תקציר
17.02.2015 • Views
Share Embed Flag

תקציר

תקציר

תקציר

SHOW MORE
SHOW LESS
ePAPER READ
DOWNLOAD ePAPER
shemer.mslib.huji.ac.il

Create successful ePaper yourself

Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.

START NOW

תקציר<br />

חישת הטעם הינה מערכת מורכבת המאפשרת לבעלי חיים לזהות ולברור מקורות מזון איכותיים בהתאם<br />

לצרכים הפיסיולוגיים ולמנוע הרעלה.‏ תאי הטעם<br />

(taste receptor cells)<br />

ממוקמים בעיקר בלשון ומרוכזים יחד ביחידות מורפולוגיות בשם פקיעיות הטעם<br />

בעצמן מאורגנות בתוך שלושה סוגים של פפילות<br />

האחראים על חישה זו<br />

buds) (taste אשר<br />

circumvallate ו-‏ folate ,fungiform :(papillae)<br />

.(CV)<br />

הקולטנים אשר אחראים על זיהוי וקשירת התרכובות המתוקות<br />

(T1Rs)<br />

והמרות<br />

(T2Rs)<br />

שבמזון התגלו לפני מספר שנים ומשתייכים למשפחה הרחבה של קולטנים התלויים בחלבון<br />

G<br />

.(GPCRs)<br />

גירוי חוש הטעם הינו תהליך מהיר אשר מסתיים תוך שניות ספורות.‏ למרות זאת,‏ טעמם של<br />

טעמנים מרים וממתיקים לא סוכריים רבים נמשך לתקופות ארוכות יותר,‏ עד מספר דקות,‏ תופעה המכונה<br />

שאריתיות.‏ התחושה הלא נעימה שנגרמת כתוצאה מכך מונעת צריכה גדולה יותר של מגוון רחב של<br />

מזונות בעלי ערך תזונתי,‏ כגון ירקות המכילים טעמנים מרים או מוצרים דיאטטים המכילים ממתיקים דלי<br />

קלוריות.‏ למרות השלכותיה,‏ המנגנון המולקולרי של תופעה זו אינו ידוע.‏<br />

רבים מן התרכובות המרות והממתיקים המלאכותיים הם בעלי אופי אמפיפטי,‏ כלומר מכילים קבוצות<br />

הידרופיליות והידרופוביות במבנה הכימי שלהם.‏ מחקרים הראו כי תכונה זו מאפשרת למולקולות אלו<br />

לחדור במהירות ממברנות ליפידיות של ליפוזומים ואף ממברנות פלסמטיות של תאים ביתר קלות.‏ בנוסף,‏<br />

מחקרים אלקטרופיזיולוגיים וביוכימיים הראו פעילות מוגברת של תאי הטעם כתוצאה מחשיפתם<br />

לטעמנים אמפיפטיים.‏ השערת העבודה הינה שבמקביל להפעלת קולטני הטעם,‏ טעמנים אמפיפטיים<br />

חודרים את הממברנה הפלסמטית של תאי הטעם.‏ בתוך ציטוזול התאים,‏ אותם הטעמנים יכולים לבוא<br />

במגע עם מרכיבים ציטוזוליים שונים,‏ ובין היתר לשבש את תהליך הדסנסיטיזציה של הקולטנים ע"י<br />

עיכוב קינאזות הקשורות לכיבוי הסיגנל,‏ כגון הקינאזות ממשפחת ה-‏<br />

.(GPCR kinases) GRKs<br />

במקרה כזה,‏ על פי השערת העבודה,‏ הטעמנים האמפיפטיים גורמים לקולטני הטעם להיות פעילים<br />

ולסיגנל להימשך לזמן רב יותר,‏ ולכן גורמים לתחושת השאריתיות.‏<br />

מחקרים קודמים הראו שטעמנים אמפיפטיים חודרים לתוך תאי טעם מפפילות<br />

CV<br />

או פקיעיות טעם<br />

מבודדות.‏ המטרה הראשונה במחקר הנוכחי היה להוכיח כי יכולת זו קיימת גם בתנאים פיזיולוגיים,‏ בהם<br />

תאי הטעם חשופים לטעמנים אך ורק מצידם האפיקלי.‏ חשיפתה של פפילת CV שלמה לתמיסות טעמנים<br />

אמפיפטיים בעלי פלואורסצנציה עצמית תחת מיקרוסקופ קונפוקלי פלואורסצנטי אפשר לעקוב אחר<br />

חדירתם של הטעמנים לתוך הפפילה.‏ הופעתה של פלואורסצנציה בדיוק בתעלת הפפילה,‏ בה ממוקמות<br />

מרבית פקיעיות הטעם,‏ הראתה כי הטעמנים חודרים ומצטברים בתוך פקיעיות הטעם עצמן.‏ חוסר יכולתו<br />

של מדעיך הפלואורסצנציה KI להפחית את עוצמת הפלואורסצנציה אשר התקבלה לאחר חשיפתה של<br />

פפילת ה-‏ CV לטעמנים השונים הוכיח כי אלה אכן חדרו לתוך ציטוזול התאים.‏ בנוסף,‏ הזרמת תמיסות<br />

טעמנים שונים לתוך פיה של חולדה מורדמת הובילה למציאת ריכוזים גבוהים ‏(מילימולרים)‏ של אותם<br />

הטעמנים בתוך ציטוזול תאי הטעם,‏ כפי שנקבע בעזרת<br />

.HPLC<br />

יחד,‏ תוצאות אלו תומכות לא רק<br />

1

בהשערה כי הטעמנים אכן חודרים בתנאים פיזיולוגיים לתוך ציטוזול תאי הטעם,‏ אלא מראות שבמקרים<br />

מסוימים,‏ כמו קפאין וכינין,‏ טעמנים אלה עשויים להצטבר כנגד מפל הריכוזים.‏<br />

בהמשך נבחנה נוכחותן של קינאזות ממשפחת ה-‏<br />

,GRKs<br />

האחראיות על תהליך הדסנסיטיזציה של<br />

קולטנים ממשפחת ה-‏ ,GPCR בתאי פקיעית הטעם של פפילת .CV תוצאות מניסוי RT-PCR הראו כי<br />

GRK5 ,GRK3 ,GRK2<br />

GRK6 ו-‏<br />

מתבטאים בפפילת ה-‏<br />

CV<br />

עצמה אך גם באפיתל הלא-סנסורי<br />

הסמוך לה בלשון.‏ צביעה פלואורסצנטית של חתכי פפילת CV בעזרת נוגדנים המכוונים כנגד כל אחד<br />

מה-‏ GRKs הראתה שלעומת<br />

GRK5 ו-‏<br />

בעיקר בתאים הלא-סנסוריים שברקמת הפפילה.‏ רמת הביטוי של<br />

שמיקומה לא נקבע.‏<br />

מכיוון שתהליך הדסנסיטזציה של הקולטנים לטעם המתוק והמר<br />

β2AR שימש בהמשך המחקר כמודל המייצג את כלל משפחת ה-‏<br />

GRK2 אשר מתבטאים בפקיעיות הטעם עצמן,‏<br />

GRK6 נמצא<br />

,GRK3<br />

,T1Rs)<br />

.GPCRs<br />

לעומת זאת,‏ נמצאה כה נמוכה<br />

(T2Rs אינו ידוע,‏ הקולטן ה-‏<br />

על מנת להוכיח את השערת<br />

העבודה ולחקור את השפעותיהם של טעמנים אמפיפטיים על תהליך הדסנסיטיזציה של הקולטן ה -<br />

,β2AR<br />

בוטא הקולטן באופן מלאכותי בתאי<br />

.HeLa<br />

תאים אלו נבחרו כתאי המודל הטובים ביותר<br />

להמשך המחקר על בסיס יכולתם של הטעמנים לחדור לתוכם ולהגיע לריכוזים ציטוזוליים הדומים לאלו<br />

שנמצאו בתאי הטעם.‏ נבחנו השפעותיהן של שש תרכובות אמפיפטיות,‏ שלוש מתוקות ‏(סכרין,‏<br />

D-TRP<br />

ו-‏ ,(NHD<br />

.β2AR<br />

cAMP ה-‏<br />

ושלוש מרות ‏(קפאין,‏ נרינגין וכינין).‏ ראשית,‏ נבחנה השפעת הטעמנים על תפקוד הקולטן ה-‏<br />

חשיפה מוקדמת של התאים לטעמנים השונים למשך 10 דקות גרמה להגברה משמעותית ברמות<br />

בתגובה ל-‏<br />

,(ISO) isoproterenol<br />

הראו כי הטעמנים לא פעלו כליגנדים לקוטלן ה-‏<br />

הכרחית על מנת לקבל את ההגברה ברמות ה-‏<br />

אשר נמשכה גם 2 דקות לאחר גירוי הקולטן.‏ התוצאות<br />

,β2AR<br />

,cAMP<br />

ושחדירתם לתוך ציטוזול התאים הייתה<br />

דבר אשר מוכיח כי מקור השפעת הטעמנים היה<br />

ציטוזולי ולא רצפטורלי.‏ בנוסף,‏ השפעתם של הטעמנים על רמות השליח המשני לא הייתה תלויה<br />

בפעילותם של<br />

,PDE<br />

אשר אחראי על פירוק נוקלאוטידים ציקליים בתא,‏ או של ,PKA אשר משתתף<br />

בתהליך הדסנסיטיזציה של הקולטן.‏ תוצאות אלו יחד מצביעות על כך שההגברה שנראתה ברמות ה-‏<br />

cAMP בנוכחות הטעמנים נבעה מהגברה בפעילות הקולטן עצמו.‏ בהמשך,‏ נעשה שימוש בנוגדן המכוון<br />

ספציפית כנגד אתר בקולטן המזורחן ע"י<br />

GRK2 ו-‏ GRK5 בלבד,‏<br />

על מנת לעקוב אחר התקדמותו של<br />

תהליך הדסנסיטיזציה.‏ חשיפה של התאים לטעמנים השונים גרמה לא רק לעיכוב בעוצמת הזרחון של<br />

הקולטן אלא גם להשהיה בזמן הופעתו.‏ בנוסף,‏ תהליך האינטרנליזציה אשר תלוי בזרחון הקולטן ע"י ה-‏<br />

,GRKs<br />

ה-‏<br />

ומתאפיין בהחדרת הקולטן לציטוזול התאים,‏ נמצא אף הוא מעוכב בנוכחות הטעמנים.‏ עיכוב זה<br />

תורגם באחוז גבוה יותר של תאים המכילים קולטן ממברנלי ונוכחות גדולה יותר של קולטן בממברנה<br />

הפלסמטית של התאים גם 15-20 דקות לאחר גירוי הקולטן.‏ תהליך נוסף אשר תלוי בזרחון הקולטן ע"י<br />

.(Mitogen-activated protein kinase) MAPK הינו מסלול ה-‏ GRKs<br />

מופעל מצד אחד כתוצאה מזרחון הקולטן ה-‏ β2AR ע"י PKA אך גם לאחר קשירת<br />

הקולטן המזורחנים ע"י<br />

מסלול העברת אותות זה<br />

β-arrestin לאתרי<br />

.GRKs<br />

כתוצאה מהפעלת מסלול זה,‏ מזורחן ומשופעל<br />

.ERK<br />

הטעמנים לא<br />

2

.PKA<br />

השפיעו על רמת הזרחון הבסיסית של ERK<br />

‏,וגם לא על<br />

ב-‏ התלוי השפעול<br />

לעומת זאת,‏<br />

הם<br />

עיכבו ספציפית את השפעול התלוי במסלול ה-‏ .GRKs/β-arrestin<br />

לסיכום,‏ תוצאות עבודה זו מוכיחות את השערת העבודה לפיה טעמנים אמפיפטיים חודרי ממברנות<br />

מעכבים את הקינאזות ממשפחת ה-‏ GRKs ולכן משבשים את מהלך הדסנסיטיזציה של הקולטן.‏ כתוצאה<br />

מכך,‏ הטעמנים גורמים לקולטן עצמו להיות פעיל יותר לזמן ארוך יותר.‏ ייתכן ומנגנון זה יסביר בעתיד<br />

את תחושת השאריתיות המורגשת בזמן טעימת טעמנים מרים וממתיקים מלאכותיים.‏ מכיוון שקינאזות ה-‏<br />

GRKs<br />

משתתפות בדסנסיטיזציה של מגוון רחב של קולטנים,‏ ייתכן ולטעמנים האמפיפטיים השפעות<br />

רחבות יותר משל חישת הטעם עצמה.‏ למשל,‏ ידוע כי טעמנים אלה מגיעים במהירות לאפיתל המעי,‏ אשר<br />

הוכח לאחרונה כי הוא מכיל קולטנים T1Rs המעורבים בוויסות ספיגת הגלוקוז ואולי רכיבים תזונתיים<br />

נוספים.‏ בנוסף,‏ ידוע כי מספר תרכובות כגון קפאין,‏ נרינגין או סכרין יכולות להימצא בדם ובאיברים<br />

שונים בגוף מספר דקות לאחר צריכתן.‏ ייתכן כי טעמנים כאלה יוכלו להשפיע באותם האיברים על<br />

תהליכים פיזיולוגיים התלויים בקולטנים אחרים השייכים למשפחת ה-‏<br />

. GPCRs<br />

3

תוכן עניינים<br />

.1<br />

8 ........................................................................................................<br />

1.1<br />

- 1.2 חישת הטעם...........................................................................................................‏ 8<br />

9 .......................................................................................<br />

1.3<br />

10 .............................................................................<br />

- 1.4<br />

10 ................................................................................................... 1.4.1<br />

13 ................................................................................................<br />

1.4.2<br />

15 .........................................................................<br />

1.4.3<br />

16 ................................................................................................<br />

1.4.4<br />

16 ................................................................................................<br />

1.4.5<br />

17 ............................................<br />

1.5<br />

17 .........................................<br />

1.5.1<br />

1.5.2<br />

1.6<br />

20 ..................................................... GPCRs<br />

1.6.1<br />

22 ...............................................GRKs<br />

1.6.2<br />

22 ................................................................................GRK2<br />

1.6.3<br />

24 .............GPCRs<br />

1.6.4<br />

1.7<br />

28.............................................................................................................<br />

.2<br />

- 2.1 חומרים...............................................................................................................‏ 28<br />

28 .............................................................................................<br />

2.1.1<br />

- 2.1.2 נוגדנים,‏<br />

- 2.1.3 בופרים ותמיסות............................................................................................‏ 30<br />

2.2 שיטות .................................................................................................................. 32<br />

(in situ)<br />

2.2.1<br />

מבוא.............................................................................................................................‏‎8‎<br />

- חושים כימיים<br />

- אברוני חוש הטעם ביונקים<br />

מנגנונים תאיים של חישת הטעם<br />

- הטעם המר<br />

- הטעם המתוק<br />

- הטעם האוממי ‏(חומצות אמינו)‏<br />

- הטעם המלוח<br />

- הטעם החמוץ<br />

- העברת אותות בין-תאית וקידוד הטעם במערכת הפריפרית<br />

- העברת המידע אל תאי העצב לאחר גירוי קולטני הטעם<br />

- תתי אוכלוסיות שונות של תאי טעם מבחינות בין הטעמים השונים............................‏ 18<br />

- מנגנון סיום העברת האותות ‏(דסנסיטיזציה)‏ של קולטנים מסוג ............................GPCR 20<br />

- תהליך הדסנסיטיזציה של קולטני ה-‏<br />

- מאפיינים מבניים של קינאזות ממשפחת ה-‏<br />

- בקרה על פעילות<br />

- שפעול מסלולי העברת האותות לאחר הדסנסיטיזציה של קולטני ה-‏<br />

- חשיבות המחקר ומטרת העבודה...............................................................................‏ 24<br />

חומרים ושיטות<br />

- רשימת חומרים<br />

אנזימים,‏ חומצות גרעין וערכות.............................................................‏ 29<br />

- הדמיית חדירת טעמנים לתוך פפילות CV שלמות תוך מעקב דינמי במיקרוסקופ<br />

קונפוקלי פלואורסצנטי...............................................................................................‏ 32<br />

- הפרדת פפילת ה-‏ CV בחולדה<br />

- הפרדת תוכן התאים מרקמת פפילת CV וקביעת כמות חלבון..................................‏ 33<br />

- חדירת הטעמן לתוך תאי הטעם של פפילת CV<br />

- קביעה כמותית של טעמנים בתוך תאי טעם מפפילת CV בעזרת שיטת ...........HPLC 35<br />

33 .........................................................................<br />

2.2.2<br />

2.2.3<br />

vivo) (in בחולדות מורדמות ............ 34<br />

2.2.4<br />

2.2.5<br />

36 ....................................................................................................RT-PCR - 2.2.6<br />

2.2.6.1<br />

36 ...............................................................Reverse Transcription (RT) - 2.2.6.2<br />

37 ...................................................Polymerase Chain Reaction (PCR) - 2.2.6.3<br />

37 ........................................................................................<br />

2.2.6.4<br />

37 ..................................................(sequences)<br />

2.2.6.5<br />

2.2.7<br />

38 ..................................................................................................<br />

2.2.7.1<br />

2.2.7.2<br />

39 ..................................... Western blot<br />

2.2.7.3<br />

40 ................................................... HeLa<br />

2.2.8<br />

- 2.2.8.1 החזקת תאים..........................................................................................‏ 40<br />

40 ...................... HeLa<br />

2.2.8.2<br />

41 .........................................................................<br />

2.2.9<br />

- הפקת רנ"א כללי RNA) (total מתוך פפילת CV ואפיתל לא סנסורי................‏ 36<br />

- בחירת תחלים<br />

- קביעת רצף חומצות הגרעין<br />

- קביעת נוכחות קינאזות ממשפחת ה-‏ GRK בפפילת CV ע"י צביעת חתכים מרקמות לשון<br />

‏(אימונוהיסטוכימיה)‏<br />

- הכנת חתכים מלשון................................................................................‏ 38<br />

- צביעת חתכי פפילת CV בעזרת נוגדנים.......................................................‏ 39<br />

- בדיקת ספציפיות של נוגדנים בשיטת<br />

- קביעת חדירת טעמנים אמפיפטיים בתאי<br />

– הכנת תמיסות סטוק של הטעמנים וקביעת חדירתם לתאי<br />

- מדידת שינויים ברמות cAMP<br />

4

- 2.2.9.1 ביטוי מלאכותי ‏(טרנספקציה)‏ של הקולטן ה-‏ β2AR בתאי ....................HeLa 41<br />

- 2.2.9.2 הכנת הדוגמאות......................................................................................‏ 41<br />

42 ....................... (RIA) radioimmunoassay<br />

2.2.9.3<br />

42 ..................................................................<br />

2.2.9.4<br />

2.2.10<br />

- 2.2.10.1 הכנת הדוגמאות....................................................................................‏ 42<br />

2.2.10.2<br />

43 .........<br />

2.2.10.3<br />

2.2.11<br />

- 2.2.12 מידור<br />

- 2.2.13 קביעת שפעול של ...............................................................................ERK 45<br />

2.2.14<br />

.3<br />

3.1<br />

3.1.1<br />

47 .........................................................<br />

3.1.2<br />

GRKs בפפילת CV בחולדות ............... 48<br />

3.2<br />

48 ....................................<br />

3.2.1- ביטוי<br />

49 .........................immunostaining<br />

3.2.2<br />

- קביעת כמות cAMP בשיטת ה-‏<br />

- קביעת חלבון בשיטת ברדפורד<br />

- קביעת רמת הזרחון של הקולטן הבטא-אדרנרגי לאחר גירוי..................................‏ 42<br />

- קשירת החרוזים לנוגדן כנגד .............................................................HA 43<br />

- השקעה אימונית (immunoprecipitation) של הקולטן הבטא-אדרנרגי<br />

- מדידת אינטרנליזציה של הקולטן הבטא-אדרנרגי לאחר גירוי............................‏ 44<br />

‏(פרקציונציה)‏ של התא.........................................................................‏ 44<br />

- ניתוח סטטיסטי של התוצאות..........................................................................‏ 45<br />

תוצאות........................................................................................................................‏‎46‎<br />

- חדירת טעמנים אמפיפטיים לפפילות CV שלמות.........................................................‏ 46<br />

- מעקב אחר חדירת הטעמנים במיקרוסקופ קונפוקלי...............................................‏ 46<br />

- חדירת טעמנים אמפיפטיים במודל של חיות<br />

- נוכחות ודפוס התבטאות של קינאזות ממשפחת ה-‏<br />

RT-PCR בשיטת ה-‏ CV שונים בפפילת ה-‏ GRKs<br />

– קביעת מיקומם של ה-‏ GRKs השונים בשיטת<br />

3.3- חקר השפעת הטעמנים על מנגנון הדסנסיטיזציה של קולטני GPCRs בעזרת מודל בתאי HeLa<br />

51 .................................................................................................................................<br />

3.3.1- חדירת טעמנים אמפיפטיים מרים ומתוקים לתאי ..........................................HeLa 51<br />

3.3.2- השפעת טעמנים אמפיפטיים על היווצרות השליח המשני cAMP לאחר גירוי הקולטן ה-‏<br />

51 ................................................................................................................... β2AR<br />

3.3.2.1- הטעמנים האמפיפטיים גורמים להגברה תלוית ריכוז ביצירת ה-‏ cAMP בתגובה<br />

לגירוי הקולטן ה-‏ β2AR ע"י ISO<br />

- הטעמנים האמפיפטיים אינם פועלים כליגנדים אנדוגניים<br />

- פראינקובציה של הטעמן עם התאים הינה הכרחית להשפעתו על יצירת cAMP<br />

בתגובה לגירוי הקולטן ה-‏ β2AR<br />

- השפעת הטעמנים איננה תלויה ב-‏ PDE או ב-‏ .PKA<br />

- השפעת הטעמנים על זרחון הקולטן ה-‏ β2AR ע"י GRK2/5 בעקבות גירוי ע"י ISO<br />

- השפעת הטעמנים על מנגנון האינטרנליזציה של הקולטן ה-‏ ..........................β2AR 58<br />

– השפעת חשיפת התאים לטעמנים על מסלול העברת האותות של ERK בתגובה לגירוי עם<br />

52 ...........................................................................<br />

52 .................................<br />

3.3.2.2<br />

3.3.2.3<br />

54 .............................................................................<br />

55 ...................................<br />

3.3.2.4<br />

56<br />

3.3.3<br />

3.3.4<br />

3.3.5<br />

61 ..................................................................................................................... .ISO<br />

.4<br />

63 ...............................................................<br />

4.1<br />

4.2<br />

4.3<br />

67 ...................................................................................................GRKs<br />

דיון ומסקנות.................................................................................................................‏‎63‎<br />

- חדירת טעמנים אמפיפטיים לתוך תאי הטעם<br />

- איפיון ביטוי קינאזות ממשפחת ה-‏ GRKs בתאי פפילת ה-‏ CV בחולדה...........................‏ 66<br />

- טעמנים אמפיפטיים מעכבים את הדסנסיטיזציה של קולטני ה-‏ GPCRs על ידי עיכוב פעילותן<br />

של קינאזות ה-‏<br />

רשימת ספרות...................................................................................................................‏‎74‎<br />

