใชงาน 

1. ติดตั้งอุปกรณใหเรียบรอยและถูกตองดังภาพ 

กลองปรับอากาศสําหรับเก็บน้ําเชื้อ 

เครื่องแปลงกระแสไฟฟา 

ไฟฟา 230 โวลต 

(ไฟฟากระแสสลับ) 

2. เปดสวิทซ ที่เครื่องแปลงกระแสไฟฟา 

3. เช็คอุณหภูมิที่ตองการ โดยดูวาอยูในชวงต่ําสุดและสูงสุดที่เครื่องบันทึกไว (ตั้งไวที่ 17– 18 องศาเซลเซียส) หาก 

ตองการปรับอุณหภูมิใหทําการปรับตามหัวขอ การปรับอุณหภูมิเครื่อง 

4. พัดลมจะทํางาน แสดงวาระบบถายเทอากาศทํางาน อุณหภูมิของกลองจะปรับไปยังอุณหภูมิที่ไดตั้งไว 

5. เมื่อเสร็จสิ้นการทํางาน ปดสวิทซ และทําความสะอาดกลองใหเรียบรอย 

6. หากไมมีการใชงานควรเปดฝากลองไว 

ขอควรระวัง 

- กลองนี้ใชกับไฟฟากําลังขยาย 12 โวลต ถาใชกับไฟฟา 230 โวลต ใหตออุปกรณเขากับเครื่องแปลงกระแสไฟฟา 

กอน 

- กลองนี้ไมไดมีไวเพื่อเปนอางน้ําอุน 

- ควรหลีกเลี่ยงการวางกลองใหสัมผัสกับแสงแดดโดยตรง 

- ไมควรวางกลองในบริเวณที่การถายเทอากาศไมดี 

การปรับอุณหภูมิเครื่อง 

การปรับอุณหภูมิเครื่องครั้งแรกตองปรับอุณหภูมิต่ําสุดและสูงสุดของเครื่อง อุณหภูมิภายในจะไมต่ํากวา 

และสูงกวา อุณหภูมิที่ตั้งไวนี้ การตั้งคาทําไดโดย 

1. กดปุม MIN คางไว และ กดปุม Set เพื่อเพื่อทําการตั้งคาอุณหภูมิต่ําสุดตามที่ตองการ

184 


2. กดปุม MAX คางไว และ กดปุม Set เพื่อเพื่อทําการตั้งคาอุณหภูมิสูงสุดตามที่ตองการ 

3. จะเห็นตัวอักษร HI และ LO ปรากฏอยูที่มุมดายซาย ซึ่งแสดงใหทราบถึงอุณหภูมิที่ถูกตอง 

4. การตั้งคาอุณหภูมิสูงสุดและต่ําสุด ไมสามารถกําหนดเปนตัวเลขเดียวกันได 

ตัวอยางเชน 

ตองการใหอุณหภูมิภายในอยูในชวงอุณหภูมิ 16 ถึง17 องศาเซลเซียส 

ตั้งคาอุณหภูมิสูงสุด 17 องศาเซลเซียส 

ตั้งคาอุณหภูมิต่ําสุด 16 องศาเซลเซียส 

การตรวจสอบ 

กดปุม MIN เครื่องจะแสดงอุณหภูมิต่ําสุดที่หนาจอ 

กดปุม MAX เครื่องจะแสดงอุณหภูมิสูงสุดที่หนาจอ 

ภายในเวลา 10 – 30 วินาทีที่เปลี่ยนการตั้งคา กลองจะทําการปรับอุณหภูมิเปนอุณหภูมิใหมที่ตั้ง 

