Determination of Phenolic Acid and Antioxidant Activity from ... - CRDC

Agricultural Sci. J. 42(2)(Suppl.): 377-380 (2011) ว. วิทย์. กษ. 42(2)(พิเศษ): 377-380 (2554)
การวิเคราะห์กรดฟี นอลิกและฤทธิ ต้านออกซิเดชั นของสารสกัดจากฟางข้าว
Determination of Phenolic Acid and Antioxidant Activity from Rice Straw Extracts
สุภัทรา ลิลิตชาญ 1 สุดารัตน์ สุพานิช 1 ธัญญลักษณ์ ทอนราช 1 ปฐมาภรณ์ พิทักษ์ภากร 1 และ นิตยา เทพปฐม 1
Lilitchan, S. 1 , Supanich, S. 1 , Thonrach, T. 1 , Pitakphakorn, P. 1 and Teppathom, N. 1
Abstract
Rice husk is the low-value agricultural waste. In recent year, researcher found that the straw contains
the important phenolic acid. Phenolic acid is a good antioxidant. There have been several studies indicated
that this compound has many applications in food, medical and cosmetics. The primary objective of this study
is to determine the phenolic acid composition of the waxy rice (RD 2) and rice (Pathumthani 1) straw extracts
by using High performance liquid chromatography (HPLC). Another objective is to analyze the total phenolic
compounds and antioxidant activity of these extracts. The results showed that the three major phenolic acids
in Pathumthani 1 straw extract was p-coumaric, ferulic and syringic acid. While the two major phenolic acids in
RD 2 straw extract was ferulic and syringic acid. In addition, the major portion of phenolic acids existed in
insoluble form. Analysis of total phenolics using Folin–Ciocalteu reagent showed that 12.94 and 12.98 (mg
GAE/100g) from Pathumthani 1 and RD 2 rice straw extracts, respectively. With DPPH radical-scavenging
assay, percentage inhibition was 44.6 % and 48.3 % from Pathumthani 1 and RD 2 rice straw extracts,
respectively. This study demonstrates that rice straw still contains useful bioactive compounds with high
antioxidant properties. In further study, the safe extracted product will be evaluated for food and cosmetics.
Keywords: rice straw, phenolic acid, antioxidant activity, extraction
บทคัดย่อ
ฟางข้าวเป็ นของเหลือทิ งทางการเกษตร ซึงมีรายงานวิจัยพบว่าในฟางข้าวยังคงประกอบไปด้วยสารสําคัญกรดฟี
นอลิก (phenolic acids) ซึงเป็ นสารต้านออกซิเดชันทีดี มีผลการศึกษาวิจัยทีระบุว่าสารนี มีคุณประโยชน์มากมายทั ง
ทางด้านอาหาร ทางการแพทย์ และเครืองสําอาง โดยวัตถุประสงค์หลักในงานวิจัยนี คือศึกษาองค์ประกอบของกรดฟี นอลิก
ของสารสกัดจากฟางข้าวเหนียว (พันธุ ์กข 2) และข้าวเจ้า (พันธุ ์ปทุมธานี 1) โดยใช้เทคนิคโครมาโทรกราฟี ของเหลวสมรรถนะ