5

רשימת קיצורים<br />

β2AR<br />

BSA<br />

cAMP<br />

CAFF<br />

CCCP<br />

cGMP<br />

CLT<br />

CV<br />

D-TRP<br />

DABCO<br />

DAG<br />

DMEM<br />

DMSO<br />

EGTA<br />

ERK<br />

FBS<br />

G protein<br />

GAPDH<br />

GMP<br />

GPCR<br />

GRK<br />

HEPES<br />

HPLC<br />

IBMX<br />

IMP<br />

IP 3<br />

ISO<br />

KI<br />

MAPK<br />

MSG<br />

β2-adrenergic receptor<br />

Bovine serum albumin<br />

Adenosine 3’-5’ cyclic monophosphate<br />

Caffeine<br />

Carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone<br />

Guanine 3’-5’ cyclic monophosphate<br />

Cyclo(Leu-Trp) / Cyclo(L-Leucine-L-Tryptophan)<br />

Circumvallate<br />

D-Tryptophan<br />

1,4-Diazabicyclo [2.2.2] octane<br />

Diacylgycerol<br />

Dulbecco's Modified Eagle's Medium<br />

Dimethylsulfoxide<br />

Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N’,N’-tetraacetic<br />

acid<br />

Extracellular signal-regulated kinase<br />

Fetal bovine serum<br />

Guanine nucleotide binding protein<br />

Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase<br />

Guanosine 5’-monophosphate<br />

G-protein-coupled receptor<br />

G-protein-coupled receptor kinase<br />

(N-[2-hydroxyethyl]piperazine-N’-[2-ethanesulfonic acid])<br />

High performance liquid chromatography<br />

3-Isobutyl 1-methylxanthine<br />

Inosine 5’-monophosphate<br />

Inositol 1,4,5-trisphosphate<br />

Isoproterenol hydrochloride<br />

Potassium iodide<br />

Mitogen-activated protein kinase<br />

Monosodium glutamate<br />

6

NaF<br />

Sodium fluoride<br />

NAR<br />

Naringin<br />

NHD<br />

Neohesperidin dihydrochalcone<br />

PBS<br />

Phosphate buffered saline<br />

PCR<br />

Polymerase chain reaction<br />

PDE<br />

Phosphodiesterase<br />

PI<br />

Propidium iodide<br />

PKA<br />

Phosphokinase A<br />

PKC<br />

Phosphokinase C<br />

PLC<br />

Phospholipase C<br />

QUIN<br />

Quinine<br />

RIA<br />

Radio-immuno assay<br />

RIPA<br />

Radio-immunoprecipitation assay buffer<br />

RT<br />

Reverse transcription<br />

SACC<br />

Saccharin<br />

T1R Taste receptor family 1<br />

T2R Taste receptor family 2<br />

TCA<br />

Trichloroacetic acid<br />

7

1. מבוא<br />

- חושים כימיים<br />

1.1<br />

היכולת לזהות,‏ לפרש ולהגיב לגירויים סביבתיים הינה תכונה חיונית להתפתחותם,‏ הסתגלותם<br />

והישרדותם של בעלי חיים בסביבה בה הם חיים.‏ מנגנוני החישה הפריפריים הכוללים חישת גירויים<br />

חיצוניים ‏(חושי הראייה,‏ השמיעה והמישוש)‏ וחישת גירויים החודרים לתוך הגוף ‏(חוש הטעם והריח)‏<br />

נועדו למטרה זו.‏<br />

חוש הריח וחוש הטעם המזהים חומרים כימים,‏ נדיפים או מוצקים בהתאמה,‏ הינן שתי מערכות חישה<br />

המאפשרות זיהוי מקורות מזון וסכנות מסוגים שונים ‏(אויבים או רעלים).‏ מערכת חישת הריח מורכבת<br />

משני איברים המופרדים מבחינה פיזית:‏ האפיתל האולפקטורי באף אשר אחראי על זיהוי המגוון האדיר<br />

של הריחנים הקיימים MOE) (main olfactory epithelium ואזור נוסף הנקרא האברון הוומרונזלי<br />

,(vomeronasal organ VNO)<br />

המשתתף בתהליך חישת הפרומונים המגדירים התנהגות מינית כגון<br />

רביה,‏ תוקפנות כלפי בעלי חיים אחרים ועוד.‏ אפיתל חוש הטעם<br />

,(taste sensory epithelium)<br />

הממוקם בלשון,‏ בחך ובתחילת הוושט מספק מידע מידי על הרכב היונים,‏ הימצאות מרכיבים עתירי<br />

קלוריות ונוכחות חומרים לא רצויים במזון.‏ למרות מיקום נפרד ותפקידים פיזיולוגיים שונים,‏ חוש הטעם<br />

והריח משתפים פעולה לעיתים קרובות:‏ בהערכת איכות המזון למשל,‏ חוש הריח מאפשר לזהות מראש<br />

מזון מקולקל או להגביר את התיאבון למאכלים מסוימים.‏ בנוסף,‏ ריחנים המשתחררים לאחר לעיסת<br />

המזון ומגיעים לחלל הפה מגרים את התאים הסנסוריים הממוקמים במוקוזה:‏ השילוב בין חוש הטעם<br />

לחוש הריח יפורש בזיכרון כ"טעם המזון"‏<br />

.(42)<br />

- חישת הטעם<br />

1.2<br />

חישת הטעם משחקת תפקיד מרכזי בתזונת בעלי החיים,‏ בהערכת ההרכב היוני והקלורי של המזון ובזיהוי<br />

חומרים העלולים להיות רעילים.‏ כיום הוכח שיונקים מסוגלים להבחין בין חמישה טעמים שונים:‏ בנוסף<br />

לארבעת הטעמים הידועים מתוק,‏ מר,‏ מלוח וחמוץ,‏ טעם המונוסודיום גלוטמאט התגלה כייחודי ומכונה<br />

כעת בספרות ‏"הטעם האוממי".‏ קיימת עדיין מחלוקת לגבי קיומו של ‏"הטעם השומני":‏ יש הטוענים כי<br />

מדובר אך ורק בתחושת מרקם,‏ אך לפני כמה שנים התגלו ראיות בהן חומצות שומניות חופשיות מסוגלות<br />

לעורר תגובה בתאי טעם דרך תעלות אשלגן ולגרום להעברת אותות<br />

.(53)<br />

טעמנים מתוקים,‏ מלוחים או אוממי וכן נוכחות חומצות שומן במזון מעוררים תחושה שלעיתים מהנה<br />

ומעוררת תיאבון.‏ תגובות אלו חשובות מבחינה אבולוציונית בכך שהן מאפשרות לבעלי החיים להעדיף<br />

מזונות עתירי אנרגיה הדרושים להישרדות.‏ חישת הטעם המר ובמידה מסוימת גם החמוץ חיונית לא פחות<br />

ומהווה קו הגנה,‏ מאחר והיא מאפשרת,‏ ביחד עם חוש הריח,‏ זיהוי מזון מקולקל או חומרים רעילים<br />

8

טבעיים ‏(טוקסינים)‏ כגון אלקלואידים צמחיים.‏ לכן תגובה אופיינית,‏ מולדת ברוב היונקים,‏ לטעם מר<br />

הינה סלידה.‏ יש לציין יחד עם זאת שדחיית הטעם המר איננה חד משמעית:‏ חלק משמעותי מן החומרים<br />

המרים והחמוצים הם בעלי חשיבות תזונתית ‏(חסה,‏ כרוב,‏ כרובית,‏ ברוקולי)‏ ואפילו מעוררי תיאבון<br />

‏(לימון,‏ אשכוליות,‏ תפוחים,‏ סודה לשתייה ועוד).‏ בנוסף להערכת הרכב יוני וקלורי,‏ נמצא שלמערכת<br />

חישת הטעם מנגנונים מיוחדים להערכת ריכוז המים מול ריכוז המומסים במזון הנבלע ולכן לחישת הטעם<br />

המלוח,‏ החמוץ וטעם המים חשיבות בשמירה על איזון מערכתי של אוסמולריות וריכוז יונים מעבר<br />

להספקת יונים חיוניים לגוף<br />

.(124)<br />

- אברוני חוש הטעם ביונקים<br />

1.3<br />

תאי הטעם TRCs) (taste receptor cells - האחראים על חישת הטעם הינם תאים נוירואפיתליאליים<br />

קטנים<br />

‏(אורכם 40-60 μm וקוטרם (20-40 μm<br />

בעלי אופי ביפולרי:‏ באזור האפיקלי נמצאים מיקרווילי<br />

(microvilli) המכילים את הקולטנים לטעם,‏ ובצד הבזולטרלי מועבר המידע למוח במנגנון מורכב הכולל<br />

תקשורת בין תאים וקשרים סינפטיים עם סיבים עצביים<br />

מורפולוגיות הנקראות פקיעיות טעם<br />

.(143)<br />

,(taste buds)<br />

ל-‏ 50 ובתוכן בין<br />

תאי הטעם מאורגנים ביחידות<br />

150<br />

תאים,‏ כאשר כל התאים<br />

מפנים את המיקרווילי לעבר פתח פקיעית הטעם pore) (taste החשוף לחלל הפה וכך למזון ולטעמנים.‏<br />

תאי הטעם,‏ המכונים מבחינה היסטורית גם תאים מסוג<br />

,(type II cells) II<br />

נמצאים בפקיעית בסמיכות<br />

לשלושה סוגי תאים נוספים IV) (type ,I III and האחראים בין היתר על תקשורת בין תאית,‏ העברת<br />

המידע למוח,‏ חידוש תאי הפקיעית ועוד.‏ פקיעיות הטעם נמצאות בעיקר על הלשון אך ניתן למצוא בודדות<br />

בין תאי האפיתל בכל חלל הפה.‏ באדם,‏ בערך שני שליש מפקיעיות הטעם מאורגנות באברונים הנקראים<br />

פפילות<br />

.(taste papillae)<br />

הטעם שהן מכילות:‏<br />

מבחינים בשלושה סוגי פפילות,‏ הנבדלות במבנה,‏ מיקום ומספר פקיעיות<br />

fungiform papillae<br />

הלשון ומכילות פקיעיות בודדות,‏<br />

מספר גדול יותר של פקיעיות,‏ ו-‏<br />

foliate papillae<br />

הנמצאות במספר רב ‏(מאות)‏ בעיקר בשליש הקדמי של<br />

circumvallate papillae<br />

הממוקמות בצידיו האחוריים של הלשון ומכילים<br />

הנמצאות בחלק האחורי של הלשון<br />

במספרים בודדים (1-5 לפי בעל החיים)‏ אך מכילות את המספר הרב ביותר של פקיעיות<br />

‏(איור 1.1).<br />

חלוקה טופוגרפית של הלשון על פי רגישותו של כל אזור לטעמים השונים הייתה מקובלת עד לפני כמה<br />

שנים.‏ ידוע כיום שניתן לחוש בכל אחד מן הטעמנים ע"י גירוי של כל אחד מסוגי פפילות הטעם מכל אזור<br />

בלשון.‏ בנוסף לפפילות הטעם,‏ קיימות על פני הלשון פפילות נוספות<br />

(filliform)<br />

פקיעיות טעם והן בעלות תפקידים שונים מחישת טעם כמו למשל ערבוב המזון בפה.‏<br />

אשר אינן מכילות<br />

9

איור 1.1<br />

(circumvallate ו-‏ foliate ,fungiform)<br />

(TRC)<br />

buds) (taste שהן מכילות.‏<br />

- מיקום ומבנה של פפילות ופקיעיות הטעם בלשון.‏<br />

הנבדלות במבנה,‏ מיקום ומספר פקיעיות הטעם<br />

a- שלושה סוגי פפילות<br />

בתוך פקיעית הטעם,‏ תאי הטעם נחשפים לטעמנים דרך ה-‏<br />

- b ניתן לחוש בכל אחד מחמשת הטעמים המוכרים בכל מקום בלשון.‏ לקוח מתוך<br />

.taste pore<br />

.(23)<br />

- 1.4<br />

1.4.1<br />

מנגנונים תאיים של חישת הטעם<br />

- הטעם המר<br />

תרכובות מרות מעוררות חוסר נעימות בריכוזים נמוכים עד לדחייה חזקה בריכוזים גבוהים.‏ מגוון רחב<br />

של תרכובות אורגניות,‏ חלקן מקורן בצומח וחלקן מתוצרת תעשייתית הינן מרות וביניהן ניקוטין,‏ קפאין,‏<br />

סטריכנין,‏ סוכרוז אוקטאצטט,‏ ציקלוהקסימיד,‏ כינין,‏ נרינגין,‏ דנטוניום ועוד.‏ אבולוציונית,‏ הטעם המר<br />

מזהיר אותנו מפני מזונות מקולקלים ורעלים מן הטבע:‏ אחד האתגרים המרתקים במחקר הטעם הינו<br />

להבין כיצד קולטנים לטעם המר עוצבו באבולוציה לשרת מטרה זו.‏<br />

משפחת הקולטנים לטעם מר,‏ כמו זאת לטעם המתוק ואוממי,‏ זוהתה בוודאות רק בסוף שנות התשעים<br />

הודות למאגרי מידע גנומיים ברשת.‏ קבוצה חדשה של קולטנים מצומדים לחלבוני<br />

(G-protein-<br />

G<br />

coupled receptors - GPCRs)<br />

זוהי משפחה רחבה למדיי של עד<br />

פוטנציאליים זוהו בבני אדם ו-‏<br />

‏(הקולטנים לפרומונים ב -<br />

מוקמה בכרומוזום מספר 6 וקרויה בשם משפחת ה-‏<br />

.(104 ,2) T2R<br />

80<br />

קולטנים בעכברים,‏ חולדות ובני אדם.‏ עד כה לפחות<br />

26<br />

33<br />

(VNO<br />

גנים<br />

בעכברים.‏ הקולטנים מראים קרבה לקולטנים הוומרונזאלים<br />

ומראים בין<br />

30 % ל-‏ 70 %<br />

זהות ברצף חומצות האמינו בתוך<br />

המשפחה.‏ ייתכן והשוני בין הקולטנים הוא המאפשר את זיהוי המגוון הרחב של מבנים כימיים הקיים<br />

בקבוצת הטעמנים המרים.‏ בדומה ל-‏ GPCRs אחרים בעלי קצה N‏-טרמינלי חוץ תאי קצר,‏ ההנחה היא<br />

10

שחומצות האמינו החשובות לקשירת הליגנד ולקביעת הספציפיות לטעמנים שונים נמצאות באזורים<br />

הטרנסממברנליים ובאחת הלולאות החוץ תאיות של הקולטן<br />

.(111)<br />

זיהוי ליגנדים לקולטנים שונים<br />

ממשפחת ה-‏ T2Rs התאפשר בשנים האחרונות ע"י ביטוי של אותם הקולטנים בתרביות תאים<br />

,18 ,8)<br />

,(149 ,137 ,89 ,24<br />

אך עד כה רובם של הקולטנים למר עדיין מוגדרים ‏"יתומים"‏<br />

(orphan<br />

.receptors)<br />

T2Rs ה-‏<br />

בנוסף לספציפיות לליגנדים שונים,‏ ייתכן והפולימורפיזם הקיים בגנים המקודדים לקולטני<br />

אחראי גם להבדלים ברגישות לטעמנים שונים בפרטים שונים ולקיום<br />

ו-‏ tasters<br />

,tasters<br />

תופעה ידועה גם בבעלי חיים וגם בבני אדם<br />

ניסויים שנעשו בחולדות ועכברים הראו נוכחות של<br />

בפפילות<br />

.(24)<br />

T2R mRNAs ב-‏ 15%<br />

,foliate ו-‏ circumvallate<br />

אך רק ב-‏ 2% מהתאים בפפילות ה-‏ fungiform<br />

מתאי פקיעיות הטעם<br />

יש ,2) .(24<br />

הטוענים שתא אחד יכול לבטא מגוון רחב של קולטני ,T2R דבר המרמז על היכולת של תא בודד לזהות<br />

טעמנים מרים שונים<br />

.(2)<br />

בניגוד לטענה זו,‏ מחקר אחר הראה שתאים המגיבים למר מופעלים אך ורק על<br />

ידי טעמן אחד מתוך חמישה,‏ כך שטעמנים שונים מעוררים תת-אוכלוסיות שונות של תאי טעם<br />

.(21 ,9)<br />

חלבון (Guanine nucleotide binding protein – protein G) G בשם ,gustducin<br />

בעל הומולוגיה<br />

גבוהה לחלבון G אחר בשם transducin ומתבטא במערכת הראייה,‏ נמצא ברקמת הטעם ‏(ומאוחר יותר<br />

גם ברקמות אחרות<br />

,10)<br />

.(107 ,16)<br />

101)) ומתבטא באופן סלקטיבי ב-‏ 20-30% מתאי הטעם בכל סוגי הפפילות<br />

הקשר בין gustducin לטעם המר ידוע כבר מתחילת שנות ה-‏<br />

.(107) 90<br />

ניסויי<br />

בעכברים הראו שתת-היחידה<br />

פוספודיאסטראז ספציפי לטעם שזוהה כ-‏<br />

הנוקלאוטידים הציקליים<br />

α-gustducin<br />

מעורבת בטרנסדוקצית הטעם המר דרך הפעלת<br />

.(147) PDE1A<br />

(cNMPs)<br />

הפעלת אנזים זה גורמת לירידה ברמת<br />

בתא.‏ השפעת ירידה זו בהמשך מסלול העברת האותות איננה<br />

ברורה.‏ ייתכן ורמות נמוכות של נוקלאוטידים משפיעות על פעילות קינאזות בתא או לחילופין תתכן<br />

בקרה של תעלות יוניות שונות המבוטאות בתאי טעם,‏ אשר חלקן מעוכבות ע"י<br />

inhibited) וחלקן תלויות ב-‏<br />

non-<br />

knockout<br />

(cNMP- cNMPs<br />

.(179) ( cNMP-gated channels) cNMPs<br />

בנוסף ל-‏ α-gustducin נמצאו בתאי טעם תת-יחידות α מחלבוני G אחרים:‏<br />

,Gα q ,Gα s ,Gα i3 ,Gα i2<br />

.(179 ,147 ,107) α-transducin ו-‏ Gα 14 ,Gα 15<br />

תפקיד בטרנסדוקצית הטעם המר מכיוון ש-‏<br />

התגובה לתרכובות מרות<br />

knock-out<br />

סביר שאחת או יותר מתת-יחידות אלה משחקת<br />

של<br />

α-gustducin<br />

.(57 ,20)<br />

איננו מבטל לחלוטין את<br />

לאחרונה,‏ הוכח שהקולטנים לטעם המר מתבטאים יחד עם<br />

Gα i2<br />

בפקיעיות טעם (20) ושקולטנים כגון mT2R5 מעוררים מסלולי העברת אותות המערבים שפעול של<br />

חלבון G מסוג<br />

.(127)<br />

G i/o<br />

עוד לפני שזוהו הקולטנים,‏ מסלולי העברת האותות של חישת הטעם המר נחקרו בהרחבה.‏ היום,‏ מסלול<br />

העברת האותות המערב היווצרות<br />

נחשב למרכזי בחישת הטעם המר<br />

במקביל להפעלת תת-היחידה α של<br />

ברמת ה-‏<br />

(IP 3 ) Inositol-1,4,5-trisphosphate<br />

ודיאצילגליצרול<br />

(DAG)<br />

,gustducin<br />

.(23)<br />

βγ תת-היחידה<br />

IP 3<br />

בתא על ידי הפעלת פוספוליפאז שזוהה כ-‏<br />

משתחררת כקומפלקס וגורמת לעלייה<br />

.(183 ,179 ,146 ,145 ,66) PLCβ2<br />

עלייה<br />

11

ב-‏ IP 3 גורמת לשחרור מאגרים תוך תאיים של סידן,‏ ובהמשך לשפעול תעלה המשתייכת למשפחת ה-‏<br />

(Transient Receptor Potential protein) TRPs<br />

וזוהתה כ-‏<br />

.(134 ,131) TRPM5<br />

התעלה וכניסה מסיבית של יוני נתרן דרכה גורמים לדפולריזציה של התא.‏ מחקרים הראו ש-‏<br />

פתיחת<br />

knock-<br />

out של<br />

PLCβ2 או של TRPM5 גורמים לחוסר רגישות לטעם המר וכן לטעם המתוק והאוממי,‏ דבר<br />

המצביע על חשיבות מרכזית של מסלול זה בחישת שלושת טעמים אלו<br />

מלוח וחמוץ לא נפגעו מ-‏<br />

.(183 ,34)<br />

knock-out זה,‏<br />

מכיוון שהטעמים<br />

נראה כי טעמים אלו מנצלים מסלולי העברת אותות שונים.‏<br />

איור 1.2<br />

– שני מסלולי העברת אותות מצטיירים כמרכזיים בחישת הטעם המר,‏ המתוק ואוממי.‏<br />

לאחר גירוי הקולטן,‏ שני מסלולי העברת אותות אפשריים.‏ מצד אחד שפעול תת-היחידה α יכולה לגרום לשפעול<br />

‏(או עיכוב)‏ של אדניליל ציקלאז או פוספודיאסטראזות,‏ אשר גורמים לשינוי ברמות נוקלאוטידים ציקליים.‏ בנוסף,‏<br />

שחרור תת-היחידה גורם לשפעול הפוספוליפאז אשר גורם לעלייה ברמות ה-‏ בתא ושפעול<br />

תעלות ה-‏ מסלול ה-‏ TRPM5/PLCβ2 ידוע כחיוני לחישת הטעמים מר,‏ מתוק ואוממי.‏ לקוח מתוך<br />

IP 3<br />

PLCβ2<br />

βγ<br />

.TRPM5<br />

.(143)<br />

תרכובות מרות מגוונות כגון כינין,‏ אוראה,‏ דנטוניום,‏ קפאין,‏ מתיל-קסאנטין וחומצות אמינו מסוימות,‏<br />

מסוגלות בנוסף למסלולים שפורטו מקודם להשפיע על מסלול העברת האותות ללא תיווך של קולטן אלא<br />

ע"י חדירה דרך הממברנה הפלסמטית ואינטראקציה ישירה עם חלבוני הטרנסדוקציה ככל הנראה הודות<br />

למבנה סטרוקטורלי דומה לאתר הקולטן הקושר את החלבון.‏ כינין ככל הנראה מסוגל לעבור בדרך זו<br />

אינטראקציה ישירות עם חלבוני G<br />

,(116)<br />

ולהפעיל תעלות קטיונים בצפרדע הקרקרנית<br />

במתח<br />

לעכב תעלות אשלגן בסלמנדרה אמריקנית<br />

(31) Necturus<br />

.(170) bullfrog<br />

,(159)<br />

cGMP<br />

תרכובות.‏<br />

בתא<br />

דנטוניום מעכב תעלות אשלגן התלויות<br />

וקפאין מעכב פוספודיאסטראזות וכך גורם לעלייה ברמות הנוקלאוטידים הציקליים כגון<br />

.(144)<br />

במקרים אלה,‏ תאים שאינם בהכרח קשורים לטעם המר מסוגלים להגיב לאותן<br />

12

1.4.2<br />

בשם<br />

- הטעם המתוק<br />

זמן קצר לאחר זיהוי הקולטנים לטעם המר,‏ מספר קבוצות חוקרים דיווחו על זיהוי קולטן לטעם המתוק<br />

T1R3 .(119 ,110 ,106 ,86) T1R3<br />

האנושי באזור המקביל לזה בגנום העכברי הנקרא<br />

התגלה ע"י סריקת גנים ל-‏ GPCRs הממוקמים בגנום<br />

.Sac locus<br />

לוקוס זה הינו אחד משני האזורים בגנום<br />

העכבר ‏(לוקוסים)‏ הידועים למעלה משלושים שנה כאחראים על חישת הטעם המתוק:‏ ה-‏<br />

שמיקומו בזרוע הדיסטלית של כרומוזום<br />

Sac locus<br />

4<br />

ואחראי על תגובה לסוכרוז,‏ סכרין וממתקים מלאכותיים<br />

נוספים.‏ בנוסף,‏ ה-‏ Dpa locus שמופה בזרוע הפרוקסימלית של כרומוזום 4 נמצא אחראי על תגובה ל-‏<br />

D‏-פנילאלנין<br />

.(121 ,96 ,5)<br />

פיזיולוגית,‏ הוכח ששני אזורים אלו משפיעים על העברת תגובה עיצבית<br />

פריפריאלית לסוכרוז,‏ דבר המרמז על קידוד לקולטן או מרכיב אחר של מסלול הטרנסדוקציה של הטעם<br />

המתוק.‏ ואכן הקולטן הראשון לטעם מתוק אותר בלוקוס ה-‏<br />

לאחר בדיקות נוספות נמצאה הומולוגיה של 30% בין<br />

.Sac<br />

T1R3<br />

GPCRs<br />

המתבטאים בתאי טעם הקרויים<br />

T1R1 ו-‏ T1R2<br />

לשני קולטנים ‏"יתומים"‏ ממשפחת ה -<br />

שתפקידם לא הוגדר עד אז.‏ בעכברים<br />

וחולדות T1R3 מתבטא בכ-‏ 15-30% מתאי הטעם בכל שלושת סוגי הפפילות.‏ לעומתו,‏<br />

בעיקר בפפילות מסוג fungiform ו-‏ T1R2 בפפילות מסוג<br />

situ hybridization הראו שבכל תא שבו מתבטא T1R3 מתבטא איתו<br />

T1R1 מבוטא<br />

.circumvallate ו-‏ foliate<br />

in ניסויים של<br />

T1R1 או<br />

,T1Rs<br />

.(119<br />

,82)<br />

T1R2 בהתאם לסוג<br />

הפפילה עובדה זו מרמזת על כך שקולטנים ממשפחת ה-‏ בדומה ל-‏ GPCRs<br />

אחרים,‏ פועלים דרך הטרודימריזציה ‏(יצירת קומפלקס בין שתי יחידות קולטן לפני או אחרי קישור<br />