ปญหาที่อาจเกิดขึ้นพรอมวิธีการแกไขเบื้องตน 

ปญหา สาเหตุที่เปนไปได การแกไขเบื้องตน 

- เครื่องไมทํางาน อุณหภูมิ 

แสดงแตอากาศไมหมุนเวียน 

- ความสกปรกของปลั๊ก เมื่อใชภายในรถ 

- ความผิดปกติของระบบไฟ 

- Fuse on relay board 

- ไมไดทําการตั้งคาเครื่อง 

- ไฟไมเขาเครื่อง 

- ทําความสะอาด 

- ปรึกษาชาง 

- เปลี่ยนฟวส 

- ตั้งคาเครื่อง 

- เช็คปลั๊กและสายไฟ เปลี่ยน 

ถาจําเปน 

- ไมรอนหรือไมเย็นแตระบบ 

หมุนเวียนอากาศปกติ 

- ความผิดปกติของ Peltier element - ปรึกษาชาง 

- ตรวจสอบระบบเชื่อมตอ ถา 

จําเปนซอมเปลี่ยนสายเคเบิ้ล 

- หนาจอไมแสดงการตั้งคา - แบตเตอรี่หมด หรือ DTC 17 ผิดปกติ - เปลี่ยนแบตเตอรี่ 

- หนาจอแสดงคาเปน ....C - T –เซนเซอรเสียหาย 

- การเชื่อมตอของปลั๊ก DTC 17 กับ 

ตัวเซนเซอรมีปญหา 

- ปรึกษาชาง 

- ตรวจสอบระบบเชื่อมตอถา 

จําเปนซอมเปลี่ยนสายเคเบิ้ล 

- ระบบถายเทอากาศไมทํางาน - พัดลมมีปญหา - ตรวจสอบวามีการอุดตันหรือไม 

- กลองปรับอากาศไมทําความ 

รอน 

- ตั้งคา LO ผิด - ตั้งคาใหม

185 


4. การใชงานเครื่องวัดความเปนกรด-ดาง (pH meter) 

1. การเปดเครื่อง 

2. การ Calibration 

กดปุม ON/OFF เครื่องจะปรับเปน Mode การวัด pH โดย ควรอุนเครื่องกอนการใชงานประมาณ 15 นาที 

เมื่อเปดเครื่องทํางานใหม จะตองทําการคาลิเบรทคา pH กับ standard buffer กอนใชวัดคา pH ของตัวอยางทุก 

ครั้ง โดยทําการคาลิเบรทคา standard pH 3 จุด (4.01, 7.00 และ 10.01) โดยทําตามขั้นตอนดังนี้ 

2.1 เปดเครื่อง ถาเครื่องไมไดอยูใน Mode การวัด pH โดยการกดปุม “EXIT” และกดปุม “>/CAL” เพื่อ 

เลือก pH หรือ Temp. ตัวที่ถูกเลือกจะกระพริบ ดังที่แสดงในภาพที่ 1 และกด “ENTER” เพื่อยืนยัน แลวเครื่องจะอยู 

ใน Mode การวัด pH ดังแสดงในภาพที่ 2 

ภาพที่ 1 


2.2 กลั้ว electrode ดวยน้ํา de-ionized หรือ rinse solution ถาใชฟงกชัน ATC ใหกลั้ว probe ATC ใน 

ลักษณะเดียวกัน หามถู electrode และ probe เนื่องจากจะทําใหเกิดไฟฟาสถิต และทําใหการคาลิเบรทและการวัดไม 

เสถียรดวย 

2.3 เลือกน้ํายาบัฟเฟอร pH และเทใสภาชนะที่สะอาด 

2.4 จุม electrode และ probe ในบัฟเฟอรที่เตรียมไวโดยใหอยูในสารละลาย แกวงเบาๆ เพื่อใหสารละลาย 

เปนเนื้อเดียวกัน 

2.5 กดปุม “>/CAL” เพื่อเขาสู Mode การคาลิเบรท “Cal Mode Activated, Please wait …” จะกระพริบบน 

หนาจอ ดังแสดงในภาพที ่ 3 ซึ่งเครื่องจะอยูใน Mode การคาลิเบรท pH 


2.6 เมื่อเขาสู standard pH buffer calibration mode จุดสําหรับการคาลิเบรทจุดแรกคือ 7.00 แถวบนจะ 

ปรากฏคาที่อานไดขณะนั้น และบรรทัดลางจะปรากฏ “Auto Buf Scan : 7.00” คา pH จะหยุดกระพริบเมื่อคาคงที่ 

ดังแสดงในภาพที่ 4 ถาคาบัฟเฟอรที่เลือกไวไมอยูในชวง ± 1 ของคา pH ที่วัดได “Auto pH Scan” จะเปลี่ยนไป 

เรื่อยๆ จนกวาคา pH ที่วัดไดจะอยูในชวง ± 1

186 



2.7 เมื่อคา pH ที่อานไดคงที่แลว กดปุม “ENTER” จะมีประโยค “pH offset Cal Done” กระพริบที่บรรทัด 

ลาง ดังแสดงในภาพที่ 5 


2.8 กลั้ว electrode และ probe ดวยน้ํา de-ionized หรือ rinse solution และจุมลงในน้ํายาบัฟเฟอรคาตอไป 