สูง (High performance liquid chromatography, HPLC) รวมทั งปริมาณสารประกอบฟี นอลิกทั งหมดและฤทธิ การต้านออก
ซิเดชัน จากผลการทดลองพบ สารสกัดทีได้จากฟางข้าวพันธุ ์ปทุมธานี 1 ประกอบด้วยกรดฟี นอลิกหลักอยู ่ 3 ชนิด ได้แก่ กรด
พาราคูมาลิก กรดเฟอรูลิก และกรดไซรินจิก ส่วนฟางข้าวพันธุ ์กข 2 พบกรดฟี นอลิกเป็ นองค์ประกอบหลักเพียง 2 ชนิดได้แก่
กรดเฟอรูลิก และกรดไซรินจิก และพบว่ากรดฟี นอลิกทีสกัดได้จากฟางข้าวส่วนใหญ่อยู ่ในรูป Insoluble ผลการวิเคราะห์
ปริมาณสารประกอบฟี นอลิกทั งหมดด้วยวิธี Folin-Ciocalteu พบว่า สารสกัดทีได้จากฟางข้าวพันธุ ์ปทุมธานี 1 และพันธุ ์กข 2
มีปริมาณสารประกอบฟี นอลิกทั งหมด 12.94 และ 12.98 (mg GAE/100g) ตามลําดับ และผลการวิเคราะห์ฤทธิ ต้านออกซิ
เดชันต่อ DPPH ของฟางข้าวรายงานในรูปเปอร์เซ็นการยับยั งอนุมูลอิสระ พบว่า สารสกัดทีได้จากฟางข้าวพันธุ ์ปทุมธานี 1
และพันธุ ์กข 2 มีฤทธิ ต้านการออกซิเดชัน 44.6% และ 48.3 % ตามลําดับ จากการศึกษานี ชี ให้เห็นว่าฟางข้าวยังคงเป็ นแหล่ง
วัตถุดิบทีมีองค์ประกอบของกรดฟี นอลิกและสารสําคัญทางชีวภาพทีมีสมบัติในการต้านออกซิเดชันสูง และควรมีการศึกษา
ความปลอดภัยของสารทีสกัดได้จากฟางข้าวนี เพือนํามาใช้กับอาหารหรือเครืองสําอางต่อไป
คําสําคัญ: ฟางข้าว กรดฟี นอลิก ฤทธิ ต้านออกซิเดชัน การสกัด
คํานํา
ฟางข้าวเป็ นของเหลือทิ งทางการเกษตรทีมีราคาตํา จากการศึกษาทีผ่านมาของ Tilay และคณะ (2008) พบว่าใน
ฟางข้าวสาลียังคงมีสารสําคัญกรดฟี นอลิก (phenolic acids) ซึงสารสําคัญนี จัดว่าเป็ นวัตถุดิบทีสําคัญในอุตสาหกรรม
1
ภาควิชาโภชนวิทยา คณะสาธารณสุขศาสตร์ มหาวิทยาลัยมหิดล 420/1 ถนนราชวิถี ราชเทวี กทม. 10400
1
Department of Nutrition, Faculty of Public Health, Mahidol University, 420/1 Rajchavithi Rd., Rajchathevee, Bangkok 10400

378 6 ปี ที 42 ฉบับที 2 (พิเศษ) พฤษภาคม - สิงหาคม 2554 ว. วิทยาศาสตร์เกษตร
อาหารและเครืองสําอาง นอกจากนี ยังพบว่ามีการนําสารนี มาใช้ในรูปของยาและผลิตภัณฑ์เสริมอาหารอีกด้วย (Alothman
และคณะ, 2009) ปัจจุบันประเทศไทยยังต้องนําเข้าสารเหล่านี จากต่างประเทศซึงมีราคาสูง ในขณะประเทศไทยมีวัตถุดิบ
ฟางข้าวซึงเป็ นของเหลือทิ งทางการเกษตรจํานวนมาก แต่ยังไม่มีการศึกษาวิจัยเกียวกับการนําสารสําคัญดังกล่าวจากฟาง
ข้าวมาใช้ประโยชน์เพือเพิมมูลค่าให้กับฟางข้าวไทย ดังนั นในการศึกษานี จึงมีความสนใจศึกษาองค์ประกอบของกรดฟี นอลิก
ในฟางข้าวด้วยเทคนิค isocratic HPLC รวมทั งหาปริมาณสารฟี นอลิกทั งหมดและฤทธิ การต้านออกซิเดชันของสารสกัดจาก
ฟางข้าวเพือเป็ นข้อมูลเบื องต้นทีจะช่วยเพิมมูลค่าให้กับฟางข้าวซึงเป็ นวัสดุเหลือทิ งทางการเกษตร และทดแทนการนําเข้า
ของสารสําคัญกรดฟี นอลิกได้
อุปกรณ์และวิธีการ