הליגנד,‏ המאפשרת יציבות בקשירת הליגנד או שפעול פעילות אנזימטית בחלק התוך תאי של הקומפלקס<br />

כגון פעילות של קינאז).‏ כחיזוק להשערה זו,‏<br />

פונקציונלי.‏ לעומת זאת תאים המבטאים<br />

(119) Nelson et al.<br />

T1R3 ו-‏<br />

הראו שקולטן T1R בודד איננו<br />

T1R2 מגיבים בצורה חזקה ביותר לטעמנים מתוקים<br />

כגון הסוכרים הטבעיים סוכרוז ופרוקטוז אך גם לממתיקים מלאכותיים כמו סכרין ואצסולפאם-‏K‏.‏<br />

בנוסף,‏ הטרודימר זה מגיב לחומצות אמינו בעלות טעם מתוק כמו D‏-טריפטופן ולחלבונים מתוקים כמו<br />

.(94) monellin<br />

T1R2/T1R3<br />

מחקרים רבים נעשו בשנים אחרונות במטרה להסביר את יכולתו של הקולטן<br />

לקשור מגוון כה רחב של מולקולות מתוקות בעלות מבנים ומשקלים מולקולרים כה<br />

שונים.‏ בניגוד לקולטנים לטעם המר<br />

של<br />

,(T2Rs)<br />

קולטני ה-‏ T1Rs הינם בעלי קצה N‏-טרמינלי ארוך ולכן<br />

אזור זה נחשב תחילה למרכזי בקשירת הליגנדים.‏ מיפוי אזורי הקשירה של הקולטן נעשה בעזרת כימרות<br />

T1R3 ו-‏ T1R2<br />

שונים.‏ למשל האזור הטרנסממברנלי TMD<br />

הממתיק<br />

מאדם ומעכבר והראה שטעמנים שונים נקשרים לקולטן ההטרודימרי באזורים<br />

domain) (transmembranal של<br />

,(74) cyclamate<br />

אשר אחראי לקשירת הממתיקים<br />

ציסטאין ב-‏<br />

לעומת האזור החוץ תאי VFTM<br />

T1R3 מעורב בקשירת<br />

של T1R2 (Venus flytrap module)<br />

ו-‏ neotame<br />

.(178 ,75) aspartame<br />

אזור עשיר בחומצת האמינו<br />

,TMD ל-‏ VFTM מקשר בין ה-‏ (cystein rich domain) CRD ומכונה T1R3<br />

חיוני לקשירת חלבונים מתוקים כגון<br />

.(75) brazzein או monellin<br />

מולקולת ה-‏<br />

,lactisole<br />

ונמצא<br />

הידועה<br />

13

בבני אדם כמעכבת את המתיקות של מגוון סוכרים טבעיים,‏ גליקוזודים וממתיקים,‏ נקשרת ל-‏ TMD של<br />

.(73) T1R3<br />

ממצא זה מסביר באותה עת את העובדה ש-‏ lactisole פועלת גם כמעכב לטעם האוממי.‏<br />

התייחסות לביטוי מקביל של T1R3 ו-‏ T1R1 תעשה בפרק הדן בטעם האוממי.‏<br />

T1R3/T1R2 ו -<br />

- 1.3 איור<br />

.T1R3/T1R1<br />

מיפוי אזורי הקשירה לתרכובות<br />

לקוח מתוך<br />

מתוקות<br />

שונות בהטרודימרים<br />

.(178)<br />

על בסיס מחקרים ביוכימיים ופיסיולוגיים רבים,‏ הוצעו מספר מודלים לטרנסדוקצית הטעם המתוק:‏<br />

לאחר גילוי קולטני ה-‏<br />

,T1Rs<br />

מפעיל גם הוא את מסלול העברת האותות המערב את<br />

knock-out בשני גנים אלו מבטל את תחושת הטעם המתוק<br />

מחקרים הראו שבדומה לקולטנים לטעם מר,‏ ההטרודימר<br />

T1R2/T1R3<br />

ו-‏ PLCβ2<br />

,131) TRPM5 ,(183 ,146 ו -<br />

.(183)<br />

למרות שמסלול ה-‏<br />

IP 3 נחשב היום<br />

למרכזי בחישת הטעם המתוק ‏(כמו לזו של הטעם המר),‏ מחקרים אחרים מראים מעורבות של מספר<br />

מסלולי העברת אותות נוספים ‏(איור<br />

סוכריים.‏<br />

,(1.2<br />

ואף על קיום מסלולים שונים לסוכרים טבעיים וממתיקים לא<br />

סוכרים טבעיים מעוררים מסלול העברת אותות בו מעורבים חלבון G מהסוג G, s שפעול האנזים אדניליל<br />

ציקלאז ויצירת השליח המשני<br />

תעלות יוניות תלויות נוקלאוטידים<br />

.(164 ,163 ,115) cAMP<br />

(109) (cNMPs - gated channels)<br />

אותו cAMP יכול מאוחר יותר להשפיע על<br />

או לגרום להפעלת<br />

PKA<br />

(protein kinase A)<br />

וזרחון תעלות אשלגן וכך לדפולריזציה של הממברנה<br />

.(4)<br />

לאחרונה,‏ פורסמו<br />

מחקרים המראים שהעלייה ברמות cAMP לאחר גירוי תאי טעם בסוכרוז אינה תלויה בנוכחות סידן חוץ<br />

או תוך תאי.‏ בנוסף,‏ ביטוי של איזופורמים ספציפיים לטעם של האדניליל ציקלאז נמצאו מקבילים<br />

לביטויו של<br />

.PLCβ2<br />

לאור התוצאות,‏ החוקרים מציעים שלאחר חשיפת תאי טעם לסוכרים טבעיים<br />

מתקיימים שני מסלולים מקבילים אך בלתי תלויים,‏ והם היווצרות<br />

תאיות דרך<br />

cAMP<br />

.(169 ,1) IP 3<br />

ועלייה ברמות סידן תוך<br />

14

במסלול העברת האותות של ממתיקים מלאכותיים כגון סכרין ו-‏ SC45647 מעורב חלבון G מסוג<br />

המפעיל פוספוליפאז C לשחרור<br />

Gq<br />

IP 3 ו-‏ .DAG שיטות של<br />

Calcium imaging בפקיעיות טעם מבודדות<br />

הראו שבניגוד לסוכרים הטבעיים הגורמים לחדירת יוני סידן מחוץ לתוך התא,‏ ממתיקים מלאכותיים<br />

גורמים לשחרור מאגרים תוך תאיים של יוני סידן,‏ כתוצאה מיצירת<br />

ממצאים נוספים מסבכים את התמונה:‏ לאחר שנמצא שמעכב ל-‏<br />

.(9) IP 3<br />

(H89) PKA<br />

לא ביטל את התגובה<br />

לטעם המתוק אלא הגביר אותה,‏ נראה ש-‏ PKA איננו מעורב במסלול העברת האותות אלא יותר בתופעת<br />

האדפטציה ‏(ירידה ברגישות לגירוי לאורך הזמן כאשר גירוי זה מופעל שוב ושוב)‏<br />

בתגובה התקבלה עבור ממתיקים טבעיים ומלאכותיים כאחד.‏ לעומת זאת עיכוב<br />

.(173)<br />

PKC<br />

ההגברה<br />

לא השפיע על<br />

התגובה לסוכרוז אבל ביטל את התגובה לממתיקים מלאכותיים:‏ ממצא זה מחזק את ההשערה על פיה<br />

מתקיימים מסלולים שונים לממתיקים טבעיים ומלאכותיים.‏ בנוסף,‏ בדיקת שליחים משניים בזמנים<br />

קצרים של מילישניות לאחר הפעלת הטעמן הראתה שהנוקלאוטיד cGMP משחק תפקיד בגירוי הראשוני<br />

ms) 75-250) של תהליך הטרנסדוקציה,‏ כאשר cAMP מופיע רק מאוחר יותר<br />

.(88)<br />

1.4.3<br />

- הטעם האוממי ‏(חומצות אמינו)‏<br />

‏"אוממי"‏ שמשמעותו ביפנית ‏"טעים מאוד",‏ הינו טעם דומיננטי במזונות המכילים חומצות אמינו ‏(מוצרי<br />

בשר וגבינות ישנות)‏ ובמיוחד L‏-מונוסודיום גלוטמאט<br />

.(MSG)<br />

המשמעות הביולוגית הרבה של הטעם<br />

הזה היא בכך שהוא מספק לגוף אינדיקציה על תכולת חומצות אמינו חיוניות במזון.‏ הוכח שנוכחות של<br />

‏'‏‎5‎‏-ריבונוקלאוטידים כמו IMP ו-‏ GMP מגבירה את עוצמת הטעם האוממי<br />

.(90 ,79)<br />

בעקבות גילוי הקולטנים לטעם המתוק,‏ נמצאו הקולטנים לטעם האוממי השייכים למשפחת ה-‏<br />

.T1Rs<br />

כפי שכבר צוין,‏ קולטנים ממשפחה זו מופעלים דרך הטרודימריזציה:‏ בניגוד לקולטן לטעם המתוק<br />

המורכב מ-‏<br />

,T1R2 ו-‏ T1R3<br />

הקולטן לטעם האוממי מורכב מ-‏<br />

זה הינו ספציפי לחומצות האמינו בעלות מבנה איזומרי<br />

,(118) T1R1 ו-‏ T1R3<br />

.L<br />

והוכח שצירוף<br />

מיפוי אזורי הקשירה של הקולטן<br />

T1R1/T1R3 אשר נעשה במקביל לזה של הקולטן למתוק,‏ גילה שקשירת חומצות האמינו מתבצעת ככל<br />

הנראה באזור החוץ תאי<br />

בנוכחות<br />

של (VFTM)<br />

.(178) T1R1<br />

,(90) IMP<br />

נמצא כי התגובה לחומצות האמינו מוגברת<br />

אפילו בריכוזים נמוכים ביותר של הריבונוקלאוטיד.‏ ההשערה היא ש-‏<br />

IMP נקשר<br />

אף הוא לקולטן באזור שאינו מתחרה על קישור חומצת האמינו ומגביר את זמינות הליגנד (167) או את<br />

האפיניות שלו<br />

על פי (91).<br />

,(178) Xu et al.<br />

לא השפיעה על עוצמת התגובה של הקולטן המתוק<br />

זמן רב לפני גילוי קולטן ה-‏<br />

IMP צפוי להיקשר ל-‏<br />

,T1R1<br />

T1R2/T1R3 לציקלמאט.‏<br />

,T1R1/T1R3<br />

לאור העובדה שנוכחותו<br />

חוקרים חשדו במעורבות של קולטנים יונוטרופיים<br />

(ligandgated<br />

ionic channels)<br />

ומטבוטרופיים ‏(קולטנים ממשפחת ה-‏<br />

(G-protein-coupled receptors<br />

בחישת הטעם האוממי.‏ הקולטן הראשון שהוכחה מעורבותו בטעם האוממי היה קולטן מטבוטרופי בשם<br />

(25) mGluR4<br />

המשתייך למשפחת ה-‏<br />

mGluR<br />

הידועה זמן רב בתאי העצב<br />

.(30)<br />

קולטנים<br />

יונוטרופיים,‏ המאפשרים זרימת יונים לאחר קישור ספציפי של ליגנד,‏ מתבטאים אף הם בלשון,‏ אך לא<br />

15

הוכח עד היום שביטוי זה הינו ספציפי לתאי טעם ולכן מעורבותם בחישת הטעם האוממי נשארה<br />

מעורפלת.‏ בדומה לטעם המר וטעם המתוק,‏ מסלול הטרנסדוקציה העיקרי בחישת הטעם האוממי הינו<br />

מסלול ה-‏<br />

IP 3 ,PLCβ2<br />

ו-‏<br />

האמינו מעלה את רמות ה-‏<br />

.(183) TRPM5<br />

cAMP<br />

תעלות יוניות,‏ ביניהן תעלות סידן.‏<br />

במקביל ל-‏<br />

למרות זאת,‏ מחקרים אחרים מראים שחלק מחומצות<br />

,IP 3<br />

לעומת חומצות אחרות אשר מפעילות ישירות<br />

1.4.4<br />

- הטעם המלוח<br />

הטעם המלוח והטעם החמוץ מאופיינים בכך שהם נובעים מנוכחות יונים במזון.‏ חישת הטעם המלוח<br />

מספקת אינפורמציה על תכולת NaCl ומינרלים נוספים במזון ולכן משרתת את שימור ההומאוסטאזיס<br />

של יונים ומים בגוף.‏ למרות שמספר מלחים מעוררים את הטעם המלוח<br />

,(NaCl, KCl, LiCl, NH 4 Cl)<br />

המלח NaCl הוא האופייני ביותר ליונקים,‏ בגלל הרעב הספציפי כלפיו.‏ כיום ידועים שני מנגנונים לחישת<br />

הטעם המלוח:‏ מסלול ספציפי לנתרן<br />

(Na + -specific pathway)<br />

ומסלול שאינו ספציפי<br />

(Na + -<br />

.nonspecific pathway)<br />

במנגנון הראשון,‏ שנחקר בהרחבה,‏ מתרחשת כניסה של יוני נתרן דרך תעלות נתרן הרגישות ל-‏<br />

(Amiloride sensitive sodium channels) amiloride<br />

הנקראות בשם מקוצר<br />

ASSC or EnaC<br />

.(58 ,40)<br />

תעלות אלה הינן אפיקליות ומורכבות משלוש תת-יחידות כאשר אחת מהן לפחות מושפעת<br />

מההורמון הסטרואידי אלדוסטרון<br />

.(95)<br />

התעלה מתפקדת כקולטן לטעם המלוח ע"י כך שהיא נפתחת<br />

באופן ספציפי בנוכחות יוני נתרן בחלל הפה ומאפשרת זרימת נתרן פנימה ועקב כך לדפולריזציה של<br />

הממברנה הבזולטרלית הגוררת אירועים סינפטיים נוספים.‏ למרות שמעורבות ה-‏ ASSCs בחישת הטעם<br />

המלוח ברורה,‏ הרגישות לאמילורייד בבני אדם מוגבלת ופחות משמעותית,‏ דבר המרמז על מעורבות של<br />

מסלול נוסף שאיננו רגיש לאותו מעכב.‏ הסברים אפשריים הם נוכחות תעלות יוניות בלתי ספציפיות<br />

בממברנה האפיקלית של תאי הטעם (41) או דיפוזית יוני נתרן דרך ה-‏<br />

נתרן בצד הבזולטרלי של התאים<br />

tight junctions והפעלת תעלות<br />

,(181 ,157)<br />

דבר הגורם לדפולריזציה.‏ מחקרים פיזיולוגיים מראים<br />

שתעלות ASSCs חדירות ליוני נתרן,‏ ליתיום ופרוטונים אך לא לאשלגן.‏ לעומת זאת,‏ חישת מלחי אשלגן<br />

ואמוניום מתרחשת באופן מקביל למסלול הלא ספציפי לחישת מלחי נתרן<br />

.(162)<br />

למרות שחישת הטעם<br />

המלוח נחקרה בהרחבה כבר עשרות שנים,‏ עדיין אין לנו הבנה מלאה של כלל התהליכים המתרחשים<br />

והתורמים לה.‏<br />

1.4.5<br />

- הטעם החמוץ<br />

הטעם החמוץ,‏ המאפשר בטבע לזהות מזונות מקולקלים ולמנוע צריבה ע"י חומצות,‏ יכול להיות נעים או<br />

נסבל כאשר הוא חלש אך נהיה דוחה כאשר הוא חזק.‏ הגירוי העיקרי האחראי על הטעם החמוץ הינו<br />

כניסת פרוטונים לתוך תא הטעם,‏ דבר המשפיע על ה-‏<br />

pH<br />

וגורם כך לפוטנציאל פעולה<br />

שני (84).<br />

מסלולים אפשריים מעורבים בחישת הטעם החמוץ:‏ במסלול הראשון כניסת פרוטונים לתוך התא<br />

16

מתאפשרת הודות לפתיחת תעלות רגישות אמילורייד<br />

(ASSCs)<br />

(51) ובמסלול השני מעורבות תעלות<br />

תלויות פרוטונים הנפתחות רק בנוכחות פרוטונים בסביבה,‏ ביניהן תעלות אשלגן בסלמנדרה האמריקנית<br />

,(84) Necturus<br />

תעלות קטיונים בלתי ספציפיות ממשפחת ה-‏<br />

קטיונים המופעלות ע"י דפולריזציה ונפתחות ע"י קשירת נוקלאוטידים<br />

,(171) ENaC/Deg channels<br />

ותעלות<br />

(Hyperpolarized-activated<br />

.(161) nucleotide-gated cation channel)<br />

junctions וכך למלא את החלל של פקיעית הטעם<br />

בנוסף,‏ נראה שפרוטונים יכולים לחדור דרך ה-‏<br />

tight<br />

.(39)<br />

כתוצאה מתנועת הפרוטונים מחלל הפה לתוך<br />

הפקיעית,‏ ובהמשך לתאי הטעם,‏ השינויים ב-‏ pH יכולים להשפיע על מערכות תוך תאיות רבות ביניהן<br />

תעלות יוניות שונות ומספר מסלולי טרנסדוקציה.‏ לאחרונה,‏ מחקרים הראו כי לתעלה<br />

חשיבות רבה בחישת הטעם החמוץ<br />

PKD2L1<br />

.(65)<br />

מאלה המבטאים את הקולטנים לטעם המר<br />

מהונדסים גנטית הראה כי<br />

תעלה זו מתבטאת בכל סוגי פקיעיות הטעם אך בתאים שונים<br />

(T2Rs)<br />

או לטעם המתוק<br />

.(T1Rs)<br />

knock-out<br />

שימוש בעכברים<br />

של תעלה זו בעכברים במטל באופן ספציפי את חישת הטעם<br />

החמוץ ולא אף טעם אחר.‏ המגוון הרחב של מסלולים שנמצאו עבור הטעם החמוץ מדגיש את מורכבות<br />

מסלול טרנסדוקצית הטעם החמוץ.‏<br />

1.5<br />

1.5.1<br />

- העברת אותות בין-תאית וקידוד הטעם במערכת הפריפרית<br />

- העברת המידע אל תאי העצב לאחר גירוי קולטני הטעם<br />

עד לפני כמה שנים,‏ סברו החוקרים שלאחר גירוי קולטן הטעם והפעלת מסלול העברת האותות,‏ תא<br />

הטעם מעביר את המידע אל סיב עצב ע"י קיום סינפסה ושחרור נוירוטרנסמיטור,‏ בדומה למערכות<br />

עצביות ידועות אחרות כגון חוש הריח<br />

מורכבת הרבה יותר.‏<br />

.(113)<br />

מחקרים אשר נערכו בשנים האחרונות מציירים תמונה<br />

מבחינה היסטורית,‏ התאים בפקיעית הטעם מוספרו מ-‏ I עד IV על פי מאפיינים ציטולוגיים.‏ התאים מסוג<br />

I הינם תאי ‏"תמיכה",‏ ותאים מסוג ,IV הנקראים גם ‏"תאים בזלים",‏ מהווים מקור לשאר סוגי התאים<br />

שבפקיעית הטעם.‏ שני סוגי תאים אלו אומנם חשובים לתפקוד מלא של פקיעית הטעם אך תפקידם<br />

בעיבוד המידע לא נחקר עד כה.‏ התאים מסוג<br />

לטעם והתאים הסינפטיים,‏ בהתאמה<br />

II ו-‏<br />

.(143)<br />

III מהווים את תאי הטעם המבטאים את הקולטנים<br />

שני מחקרים אשר פורסמו במקביל הראו שתאי הטעם המבטאים את הקולטנים לטעם אינם מבטאים<br />

חלבונים אשר ממוקמים במערכות אחרות באזור הפרסינפטי של תא עצב.‏ החוקרים הראו שהחלבונים<br />

synaptin II ,SNAP25<br />

,NCAM ו-‏<br />

אשר מעורבים במנגנון שחרור ווסיקולות מלאות<br />

נוירוטנסמיטורים לחלל הסינפטי אינם מתבטאים בתאים מסוג II אלא בתאים מסוג<br />

.(180 ,36 ,28) III<br />

ממצאים אלו מציעים מנגנון בו תאי הטעם עצמם אינם מקיימים תקשורת ישירה עם תאי עצב אלא עם<br />

התאים מסוג<br />

,III<br />

ואלה הם המעבירים את המידע לתאי העצב<br />

‏(איור 1.4).<br />

בעקבות מחקרים אשר הראו שחרור של הנוירוטרנסמיטור סרוטונין לאחר גירוי תאי טעם<br />

וביטוי ספציפי של הקולטן לסרוטונין<br />

(67-69)<br />

(5-hydroxytryptamine) 5-HT<br />

בתאי הטעם<br />

,(81 ,80)<br />

17

סרוטונין הוצע להיות אחד הנוירוטרנסמיטורים המעורבים בהעברת האינפורמציה אל תאי העצב.‏ אך<br />

לאור העובדה שעכברי knock-out ל-‏ 5-HT לא הראו שינוי התנהגותי כלשהו<br />

משחק תפקיד שונה.‏ לעומת זאת,‏<br />

,(45)<br />

(45) Finger et al.<br />

נראה שסרוטונין<br />

הראו שמולקולת ה-‏ ATP מהווה נוירוטרנסמיטור<br />

אשר מעורר ישירות את תאי עצב הראשוניים המעצבבים את פקיעית הטעם<br />

(primary afferent<br />

.nerves)<br />

אלו<br />

בנוסף,‏ הקולטנים היונוטרופיים ל-‏<br />

,P2X3 ו-‏ P2X2<br />

,ATP<br />

(12) ו-‏<br />

מתבטאים ספציפית בתאי עצב<br />

knock-out בהם מחליש באופן דרמטי את התגובה לטעמנים מרים,‏ מתוקים ואוממים<br />

.(45)<br />

הגילוי ש-‏ ATP משוחרר מתאים מסוג II וששחרור סרוטונין מתבצע בתאים מסוג III הביא למודל בו<br />

לאחר גירוי הקולטנים לטעם ע"י טעמנים,‏ תאי הטעם משחררים ATP בצורה פרה-קרינית אשר יהווה<br />

מצד אחד נוירוטרנסמיטור ישיר לתאי העצב,‏ אך ייתכן גם לתאים מסוג<br />

זאת,‏ משחררים סרוטונין להעברת המידע לתאי עצב המעצבבים אותו<br />

.III<br />

התאים מסוג<br />

,III<br />

‏(איור 1.4).<br />

לעומת<br />

איור 1.4<br />

– דרכי תקשורת בין תאים בתוך פקיעית הטעם.‏<br />

לאחר גירוי הקולטנים לטעם אשר בקצה האפיקלי של תאי הטעם ‏(תאים מסוג משוחרר בצורה פרה-‏<br />

קרינית ומהווה נוירוטרנסמיטור לתאי העצב fibers) (sensory afferent אך גם לתאים מסוג בתגובה,‏ התאים<br />

מסוג III משחררים סרוטונין להעברת המידע לתאי עצב המעצבבים אותו.‏ לקוח מתוך<br />

ATP ,(II<br />

.III<br />

.(143)<br />

1.5.2<br />

בשם<br />

- תתי אוכלוסיות שונות של תאי טעם מבחינות בין הטעמים השונים<br />

ישנה מחלוקת בספרות לגבי יכולתו של תא טעם בודד לחוש במקביל במספר טעמים ‏(תופעה הקרויה<br />

,(multiple modalities broadly tuned cells<br />

תאים,‏ כאשר כל אחת רגישה לטעם אחר<br />

או שמא מתקיימות תתי אוכלוסיות שונות של<br />

.(single taste modalities tuned cells)<br />

בנוסף,‏ מנגנון<br />

העברת המידע מתא הטעם אל המוח מהווה גם הוא נושא לדיון מדעי:‏ אפשרות ראשונה הינה שסיבי העצב<br />

מעצבבים באופן ייחודי תאים אשר רגישים לאותו הטעם ולכן מעבירים מידע עבור אחד מן טעמים בלבד,‏<br />

וזהות הטעם נקבעת על פי העצב המעוצבב<br />

.(labeled-line model)<br />

מודל מנוגד מציע שסיבי עצב<br />

18

מעצבבים ללא הבחנה תאי טעם שונים ולכן מעבירים את המידע עבור כל הטעמים (across fiber<br />