แถวลางจะปรากฏคาน้ํายาบัฟเฟอรนั้นโดยอัตโนมัติ 

2.9 รอใหคา pH ที่วัดไดคงที่ โดยคา pH ที่แถวบนจะหยุดกระพริบเมื่อคาที่วัดไดคงที่ 

2.10 เมื่อคาที่อานไดคงที่แลว กดปุม “ENTER” ที่แถวลางจะมีขอความ “2 Point Cal Done” ดังแสดงใน 

ภาพที่ 6 ทําตามขอ 8-10 เพื่อทําการคาลิเบรทแตละจุด เมื่อคาลิเบรทเสร็จแลว กดปุม “EXIT” ขอความ “Sys. 

Updating… Please wait…” จะกระพริบบนหนาจอ แลวเครื่องจะกลับสู Mode การวัด pH 

3. การวัดคา pH ของตัวอยาง 


3.1 ลาง electrode ดวยน้ํา de-ionized หรือ น้ํากลั่น โดยฉีดลางบริเวณที่จะตองสัมผัสกับสารละลายตัวอยาง 

ใหสะอาดมากที่สุด เพื่อจะเอาสิ่งปนเปอนตางๆ ออกไป ถา electrode แหงใหทําการแชใน electrode solution หรือ 

สารละลาย 2M – 4M KCl แลวใชกระดาษทิชชูซับใหแหง หามเช็ดตัว electrode โดยตรง 

3.2 กดปุม “ON” บรรทัดบนจะปรากฏคา pH ที่อานไดและอุณหภูมิขณะนั้น และมีสัญลักษณชี้วาใชการ 

ชดเชยอุณหภูมิอัตโนมัติหรือแบบ manual ที่บรรทัดลางจะปรากฏ วัน เดือน ป และเวลา ดังแสดงในภาพที่ 7 


3.3 จุม electrode และ probe ชดเชยอุณหภูมิ ลงในสารละลายตัวอยาง ใหสารละลายทวมตัว electrode และ 

probe กวนสารละลายเบาๆ เพื่อใหความเขมขนของสารละลายตัวอยางเปนเนื้อเดียวกัน 

3.4 รอจนกระทั่งเครื่องอานคา pH ไดคงที่ สังเกตไดจากสัญลักษณ “pH” จะหยุดกระพริบ 

3.5 เมื่อเสร็จสิ้นการวัดคา pH ของตัวอยางแตละครั้ง ควรลาง electrode และ probe ชดเชยอุณหภูมิ ดวยน้ํา 

กลั่น แลวแช electrode ลงในขวดสําหรับสวมปลาย electrode หาม ปลอยใหสัมผัสอากาศจนแหงโดยเด็ดขาด

ภาคผนวก 210 แบบฟอรมการขอใชหองปฏิบัติการ/ 

ครุภัณฑ/วัสดุอุปกรณ

ภาคผนวก ขั้นตอนการขอใชหองปฏิบัติการ/ 

ครุภัณฑ/วัสดุอุปกรณ 

ขั้นตอนการขอใชหองปฏิบัติการ/ครุภัณฑ/วัสดุอุปกรณ 

คณะสัตวแพทยศาสตร มหาวิทยาลัยเชียงใหม 

1. ตรวจสอบตารางการใชหองปฏิบัติการจากนักวิทยาศาสตรประจําหองปฏิบัติการ 

2. เขียนคําขอใชหองปฏิบัติการลวงหนาอยางนอย 1 สัปดาห เพื่อลงตารางการใชหองปฏิบัติการ โดยจะใหสิทธิ์แกผูที่ยื่นใบขอ 

ใชหองกอน – หลังตามลําดับ สามารถขอรับแบบฟอรมการขอใชหองปฏิบัติการไดที่หองปฏิบัติการนั้นๆ หรือที่ธุรการ 

สาขาวิชาที่หองปฏิบัติการนั้นสังกัด 

3. กรอกรายละเอียดตามที่กําหนดไวในแบบฟอรม แจงรายละเอียดเกี่ยวกับอุปกรณ สารเคมี ครุภัณฑ ที่ตองการใช เพื่อให 

นักวิทยาศาสตรประจําหองปฏิบัติการไดจัดเตรียมไวให แลวยื่นเอกสารไดที่นักวิทยาศาสตรประจําหองปฏิบัติการ นั้นๆ 