ฟางข้าวเจ้า (พันธุ ์ปทุมธานี1) จากศูนย์วิจัยข้าวปทุมธานี จังหวัดปทุมธานี และ ฟางข้าวเหนียว (พันธุ ์กข 2) จาก
จังหวัดนครพนม สารมาตรฐานกรดฟี นอลิกจาก Fluka chemical (Buchs, Switerland) ตัวทําละลายอินทรีย์ทีใช้เป็ น
analytical grade จาก Merck (Darmstadt, Germany) ตัวอย่างฟางข้าวนํามาบดให้ละเอียดและร่อนผ่านตะแกรงร่อน
ขนาด 50 MESH เก็บใส่ถุงพลาสติกปิ ดสนิททึบแสง เก็บในตู ้แช่แข็งทีอุณหภูมิ -18 ๐ C
ทําการสกัด soluble phenolic acid จากฟางข้าว ตามวิธีของ Renuka และ Arumughan (2007) โดยใช้ตัวอย่าง
ฟางข้าว 10 กรัมต่อเมทานอล 750 มิลลิลิตร สกัดด้วย Soxhlet extractor เป็ นเวลา 10 ชัวโมง และทําการสกัด Insoluble
phenolic acid จากฟางข้าว ดัดแปลงจากวิธีของ Adom และ Liu (2002) โดยใช้กากฟางข้าวทีสกัด soluble phenolic
acid ปริมาณ 10 กรัม มาไฮโดรไลซ์ด้วย 2 โมลาร์ของโซเดียมไฮดรอกไซด์ (30 มิลลิลิตร) เขย่าภายใต้ก๊าซไนโตรเจนที
อุณหภูมิห้องเป็ นเวลาประมาณ 1 ชัวโมง แล้วปรับสภาวะของสารละลายให้ได้ค่า pH 2 ด้วยกรดไฮโดรคลอริกเข้มข้น 6 โม
ลาร์ และนํามาสกัดด้วยเฮกเซน 30 มิลลิลิตร สกัดต่อด้วยเอททิลอาซิเตท 30 มิลลิลิตร แล้วนําไประเหยจนเอททิลอาซิเตท
แห้ง นําทั งสองส่วนมาทําการวิเคราะห์หาองค์ประกอบของกรดฟีนอลิกด้วย HPLC บนคอลัมน์ C 18 reversed-phase
HPLC pump รุ่น Waters 510 UV-Detector โดย mobile phase ทีใช้คือ 2% acetic acid ในนํ าต่อเมทานอลในอัตราส่วน
82:18 (Bonoli และคณะ, 2004) โดยควบคุมอัตราการไหลของวัฏภาคเคลือนทีเท่ากับ 1.5 มิลลิลิตร/นาที ใช้ระบบการแยก
สารแบบ isocratic elution ตรวจวิเคราะห์ด้วย UV-spectrophotometry detector รุ่น Waters 2487 ทีความยาวคลืนที
280 และ 320 นาโนเมตร
นําสารสกัดทีเหลือนําไปวิเคราะห์หาปริมาณสารประกอบฟี นอลิกทั งหมดตามวิธีของ Alothman และคณะ (2009)
โดยนําสารสกัดฟางข้าว 0.1 มิลลิลิตร ผสมกับ Folin-Ciocalteu reagent 0.5 มิลลิลิตร และ นํ า 6 มิลลิลิตร ตั งทิ งไว้ 2 นาที
ทีอุณหภูมิห้อง จากนั นเติม Na 2 CO 3 7.5% (นํ าหนักต่อปริมาตร) ปริมาตร 2 มิลลิลิตรตั งทิ งไว้ทีอุณหภูมิห้อง 30 วินาที ปรับ
ปริมาตรด้วยนํ ากลันให้ปริมาตรสุดท้ายเป็ น 10 มิลลิลิตร ตั งทิ งไว้ทีอุณหภูมิห้อง 1 ชัวโมง แล้วนํามาวัดค่าการดูดกลืนแสง
ด้วยเครืองสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ทีความยาวคลืน 765 นาโนเมตร เปรียบเทียบผลโดยใช้กราฟมาตรฐานของสารละลายกรด
แกลลิก และหาฤทธิ ต้านออกซิเดชัน ตามวิธีของ Alothman และคณะ (2009) โดยนําสารสกัดฟางข้าวปริมาตร 0.1
มิลลิลิตร ผสมกับ DPPH 2.5 มิลลิโมลาร์ ในเมทานอลปริมาตร 1.9 มิลลิลิตร ผสมให้เข้ากันแล้วทิ งไว้ในทีมืดเป็ นเวลา 30
นาที จากนั นวัดค่าการดูดกลืนแสงด้วยเครืองสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ทีความยาวคลืน 515 นาโนเมตร ฤทธิ ต้านออกซิเดชันต่อ