,model)<br />

וזיהוי הטעם עצמו טמון בעיבוד מידע נוסף אשר טרם פוענח.‏<br />

איור 1.5<br />

– קידוד הטעם בפריפריה.‏<br />

כאן מוצגים שני מודלים מנוגדים לקידוד הטעמים בפקיעית הטעם.‏ - במודל זה,‏ התאים מתוכננים להגיב לטעם<br />

אחד בלבד ומעוצבבים ע"י סיב עצבי ייחודי לכל טעם.‏ במקרה זה,‏ אין כל חפיפה בין הטעמים השונים.‏<br />

אפשרויות למודל בו סיבי העצב מעבירים מידע עבור מספר טעמים.‏ ייתכן ותאי הטעם רגישים לכל הטעמים<br />

השונים וכל תא טעם מעוצבב ע"י סיב עצב אחר או שכל תא טעם רגיש לטעם אחד בלבד וסיבי העצב<br />

מעצבבים ללא הבחנה תאים בעלי אופי שונה במקרים אלו,‏ ההבחנה הסופית בין הטעמים השונים תיעשה ע"י<br />

סיבי העצב או המוח בדרך ייחודית.‏ לקוח מתוך<br />

מספר מחקרים אלקטרופיזיולוגיים וניסויי<br />

– c ,b שתי<br />

a<br />

(b)<br />

.(c)<br />

.(23)<br />

calcium-imaging<br />

הראו שתאי טעם מבודדים מסוגלים<br />

להגיב ליותר מטעם אחד והציעו מודל בו תאי הטעם עצמם מגיבים למספר טעמים וההבחנה בין הטעמים<br />

נעשית ברמת העברת המידע לסיבים עצביים<br />

ב-‏<br />

.(152 ,141 ,52 ,19)<br />

בנוסף,‏ מחקר בו נעשה<br />

knock out<br />

gustducin<br />

הראה ירידה בתגובה לתרכובות מרות וגם מתוקות<br />

.(176)<br />

מחקרים מראים שהקולטנים למר ולמתוק אינם מתבטאים באותם תאים.‏ כבר ב-‏<br />

מצד שני,‏ מספר רב של<br />

Hoon et al. ,1999<br />

(62)<br />

הראו שבשלושת סוגי הפפילות,‏<br />

T1Rs<br />

ו-‏ T2Rs מתבטאים בתתי אוכלוסיות שונות של תאי טעם.‏<br />

בשנים האחרונות,‏ שימוש מרובה בחולדות מהונדסות גנטית אפשר לשפוך אור על נושא זה.‏ ניסוי בו<br />

חולדות הונדסו באופן כזה שהגן PLCβ2 יבוטא אך ורק בתאים המבטאים את הקולטנים למר,‏ הראה<br />

שבאופן סלקטיבי מאוד הטעם המר בלבד חודש ‏(למרות ש-‏ PLCβ2 מעורב בחישת הטעמים מר,‏ מתוק<br />

ואוממי),‏ ומתוך כך הוסק שהטעמים השונים אינם תלויים באותם תאי הטעם<br />

.(183)<br />

במחקר אחר,‏ קולטן<br />

לאופיואידים RASSL) (κ-opioid receptor בוטא בתאי טעם תחת הפרומוטור של הקולטנים למתוק.‏<br />

החוקרים הראו שהמולקולה spiradoline אשר מהווה ליגנד ל-‏ RASSL וחסרת טעם בדרך כלל,‏ הפכה<br />

למולקולה מתוקה.‏ לעומת זאת כאשר<br />

RASSL<br />

spiradoline למרה .(114)<br />

כמו כן,‏<br />

Huang et al.<br />

בוטא תחת הפרומוטור לקולטנים מרים,‏ הפכה<br />

(65) הראו שהרס ספציפי של תאים אשר מבטאים<br />

את הקולטנים לאחד הטעמים ‏(מר,‏ מתוק או אוממי)‏ מבטל ייחודית את הטעם עצמו מבלי לפגוע בטעמים<br />

19

האחרים.‏ מחקרים אלו ביחד עם רבים נוספים מהווים עדויות יותר ויותר מבוססות התומכות במודל ה-‏<br />

.labelled line<br />

- 1.6<br />

מסוג GPCR<br />

1.6.1<br />

משפחת ה-‏<br />

מנגנון סיום העברת האותות ‏(דסנסיטיזציה)‏ של קולטנים<br />

- תהליך הדסנסיטיזציה של קולטני ה-‏<br />

GPCRs<br />

,(G-protein-coupled receptors) GPCRs<br />

לה משתייכים קולטני הטעם,‏ הינה המשפחה<br />

הגדולה ביותר של קולטנים המתבטאים על פני הממברנה הפלסמטית של התא.‏ לאחר קשירת הליגנד<br />

לקולטן,‏ קיימים מספר מסלולי העברת אותות אפשריים,‏ התלויים בסוג חלבון ה-‏<br />

G<br />

המוצמד לקולטן<br />

עצמו,‏ ומערבים שפעול ‏(או עיכוב)‏ של אנזימים ציטוזוליים ‏(אדניליל ציקלאז,‏ פוספודיאסטראזות,‏<br />

פוספוליפאזות ועוד)‏ אשר מעבירים את ה"מידע"‏ הלאה בתוך ציטוזול התא.‏ כל המערכות בהן מעורבים<br />

קולטנים מסוג GPCR מראות הסתגלות בעוצמת תגובתן לסביבה:‏ רגישות התא לסיגנל מסוים בדרך כלל<br />

משתנה על פי העוצמה ומשך הסיגנל.‏ מטרת מנגנון אדפטציה זה הינו למנוע תגובת יתר לסיגנל אינטנסיבי<br />

או ממושך מדי באופן המסכן את מערכות הגוף.‏ כתוצאה מחשיפה חוזרת ונשנית לליגנד או חשיפה<br />

לריכוזי ליגנד גבוהים,‏ קולטני ה-‏<br />

GPCR<br />

עוברים תהליך מורכב הנקרא ‏"דסנסיטיזציה"‏<br />

(desensitization) אשר מוריד את רגישותו של הקולטן ואת יכולתו להגיב לליגנדים סביבתיים.‏ אחד<br />

השלבים העיקריים של תהליך זה הינו זרחון הקולטן בקצה ה-‏ C טרמינלי וב-‏ loop השלישי התוך-תאי<br />

שלו ע"י קינאזות ממשפחת ה-‏<br />

(G-protein-coupled GRKs הנקראות serine/threonine kinases<br />

kinases) receptor ‏(איור .(1.5<br />

בעקבות זרחון הקולטן ע"י ה-‏<br />

,GRKs<br />

החלבון β-arrestin מונע אל<br />

הממברנה ונקשר ספציפית לאתרים המזורחנים של הקולטן:‏ קשירה זו תמנע מנקודה זו ואילך כל<br />

אפשרות לשפעל חלבוני<br />

G<br />

נוספים,‏ ובכך מסמנת את תחילת כיבוי מסלול העברת האותות.‏ על מנת<br />

להרחיק סופית את הקולטן מן הממברנה הפלסמטית וכך למנוע ממנו כל שפעול אפשרי נוסף,‏ מתקיים<br />

תהליך נוסף הקרוי בשם אינטרנליזציה<br />

מספר רב של חלבונים נוספים,‏ כגון<br />

.(internalization)<br />

,clathrin ו-‏ AP2<br />

של הקולטן לתוך ציטוזול התא דרך יצירת ווסיקולה בשם<br />

לקומפלקס קולטן/‏β-arrestin נקשרים עתה<br />

היוצרים יחד קומפלקס ענק אשר גורם להחדרתו<br />

.clathrin-coated pit<br />

לאחר האינטרנליזציה,‏<br />

הקולטן יכול לעבור תהליך של מחזור לממברנה הפלסמטית,‏ או לחילופין עיכול אנזימטי לאחר איחוי<br />

ווסיקולת ה-‏<br />

clathrin-coated pit עם ליזוזום.‏<br />

הוכח במספר מחקרים שביטול או פגיעה בפעילותם של ה-‏<br />

(142 ,47 ,46) GRKs<br />

-β וכן של ה-‏<br />

,14) arrestin<br />

לאחר גירוי.‏<br />

זרחון של קולטן ה-‏<br />

15) גורמים לפעילות יתר של הקולטן ולחוסר יכולת של המערכת הנחקרת ‏"להירגע"‏<br />

GPCR ע"י GRKs<br />

לאחר שפעולו ע"י ליגנד נקרא בספרות ‏"דסנסיטיזציה<br />

הומולוגית"‏ ונבדל מ-"הדסנסיטיזציה ההטרולוגית"‏ אשר מתארת זרחון של הקולטן ע"י הקינאז ,PKA<br />

20

ובמקרים מסוימים גם ע"י<br />

PKA .(150 ,38 ,26) PKC<br />

PKC ו-‏<br />

serine/threonine kinases<br />

שונות משל ה-‏<br />

.GRKs<br />

משתייכים אף הם למשפחת ה -<br />

אך מזרחנים קולטנים גם כאשר הם אינם תפוסים ע"י ליגנד ובעמדות<br />

מעבר לתפקידו בשיתוק הקולטן והרחקת הקולטן מהממברנה הפלסמטית,‏ לזרחון הקולטן ע"י<br />

GRKs ו -<br />

PKA השלכות רבות לגבי מסלולי העברת אותות המשופעלים מאוחר יותר,‏ אשר יפורטו בפרק 1.6.4.<br />

,(∗<br />

איור 1.5<br />

– בקרת פעילותו של קולטן GPCR ע ‏"י תהליך הדסנסיטיזציה ואינטרנליזציה.‏<br />

משתחררות ומשפעלות את מסלול העברת<br />

תת-היחידות של חלבון ה-‏ לאחר קשירת הליגנד ‏(מסומן ב-‏ האותות ‏(שלב 1). לאחר מכן,‏ GRKs מזרחנים את הקולטן התפוס ע"י ליגנד וגורמים כך לקשירת<br />

הקומפלקס קולטן/‏β-arrestin הופך מטרה לקשירה למספר חלבונים ביניהם<br />

לקצה ה-‏ C‏-טרמינלי שלו ‏(שלב אשר גורמים להחדרת הקולטן לציטוזול<br />

(AP-2) ו-‏ פוספואינוזיטידים לאחר האינטרנליזציה,‏ הקומפלקס קולטן/‏β-arrestin הינו אחראי לשפעול של מספר מסלולי<br />

התא ‏(שלב או מחזור חזרה לממברנה הפלסמטית ‏(שלב<br />

ולאחר מכן יכול לעבור דגרדציה ‏(שלב העברת אותות ‏(שלב 5b). לקוח מתוך<br />

β-arrestin<br />

G<br />

,(PIP2)<br />

(5a<br />

.(2<br />

adapter protein 2 ,clathrin<br />

.(3<br />

(4<br />

.(112)<br />

21

1.6.2<br />

משפחת ה-‏<br />

- מאפיינים מבניים של קינאזות ממשפחת ה-‏<br />

GRKs<br />

GRKs<br />

מורכבת משבע קינאזות אשר מזהות באופן ייחודי קולטנים תלויי חלבון<br />

G<br />

(GPCRs) ומזרחנות באופן ספציפי את חומצות האמינו סרין וטראונין.‏ משפחה זו מחולקת לשלוש תת<br />

משפחות:‏ א)‏ לתת המשפחה הראשונה משתייכים<br />

,GRK7 ו-‏ GRK1<br />

אשר מתבטאים יחודית במערכת<br />

הראייה,‏ ב)‏ לתת המשפחה השנייה,‏ אשר מכונה גם משפחת הקינאזות של הקולטן הבטא-אדרנרגי<br />

(βARK)<br />

משתייכים<br />

GRK2 ו-‏ ,GRK3<br />

ולבסוף ג)‏ משפחת ה-‏<br />

GRK4<br />

לה משתייכים<br />

,GRK4<br />

GRK5<br />

∼270)<br />

ו-‏<br />

משפחת ה-‏<br />

.GRK6<br />

חומצות<br />

GRKs ל-‏<br />

השונים מבנה שמור למדי המורכב משלושה אזורים:‏ מרכז החלבון<br />

אמינו)‏ בעל הפעילות הקטליטית ‏(זרחון חומצות אמינו סרין וטראונין)‏ שמור בתוך<br />

∼45%) serine/threonine kinases הומולוגיה).‏<br />

הקצוות ה-‏ N ‏-טרמינליים<br />

(185∽ חומצות<br />

אמינו)‏ מעורבים בזיהוי חלבון המטרה ‏(הסובסטרט)‏ ומראים הומלוגיה נמוכה בין האנזימים השונים<br />

.(∼27%)<br />

הקצוות ה-‏ C‏-טרמינליים אינם מראים כלל הומולוגיה,‏ הם בעלי אורך משתנה באנזימים שונים<br />

(105-230∽ חומצות אמינו),‏ וקובעים את מיקום האנזים ותנועתו בתא בכך שהם מקיימים אינטראקציה<br />

עם ליפידים ו/או חלבונים ממברנליים שונים.‏ הקצה ה-‏ C‏-טרמינלי של<br />

הנקרא<br />

GRK2 ו-‏<br />

(PH) pleckstrin homology domain<br />

היחידות βγ של חלבוני ה-‏ G. מכיוון ש-‏<br />

אשר מאפשר קשירה לפוספוליפיד<br />

GRK3 מכיל אזור<br />

PIP2 ולתת -<br />

GRK2 ו-‏<br />

שמטרתן של אינטראקציות מסוג זה לאפשר הימצאות של חלק מן ה-‏<br />

הופעל הקולטן.‏<br />

GRK3 הינם בעיקר חלבונים ציטוזוליים נראה<br />

GRKs<br />

GRK4 ו-‏<br />

הקבועה בממברנה הפלסמטית.‏ לעומתם,‏<br />

קרוב לממברנה בטרם<br />

GRK6 עוברים פלמיטואילציה (palmitoylation) אשר גורמת להימצאותם<br />

GRK1 ו-‏<br />

(farnesylation)<br />

בקצה ה-‏ C‏-טרמינלי שלהם.‏<br />

GRK7 הינם בעיקר ממברנליים הודות לפרנזילציה<br />

GRK5<br />

נמצא אף הוא קשור לממברנה באופן קבוע<br />

הודות לאתר בקצה ה-‏ N‏-טרמינלי שלו הקושר PIP2 ולאתר בקצה ה-‏ C‏-טרמינלי הקושר פוספוליפידים<br />

באופן קונסטיטוטיבי.‏<br />

לעומת<br />

,GRK4 ,GRK1<br />

ו-‏<br />

GRK7 מתבטאים אך ורק ב-‏<br />

GRK7<br />

הצרבלום במוח,‏ בכליה ובאשכים),‏<br />

הגוף<br />

אשר מתבטאים באופן יחודי ברקמות ספציפיות<br />

GRK1)<br />

,retinal cones ו-‏ retinal rods<br />

GRK5 ,GRK3 ,GRK2 ו-‏<br />

.(ubiquitously expressed)<br />

הרחב ביותר של מערכות פיזיולוגיות<br />

ו-‏<br />

כאשר GRK4 נמצא בעיקר ברקמות<br />

GRK6 מתבטאים בכמעט כל רקמות<br />

מסיבה זו,‏ ארבעת הקינאזות האלו הינן אחראיות על וויסות המגוון<br />

.(135)<br />

1.6.3<br />

- בקרה על פעילות<br />

GRK2<br />

GRK2<br />

הינו האיזופורם הנחקר ביותר בספרות מכל משפחת ה-‏<br />

knock-out בו גורם ל-‏ 100% מוות עוברי<br />

המגוון הרחב ביותר של קולטני<br />

.GRKs<br />

GRK זהו ה-‏<br />

,(70)<br />

,GPCR<br />

היחיד אשר<br />

כאשר הוא נמצא מעורב בתהליך הדסנסיטיזציה של<br />

שהידוע מביניהם הינו הקולטן ה-‏ β2‎‏-אדרנרגי<br />

(β2-<br />

.adrenergic receptor – β2AR)<br />

GRK2 נמצא מעורב בתפקוד תקין של המערכת הקרדיווסקולרית,‏<br />

22

המערכת האימונית,‏ מערכת העצבים,‏ התפתחות העצם ועוד<br />

.(135)<br />

בקרת פעילותו של<br />

הינה GRK2<br />

תהליך מורכב המשלב אינטראקציות תוך-מולקולריות,‏ קשירה לחלבונים ציטוזוליים שונים ‏(כגון תת-‏<br />

היחידה<br />

G) של חלבון βγ<br />

וזרחון על ידי קינאזות אחרות<br />

.(140)<br />

איור 1.6<br />

– משפחת ה-‏<br />

קינאזות ממשפחת ה-‏<br />

החלבון בקצה ה-‏ C‏-טרמינלי<br />

לקוח מתוך<br />

.GRKs<br />

GRKs<br />

עבור GRK4 palmitoylation לעומת GRK7 ו-‏ עבור GRK1 farnesylation)<br />

.(128)<br />

ו-‏ .(GRK6<br />

חולקו לתתי משפחות על פי הומולוגיה בין הרצפים והשינויים שלאחר תרגום<br />

אחד ממנגנוני הבקרה על ה-‏ GRKs מתווך על ידי קינאזות ממשפחת ה-‏<br />

.serine/threonine kinases<br />

זרחון GRK2 בעמדות של סרינים ספציפיים יכול,‏ במצבים שונים,‏ לגרום לעיכוב או להגברת פעילות<br />

האנזים.‏ מחקרים הראו שזרחון<br />

GRK2 בעמדת<br />

לעיכובו,‏ ע"י כך שאינו מאפשר את קשירתו ל-‏<br />

Ser670 ע"י הקינאז ERK ממשפחת ה - MAPK גורם<br />

.(43) Gβγ<br />

לעומת זאת זרחון בעמדת<br />

PKA גורם להגברת הפעילות,‏ על ידי כך שנחשפים אזורים המעורבים בקשירה ל-‏<br />

מנגנון בקרה נוסף אשר התגלה לאחרונה מתווך על ידי קינאז בשם<br />

Ser685<br />

.(29) Gβγ<br />

,c-Src<br />

ממשפחת ה-‏<br />

ע"י<br />

tyrosine<br />

,kinases<br />

ומערב זרחון של GRK2 בעמדות טירוזינים שונות בקצה ה-‏ N‏-טרמינלי<br />

הראו שזרחון מסוג זה מגדיל את האפיניות של<br />

ציטוזוליים כגון<br />

.(151 ,44)<br />

GRK2<br />

.Gα 11 ו-‏ Gα q<br />

הוכח שאינטראקציה מסוג<br />

מחקרים<br />

כלפי חלבונים ממברנליים ‏(קולטנים)‏ וכן<br />

Gα q /GRK2<br />

.(35) Gq<br />

גורמת לעיכוב של חלבון ה-‏<br />

לכן,‏ זרחון ה-‏ GRK ע"י c-Src גורם לדיכוי מזורז של מסלול העברת האותות ע"י עיכוב<br />

23

מסלול ה-‏<br />

Gαq/PLCβ2<br />

ספציפית ל-‏ GRK2 ולא נמצאה ב-‏<br />

במקביל לדסנסיטיזציה מוגברת של קולטן ה-‏ .GPCR בקרה מסוג זה הינה<br />

או .GRK6 אחרים כגון GRK5 GRKs<br />

1.6.4<br />

- שפעול מסלולי העברת האותות לאחר הדסנסיטיזציה של קולטני ה-‏<br />

GPCRs<br />

במשך תקופה ארוכה,‏ נחשב תהליך הדסנסיטיזציה של קולטני ה-‏ GPCRs לתהליך אשר מטרתו היחידה<br />

הייתה כיבוי העברת האותות לאחר שפעול הקולטן.‏ בשנים האחרונות,‏ מחקרים רבים הראו שלא כך<br />

המצב:‏ ישנן היום ראיות מוצקות לכך שתהליך הדסנסיטיזציה מעורר בעצמו מסלולי העברת אותות<br />

מאוחרים יותר,‏ כאשר העיקרי מביניהם הינו מסלול ה-‏<br />

(Mitogen-activated protein MAPK<br />

.(100 ,99 ,92) kinases)<br />

ישנן שתי דרכים דרכן קולטן ה-‏ β2AR ‏(לגביו נעשו רוב המחקרים בנושא)‏ גורם לשפעול של מסלול ה-‏<br />

:MAPK<br />

אחת התלויה בזרחון הקולטן ע"י (PKA dependent) PKA והשנייה התלויה בזרחון הקולטן<br />

ע"י GRK וקשירת β-arrestin אליו<br />

גירוי הקולטן ה-‏<br />

.(β-arrestin dependent)<br />

β2AR<br />

גורם לשפעול ושחרור חלבון<br />

G s<br />

וכך לשפעול אדניליל ציקלאז,‏ היווצרות<br />

השליח המשני cAMP ושפעול PKA .PKA עצמו יכול לזרחן בחזרה את הקולטן ה-‏ β2AR ‏(כמתואר<br />

בפרק<br />

לחלבון<br />

ה-‏<br />

בשם<br />

.(1.6.1<br />

,32)<br />

G i<br />

,Ras<br />

כתוצאה מזרחון זה,‏ האפיניות של הקולטן לחלבון G s יורדת לטובת אפיניות גדולה יותר<br />

182). נמצא שתת-היחידה βγ המשתחררת מחלבון ה-‏ G i מסוגלת לשפעל את מולקולת<br />

אשר משפעל את c-Src ומכאן את מסלול ה-‏<br />

,MAPK<br />

עד לקינאזות<br />

,p42/44<br />

.(98 ,13) ERK1/2<br />

שפעול זה של<br />

ERK1/2 דרך<br />

הידועות גם<br />

PKA הינו מהיר למדי וקורה בפחות מ-‏<br />

2<br />

דקות.‏<br />

בנוסף,‏ נמצא שהקומפלקס של הקולטן המזורחן ע"י GRK יחד עם ה-‏ β-arrestin מסוגל לשפעל גם הוא<br />

את c-Src ולכן גם הוא גורם לשפעול מסלול ה-‏ MAPK<br />

.(97)<br />

שפעול של ERK1/2 בדרך זו נראה<br />

מאוחר יותר יחסית לשפעול ע"י PKA ‏(היות וזרחון הקולטן ע"י GRK וקשירת β-arrestin אליו הינו<br />

תהליך ארוך יותר)‏<br />

,<br />

אך קיים לזמן ארוך הרבה יותר ‏(עד<br />

ERK1/2 בדרך זו הינה תלויה בחוזק האינטראקציה בין הקולטן ל-‏<br />

בזהות חומצות האמינו המזורחנות ע"י ה-‏<br />

30-45 דקות)‏ .(155)<br />

β-arrestin<br />

GRKs השונים .(155)<br />

מחקרים הראו ששפעול<br />

(87) אשר תלוי בעצמו<br />

- חשיבות המחקר ומטרת העבודה<br />

1.7<br />

בשנים האחרונות עלתה בעולם המערבי צריכת הסוכר בצורה ניכרת,‏ דבר המגביר את הסיכון והרגישות<br />

למחלות כגון השמנה,‏ יתר לחץ דם,‏ סכרת וכו'.‏ פתרון אפשרי לבעיה זו הוא מציאת ממתיק מלאכותי בעל<br />

טעם זהה לסוכר טבעי אך במהותו חסר קלוריות.‏ טרם נמצא ממתיק מלאכותי כזה שמתיקותו וטעמו יידמו<br />

לאלה של סוכרים כגון סוכרוז,‏ הנחשב לממתיק אופטימלי.‏ בנוסף,‏ צריכת ירקות ופירות מסוימים בעלי<br />

טעם מר כגון חסה,‏ ברוקולי,‏ כרוב,‏ כרובית,‏ אשכוליות איננה עולה עקב טעם חזק הנתרם ע"י פנולים<br />

24

ותרכובות אחרות ‏(חלקן הגדול בעלות ערך תזונתי או בריאותי).‏ בנוסף,‏ התפתחות מנגנוני עיבוד המזון<br />

בתעשייה הביאה במקרים מסויימים להיווצרות תרכובות מרות ‏(חלקן בעלות תרומה תזונתית)‏ אשר<br />

עלולות לגרום לדחייה של מוצרים אלו.‏ לכן,‏ על מנת למסך את המרירות במזונות המעובדים,‏ מוסיפות<br />