4. นักวิทยาศาสตรประจําหองปฏิบัติการนั้นๆ พิจารณาอนุมัติ และแจงผลกลับไปยังผูขอใชหองปฏิบัติการ ภายใน 3 วัน 

5. ลงชื่อในบันทึกการใชหองปฏิบัติการทุกครั้ง 

6. ทําความสะอาดอุปกรณตางๆ ใหเรียบรอยหลังการใชงาน แลวสงคืนตามกําหนด 

7. ปฏิบัติตามขอปฏิบัติการใชหองปฏิบัติการอยางเครงครัด 

8. ขั้นตอนการขอใชหองปฏิบัติการ/ครุภัณฑ/วัสดุอุปกรณจะถือวาเสร็จสิ้นสมบูรณเมื่อไดรับการพิจารณาจากนักวิทยาศาสตร 

ประจําหองปฏิบัติการนั้น 

9. ในกรณีที่นักศึกษาตองการใชหองปฏิบัติการเพื่องานวิจัย ใหอาจารยที่ปรึกษางานวิจัยเปนผูดําเนินการขอใชหองปฏิบัติการ 

10. ในกรณีที่นักศึกษาตองการใชหองปฏิบัติการเพื่อกิจกรรมตางๆ ใหติดตองานกิจการนักศึกษาเพื่อชวยประสานงานในการ 

ดําเนินการขอใชหองปฏิบัติการ โดยผูขอใชตองเปนอาจารยที่ปรึกษาโครงการ 

11. กรณีเกิดความชํารุดเสียหายตอทรัพยสินของทางราชการ ผูขอใชตองเปนผูรับผิดชอบในเบื้องตน ตามระเบียบหรือไดตกลง 

ไวในแบบฟอรมการขอใชหองปฏิบัติการ และในกรณีที่อาจารยเปนผูขอใชใหกับนักศึกษา ใหถือวานักศึกษามีสวนในการ 

รับผิดชอบดวย 

12. ในกรณีที่นักวิทยาศาสตรไมสามารถพิจารณาไดเอง หรือเห็นสมควรจะตองมีการพิจารณาเพิ่มเติม ใหนําเรื่องเสนอหัวหนา 

สาขาเปนผูพิจารณา 

13. กรณีที่ครุภัณฑมีลักษณะการใชงานภายนอกหองปฏิบัติการและใชงานติดตอกันหลายๆ ครั้ง ใหทําเรื่องเคลื่อนยายในครั้ง 

แรก พรอมแนบตารางการใชงาน 

หมายเหตุ : 

1. กรณียืม ครุภัณฑออกนอกหองปฏิบัติการ ใหใชแบบฟอรม ใบเคลื่อนยาย/ใบยืมครุภัณฑ ของคณะสัตวแพทยศาสตร 

มหาวิทยาลัยเชียงใหม 

2. กรณียืม วัสดุอุปกรณ ออกนอกหองปฏิบัติการ ใหใชแบบฟอรมการขอใชหองปฏิบัติการ/ครุภัณฑ/วัสดุอุปกรณ คณะสัตว- 

แพทยศาสตร มหาวิทยาลัยเชียงใหม 

3. การขอใชหองปฏิบัติการใดๆ สําหรับการวิจัยทั้งปซึ่งอาจตรงกับการเรียนการสอนใหนักวิทยาศาสตรประสานงานกับหัวหนา 

สาขาวิชาโดยตรง 

บันทึกรายละเอียดเพิ่มเติม (ถามี) : 

..................................................................................................................................................................................... 

..................................................................................................................................................................................... 

..................................................................................................................................................................................... 

..................................................................................................................................................................................... 

..................................................................................................................................................................................... 

.....................................................................................................................................................................................

ภาคผนวก ขั้นตอนการปฏิบัติงานหองปฏิบัติการ

à¸à¸¹à¹à¸¡à¸·à¸­à¸à¸²à¸£à¹à¸à¹à¸«à¹à¸­à¸à¸à¸à¸´à¸à¸±à¸à¸´à¸à¸²à¸£ (à¸à¸à¸±à¸à¸à¸£à¸±à¸à¸à¸£à¸¸à¸à¸à¸µ 2555)

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?

à¸à¸¹à¹à¸¡à¸·à¸à¸à¸²à¸£à¹à¸à¹à¸«à¹à¸à¸à¸à¸à¸´à¸à¸±à¸à¸´à¸à¸²à¸£ (à¸à¸à¸±à¸à¸à¸£à¸±à¸à¸à¸£à¸¸à¸à¸à¸µ 2555)