DPPH รายงานในรูปของเปอร์เซ็น (% inhibition)
ผลและวิจารณ์ผลการทดลอง
ในการศึกษานี มุ ่งเน้นพัฒนาวิธีวิเคราะห์สารด้วยเทคนิค HPLC แบบ isocratic elution ผลการทดสอบการใช้ได้ของ
การวิเคราะห์ด้วย HPLC สรุปไว้ใน Table 1 ได้กราฟมาตรฐานทีมีความสัมพันธ์อย่างเป็ นเส้นตรง (R 2 มีค่าสูงกว่า 0.999)
จากผลการทดสอบหาค่า LOD จาก 3 เท่าของ SD และ LOQ จาก 10 เท่าของ SD ได้ LOD เท่ากับ 0.0001 และ LOQ
เท่ากับ 0.0003 mg/kg ซึงแสดงถึงว่าวิธีนี มีสมรรถนะดี สามารถวิเคราะห์ปริมาณตัวอย่างทีมีความเข้มข้นตําได้ ซึงเหมาะสม
กับการวิเคราะห์องค์ประกอบของกรดฟี นอลิกในตัวอย่างฟางข้าว (Figure 1) ในขณะที Figure 2 แสดงปริมาณของกรดฟี
นอลิกในฟางข้าว พบว่า soluble phenolic acid ในสารกัดจากฟางข้าวสายพันธุ ์ปทุมธานี 1 พบกรดไซรินจิก กรดพาราคูมา
ริก และกรดเฟอรูลิก โดยพบกรดพาราคูมาริกมีปริมาณสูงทีสุด ส่วนฟางข้าวพันธุ ์กข 2 พบกรดไซรินจิก และกรดเฟอรูลิก โดย
ทีกรดเฟอรูลิกมีปริมาณสูงกว่ากรดไซรินจิก Insoluble phenolic acid ของฟางข้าวทั ง 2 สายพันธุ ์พบกรดพาราคูมาริกและ
กรดเฟอรูลิก ซึงฟางข้าวสายพันธุ ์ปทุมธานี 1 มีปริมาณกรดพาราคูมาริกสูงกว่ากรดเฟอรูลิก และทั ง 2 สายพันธุ ์มีปริมาณกรด

ว. วิทยาศาสตร์เกษตร ปี ที 42 ฉบับที 2 (พิเศษ) พฤษภาคม - สิงหาคม 2554 379
เฟอรูลิกใกล้เคียงกัน นอกจากนี พบว่ากรดฟี นอลิกส่วนใหญ่ในรูปของ Insoluble phenolic acid ซึงสอดคล้องกับงานวิจัยที
ผ่านมา พบว่ากรดฟี นอลิกในธัญพืชส่วนใหญ่จะอยู ่ในรูป bound phenolic acid (Laokuldilok และคณะ, 2011; Liu, 2007)
Table 1 Standard calibration curves, maximum wavelengths (λ max ) and method validation data for
determination of caffeic acid, chlorogenic acid, syringic acid, p-coumaric acid and ferulic acid by
isocratic HPLC-UV detection
Compound Linear range Calibration curves
LOD LOQ λ max (nm)
(mg/ml) Regression R 2 (mg/ml) (mg/ml)
equation a
Caffeic acid 0.001-0.1 Y = 66334.53x 0.9997 0.0001 0.0003 320
Chlorogenic acid 0.001-0.1 Y = 37736.06x 0.9987 0.0003 0.001 320
Syringic acid 0.001-0.1 Y = 38998.54x 0.9998 0.0001 0.0002 280
p-coumaric acid 0.001-0.1 Y = 85720.67x 0.9999 0.0001 0.0004 320
Ferulic acid 0.001-0.1 Y = 69463.45x 0.9959 0.0001 0.0003 320
a
y = peak area, x = concentration (mg/ml)
Figure 1 Chromatogram of soluble (left) and insoluble (right) phenolic acid from Pathum Thani 1 rice straw
extract. Peaks : (a) Syringic acid (b) p-Coumaric acid (c) Ferulic acid detected at 2 nm.
Figure 2 Soluble (left) and insoluble (right) phenolic acid content from rice straw extract.