חברות המזון ממסכי מרירות הכוללים לעיתים סוכר,‏ דבר הגורם להשקעת כסף רב והפיכת המוצרים<br />

לעתירי קלוריות.‏<br />

1.7<br />

איור – מבנים מולקולריים של מספר תרכובות מרות ומתוקות אמפיפטיות ‏(המרות מוצגות בצד<br />

שמאל,‏ המתוקות בצד ימין)‏ אשר שימשו במחקר הנוכחי.‏<br />

ידוע כי תרכובות מרות וממתיקים מלאכותיים מעוררים תחושות ‏"מוזרות"‏ של טעמי לוואי כגון הטעם<br />

המתכתי.‏ תופעה ידועה נוספת הינה תופעת ה-"טעם המים המתוקים"‏<br />

,(water sweet aftertaste)<br />

המתארת מצב בו מים מורגשים כמתוקים כאשר הם נבלעים לאחר טעימת ממתיקים כגון סכרין או<br />

אצסולפאם-‏K‏.‏ במשך שנים,‏ לא נמצא הסבר לתופעה זו עד שלאחרונה פורסם מחקר אשר מציע מנגנון<br />

חדש בו הממתיק עצמו יכול,‏ בריכוזים גבוהים,‏ לפעול כמעכב לקולטן למתוק על ידי קשירה לאזור<br />

25

הטרנסממברנלי של .T1R3 שטיפה של הטעמן ע"י בליעת המים משחררת את הקולטן מהמעכב שלו וכך<br />

המים מורגשים כמתוקים<br />

.(49)<br />

בנוסף,‏ ידוע כי בניגוד לסוכרים טבעיים המורגשים מיד לאחר הטעימה ולמשך זמן קצר,‏ הטעם של<br />

תרכובות מרות וממתיקים מלאכותיים מגיע לשיא לאחר זמן ממושך,‏ תופעה הידועה בשם<br />

ונשאר זמן רב בפה,‏ תופעה המכונה שאריתיות או<br />

,slow onset<br />

.lingering aftertaste<br />

תופעת השאריתיות גורמת<br />

לתחושה לא נעימה לאורך זמן ‏(לעתים עשרות דקות)‏ לאחר סיום צריכת מוצר המזון,‏ ובכך מהווה גורם<br />

מגביל לצריכה רחבה יותר של מוצרים הכוללים תרכובות מסוג זה.‏ המנגנון המולקולרי של תופעת<br />

השארתיות אינו ידוע.‏<br />

תרכובות מרות וממתיקים מלאכותיים מגוונים מאוד במבנה שלהם אך לרובם תכונה משותפת בהיותם<br />

תרכובות אמפיפטיות,‏ כלומר מולקולות בעלות חלק הידרופובי וחלק הידרופילי ‏(איור<br />

.(1.7<br />

לפני מספר שנים,‏ הועלתה ההשערה לפיה תכונת האמפיפטיות מקנה לתרכובות אלו אפשרות להיצמד<br />

לממברנת התא,‏ לחדור דרכה לתוך הציטוזול,‏ ושם להשפיע על פעילותם של מרכיבים תוך תאיים.‏ בעבר<br />

נמצא שתרכובות אמפיפטיות מרות יכולות לחדור ממברנות ליפוזומים<br />

אינטראקציה ישירות עם חלבוני G<br />

אנזימים כגון פוספודיאסטראזות<br />

,(133 ,132 ,22)<br />

,(116)<br />

לעכב או ולהפעיל תעלות מסוגים שונים<br />

,(170 ,31)<br />

(132) Peri et al. .(144)<br />

,cyclo(Leu-Trp)<br />

לעבור<br />

או לעכב<br />

הראו שתרכובות מרות כמו כינין ו-‏<br />

ותרכובות מתוקות כמו סכרין ו-‏ D‏-טריפטופן אכן חודרות לתוך תאי טעם בפפילה<br />

מבודדת ‏(המופרדת מאפיתל הלשון ע"י טיפול בקולגנאז)‏ וגם לתוך תאי טעם בפקיעיות מבודדות.‏<br />

השערת העבודה הינה שבמקביל לקשירה לקולטן והפעלת מסלול העברת האותות,‏ תרכובות מרות<br />

ומתוקות אמפיפטיות מסוגלות לחדור את ממברנת תאי הטעם ומרגע שנמצאות בתוך ציטוזול התא,‏<br />

משבשות את פעילותן של קינאזות ממשפחת ה-‏<br />

מנגנון הדסנסיטיזציה של הקולטן<br />

.GRKs<br />

(desensitization)<br />

עיכוב פעילותן של ה-‏ GRKs תגרום לעיכוב<br />

ולכן למסלול העברת האותות להימשך זמן רב<br />

יותר.‏ תופעה כזו,‏ אם תוכח,‏ תהווה מנגנון אפשרי לתופעת השאריתיות ‏(איור 1.8).<br />

ד"ר מירב צוברי-סמואלוב הראתה בעבודת הדוקטור שלה כי טעמנים אמפיפטיים מרים ומתוקים מסוגלים<br />

לעכב<br />

in-vitro<br />

את פעילותן של<br />

הדסנסיטיזציה של מגוון קולטני GPCR<br />

,PKA ו-‏ GRK5 ,GRK2<br />

.(186)<br />

שלוש קינאזות אשר אחראיות על מנגנון<br />

26

איור<br />

(T)<br />

– 1.8<br />

.GPCRs<br />

השערת העבודה:‏ טעמנים אמפיפטיים מעכבים את מנגנון הדסנסיטיזציה של קולטני<br />

המודל מתאר מצב בו טעמנים מרים ומתוקים אמפיפטיים משפעלים מצד אחד את הקולטן שלהם אך (R)<br />

במקביל חודרים לתוך ציטוזול תאי הטעם ושם מעכבים את פעילותן של קינאזות ממשפחת ה-‏ ,GRK ובדרך זו<br />

של הקולטן.‏ במקרה כזה,‏ הקולטן צפוי להראות פעילות<br />

מעכבים את מנגנון הדסנסיטיזציה<br />

ממושכת מהרגיל.‏<br />

(desensitization)<br />

מטרה ראשונה של עבודת המחקר הנוכחית הייתה להוכיח את יכולתם של טעמנים אמפיפטיים לחדור<br />

באופן טבעי לתוך תאי הטעם ‏(דרך הצד האפיקלי,‏ בהתאם לתנאים פיזיולוגיים).‏ לשם כך נעשה בשלב<br />

ראשון בעזרת מיקרוסקופיה קונפוקלית מעקב דינמי אחר חדירתם של טעמנים אמפיפטיים מרים ומתוקים<br />

לפפילת<br />

(CV) circumvallate<br />

שלמה ‏(שלא הופרדה מהלשון).‏ ניסויים נוספים נערכו בחולדות<br />

מורדמות במטרה להעריך את ריכוז הטעמנים בתוך תאי פקיעית הטעם לאחר צריכתם.‏ בשלב הבא,‏<br />

נבדקה נוכחותם של<br />

GRKs<br />

בתאי פקיעית הטעם מפפילת<br />

CV<br />

במטרה לזהות קיום מנגנון של<br />

דסנסיטיזציה הומולוגית לקולטני GPCRs בתאים אלו.‏ בנוסף,‏ נבחנה השפעתם של טעמנים אמפיפטיים<br />

מרים ומתוקים על מנגנון הדסנסיטיזציה המתווך ע"י<br />

,GRKs<br />

(β2AR)<br />

כמודל לקולטנים ממשפחת ה-‏<br />

,GPCRs<br />

ע"י שימוש בקולטן ה-‏ β2‎‏-אדרנרגי<br />

לה משתייכים הקולטנים לטעם.‏ לשם כך נבחנה<br />

השפעתם של טעמנים חודרי ממברנות על שלושת הקריטריונים האופייניים לדסנסיטיזציה של הקולטן ה-‏<br />

(1 :β2AR<br />

דסנסיטיזציה של האותות ‏(סיגנל)‏ המועברים על ידי הקולטן;‏<br />

(2<br />

מידת זרחון הקולטן;‏<br />

(3<br />

אינטרנליזציה של הקולטן לציטוזול התא.‏ בנוסף,‏ נבחנה השפעה אפשרית של הטעמים האמפיפטיים על<br />

שפעול ERK אשר תלוי בדסנסיטיזציה של הקולטן ה-‏ β2AR עצמו.‏<br />

27

2. חומרים ושיטות<br />

- 2.1 חומרים<br />

- 2.1.1 רשימת חומרים<br />

Acetic acid<br />

Acetic anhydride<br />

Acrylamide-bis<br />

Adenosine 3’5’ cyclic monophosphate (cAMP)<br />

[ 125 -I]- cAMP (Adenosine 3’5’ cyclic phosphoric<br />

acid, 2’-O-succinyl [ 125 -I] iodotyrosine methyl ester<br />

Agarose<br />

Aprotinin<br />

Anti cAMP-BSA serum<br />

Benzamidine<br />

Bovine serum albumin (BSA)<br />

Caffeine<br />

Calcium chloride<br />

Collagenase D<br />

Coomassie brilliant blue G<br />

Cyclo (Leu-Trp)<br />

Deoxycholic acid sodium salt<br />

1,4-Diazabicyclo[2.2.2] octane (DABCO)<br />

Dimethylsulfoxide (DMSO)<br />

Dithiothreithol (DTT)<br />

Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)<br />

Ether<br />

Ethidium bromide<br />

Ethyl alcohol<br />

Ethylene diaminetetraacetic acid (EDTA)<br />

Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)<br />

-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA)<br />

Fetal bovine serum (FBS) heat inactivated<br />

Glucose<br />

Glutamine solution<br />

Glycerol<br />

β-Glycerophosphate<br />

Glycine<br />

N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-<br />

N’-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES)<br />

3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)<br />

Isopentane<br />

(−)-Isoproterenol hydrochloride (ISO)<br />

Leupeptin<br />

Magnesium chloride<br />

Frutarom, Israel<br />

Sigma, USA<br />

Serva, Germany<br />

Sigma, USA<br />

NEN, USA<br />

Gibco, USA<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Boehringer, Germany<br />

Sigma, USA<br />

Bachem, Switzerland<br />

Fluka, Israel<br />

Sigma, USA<br />

Merck, Germany<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Gadot, Israel<br />

Tamar, Israel<br />

Bio-Lab, Israel<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Gibco, USA<br />

Merck, Germany<br />

Biological Industries,<br />

Israel<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

28

Magnesium sulfate<br />

Neohesperidin dihydrochalcone (NHD)<br />

Naringin<br />

Optimal Cutting Temperature (OCT)<br />

Opti-MEM® I<br />

Orthovanadate<br />

Paraformaldehyde (PFA)<br />

Penicillin-Streptomycin<br />

Pepstatin A<br />

Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)<br />

Potassium carbonate<br />

Potassium chloride<br />

Potassium dihydrogen phosphate<br />

Potassium iodide<br />

Propidium iodide<br />

Protein G PLUS-Agarose beads<br />

Pyruvic acid<br />

Quinine hydrochloride<br />

Sodium acetate<br />

Sodium bicarbonate<br />

Sodium chloride<br />

Sodium dodecyl sulfate (SDS)<br />

Sodium fluoride (NaF)<br />

di- Sodium hydrogen phosphate heptahydrate<br />

Sodium hydroxide<br />

Sodium phosphate<br />

Sodium saccharin<br />

Trichloroacetic acid (TCA)<br />

Tricine<br />

Triethylamine<br />

Tris (Tris [hydroxymethyl]aminomethane)<br />

Triton X-100<br />

Trypsin-EDTA solution C<br />

Trypsin inhibitor (type П-S: soybean)<br />

D-Tryptophan<br />

Tween-20<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Menzel-Glazer,<br />

Germany<br />

Gibco, USA<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Biological Industries,<br />

Israel<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Frutarom, Israel<br />

Frutarom, Israel<br />

Merck, Germany<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Santa-Cruz, USA<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Merck, Germany<br />

Merck, Germany<br />

Frutarom, Israel<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Merck, Germany<br />

Frutarom, Israel<br />

Merck, Germany<br />

Sigma, USA<br />

Merck, Germany<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Biological Industries,<br />

Israel<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

Sigma, USA<br />

- 2.1.2 נוגדנים,‏ אנזימים,‏ חומצות גרעין וערכות<br />

GRK2, GRK5, GRK6, HA probe, β2AR and<br />

antiphosphoSer(355-356) β2AR first antibodies<br />

ERK and phosphoERK first antibodies<br />

HRP/FITC-conjugated secondary antibodies<br />

ECL luminescence kit<br />

all Santa-Cruz, USA<br />

Sigma, USA<br />

Jackson, USA<br />

Santa-Cruz, USA<br />

29

Rneasy Protect Starter kit<br />

PCR purification kit<br />

Reverse-iT 1 st strand synthesis kit<br />

ReddyMix PCR Master kit<br />

Red Load Taq Master<br />

Primers<br />

pcDNA3 plasmid containing human β2AR gene<br />

pcDNA3 plasmid containing HA tagged-β2AR gene<br />

MaxFect<br />

Qiagen, Germany<br />

Qiagen, Germany<br />

ABgene, UK<br />

ABgene, UK<br />

Larova GmbH, Germany<br />

HyLabs, Israel<br />

Dr. Lefkowitz, R.J.,<br />

Howard Hughes Medical<br />

Institute, Durham, NC,<br />

USA<br />

Missouri S&T cDNA<br />

Resource Center, USA<br />

(www.cdna.org)<br />

Molecula Research Labs,<br />

USA<br />

(www.molecula.com)<br />

- 2.1.3 בופרים ותמיסות<br />

Phosphate buffered saline (PBS X1): NaCl 120 mM, KCl 2.5 mM, EGTA 1 mM and<br />

Tris 2.0 mM titrated with HCl to pH 7.4.<br />

Bradford solution: Coomassie brilliant Blue G 10% (w/v), ethanol 4.75% (v/v) and<br />

phosphoric acid 8.5% (v/v) in DDW.<br />

Buffer A: β-glycerophosphate 50 mM, EGTA 1.5 mM, orthovanadate 0.1 mM, EDTA<br />

1 mM, DTT 1 mM with HCl to pH 7.3.<br />

Buffer H: β-glycerophosphate 50 mM, EGTA 1.5 mM, orthovanadate 0.1 mM, EDTA<br />

1 mM, DTT 1 mM, benzamidine 1 mM, aprotinin 10 μg/ml, leupeptin 10 μg/ml,<br />

pepstatin A, 2 μg/ml.<br />

Hank's buffer: NaCl 137 mM, KCl 5.3 mM, Na 2 HPO 4 0.3 mM, MgSO 4 0.4 mM,<br />

MgCl 2 0.5 mM, Hepes 5 mM, Tricine 6.5 mM, glucose 30 mM, NaHCO 3 4 mM.<br />

Mounting solution: Glycerol 90% (v/v), Tyrode 10% (v/v), DABCO 3% (w/v),<br />

sodium azide 0.1% (w/v).<br />

RIPA buffer: Tris 20 mM, NaCl 137 mM, Glycerol 10%, SDS 0.1%, Deoxycholate<br />

0.5%, Triton X-100 1%, EDTA 2 mM, PMSF 1 mM, Leupeptin 20 μM.<br />

Running buffer: Tris 25 mM, Glycine 192 mM and SDS 0.1% (w/v).<br />

Sample buffer X4: Tris 0.2 M, glycerol 40% (v/v), SDS 0.08% (w/v), DTT 0.1 M,<br />

bromophenol blue for blue color.<br />

TBST: Tris 20 mM, NaCl 150 mM, Tween-20 0.05% (v/v).<br />

30

Tyrode Buffer: NaCl 140 mM, KCl 5 mM, Hepes 10 mM, MgCl 2 1 mM, CaCl 2 1 mM<br />

fixed to pH 7.4 with tris.<br />

TGPP: Tyrode buffer containing pyruvic acid 10 mΜ and glucose 10 mM.<br />

TAE buffer: Tris- acetate 40 mM, EDTA 1 mM.<br />

Transfer buffer: Tris 15 mM and Glycine 120 mM.<br />

31

2.2 שיטות<br />

2.2.1<br />

- הדמיית חדירת טעמנים לתוך פפילות CV שלמות תוך מעקב דינמי<br />

במיקרוסקופ קונפוקלי פלואורסצנטי<br />

חולדות נקבות מזן<br />

(in situ)<br />

,Sprague-Dawley<br />

במשקל של<br />

150-175<br />

גרם,‏ התקבלו מבית החיות<br />

האוניברסיטאי.‏ החיות הוחזקו בכלובים בגודל 40×25 ס"מ עם מזון ומים ללא הגבלה,‏ בטמפרטורה של<br />

23±2°C ובמחזור הארה של 12 שעות אור,‏ 12 שעות חושך.‏ ביום הניסוי,‏ החולדות הורדמו ע"י אתר<br />

והומתו ע"י הסרת ראש .(decapitation)<br />

על מנת לעקוב אחר תנועה והצטברות של הטעמנים לתוך רקמת הפפילה,‏ ניצלנו את התכונות<br />

הפלואורסצנטיות שלהם תוך שימוש בשיטת מיקרוסקופיה קונפוקלית פלואורסצנטית.‏ בעזרת מספריים<br />

עדינות וללא טיפול בקולגנאז,‏ הוצא מלשון החולדה משטח רקמת אפיתל בגודל של<br />

ובמרכזו פפילת ה-‏<br />

2X2X2<br />

circumvallate<br />

מ"מ<br />

(CV) ביחד עם רקמות השומן והשריר שבצד הבזולטרלי,‏ כך שהצד<br />

האפיקלי בלבד של הפפילה נמצא חשוף לסביבה,‏ בדומה למצב פיזיולוגי.‏ משטח זה הונח על זכוכית נושא<br />

בתוך 5 μL של בופר .TGPP<br />

של הטעמנים היה:‏ סכרין<br />

לאחר מכן,‏ הוספו 5 μL של תמיסה מרוכזת של טעמן כך שהריכוז הסופי<br />

,10 mM - D‏-טריפטופן ,10 mM -<br />

נרינגין<br />

,1 mM - CLT ,1 mM -<br />

.10 mM - וקפאין 1 mM -<br />

הצילומים התמקדו בתעלה הפנימית של הפפילה<br />

היכן שפקיעיות הטעם מרוכזות.‏ זמן הוספת הטעמן הוגדר כזמן<br />

כינין<br />

,(inner trench circle)<br />

,0<br />

כאשר רמת הפלואורסצנציה הותאמה<br />

לרמת הרקע.‏ לאחר מכן,‏ תמונות נוספות צולמו כל שתי דקות.‏ כביקורת,‏ צולמה הפפילה בתוך תמיסת<br />

TGPP<br />

בהיעדר טעמן.‏ לאחר<br />

6<br />

דקות של הדגרה עם הטעמן,‏ הוספה תמיסה של אשלגן יודיד<br />

בריכוז סופי של 0.5 M למשך שתי דקות נוספות.‏ KI הינו מלח מדעיך פלואורסצנציה<br />

(KI)<br />

(quencher)<br />

אשר אינו חודר ממברנות של תאים ולכן מטרתו בניסוי זה לגרום לדעיכת הפלואורסצנציה של מולקולות<br />

הטעמנים אשר נספחו על פני שטח ממברנת הפפילה.‏ על פי אותו היגיון,‏ מולקולות הטעמנים אשר חדרו<br />

דרך ממברנות התאים פנימה,‏ לתוך הציטוזול,‏ תהינה מוגנות מפני השפעת ה-‏KI‏.‏ כביקורת חיובית<br />

לפעילות המדעיך ולחיותם של תאי הטעם השתמשנו בפרופידיום יודיד<br />

,(50 μg/mL) PI<br />

תרכובת<br />

פלואורסצנטית אשר נקשרת לחומצות הגרעין אך אינה חודרת ממברנות של תאים חיים ולכן משמשת<br />

במחקרים רבים לזיהוי תאים מתים ע"י צביעת הגרעין שלהם.‏ התמונות נשמרו בפורמאט<br />

בעזרת התוכנות<br />

TIFF ועובדו<br />

.Adobe Photoshop ו-‏ Image-Pro Plus Media Cybernatics<br />

לפני שבוצעו ניסויים במיקרוסקופ הקונפוקלי,‏ נקבע כושרו של KI בהדעכת פלואורסצנציה של הטעמנים<br />

הנבדקים ופרופידיום יודיד מומסים בתמיסת<br />

TGPP<br />

בעזרת ספקטרופוטומטר מסוג<br />

Carry Eclipse<br />

.(Variant Australia PTY LTD, Australia) fluorescence spectrophotometer<br />

32

2.2.2<br />

- הפרדת פפילת ה-‏ CV בחולדה<br />

רקמת פפילת ה-‏ CV הופרדה מהלשון לפי<br />

(163) ‏(איור .(2.1<br />

החיות הורדמו בעזרת אתר והומתו ע"י<br />

הסרת ראש.‏ הלשון הוצאה ונשטפה מיד בבופר TGPP קר.‏<br />

במטרה להפריד בין רקמת הפפילה לבין רקמת החיבור בלשון,‏ הוזרקו מסביב לפפילה ומתחתה<br />

500 μl<br />

מתמיסה המורכבת מקולגנאז בריכוז של 4 mg/ml ומעכב טריפסין שמקורו מסויה בריכוז 4. mg/ml<br />

ההזרקה נעשתה בשש נקודות שונות<br />

) 5 מסביב,‏<br />

1 מתחת לפפילה)‏ תחת מיקרוסקופ בינוקולרי.‏ לאחר<br />

תהליך ההזרקה,‏ הלשון הודגרה בתמיסת TGPP תוך בעבוע אוויר במשך 15 דקות בטמפרטורה של<br />

30<br />

. °C<br />

לאחר מכן ריבוע של אפיתל הכולל את הפפילה נגזר בעזרת מספריים עדינות,‏ הופרד ע"י משיכה<br />

עם פינצטה עדינה<br />

‏(מספר 5)<br />

ונשטף בתמיסת TGPP קרה<br />

.(4°C)<br />

ריבוע האפיתל הונח על צלחת בתוך תמיסת TGPP קרה כך שצינורות ההפרשה<br />

(von Ebner gland<br />

ducts) פונים כלפי מעלה.‏ הצינורות הוסרו בעזרת מספריים עדינות והפפילה הופרדה מרקמת האפיתל<br />

הלא סנסורי ע"י גזירה,‏ כך שהתקבל מבנה פרסה המכיל את פקיעיות הטעם והוא הפפילה ‏(איור<br />

.(2.1<br />

2.1<br />

- בידוד פפילת CV מלשון חולדה.‏<br />

איור אפיתל הלשון עם פפילת ה-‏ CV לאחר<br />

א-‏ טיפול בקולגנאז והסרתה מן הלשון השלמה.‏<br />

הסרת צינורות ההפרשה.‏<br />

ב-‏ חיתוך פפילת ה-‏ CV משטח האפיתל.‏<br />

אשר מכילה את<br />

פפילת ה-‏ ד-‏ האיברונים הסנסוריים מופרדת מן האפיתל<br />

הלא-סנסורי.‏<br />

לקוח מתוך (163).<br />

CV<br />

ג -<br />

2.2.3<br />

- הפרדת תוכן התאים מרקמת פפילת CV וקביעת כמות חלבון<br />

פפילות CV אשר בודדו כמתואר בסעיף<br />

2.2.2 עברו<br />

הדגרה עם הטעמנים השונים,‏ נשטפו בבופר TGPP<br />

חמש פעמים,‏ ופוצצו ע"י סידרה של ארבע הקפאות והפשרות ב-‏ 20°C-. ממברנות התאים הושקעו ע"י<br />

סרכוז בצנטריפוגת אפנדורף ב-‏ 20,000g בטמפרטורה של 4°C למשך<br />

45 דקות.‏<br />

הנוזל העליון שהכיל<br />

33

את תוכן התאים הופרד,‏ הוקפא,‏ יובש בהקפאה ונשמר בטמפרטורה של 20°C- עד לקביעה כמותית ב-‏<br />

.HPLC<br />

המשקע שהתקבל אחרי סרכוז הכיל את ממברנות תאי הפפילה ושימש לקביעת כמות החלבון בשיטת<br />