จากการศึกษาพบว่า soluble phenolic acid ของสารสกัดจากฟางข้าวพันธุ ์ปทุมธานี 1 และพันธุ ์กข 2 มีปริมาณ
สารประกอบฟี นอลิกทั งหมด เท่ากับ 12.94 และ 12.98 (mg GAE/100g) ตามลําดับ นอกจากนี ได้ศึกษาฤทธิ ต้านอนุมูล
อิสระ DPPH ของฟางข้าว ซึงรายงานในรูปเปอร์เซ็นต์การยับยั งของอนุมูลอิสระ DPPH พบว่า soluble phenolic acid ของ
สารสกัดจากฟางข้าวพันธุ ์ปทุมธานี 1 และพันธุ ์กข 2 มีฤทธิต้านการออกซิเดชัน 44.6% และ 48.3% ตามลําดับ ซึงชี ให้เห็น
ว่าฟางข้าวยังคงเป็ นแหล่งวัตถุดิบทีมีองค์ประกอบของสารสําคัญทางชีวภาพทีมีสมบัติในการต้านออกซิเดชันสูง (Table 2)

378 380 6 ปี ที 42 ฉบับที 2 (พิเศษ) พฤษภาคม - สิงหาคม 2554 ว. วิทยาศาสตร์เกษตร
Table 2 Total phenolic content (TPC) and antioxidant activity (DPPH assay) in soluble phenolic acid from
different rice straw extracts
Varieties TPC (mg GAE/100 g of straw) 1 DPPH radical scavenging activity
(% inhibition )
Pathum Thani 1 12.94±0.011 44.6
RD 2 12.98±0.002 48.3
1 Values are mean±SD (n=3).
สรุปผล
การศึกษานี สามารถพัฒนาวิธีวิเคราะห์องค์ประกอบของกรดฟี นอลิกในฟางข้าวด้วย Isocratic HPLC ซึงเป็ นวิธีที
สะดวก รวดเร็ว และถูกต้อง เหมาะกับการนํามาใช้สําหรับงานวิเคราะห์ทีต้องทําเป็ นประจํา จากผลการทดลองพบปริมาณ
กรดฟี นอลิกในฟางข้าวจะแตกต่างกันขึ นกับชนิดของสายพันธุ ์ข้าว โดยพบว่ากรดเฟอรูลิกและกรดพาราคูมาลิกเป็ น
องค์ประกอบหลักในฟางข้าวทั งสองสายพันธุ ์ และกรดฟี นอลิกทีพบส่วนใหญ่จะอยู ่ในรูป insoluble จากการศึกษานี ชี ให้เห็น
ว่าฟางข้าวยังคงมีสมบัติในการต้านออกซิเดชันสูง ดังนั นฟางข้าวเป็ นแหล่งของสารต้านออกซิเดชันธรรมชาติทีน่าสนใจและ
มีคุณค่า
คําขอบคุณ
ขอขอบคุณมูลนิธิโทเรเพือการส่งเสริมวิทยาศาสตร์ ประเทศไทยทีให้การสนับสนุนทุนวิจัยในการศึกษานี
เอกสารอ้างอิง
Adom, K.K. and Liu, R.H., 2002, Antioxidant Activity of Grains, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50:
6182-6187.
Alothman, M., Bhat, R. and Karim, A.A., 2009, Antioxidant Capacity and Phenolic Content of Selected Tropical
Fruits from Malaysia, Extracted with Different Solvent, Food chemistry, 115: 785-788.
Bonoli, M., Verardo, V., Marconi, E. and Caboni, M.F., 2004, Antioxidant Phenols in Barley (Hordeum vulgare
L.) Flour: Comparative Spectrophotometric Study among Extraction Methods of Free and Bound Phenolic
Compounds, Journal of Agricultural and Food chemistry, 52: 5195-5200.
Laokuldilok, T., Shoemaker, C.F., Jongkaewwattana, S. and Tulyathan, V., 2011, Antioxidants and Antioxidant
Activity of Several Pigmented Rice Brans, Journal of Agricultural and Food chemistry, 59: 193-199.
Liu, R.H., 2007, Whole Grain Phytochemicals and Health, Journal of Cereal Science, 46: 207-219.
Renuka, D.R. and Arumughan, C., 2007, Phytochemical Characterization of Defatted Rice Bran and
Optimization of a Process for their Extraction and Enrichment, Bioresource Technology, 98: 3037-3043.
Tilay, A., Bule, M., Kishenkumar, J. and Annapure, U., 2008, Preparation of Ferulic Acid from Agricultural
Wastes: Its Improved Extraction and Purification, Journal of Agricultural and Food chemistry, 56: 7644-
7648.