.(17) Bradford<br />

למשקע הוספו<br />

בטמפרטורה של 60°C. לאחר מכן הוספו<br />

של<br />

50 μl של תמיסת NaOH 5 M והתמיסה הודגרה במשך 45<br />

450 μl מים מזוקקים,‏<br />

50 μl לבדיקה.‏<br />

לכל דוגמא הוסף נפח של<br />

קריאת בליעה באורך גל של 595 nm<br />

BSA שימש לעקום כיול.‏<br />

,Bradford מתמיסת 250 μl<br />

דקות<br />

התמיסה עורבבה ונלקחו שלוש דגימות<br />

וכמות החלבון נקבעה בעזרת<br />

במכשיר ,(Bio-Tek®Instruments, Inc., USA) Elisa<br />

כאשר<br />

2.2.4<br />

- חדירת הטעמן לתוך תאי הטעם של פפילת CV<br />

חולדות הורדמו ע"י הזרקת<br />

vivo) (in בחולדות מורדמות<br />

0.5 mL פנטוברביטל mg/kg) 60 משקל גוף)‏<br />

לתוך חלל הבטן והונחו על<br />

משטח מיוחד שאיפשר הטיה נוחה של הגוף בזווית של 30° כלפי מטה,‏ כך שניתן היה לשמור על חלל<br />

הפה פתוח בעזרת פינצטה ‏(איור<br />

(2.2<br />

ולהזרים לסירוגין נפח של 10 מ"ל של הטעמן בעזרת פיפטת פסטר<br />

למשך 90 שניות ללא גרימת חנק לחיה.‏ ריכוזי הטעמנים היו כדלקמן:‏ D‏-טריפטופן<br />

- CLT ,30 mM -<br />

כינין ,2 mM<br />

קולגנאז ‏(כמתואר בסעיף<br />

מזוקקים פעמיים<br />

.10 mM - וקפאין 2 mM -<br />

.(2.2.2<br />

(DDW)<br />

CV נעשתה כמתואר בסעיף<br />

לאחר מכן החיות הומתו ופפילת ה-‏ CV הופרדה בעזרת<br />

הפפילה המופרדת העשירה בפקיעיות טעם הוכנסה ל-‏ 100 μL מים<br />

ונשמרה ב 70°C- עד להמשך הטיפול.‏ הפרדת תוכן התאים מרקמת פפילת ה-‏<br />

.2.2.3<br />

הפה של החיה לא כללה את הטעמן.‏<br />

מאחר והטיפול בקולגנאז להוצאת פפילת ה-‏ CV מן הלשון ארך כ-‏<br />

כמות הטעמן אשר זרמה החוצה מתאי הטעם<br />

נוספים בהם פפילות<br />

חיות הביקורת טופלו באופן דומה,‏ אך התמיסה שהוזרמה לתוך חלל<br />

25 דקות,‏<br />

(efflux)<br />

CV<br />

הודגר בשלב ראשון 2 דקות ב<br />

שניות באותה טמפרטורה.‏ בתום<br />

הופרדו כמתואר בסעיף<br />

,2.2.2<br />

100 μL<br />

תמיסת<br />

נעשה ניסיון להעריך את<br />

במהלך טיפול זה.‏ למטרה זו,‏ בוצעו ניסויים<br />

נחתכו לשני חצאים שווים וכל חצי פפילה<br />

30°C ב-‏ TGPP<br />

ולאחר מכן עם טעמן למשך<br />

30<br />

30<br />

השניות,‏ חצי פפילה אחד נשטף 5 פעמים בתמיסת<br />

,TGPP הוכנס<br />

ל 100 μL<br />

מים מזוקקים והוקפא ב-‏ 70°C-. לעומתו,‏ חצי הפפילה השני הועבר לתוך 100 μL תמיסת<br />

30°C, למשך 25 דקות ב-‏ TGPP<br />

קולגנאז לאחר ניסויי ה-‏<br />

.in vivo<br />

בניסיון לחקות את זמן ההמתנה אותו עוברת פפילת ה-‏ CV בטיפול<br />

רק לאחר המתנה זו חצי הפפילה נשטף ונשמר בדומה לחצי הפפילה<br />

הראשון עד להמשך הטיפול של הפרדת תוכן התאים מרקמת פפילת CV ‏(סעיף 2.2.3).<br />

לאחר הפרדת תוכן התאים כמתואר בסעיף<br />

בסעיף<br />

,2.2.3<br />

כמות הטעמן נקבעה בשיטת ה-‏<br />

HPLC<br />

.2.2.5<br />

כמתואר<br />

שיעור בריחת הטעמן החוצה בזמן הטיפול בקולגנאז הוערך ע"י השוואת כמות הטעמן<br />

שנמצאה בחצי הפפילה אשר נשטף 25 דקות לאחר הדגרה עם הטעמן יחסית לכמות הטעמן שנמצאה<br />

בחצי הפפילה שלא עבר את שלב ‏"ההמתנה".‏ לניסוי זה שימשו טעמנים בעלי אופי פלואורסצנטי או<br />

לחילופין בעלי בליעה גבוהה באור UV אשר אפשרה סף זיהוי נמוך במערכת ה-‏HPLC‏.‏<br />

34

איור 2.2<br />

- הזרמת תמיסת טעמנים לתוך פיה של חולדה מורדמת לצורכי בחינת יכולתם של טעמנים<br />

אמפיפטיים לחדור לתוך פפילת CV בתנאי<br />

.in vivo<br />

2.2.5<br />

- קביעה כמותית של טעמנים בתוך תאי טעם מפפילת CV בעזרת שיטת HPLC<br />

לאחר ייבוש תוכן התאים כמתואר בסעיף<br />

כרומטוגרפיה נוזלית<br />

,2.2.3<br />

.HPLC<br />

הבדיקה נעשתה במערכת מתוצרת<br />

כמות הטעמן שנכנסה לתוך תאי הטעם נמדדה בעזרת<br />

Merck-Hitachi (Darmstadt,<br />

Germany)<br />

המצוידת במשאבה<br />

, L-7100<br />

גלאי פלואורסצנטי<br />

F-1050<br />

וגלאי<br />

L-7455 UV<br />

(UltraViolet-visible diode-array)<br />

המחוברים בטור.‏ ההפרדה נעשתה בקולונה ארוכה<br />

(LiChroCart® או בקולונה קצרה (LiChroCart® 250-4 LiChrospher® 100 RP-18 (5 μm))<br />

.(186 ,132) בתוספת פרקולונה מתאימה של RP-18 55-4 Purospher Star RP-18 (3 μm))<br />

הטעמנים המתוקים סכרין ו-‏<br />

ונרינגין הופרדו בקולונה ארוכה וזוהו בגלאי<br />

,(NHD) neohesperidin dihydrochalcone<br />

.UV<br />

והטעמנים המרים קפאין<br />

לעומתם,‏ שלושת הטעמנים D‏-טריפטופן,‏ כינין<br />

והפפטיד (Leu-Trp) cyclo הופרדו בקולונה קצרה ונבדקו בגלאי הפלואורסצנטי כל אחד לפי אורכי גל<br />

עירור ופליטה מתאימים.‏ הטעמנים זוהו על פי זמני שהייה של כל אחד מהם בקולונה<br />

(RT - Retention<br />

, Time)<br />

וכומתו על בסיס עקומת כיול והשוואת שטחי פיקים שהתקבלו בדוגמאות לאותה עקומה.‏<br />

הפרדת סכרין נעשתה בהרצה איזוקרטית עם פאזה נעה המורכבת ממתנול ומחומצה אצטית 1.5%<br />

ביחסים של<br />

(v/v)<br />

(v/v) 20:80 בהתאמה,‏<br />

בקצב זרימה של<br />

.0.45 ml/min<br />

.268 nm<br />

בליעת סכרין נמדדה באורך גל של<br />

D‏-טריפטופן הופרד בקולונה קצרה ביחסים משתנים של חומצה אצטית (v/v) 1.5% ומתנול בגרדיאנט:‏<br />

יחסם של שני הסולבנטים<br />

(v/v) בזמן 0 היה ,5:95<br />

השתנה תוך 4 דקות ל-‏<br />

,25:75<br />

חזר תוך<br />

4 דקות<br />

35

ליחס התחלתי של 5:95 ונשאר כך עוד<br />

4 דקות,‏<br />

אורך הגל לעירור היה 280 nm ולפליטה 345. nm<br />

סה"כ 12 דקות הרצה.‏ קצב הזרימה היה<br />

.1 ml/min<br />

NHD<br />

הופרד בהרצה איזוקרטית בעזרת פאזה נעה המורכבת מאצטוניטריל ומחומצה אצטית<br />

0.5% ביחסים של<br />

(v/v)<br />

(v/v) 65:35 בהתאמה,‏<br />

בקצב זרימה של<br />

.0.75 ml/min<br />

בליעת ה-‏ NHD נמדדה<br />

באורך גל של 282. nm<br />

נרינגין הופרד בקולונה ארוכה בהרצה איזוקרטית בסולבנט המורכב מאצטוניטריל ומים ביחסים של<br />

(v/v) 80:20 בהתאמה,‏<br />

בקצב זרימה של<br />

.1.0 ml/min<br />

הפאזה הנעה ששימשה להפרדת קפאין הייתה מורכבת ממתנול ומים ביחסים של<br />

בקצב זרימה של<br />

בליעת הנרינגין נמדדה באורך גל של 280. nm<br />

(v/v) 50:50 בהתאמה,‏<br />

.0.7 ml/min<br />

בליעתו של הקפאין נמדדה באורך גל של 268. nm<br />

כינין הופרד בקולונה קצרה בהרצה איזוקרטית עם פאזה נעה המורכבת מאצטוניטריל ובופר פוספאט<br />

שהכיל SDS 25 mM ,tetrabutylammonium bromide 3 mM ו-‏ KH 2 PO 4 10 mM והותאם ל-‏<br />

pH 2.3 ע"י חומצה אורתוזרחתית.‏ שני הסולבנטים היו ביחסים של (v/v) 50:50 וקצב הזרימה היה<br />

0.6<br />

.ml/min<br />

אורך הגל לעירור היה 343 nm ולפליטה 395. nm<br />

הפאזה הנעה אשר שימשה להפרדת הפפטיד<br />

ומים אשר הכילו<br />

של<br />

(CLT) cyclo (Leu-Trp)<br />

הייתה מורכבת מאצטוניטריל<br />

(v/v) 1% אצטוניטריל ו-‏ (v/v) 0.02% חומצה טריפלואורואצטית (TFA) ביחסים<br />

(v/v) 70:30 בהתאמה,‏<br />

בהרצה איזוקרטית,‏ בקצב זרימה של<br />

.0.4 ml/min<br />

.345 nm ולפליטה 280 nm<br />

זמני שהייה (RT) של הטעמנים היו<br />

5.0 ,5.8 ,4.5 ,10.2 ,4.25 ,4.39 ,7.05<br />

טריפטופן,‏ ,NHD<br />

נרינגין,‏ קפאין,‏ כינין ו-‏ CLT בהתאמה.‏<br />

אורך הגל לעירור היה<br />

דקות עבור סכרין,‏ D-<br />

RT-PCR - 2.2.6<br />

2.2.6.1<br />

CV פפילות<br />

- הפקת רנ ‏"א כללי RNA) (total מתוך פפילת CV ואפיתל לא סנסורי<br />

מ-‏ 7 חולדות הופרדו מאפיתל הלשון ע"י טיפול בקולגנאז כמתואר בסעיף<br />

אוחדו 2.2.2,<br />

והוקפאו במבחנת אפנדורף ב-‏ 80- C° עד להפקת הרנ"א.‏ דגימות מן האפיתל הלא-סנסורי אשר בסמוך<br />

לפפילת ה-‏<br />

,CV בגודל 1x1x1<br />

מ"מ בקירוב<br />

‏(שטח דומה לזה של הפפילה),‏<br />

בתנאים זהים.‏ הרנ"א הכללי הופק בסביבה סטרילית ככל האפשר בעזרת<br />

נלקחו גם כן ואוחסנו<br />

Rneasy Protect Starter kit<br />

,(Qiagen, Germany)<br />

2.2.6.2<br />

על פי הוראות היצרן.‏<br />

Reverse Transcription (RT) -<br />

שלב ה-‏ RT נעשה מיידית לאחר הפקת הרנ"א הכללי בעזרת<br />

Reverse-iT 1 st Strand Synthesis Kit<br />

(ABgene)<br />

על פי הוראות היצרן:‏ בשלב הראשון,‏<br />

למבחנת אפנדורף ביחד עם<br />

0.5 μg של RNA<br />

מתוך ה-‏<br />

total RNA<br />

הוספו<br />

oligo-dT ומים והודגרו למשך 5 דקות ב-‏ 70°C ולאחר מכן הועברו לקרח.‏<br />

36

ד-‏<br />

dNTPs<br />

למבחנות הוספו ,first standard buffer<br />

והאנזים<br />

.Reverse Transcriptase<br />

התבצעה ב-‏ 47°C למשך 50 דקות וסיום התגובה נעשתה ע"י הדגרה ב-‏ 75°C למשך<br />

הסופי במבחנה היה<br />

10 דקות.‏<br />

.20 μl<br />

תוצרי ה-‏<br />

cDNA<br />

נשמרו ב<br />

-80°C<br />

.PCR<br />

הראקציה<br />

הנפח<br />

עד שישמשו כתבנית בריאקצית ה-‏<br />

דוגמת RNA מקורית ללא שלב ה-‏ RT נשמרה על מנת להוכיח בשלב מאוחר יותר כי לא נותרו<br />

שאריות DNA בעת הפקת ה-‏ RNA ‏(ביקורת שלילית).‏<br />

Polymerase Chain Reaction (PCR) -<br />

2.2.6.3<br />

תגובת ה-‏<br />

PCR<br />

להגברת מקטעי ה-‏<br />

DNA<br />

ReddyMix PCR Master Mix (ABgene)<br />

מראש כל המרכיבים הדרושים ל-‏<br />

ייחודים לאותו גן<br />

ב'‏<br />

.(PCR<br />

של הגנים השונים אשר ביטוים נבדק נעשתה בעזרת<br />

‏(ערכה מוכנה ל-‏PCR אשר מכילה בופר ובו הוכנסו<br />

עבור כל גן נבדק עורבבו<br />

1 μl<br />

,cDNA 2.5 µl<br />

,10 μM מכל אחד בריכוז 0.5 µl)<br />

ראה סעיף<br />

(2.2.6.4<br />

תחלים<br />

ו-‏ 12.5 μl של בופר ה-‏<br />

ReddyMix והנפח הושלם ל-‏ 25 μl עם מים סטריליים.‏ תוכנית ה-‏ PCR כללה 5 שלבים.‏ שלב א':‏<br />

5<br />

דקות ב-‏ 94°C, שלב ב':‏ דנטורציה של גדילי התבנית דקה ב-‏ 94°C, שלב ג':‏ היברידיזציה של התחל<br />

עם התבנית דקה ב-‏ 52°C, טמפרטורה שהינה נמוכה מטמפרטורת ההיתוך של התחלים ושלב ד':‏ סינטזה<br />

של התוצר על ידי הדגרה למשך דקה ב-‏ 72°C ואז חזרה לשלב ב'‏ לשלושים מחזורים נוספים ‏(שלבים<br />

'), שלב ה':‏<br />

על ידי הפרדת<br />

10 דקות ב-‏ 72°C.<br />

10 μl<br />

300-800 בסיסים),‏<br />

בתום שלב זה,‏ הדוגמאות נשמרו ב-‏ 4°C. תוצרי ה-‏ PCR<br />

נבדקו<br />

מכל דוגמה בג'ל אגרוז (w/v) 1.5% ‏(צפיפות המתאימה לגודל המקטעים של<br />

כאשר הבופר להכנת הג'לים היה TAE בתוספת אתידיום ברומיד.‏<br />

ביקורת לשלילת זיהום דנ"א גנומי לתוך הרנ"א המופק נעשה ע"י ביצוע תגובת PCR כפי שתואר קודם<br />

לכן על דגימת רנ"א אשר לא עברה את שלב ה-‏ ,RT בנוכחות התחלים של .GRK2<br />

2.2.6.4<br />

- בחירת תחלים<br />

התחלים ששמשו לקבלת תבנית ה-‏ DNA עבור ה-‏ GRKs והקולטנים לטעם הוזמנו מחברת<br />

HyLabs<br />

‏(רחובות,‏ ישראל).‏ התחלים עבור GAPDH התקבלו מהמעבדה של דר'‏ אורן תירוש.‏ הרצפים מבוססים<br />

על רצפי mRNA מחולדה המפורסמים בבנק הגנים<br />

עבור הקצה ה-‏<br />

.GenBank<br />

5'<br />

(sense) והשני עבור הקצה ה-‏<br />

עבור כל גן תוכננו שני תחלים,‏ אחד<br />

3' (antisense) ‏(ראה טבלה .(2.1<br />

(sequences)<br />

2.2.6.5<br />

- קביעת רצף חומצות הגרעין<br />

לאחר שנקבע כי גודלם של תוצרי ה-‏<br />

RT-PCR<br />

תואמים את הצפוי,‏ הדוגמאות נוקו בעזרת<br />

PCR<br />

Purification Kit (Qiagen, Germany)<br />

ונשלחו לקביעת רצף נוקלאוטידים בחברת<br />

השוואת רצפי האנליזה וזיהוי סופי של התוצרים בוצעו על ידי תוכנת<br />

הנתונים של<br />

.HyLabs<br />

BLAST<br />

.GenBank<br />

תוך שימוש במאגר<br />

37

טבלה מס - רשימת התחלים הייחודיים,‏ גודל התוצר הצפוי וקוד הרצף ב-‏ GenBank לגנים<br />

שביטוים בפפילת ה-‏ CV נבחן בשיטת ה-‏ .RT-PCR<br />

2.1<br />

Gene<br />

Primers<br />

Product<br />

size (bp)<br />

GenBank #<br />

GRK1<br />

Sense 5' TTTCCTGCGGTTTCTTCAGT 3'<br />

Antisense 5' CACGTTCTCTGGCTTGAGGT 3'<br />

460<br />

NM_031096<br />

GRK2<br />

Sense 5’ CTTTGACATTGGCTCCTTTGA 3’<br />

Antisense 5' GTGGCTTGTTCTTCATCTTGG 3'<br />

559<br />

NM_001619<br />

GRK3<br />

Sense 5'ACTGGCTTTGAACGAGAGGA 3'<br />

Antisense 5' GTCGATGCCCTTGAAGAAGA 3'<br />

670<br />

NM_012897<br />

GRK5<br />

Sense 5’CTGGCTTTGAGGAAGAACGA 3’<br />

Antisense 5' GTTTTGATGCTGACGCCTGA 3'<br />

841<br />

NM_030829<br />

GRK6<br />

Sense 5'AGGTGACCCCAGATGAGAAA 3'<br />

Antisense 5' TCTCGGCAGCATAGAAGACA 3'<br />

612<br />

NM_031657<br />

T2R4<br />

Sense 5’ CCACACATACTTACCTTTGGA 3’<br />

Antisense 5' GAGTAGGTTGTTTTGTGGCAG 3'<br />

560<br />

AF227142<br />

T1R3<br />

Sense 5’ CATGACCTCTCACCCAAGGTA 3’<br />

Antisense 5' CATAGCAGCAGGAATGAAAGC 3'<br />

705<br />

AF456324<br />

GAPDH<br />

Sense 5' TCCGCCCCTTCCGCTGATG 3'<br />

Antisense 5' CACGGAAGGCCATGCCAGTGA 3'<br />

350<br />

NM_017008<br />

- קביעת נוכחות קינאזות ממשפחת ה-‏ GRK בפפילת CV ע ‏"י צביעת חתכים<br />

, in-vivo fixation<br />

2.2.7<br />

מרקמות לשון ‏(אימונוהיסטוכימיה)‏<br />

- הכנת חתכים מלשון<br />

2.2.7.1<br />

חולדות הורדמו כמתואר בסעיף 2.2.1 ועברו תהליך של<br />

הכולל פרפוזיה דרך חדר-‏<br />

הלב השמאלי,‏ הזרמת כ-‏ 50 מ"ל בופר פזיולוגי Hank’s לשטיפת הדם החוצה ומניעת קרישה,‏ ולאחר מכן<br />

כ-‏ 40 מ"ל של תמיסת (w/v) 3% paraformaldehyde<br />

לקיבוע כללי של גופת החיה<br />

אשר הומס בבופר פוספט בריכוז של 0.1 M ו-‏<br />

(77). לאחר הפרפוזיה,‏ הלשון הוצאה והודגרה למשך 16 שעות<br />

סוכרוז (w/v) 20%<br />

,pH 7.4<br />

בתמיסת<br />

בבופר פוספט בריכוז של 0.1 M ב-‏ 4°C, במטרה למנוע נזקי קור בהמשך<br />

הטיפול ולשמור על רקמות הלשון גם בתנאי הקפאה.‏ לאחר מכן לשון החולדה הוקפאה ב-‏ 70°C- בתוך<br />

(Optimal Cutting<br />

OCT<br />

איזופנטן עד להמשך הטיפול.‏<br />

הלשונות הקפואות נעטפו בחומר<br />

38

Temperature) ונחתכו באזור פפילת CV במכשיר קריוסטט לחתכים בעובי של 10. μm החתכים הונחו<br />

על זכוכיות נושאות מסוג<br />

,(Menzel-Glazer, Germany) SuperFrost Plus<br />

כאשר חתכים עוקבים<br />

הונחו על זכוכיות שונות על מנת שחתכי הביקורת וגם אלו שעברו טיפול ייצגו את אותו אזור של הפפילה.‏<br />

החתכים יובשו באוויר במשך 30 דקות והוקפאו ב-‏ 20°C- עד להמשך הטיפול.‏<br />

2.2.7.2<br />

- צביעת חתכי פפילת CV בעזרת נוגדנים<br />

החתכים שהתקבלו כמתואר בסעיף הקודם הודגרו למשך שעה אחת עם תמיסת Blocking אשר הכילה<br />

0.3% Triton X-100 ו-‏ (v/v) 10% goat serum<br />

0.1 M בתוך בופר פוספט בריכוז של (v/v)<br />

pH<br />

7.3 בטמפרטורת החדר,‏ כדי למנוע קשירה לא ספציפית של הנוגדן.‏ לאחר מכן,‏ הודגרו החתכים עם נוגדן<br />

ראשוני ספציפי כנגד<br />

הנוגדנים נמהלו ביחס<br />

GRK5 ,GRK3 ,GRK2 או GRK6 למשך<br />

.PBS X1 ב-‏ 1:100<br />

הראשוני ביחד עם החלבון החוסם הייחודי לו<br />

הנושאות נשטפו<br />

24 שעות בתא סגור ולח ב-‏ 4°C. כל<br />

לבדיקת ספציפיות הצביעה,‏ חתכים נוספים נחשפו לנוגדן<br />

.(25 µg/ml)<br />

פעמים עם 3<br />

הקשור למולקולה פלואורסצנטית<br />

PBS X1<br />

לאחר תגובה עם נוגדנים ראשוניים הזכוכיות<br />

ונחשפו לשעה אחת נוספת בטמפרטורת החדר לנוגדן שניוני<br />

,(FITC-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)) FITC מהול<br />

1:200 ב-‏ .PBS X1<br />

החתכים נשטפו שוב 3 פעמים עם<br />

, PBS X1<br />

וטיפה מתמיסת<br />

mounting<br />

טופטפה<br />

על החתכים אשר כוסו בזכוכית מכסה.‏ נוכחות פלואורסצנציה נבדקה במיקרוסקופ קונפוקלי פלואורסצנטי.‏<br />

התמונות נשמרו בפורמאט<br />

TIFF<br />

ועובדו בעזרת התוכנות<br />

Image-Pro Plus Media Cybernatics<br />

ו-‏ .Adobe Photoshop<br />

2.2.7.3<br />

- בדיקת ספציפיות של נוגדנים בשיטת<br />

מוחות של חולדות שימשו כמקור ל-‏<br />

למשך<br />

Western blot<br />

GRKs השונים.‏<br />

המוחות הומגנו בבופר RIPA וסורכזו ב-‏<br />

20,000g<br />

15 דקות ב-‏ 4 o C בצנטריפוגת אפנדורף.‏<br />

הנוזל העליון אשר התקבל מהסרכוז הורתח עם<br />

sample<br />

buffer ב-‏ 95 o C למשך 5-10 דקות.‏<br />

לקביעת כמות חלבון כמתואר בסעיף<br />

ג'ל<br />

עשרה מיקרוליטרים מן הנוזל העליון נלקחו לפני הרתחה ושימשו<br />

.2.2.3<br />

SDS‏-אקרילאמיד 12%,<br />

עשרים מיקרוגרם חלבונים מן המיצוי הוטענו בכל באר של<br />

ולאחר ההרצה הועברו לממברנת ניטרוצלולוז.‏ הממברנות הודגרו עם תמיסת<br />

TBST מומס בבופר 2% (w/v) BSA אשר הכילה blocking<br />

נוספת בטמפרטורת החדר עם הנוגדן ראשוני כנגד<br />

GRK2<br />

‏(מיהול<br />

במשך שעה ובהמשך הודגרו למשך שעה<br />

,(1:5000 GRK5 או GRK6 ‏(מיהול<br />

(1:1000<br />

בהיעדר או בנוכחות<br />

blocking peptide (1µg/ml)<br />

יחודי לנוגדן הנבדק.‏ הממברנות נשטפו<br />

שלוש פעמים,‏ 20 דקות כל פעם,‏ בבופר TBST נקי והודגרו שעה בטמפרטורת החדר עם הנוגדן השניוני<br />

.Peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)<br />

כל אחת,‏ הממברנות נחשפו לתמיסת<br />

לאחר שלוש שטיפות נוספות של<br />

20 דקות<br />

ECL<br />

במשך 2 דקות והוצמדו בחדר חושך לפילם<br />

Fuji, ) X-ray<br />

.(Japan<br />

39

2.2.8<br />

- קביעת חדירת טעמנים אמפיפטיים בתאי<br />

HeLa<br />

2.2.8.1<br />

תאי<br />

- החזקת תאים<br />

10% Fetal בתוספת (DMEM) Dulbecco's Modified Eagle's Medium גודלו במצע HeLa<br />

,2 mM glutamine ,Bovine Serum (FBS)<br />

ושתי אנטיביוטיקות<br />

100 U/ml penicillin ו-‏ 100<br />

.10% DMEM אשר ייקרא להלן - µg/ml streptomycin<br />

לצפיפות של 90%) ע"י שטיפה עם<br />

התאים פוצלו כל<br />

3 ימים<br />

PBS X1 סטרילי,‏<br />

‏(או לאחר שהגיעו<br />

הוספת טריפסין ‏(אנזים אשר מנתק את התאים<br />

מצלחת הגידול)‏ והעברת התאים לצלחות חדשות לצפיפות הרצויה.‏ התאים הוחזקו באינקובטור בתנאים<br />

של 37 °C ו-‏ .5% CO 2<br />

2.2.8.2<br />

– הכנת תמיסות סטוק של הטעמנים וקביעת חדירתם לתאי<br />

HeLa<br />

התאים פוצלו לצלחות בקוטר 60 mm בצפיפות של 50-60% וגודלו ל-‏ 24-48 שעות נוספות.‏<br />

שעות לפני הניסוי,‏ הוחלף המצע למצע ‏"הרעבה"‏ אשר הכיל<br />

16-18<br />

0.1% FBS בלבד<br />

– ייקרא להלן<br />

0.1%<br />

.DMEM<br />

חשיפת התאים לטעמנים השונים נעשתה ע"י הוספת תמיסה מרוכזת ‏(סטוק)‏ של כל טעמן ישירות אל<br />

מצע התאים.‏ הטעמנים סכרין,‏<br />

D-TRP<br />

מהריכוז הסופי לו נחשפו התאים.‏ הטעמן<br />

וקפאין הומסו במדיום<br />

DMEM<br />

נקי,‏ בריכוז הגבוה פי<br />

10<br />

NHD<br />

הומס אף הוא ב-‏ ,DMEM אך בריכוז גבוה פי<br />

2<br />

מהריכוז הסופי.‏ הטעמנים כינין ונרינגין הומסו קודם באתנול ו-‏ DMSO בהתאמה,‏ ורק לאחר מכן ב-‏<br />

.DMEM<br />

ריכוזי הסטוקים חושבו כך שהתאים לא נחשפו לאחוזי ממס ‏(אתנול או (DMSO העולים על<br />

0.1%. כל הסטוקים הובאו ל-‏ pH 7-7.5 לפני הוספתם לתאים.‏<br />

התאים הודגרו עם הטעמנים השונים באינקובטור למשך<br />

התאים נשטפו 5 פעמים עם<br />

10 דקות<br />

‏(חוץ מכינין<br />

– 3 דקות).‏<br />

PBS X1 קר,‏<br />

בתום זמן זה,‏<br />

250 µl של מים הוספו לכל צלחת והתאים נקצרו והועברו<br />

למבחנה קרה.‏ התאים פוצצו ע"י סידרה של שלוש הקפאות והפשרות ב-‏<br />

-20°C<br />

הושקעו ע"י סרכוז בצנטריפוגת אפנדורף ב-‏ 20,000g בטמפרטורה של 4°C למשך<br />

העליון שהכיל את תוכן התאים הופרד,‏ הוקפא,‏ יובש בהקפאה ונשמר בטמפרטורה של<br />

וממברנות התאים<br />

30 דקות.‏<br />

-20°C<br />

הנוזל<br />

עד<br />

לקביעה כמותית ב-‏ ,HPLC כמתואר בסעיף 2.2.5. ריכוז הטעמנים בתאים חושב על פי מספר התאים<br />

בכל דוגמא ונפח תאי ה-‏ HeLa שחושב להיות בממוצע 0.7 pL ‏(מכיוון שלתאי HeLa אין צורה אחידה,‏<br />

נפח התאים חושב עבור מספר ‏"צורות"‏ על בסיס מדידות שנלקחו במיקרוסקופ קונפוקלי).‏<br />

40

2.2.9<br />

- מדידת שינויים ברמות cAMP<br />

- 2.2.9.1 ביטוי מלאכותי ‏(טרנספקציה)‏ של הקולטן ה - β2AR בתאי HeLa<br />

HeLa תאי<br />

גודלו כמתואר בסעיף<br />

.2.2.8.1<br />

למטרות טרנספקציה,‏ התאים פוצלו ביום אשר קדם לה<br />

לצפיפות של 60-70% בצלחות בקוטר 100. mm הטרנספקציה בוצעה בעזרת החומר<br />

MaxFect<br />

USA) (Molecula Research Labs, בעיקר על פי הוראות היצרן.‏ בקצרה,‏ הפלסמיד עורבב ביחד עם<br />

החומר MaxFect ביחסים<br />

25 µl) 1:2.5<br />

(100 mm<br />

בופר 400 µl בתוך<br />

MaxFect עורבבו עם 10 µg פלסמיד עבור צלחת בקוטר<br />

(Gibco, USA) Opti-MEM® I<br />

וניתנה השהייה של<br />

דקות 25<br />

בטמפרטורת החדר.‏ תאי ה-‏ HeLa נשטפו פעמיים עם מדיום DMEM נקי ונפח מינימלי של מצע זה<br />

(5.5-6 מ"ל,‏<br />

מספיק על מנת לכסות את התאים)‏ הוסף לצלחת.‏ בתום ה-‏ 25 דקות השהייה,‏ הפלסמיד<br />

ביחד עם ה - MaxFect טופטפו מעל המצע והתאים הוחזרו לאינקובטור ל-‏<br />

מצע המכיל<br />

5-7 שעות,‏<br />

,20% FBS<br />

בסופן הוסף<br />

על מנת להגיע למצב של 10%. DMEM לאחר שמונה עשרה שעות,‏ המצע<br />

הוחלף ל-‏ 10% DMEM חדש או שהתאים פוצלו לצלחות חדשות.‏ התאים ‏"הורעבו"‏ במשך<br />

שעות לפני כל ניסוי על ידי החלפת מצע התאים<br />

16-18<br />

ל-‏ .0.1% DMEM<br />

2.2.9.2<br />

- הכנת הדוגמאות<br />

תאי HeLa עברו טרנספקציה עם פלסמיד pcDNA3 המכיל את הקולטן ה-‏ β2‎‏-אדרנרגי<br />

‏(להלן (β2AR<br />

24<br />

כמתואר בסעיף 2.2.9.1. שמונה עשרה שעות לאחר סיום הטרנספקציה,‏ התאים פוצלו לתוך פלטות של<br />

בארות בצפיפות של כ-‏ 60% וגודלו ל-‏<br />

30-36<br />

שעות נוספות.‏ שמונה עשרה שעות לפני ביצוע<br />

הניסוי הוחלף המצע מ-‏ 10% DMEM ל-‏ 0.1% DMEM ‏(מצע הרעבה).‏ ביום הניסוי התאים הודגרו<br />

למשך 10 דקות בנוכחות או בהיעדר טעמן ולאחר מכן עם<br />

(ISO) 10 μM isoproterenol לזמנים שבין<br />

30 שניות<br />

הוספו<br />

5 דקות,‏ ל-‏<br />

לגירוי הקולטן האדרנרגי.‏ סיום הראקציה והמשך הניסוי בוצעו לפי<br />

:(185 ,56)<br />

450 μl חומצת (v/v) 5% TCA קרה לכל באר,‏<br />

מבחנות זכוכית קרות והוספו<br />

ולאחר<br />

30 דקות ב-‏ ,4ºC<br />

TCA 5% 450 μl<br />

נוספים לכל באר.‏ לאחר<br />

30<br />

הנוזלים נאספו לתוך<br />

דקות הדגרה נוספות,‏<br />

אוחדו הנוזלים מכל דוגמא וסילוק החומצה אשר בתוכם נעשה ע"י שתי הוספות של 4.5 ml של אתר קר,‏<br />

ערבוב חזק ושאיבת האתר במשאבת וואקום.‏ הדוגמאות הוקפאו ויובשו בליופילייזר תחת וואקום.‏ לאחר<br />

הייבוש כל דוגמא הורחפה ב-‏<br />

250-500 μl<br />

בופר סודיום אצטט<br />

,pH 6.2 ,0.05 M<br />

.cAMP<br />

לשם קביעת חלבון הוספו מייד לאחר הוצאת ה-‏ 5% TCA האחרון<br />

לקביעת רמות<br />

של NaOH 0.1 500 μl<br />

-20ºC לכל באר למשך שעה.‏ בתום זמן זה,‏ הועברו הדוגמאות למבחנת אפנדורף,‏ הוקפאו ונשמרו ב-‏ M<br />

עד לקביעת חלבון.‏<br />

41

2.2.9.3<br />

- קביעת כמות cAMP בשיטת ה-‏<br />

כל שלבי הניסוי בוצעו בקרח לפי<br />

אצטילציה ע"י הוספת<br />

(RIA) radioimmunoassay<br />

,56)<br />

,triethylamine של 20 μl<br />

185). ראשית הדוגמאות המומסות בבופר סודיום אצטט עברו<br />

ערבוב בעזרת וורטקס והוספה מידית של<br />

10 μl של<br />

.acetic anhydride<br />

של<br />

acetyl-cAMP לנוגדן<br />

במבחנות פוליסטירן שהכילו<br />

תהליך האצטילציה נועד להגדיל את הרגישות של שיטת ה-‏ RIA מאחר והאפיניות<br />

הינה פי 20 גבוהה יותר בהשוואה ל-‏ cAMP עצמו.‏ קביעת<br />

cAMP נעשתה<br />

50 μl של<br />

.(w/v) 0.1% BSA<br />

200 μl של תמיסת<br />

הדוגמא הנבדקת ו-‏ 50 μl של נוגדן כנגד cAMP המומס ב-‏<br />

לאחר ערבוב,‏ המבחנות הועברו להשהיה בקור למשך 4 שעות ובתום זמן זה הוספו<br />

[ 125 I]-cAMP אשר נמהלה בעזרת בופר אצטט בריכוז<br />

,pH 6.2 0.05 M<br />

קריאה של 3000-4000. cpm<br />

של 100 μl<br />

,10% (w/v) BSA<br />

לקבלת<br />

לאחר הדגרה של 18-22 שעות בקור,‏ סיום התגובה בוצע ע"י הוספת<br />

ערבוב כפול בוורטקס והשקעת הקומפלקס ע"י הוספת<br />

אתנול קר.‏ הדוגמאות עורבבו פעמיים בוורטקס וסורכזו למשך 15 דקות במהירות של<br />

הסרכוז הנוזל העליון נשאב במשאבת וואקום והמשקע נמנה במונה גמא.‏ חישוב כמות ה-‏<br />

2<br />

.4,000g<br />

כנגד עקומת כיול של נוקלאוטיד נקי אשר הוכנה באותם תנאים.‏ הערכים בוטאו ביחידות של<br />

מ"ל של<br />

בתום<br />

cAMP נעשה<br />

fmole<br />

.cAMP/μg protein<br />

2.2.9.4<br />

- קביעת חלבון בשיטת ברדפורד<br />

חמישים מיקרוליטרים מן הדוגמה המהולה ב-‏ 0.1 M NaOH הועברו לפלטה בעלת 96 בארות להם<br />

הוספו 250 μl של תמיסת ברדפורד.‏ כל באר עורבבה היטב ולאחר 15 דקות השהיה בטמפרטורת החדר<br />

נמדדה הבליעה במכשיר<br />

595. nm באורך גל של Bio-Elisa<br />

סטנדרט של BSA אשר הוכנה באותם תנאים.‏<br />

חישוב כמות החלבון נעשה מול עקומת<br />

2.2.10<br />

2.2.10.1<br />

HeLa תאי<br />

- קביעת רמת הזרחון של הקולטן הבטא-אדרנרגי לאחר גירוי<br />

- הכנת הדוגמאות<br />

אשר גודלו בצלחות בקוטר 100 mm עברו טרנספקציה עם פלסמיד pcDNA3 המכיל את<br />

הקולטן ה-‏ β2‎‏-אדרנרגי הקשור לסמן<br />

HA<br />

‏(להלןβ2HA‏),‏ כמתואר בסעיף<br />

.2.2.9.1<br />

48 שעות לאחר<br />

הטרנספקציה,‏ התאים הורעבו ע"י החלפת המדיום מ-‏ 10% DMEM ל-‏ 0.1% DMEM למשך שמונה<br />

עשרה שעות לפני ביצוע הניסוי.‏<br />

ביום הניסוי,‏ התאים הודגרו קודם בהיעדר או בנוכחות טעמן ולאחר מכן גורו עם ISO<br />

שבין<br />

μM) (10 לזמנים<br />

25 דקות.‏ ל-‏ 5<br />

לאחר השטיפה,‏ הוספו לתאים<br />

בתום הגירוי המדיום נשאב והתאים נשטפו פעמיים עם PBS X1 קר על קרח.‏<br />

,NaF 25 mM אשר מכיל בנוסף RIPA של בופר 400 μl<br />

.serine phosphatases<br />

הפועל כמעכב<br />

התאים נקצרו והנוזלים הועברו לתוך מבחנות אפנדורף קר.‏ המבחנות סורכזו<br />

42

דקות ב-‏ 15<br />

ב-‏ 15,000g<br />

והנוזל העליון הועבר למבחנת אפנדורף נפרדת<br />

אשר הכילה חרוזים<br />

,4ºC<br />

הקשורים לנוגדן כנגד הסמן .HA<br />

2.2.10.2<br />

- קשירת החרוזים לנוגדן כנגד HA<br />

כל הכמויות המפורטות בסעיף זה הותאמו לטיפול ב-‏<br />

6<br />

.2.2.10.1<br />

צלחות בהן התאים טופלו כמתואר בסעיף<br />

מאה עשרים מיקרוליטרים של חרוזים מסוג אגרוז אליהם קשור חלבון G<br />

(proteinG-plus<br />

agarose beads, Santa-Cruz)<br />

בסרכוז של דקה ב-‏<br />

נשטפו שלוש פעמים עם<br />

PBS X1<br />

4ºC ב-‏ 12,000g<br />

500 μl של PBS X1 ו-‏<br />

קור,‏ החרוזים נשטפו פעמיים ב-‏<br />

קר כאשר כל שטיפה הסתיימה<br />

ושאיבת הנוזל העליון.‏ בסוף הסרכוז האחרון החרוזים הורחפו ב-‏<br />

12 μl של נוגדן הוספו.‏ לאחר ערבוב בצורה של end-to-end כל הלילה בחדר<br />

PBS X1<br />

RIPA וחולקו ל-‏‎6‎ מנות שוות במבחנות אפנדורף קרות.‏<br />

קר,‏ פעם נוספת בבופר ,RIPA ולבסוף הורחפו ב-‏<br />

300 µl<br />

2.2.10.3<br />

- השקעה אימונית (immunoprecipitation) של הקולטן הבטא-אדרנרגי<br />

הנוזל העליון שהתקבל לאחר סרכוז תמצית התאים ‏(כמתואר בסעיף<br />

המכילה את החרוזים הקשורים לנוגדן כנגד HA ‏(כמתואר בסעף<br />

(2.2.10.1<br />

.(2.2.10.2<br />

4ºC<br />

הועבר למבחנת אפנדורף<br />

המבחנות עורבבו בצורה של<br />

end-to-end למשך שעתיים בקור.‏ בסוף זמן זה,‏ החרוזים הושקעו ע"י סרכוז למשך דקה ב-‏ 10,500g ב-‏<br />

ונשטפו פעמיים עם<br />

תמיסת LiCl 0.5 mM<br />

וואקום.‏ לאחר השאיבה האחרונה הדוגמאות הורחפו ב-‏<br />

למשך<br />

ע"י סרכוזים זהים ושאיבת הנוזל העליון במשאבת<br />

95ºC והורתחו ב-‏ sample buffer של 50 μl<br />

5 דקות.‏<br />

הדוגמה כולה הורצה לבסוף בג'ל<br />

SDS‏-אקרילאמיד 10%.<br />

הועברו לממברנת ניטרוצלולוז ע"י אלקטרוטרנספר.‏ לאחר קיבוע הממברנה בעזרת<br />

מהול ב-‏<br />

לאחר סיום ההרצה,‏ החלבונים<br />

2% (w/v) BSA<br />

,TBST<br />

1:1000 ב-‏ .TBST<br />

זוהתה נוכחות הקולטן ה-‏ β2HA ע"י שימוש בנוגדן המכוון כנגד הפפטיד ,HA מהול<br />

לעומת זאת,‏ נוכחות של קולטן מזורחן נבדקה ע"י שימוש בנוגדן ראשוני יחודי,‏ בשם<br />

,anti-phosphoSer(355-356) β2-adrenergic receptor<br />

המזורחנות ספציפית ע"י<br />

למשך<br />

.GRK2/5<br />

המכוון כנגד שתי חומצות אמינו סרין<br />

הממברנות טולטלו עם נוגדן ראשוני זה,‏ מהול<br />

1:600 ב-‏ ,TBST<br />

18<br />

שעות בחדר קור.‏ לאחר שלוש שטיפות של<br />

הודגרה שעה בטמפרטורת החדר עם נוגדן שניוני<br />

20<br />

דקות כל אחת עם בופר<br />

,TBST<br />

הממברנה<br />

Peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG<br />

(H+L)<br />

נחשפו לתמיסת<br />

אשר נמהל 1:10,000 ב-‏ .TBST לאחר שלוש שטיפות נוספות של 20 דקות כל אחת,‏ הממברנות<br />

ECL במשך<br />

טיפול נקבעה ע"י שימוש בתוכנת<br />

2 דקות והוצמדו בחדר חושך לפילם<br />

.X-ray<br />

.ImageJ<br />

עוצמת הכתמים היחסית בכל<br />

43

2.2.11<br />

ע"י<br />

- מדידת אינטרנליזציה של הקולטן הבטא-אדרנרגי לאחר גירוי<br />

תאי HeLa אשר עברו טרנספקציה לביטוי הקולטן ה-‏ β2AR ‏(סעיף<br />

(2.2.9.1<br />

הטרנספקציה לתוך פלטות של 12 בארות שבתוכן הוכנסו זכוכיות מכסות בקוטר<br />

פוצלו 24 שעות לאחר<br />

18 מ"מ.‏<br />

לאחר<br />

שעות נוספות התאים הורעבו ע"י החלפת המצע מ-‏ 10% DMEM ל-‏ 0.1% DMEM ל-‏<br />

30-36<br />

18 שעות<br />

נוספות.‏ ביום הניסוי,‏ התאים עברו פראינקובציה בנוכחות או היעדר טעמן למשך 10 דקות ולאחר מכן<br />

גירוי הקולטן האדרנרגי ע"י 10). μM) ISO בתום הגירוי התאים נשטפו פעמיים עם<br />

תמיסת<br />

PBS X1<br />

(w/v) PFA 3% למשך 20 דקות.‏<br />

PFA ה-‏<br />

blocking<br />

פוספט בריכוז<br />

אשר הכילה<br />

3% (w/v) BSA<br />

ו-‏<br />

וקובעו<br />

נשטף 3 פעמים עם PBS X1 והתאים הודגרו עם<br />

0.3% (v/v) Triton X-100<br />

pH 7.3 0.1 M<br />

למשך 1-2 שעות בטמפרטורת החדר.‏<br />

הנוגדן הראשוני כנגד הקולטן הבטא-אדרנרגי הומס בתמיסת ה-‏<br />

הנושאות נעשתה ל-‏<br />

blocking<br />

18<br />

המומסים בבופר<br />

והדגרה עם הזכוכיות<br />

שעות בקור בתא לח.‏ לאחר מכן התאים נשטפו שלוש פעמים עם<br />

PBS X1<br />

והודגרו עם נוגדן שניוני הקשור לסמן הפלואורסצנטי FITC לעוד שעה בטמפרטורת החדר.‏ לבסוף<br />

התאים נשטפו שלוש פעמים עם<br />

PBS X1<br />

.mounting<br />

והועברו לזכוכית נושא עליה טופטפה טיפה של תמיסת<br />

הפלואורסצנציה נמדדה במיקרוסקופ קונפוקלי פלואורסצנטי (BioRad) בעזרת עדשה<br />

שמן מינרלי,‏ ותמונות נלקחו בעזרת תוכנת<br />

נעשה בעזרת תוכנת Photoshop 7.0<br />

×60<br />

.LaserSharp 2000 software (BioRad)<br />

.(Adobe)<br />

המצריכה<br />

עיבוד התמונות<br />

להשוואת מידת האינטרנליזציה של הקולטן הבטא-אדרנרגי בהיעדר מול נוכחות טעמן אמפיפטי נעשתה<br />

ספירה של מספר התאים בהם הקולטן נראה על הממברנה הפלסמטית מול מספר התאים בהם הקולטן<br />

נראה אך ורק בווסיקולות תוך תאיות.‏<br />

- 2.2.12 מידור<br />

‏(פרקציונציה)‏ של התא<br />

שיטת מידור התאים התבססה לרוב על<br />

‏(סעיף<br />

.(37)<br />

לאחר טרנספקציה של הקולטן ה-‏ β2HA בתאי<br />

HeLa<br />

0.1%<br />

,(2.2.9.1<br />

DMEM למשך 16-18 שעות.‏<br />

‏(חוץ מכינין,‏<br />

התאים גודלו בצלחות בקוטר 60 mm ל-‏ 48 שעות נוספות בסופן הורעבו ב-‏<br />

ביום הניסוי,‏ התאים הודגרו בהיעדר או בנוכחות טעמן במשך<br />

10 דקות<br />

3 דקות)‏<br />

והקולטן גורה עם ISO<br />

בתום זמן הגירוי,‏ התאים נשטפו עם<br />

µM) (10 לזמנים שונים ,0) 15 ,10 ,5 ו-‏ 20 דקות).‏<br />

PBS X1 קר פעמיים,‏<br />

H של בופר 150 µl<br />

ב-‏<br />

לאחר מכן עם בופר A קר פעם אחת,‏ ולבסוף<br />

אשר הכיל סוכרוז בריכוז של 0.25 M הוספו לכל צלחת.‏ התאים נקצרו ביחד עם<br />

הבופר,‏ וכל דוגמא ‏(צלחת)‏ הועברה למבחנת סרכוז קרה נפרדת וסורכזה בשלושה שלבים:‏ סרכוז ראשון<br />

3,000g<br />

דקות ב-‏ 10 למשך<br />

;4 °C<br />

הועבר למבחנת סרכוז קרה חדשה וסורכז ב-‏<br />

הכיל אורגנלות גדולות<br />

המשקע אשר הכיל את גרעיני התאים הושלך והנוזל העליון<br />

4 °C למשך 10 דקות ב-‏ 10,000g<br />

‏(גולג'י,‏ (...ER<br />

הושלך והנוזל העליון הועבר למבחנת סרכוז עבות<br />

; המשקע החדש אשר<br />

(Beckman,<br />

44

Germany)<br />

וסורכז בצנטריפוגת<br />

Ultra<br />

במהירות של<br />

100,000g<br />

דקות ב-‏ 45 למשך<br />

העליון מכל דוגמא,‏ אשר הכיל את התוכן הציטוזולי,‏ הועבר למבחנה חדשה ולאחר הוספת<br />

הנוזל .4 °C<br />

sample<br />

buffer הורתח ב-‏ 95 C° ל-‏ 5 דקות.‏<br />

ב-‏<br />

120 µl בופר RIPA ולאחר הוספת<br />

מכל דוגמה הורצו בג'ל SDS‏-אקרילאמיד<br />

באלקטרוטרנספר.‏<br />

המשקע מכל דוגמא,‏ אשר הכיל את הממברנה הפלסמטית,‏ הומס<br />

sample buffer הורתח אף הוא ב-‏ 95 C° ל-‏<br />

5 דקות.‏ 60 µl<br />

12% (v/v)<br />

לאחר קיבוע עם (w/v) BSA 2%,<br />

1:1000<br />

16-18 למשך<br />

שעות ב-‏<br />

4 °C<br />

והחלבונים הועברו לממברנת ניטרוצלולוז<br />

הממברנה הודגרה עם נוגדן כנגד HA במיהול<br />

ולאחר מכן עם נוגדן שניוני קשור ל-‏<br />

בטמפרטורת החדר.‏ הממברנות נחשפו לתמיסת ECL והוצמדו בחדר חושך לפילם<br />

HRP<br />

.X-ray<br />

במשך שעה<br />

2.2.13<br />

- קביעת שפעול של ERK<br />

לאחר טרנספקציה של הקולטן ה-‏<br />

בתאי β2AR<br />

נוספות בסופן הורעבו ב-‏ 0.1% DMEM למשך<br />

בנוכחות טעמן במשך<br />

‏(סעיף HeLa<br />

,(2.2.9.1<br />

התאים גודלו ל-‏<br />

48<br />

16-18 שעות.‏<br />

10 דקות<br />

‏(חוץ מכינין,‏<br />

3 דקות)‏<br />

שעות<br />

ביום הניסוי,‏ התאים הודגרו בהיעדר או<br />

והקולטן גורה עם ISO<br />

µM) 10) לזמנים שונים<br />

,0) 20 ,10 ,5 ,2 או 30 דקות).‏<br />

בתום זמן הגירוי,‏ התאים נשטפו עם PBS X1 קר פעמיים ונקצרו על<br />

קרח בנוכחות בופר .RIPA התאים ביחד עם הבופר הועברו למבחנות סרכוז קרות וסורכזו בצנטריפוגת<br />

אפנדורף במהירות<br />

17,000g למשך<br />

הוצאת דגימה לצורכי קביעת חלבון,‏ הוסף<br />

15 דקות ב-‏<br />

.4 °C<br />

הנוזל העליון הועבר למבחנה חדשה,‏ ולאחר<br />

sample buffer והדוגמה הורתחה ב-‏ 95 °C ל-‏ 5 דקות.‏ 25<br />

µg<br />

מכל דוגמה הורצו בג'ל SDS‏-אקרילאמיד<br />

ניטרוצלולוז באלקטרוטרנספר.‏ לאחר קיבוע עם<br />

12% (v/v)<br />

,2% (w/v) BSA<br />

ולאחר מכן החלבונים הועברו לממברנת<br />

זיהוי חלבון ה-‏<br />

ERK<br />

ERK<br />

וזיהוי ה-‏<br />

המזורחן נעשו ע"י שימוש בשני נוגדנים שונים:‏ זיהוי הכמות הכללית של ERK בכל דוגמה נעשה<br />

ע"י נוגדן אשר מזהה את הקצה ה-‏ C טרמינלי של ERK<br />

.TBST ונמהל 1:40,000 ב-‏ (gERK)<br />

זאת זיהוי ה-‏ ERK המזורחן נעשה ע"י נוגדן מכוון כנגד אתרי טירוזין מזורחנים ב-‏ ERK<br />

ונמהל<br />

לעומת<br />

,(pERK)<br />

ב-‏ 1:30,000<br />

.(154) TBST<br />

ממברנות הניטרוצלולוז נחשפו למשך שעה בטמפרטורת החדר<br />

לאחד מן הנוגדנים האלו,‏ ולאחר שלוש שטיפות של 20 דקות כל אחת,‏ נחשפו לנוגדן שניוני הקשור ל-‏<br />

HRP במשך שעה בטמפרטורת החדר.‏ לאחר שלוש שטיפות נוספות,‏ הממברנות נחשפו לתמיסת<br />

והוצמדו בחדר חושך לפילם<br />

ECL<br />

.X-ray<br />

.ImageJ<br />

עוצמת הכתמים היחסית בכל טיפול חושבה ע"י שימוש בתוכנת<br />

- 2.2.14<br />

ניתוח סטטיסטי של התוצאות<br />

ניתוח סטטיסטי של התוצאות וקביעת מובהקות סטטיסטית בין הטיפולים השונים בכל ניסויי המחקר נעשו<br />

בעזרת תוכנת<br />

(SAS Institute, Cary, NC) JMP statistical software<br />

Student's t-test<br />

זוגי דו-‏ כיווני.‏<br />

ע"י שימוש במבחן<br />

45

3. תוצאות<br />

3.1<br />

3.1.1<br />

- חדירת טעמנים אמפיפטיים לפפילות CV שלמות<br />

- מעקב אחר חדירת הטעמנים במיקרוסקופ קונפוקלי<br />

לאחר הוצאתה של פפילת ה-‏ CV בצורה שלמה מתוך הלשון,‏ הפפילה הונחה תחת מיקרוסקופ קונפוקלי<br />

כך שבתמונות אשר צולמו כפי שנראה באיור 3.1 מתגלה הצד הדורסלי שלה.‏ החיצים באיור מציינים את<br />

מיקומה של התעלה הפנימית של הפפילה<br />

(inner trench)<br />

שם ממוקמות רוב פקיעיות הטעם.‏ בתנאי<br />

הניסוי הנוכחיים,‏ הצד האפיקלי בלבד של תאי פקיעיות הטעם נחשף לסביבה ‏(במקרה זה לטעמנים<br />

הפלואורסצנטים)‏ בדומה לתנאים פיזיולוגיים.‏ ניתן לראות באיור 3.1 שלאחר חשיפה של פפילות ה-‏ CV<br />

לטעמנים אמפיפטיים שונים,‏ סכרין<br />

,(SACC)<br />

הפפטיד המר<br />

(CLT)<br />

וקפאין<br />

,(CAFF)<br />

מבחינים<br />

בהופעתה של פלואורסצנציה בעיקר באזור התעלה,‏ ובהתעצמותה עם הזמן.‏ פלואורסצנציה נראתה לעין<br />

כבר לאחר דקה של חשיפה,‏ אך זמני חשיפה מ-‏<br />

0 עד<br />

6 דקות נבחרו על מנת להראות את התגברותה של<br />

רמת הפלואורסצנציה עם הזמן.‏ תוצאות אלו מעידות לכאורה על חדירה והצטברות של אותם הטעמנים<br />

לתוך פקיעיות הטעם עצמן.‏ על מנת להוכיח שאכן העלייה ברמת הפלואורסצנציה נבעה מחדירת הטעמנים<br />

לתוך תאי הפקיעיות ולשלול ספיחה חיצונית לאפיתל הלשון,‏ נעשו שני ניסויים נוספים.‏ ראשית,‏ נעשה<br />

שימוש במלח אשלגן יודיד<br />

(KI)<br />

3.1<br />

אשר פועל כמדעיך פלואורסצנציה:‏ משמעות הדבר שחומר זה גורם<br />

לדעיכה של כל מולקולה פלואורסצנטית אשר יפגוש.‏ KI איננו חודר ממברנות שלמות של תאים ולכן<br />

צפוי לגרום לדעיכה של כל מולקולה פלואורסצנטית אשר נמצאת מחוץ לתאי הפפילה.‏ ניתן לראות באיור<br />

KI שהוספת<br />

לפפילת ה-‏<br />

6 לאחר CV<br />

דקות חשיפה לטעמנים לא גרמה לירידה בעוצמת<br />

הפלואורסצנציה שהתקבלה.‏ תוצאות אלו מעידות על חדירה עמוקה של הטעמנים האמפיפטיים לתוך<br />

ציטוזול תאי פקיעיות הטעם או לכל הפחות לצד הפנימי של הממברנה הפלסמטית,‏ שם אין ל-‏<br />

כביקורת נוספת,‏ נעשה ניסוי דומה כאשר הפעם פפילת ה-‏ CV נחשפה לפרופידיום יודיד<br />

KI גישה.‏<br />

חומר ,(PI)<br />

אשר משמש בניסויים ביולוגיים רבים כמולקולה פלואורסצנטית החודרת ממברנות מפורקות של תאים<br />

מתים.‏ מכיוון שתאי הפפילה נשארים חיים במהלך ניסוי זה,‏ PI אינו צפוי לחדור לתוכם.‏ באיור,‏ ניתן<br />

לראות שכתוצאה מחשיפת פפילת ה-‏<br />

CV ל-‏ PI<br />

התגלתה הופעה של פלואורסצנציה אשר התגברה<br />

במידה מסוימת עם זמן החשיפה,‏ אך הוספת KI גרמה לדעיכה כמעט מוחלטת שלה.‏ תוצאה זו מעידה על<br />

כך שמולקולות ה-‏<br />

,PI<br />

בניגוד לטעמנים האמפיפטיים,‏ לא חדרו לתוך תאי הפפילה אך נספחו חיצונית אל<br />

האפיתל,‏ ולכן חשיפתן ל-‏ KI גרמה במקרה זה לדעיכת הפלואורסצנציה שלהן.‏<br />

46

3.1<br />

איור – הסתכלות במיקרוסקופ קונפוקלי על הצטברותם של טעמנים אמפיפטיים פלואורסצנטיים<br />

בתעלה הפנימית של פפילת .CV<br />

פפילות CV שלמות הונחו מתחת למיקרוסקופ קונפוקלי ונחשפו לטעמנים אמפיפטיים פלואורסצנטיים.‏ תמונות של<br />

הצד הדורסלי של הפפילה מאפשרות לעקוב אחר הופעת פלואורסצנציה בתעלה הפנימית ‏(מצויינת ע"י חיצים)‏ בה<br />

ממוקמות רוב פקיעיות הטעם של הפפילה.‏ התמונות נלקחו לאחר חשיפת הפפילות לתמיסות של 10 mM סכרין<br />

(CAFF) או בהיעדר טעמן במקרה של הביקורת<br />

בזמן 0 תמיסת הטעמנים טופטפה על הפפילה ורמת הפלואורסצנציה נמדדה כל דקה ‏(כאן הזמנים<br />

צורף לתמיסה לאחר 6 דקות ותמונות נלקחו 2 דקות לאחר מכן.‏ ניתן<br />

6 דקות מוצגים).‏ המלח<br />

לראות שהוספת לא השפיעה על רמת הפלואורסצנציה שהתקבלה לאחר חשיפתה של הפפילה לטעמנים<br />

שימש כביקורת חיובית לניסוי.‏ כל תמונה מייצגת חזרה מתוך<br />

השונים.‏ פרופידיום יודיד<br />

ורוחב הפפילה נמצא קרוב ל-‏ 0.6 mm ‏(נעשה<br />

חזרות שנעשו לאותו ניסוי.‏ ה-‏<br />

בשיתוף עם מר אלכסנדר אלילויקו).‏<br />

2 ,0 ו-‏<br />

4<br />

,(SACC) 10 mM ,(CLT) cyclo(Leu-Trp) 1 mM קפאין<br />

.(CON)<br />

,(500 mM) KI<br />

KI<br />

,(50 µg/ml) (PI)<br />

100 µm הינו של scale bar<br />

3.1.2<br />

- חדירת טעמנים אמפיפטיים במודל של חיות<br />

על מנת לבחון את יכולתם של הטעמנים האמפיפטיים לחדור לתוך פפילות טעם בתנאי<br />

ניסוי בו טופטפו לסירוגין תמיסות טעמנים שונות לפיהן של חולדות מורדמות במשך<br />

ניתוח להוצאת פפילת ה-‏<br />

,in-vivo<br />

90 שניות,‏<br />

CV<br />

בשיטת .HPLC<br />

נעשה<br />

ולאחר<br />

מתוך אפיתל הלשון,‏ נבחנו נוכחות וכמות הטעמנים בציטוזול התאים<br />

על מנת לאמוד את הריכוז התוך תאי של הטעמנים השונים בתוך תאי פקיעיות הטעם,‏<br />

47

נעשה בנוסף חישוב בו נלקחה בחשבון בריחתם של הטעמנים החוצה מן הפפילה במשך<br />

טיפול הקולגנאז להוצאת הפפילה מתוך אפיתל הלשון,‏ כמתואר בסעיף<br />

25<br />

.2.2.4<br />

כפי שרואים בטבלה<br />

הדקות של<br />

,3.1<br />

השטף של הטעמנים השונים החוצה נאמד בין 64% ל-‏ 86%. ניתן לראות שהריכוז התוך תאי הסופי של<br />

הטעמנים הגיע לרמות גבוהות של מילימולרים<br />

(mM)<br />

הריכוזים עבור כינין וקפאין,‏ תופעה אשר תוארה גם בתאי טעם מבודדים<br />

ואף נראתה תופעה של הצטברות כנגד מפל<br />

.(132)<br />

CV<br />

-<br />

טבלה מס'‏ 3.1<br />

שלמה.‏<br />

חדירת טעמנים אמפיפטיים מרים ומתוקים לתוך פקיעיות טעם של פפילת<br />

90 שניות,‏<br />

שבסופן החיות<br />

תמיסת הטעמנים בריכוזים המצויינים טופטפה לתוך פיהן של חולדות מורדמות במשך במטרה לזהות נוכחות טעמנים אלה ולקבוע<br />

הוקרבו.‏ תוכן התאים הופרד והורץ ב-‏ HPLC ‏(כמתואר סעיף את ריכוזם התוך תאי.‏ דליפת הטעמנים החוצה מן התאים שהתרחשה במשך הוצאת הפפילה מן הלשון שימשה<br />

ו-‏<br />

כפקטור תיקון לחישוב הריכוז התוך תאי הסופי.‏ הערכים הינם ממוצע ± שגיאת תקן של<br />

בהתאמה)‏ ‏(נעשה בשיתוף עם מר אלכסנדר<br />

ו-‏ מציינות ערכים מובהקים סטטיסטית אלילויקו).‏<br />

**<br />

Tastant<br />

4-9 חזרות.‏ *<br />

Extracellular conc.<br />

(mM) during 90 s of<br />

oral stimulation<br />

(2.2.5<br />

,p

דנ"א גנומי במערכת.‏ כל התוצרים של ריאקצית ה-‏ RT-PCR הובאו ל-‏ sequencing לזיהוי וודאי של<br />

התוצרים.‏<br />

CV<br />

GRKs<br />

-<br />

3.2<br />

איור זיהוי ביטוין של קינאזות ממשפחת ה-‏ בפפילת ה-‏ ובאפיתל הלא-סנסורי<br />

בלשון בשיטת ה-‏ .RT-PCR<br />

cDNA סונתז מרקמת פפילת CV ומאפיתל לא-סנסורי מן הלשון (EP) וביטוי הגנים השונים נבחן ע"י שימוש<br />

בפריימרים יחודיים.‏ GAPDH שימש כביקורת חיובית.‏ כביקורת שלילית (CON) שימשה דוגמא שעברה PCR<br />

ללא שלב ה-‏ .RT תוצרי ה-‏ RT-PCR הורצו בג'ל אגרוז ‏(כמתואר בסעיף גודלם הצפוי של התוצרים<br />

היו<br />

מעקובת הבסיסים של<br />

עבור<br />

כל התוצרים נקבעה על מנת לוודא את זהותם.‏<br />

.(2.2.6.3<br />

612 bp עבור ,GRK5 841 bp עבור ,GRK3 670 bp עבור ,GRK2 559 bp עבור ,GRK1 460 bp<br />

.GAPDH עבור 350 bp ו-‏ עבור T1R3 705 bp עבור ,T2R4 560 bp ,GRK6<br />

3.2.2<br />

– קביעת מיקומם של ה-‏ GRKs השונים בשיטת<br />

immunostaining<br />

על מנת לבחון את מיקום התבטאותם של ה-‏ GRKs השונים בתוך הפפילה,‏ משמע בתאי פקיעיות הטעם<br />

עצמם או בתאי האפיתל שבה,‏ לשון של חולדה נחתכה לרוחב באזור פפילת ה-‏<br />

קריוסטט,‏ והחתכים בעובי של 10 µm הודגרו עם נוגדנים ספציפיים כנגד כל אחד מה-‏<br />

CV<br />

בעזרת מכשיר<br />

.GRKs<br />

באיור 3.3A ניתן לראות בבירור בחתכים את פקיעיות הטעם בעלות צורת אגס ‏(מודגשות ע"י חיצים).‏<br />

ניתן לראות שלאחר הדגרה של החתכים עם נוגדנים כנגד<br />

או ,GRK6 GRK5 ,GRK2<br />

התקבלה צביעה<br />

חזקה של החתכים,‏ כאשר GRK2 נראה גם בתוך פקיעיות הטעם אך גם בתאי האפיתל הלא סנסוריים<br />

העוטפים אותן,‏<br />

GRK5<br />

נראה בעיקר בפקיעיות הטעם עצמן ו-‏<br />

GRK6<br />

נראה בעיקר באפיתל הלא<br />

סנסורי.‏ נוגדן כנגד GRK3 גרם לצביעה חלשה במיוחד ולכן התוצאות אינן מופיעות כאן.‏ צביעת החתכים<br />

נמנעה כמעט לחלוטין בנוכחות החלבון החוסם µg/ml) 25), דבר אשר מעיד על הספציפיות של הנוגדנים<br />

והצביעה.‏<br />

במטרה לבחון בדרך נוספת את הספציפיות של כל אחד מהנוגדנים אשר שימשו בניסוי זה,‏ מיצוי של מוח<br />

חולדה הורץ בג'ל אקרילאמיד,‏ החלבונים הועברו לממברנת ניטוצלולוז וכל פס הודגר עם נוגדן אחר,‏<br />

בהיעדר או בנוכחות חלבון חוסם.‏ כפי שנראה באיור 3.2B, התקבלו פסים יחידים וספציפיים בעלי משקל<br />

מולקולרי צפוי GRK2) בעל משקל של ∼<br />

.(65 kDa ∼ בעלי משקל של GRK6 ו-‏ GRK5 ו-‏ 80 kDa<br />

49

בנוסף,‏ קשירתם של הנוגדנים השונים נחסמה לחלוטין ‏(במקרה של GRK2 רק נחלשה)‏ בנוכחות החלבון<br />

החוסם הספציפי<br />

.(1 µg/ml)<br />

A<br />

B<br />

איור 3.3<br />

– מיקום התבטאות של ה-‏ GRKs בפפילת ה-‏ CV בחולדה.‏<br />

חתכים של פפילת<br />

(A) צביעת חתכים של פפילת CV ע"י נוגדנים ספציפיים כנגד<br />

המכוון כנגד כל אחד מן<br />

CV בעובי של 10 µm הודגרו בבופר בהיעדר (CON) או בנוכחות נוגדן ספציפי מיקומן של פקיעיות הטעם מצויין ע"י חיצים לבנים.‏ קשירתם של הנוגדנים נבחנה גם בנוכחות חלבון<br />

ה-‏ יחודי לכל נוגדן.‏<br />

העברת החלבונים<br />

(B) ספציפיותם של הנוגדנים השונים נבחנה ע"י הרצת מיצוי ממוח חולדה ב-‏<br />

או<br />

והגבה עם אותם הנוגדנים אשר שימשו ב-‏<br />

לממברנת ניטרוצלולוז ‏(כמתואר בסעיף חלבון חוסם.‏ ‏(נעשה בשיתוף עם מר אלכסנדר אלילויקו).‏<br />

בנוכחות .GRK6 ו-‏ GRK5 ,GRK2<br />

(Ab)<br />

,SDS-PAGE<br />

,(A) בהיעדר (-)<br />

.20 µm של Bar scale<br />

(2.2.7.3<br />

.GRKs<br />

חוסם protein) (BP - binding<br />

(+)<br />

50

3.3- חקר השפעת הטעמנים על מנגנון הדסנסיטיזציה של קולטני<br />

HeLa בעזרת מודל בתאי GPCRs<br />

3.3.1- חדירת טעמנים אמפיפטיים מרים ומתוקים לתאי<br />

HeLa<br />

ישנן עדויות בספרות על יכולתם של טעמנים אמפיפטיים לחדור לתוך ציטוזול של תאי טעם מבודדים<br />

ותאי מלנוציטים בתרבית<br />

.(185 ,132)<br />

לאחר בדיקת מספר שורות תאים בתרבית ,HeLa)<br />

,HEK293<br />

,(HCT/116<br />

נמצא ששלושת הטעמנים המתוקים ‏(סכרין,‏<br />

(NHD ו-‏ D-TRP<br />

ושלושת הטעמנים המרים<br />

‏(קפאין,‏ נרינגין וכינין),‏ אמפיפטיים כולם,‏ חדרו לציטוזול התאים במידה הרבה ביותר בתאי<br />

ריכוזי הטעמנים להם נחשפו התאים תאמו ריכוזים המצויים במזון<br />

.HeLa<br />

.(172 ,158 ,129 ,27 ,7)<br />

זמני<br />

החשיפה היו לרוב 10 דקות חוץ מאשר לכינין,‏ עבורו זמן החשיפה קוצר ל-‏ 3 דקות על מנת שלא לפגוע<br />

בחיות התאים.‏ ניתן לראות בטבלה 3.2 שלאחר החשיפה התקבלו עבור כל הטעמנים ריכוזים תוך תאיים<br />

גבוהים מאוד,‏ אשר הגיעו במקרה של קפאין,‏ סכרין ו-‏ D-TRP לרמות של עשרות מילימולרים.‏ שוב<br />

נראתה כאן תופעה של הצטברות כנגד מפל הריכוזים,‏ בדומה למה שנצפה בניסויי ה-‏<br />

in vivo ‏(סעיף<br />

,(3.1.2<br />

תופעה אשר תוארה בתאי טעם מבודדים אך גם בסוגי תאים נוספים.‏<br />

טבלה 3.2<br />

– חדירת טעמנים אמפיפטיים מרים ומתוקים לתוך תאי .HeLa<br />

תאי HeLa הודגרו עם כל אחד מחמשת הטעמנים הראשונים במשך 10 דקות או במשך 3 דקות עם הטעמן המר<br />

כינין ‏(כמתואר בסעיף בסוף החשיפה,‏ התאים נשטפו נקצרו ופוצצו במטרה לבודד את התוכן<br />

התוך-תאי.‏ נוכחות וריכוז הטעמנים בציטוזול נקבעו בעזרת מכשיר התוצאות מייצגות את הממוצע<br />

שגיאת התקן של 3 חזרות של ניסוי אשר בוצע פעמיים.‏<br />

±<br />

3 פעמים,‏<br />

.HPLC<br />

.(2.2.8.2<br />

3.3.2- השפעת טעמנים אמפיפטיים על היווצרות השליח המשני cAMP לאחר גירוי<br />

הקולטן ה-‏ β2AR<br />

על מנת להעריך את השפעת הטעמנים חודרי ממברנות על פעילות הקולטן ה-‏ ,β2AR תאי<br />

HeLa אשר<br />

ביטאו את הקולטן הודגרו בהיעדר או בנוכחות טעמן,‏ בריכוזים שונים ולזמנים שונים,‏ ואח"כ גורו ע"י<br />

51

,10 µM isoproterenol (ISO)<br />

ליגנד ספציפי ל-‏ ,β2AR לזמנים שונים.‏ מסלול העברת האותות של<br />

הקולטן ה-‏ β2AR כולל הפעלה של חלבון G מסוג G s ושפעול האנזים אדניליל ציקלאז<br />

.cAMP אשר מייצר את השליח המשני cyclase)<br />

(Adenylyl<br />

3.3.2.1- הטעמנים האמפיפטיים גורמים להגברה תלוית ריכוז ביצירת ה-‏ cAMP בתגובה לגירוי<br />

הקולטן ה-‏ β2AR עי"‏<br />

ISO<br />

מתוך התוצאות ‏(איור 3.4A), ניתן לראות שגירוי הקולטן ה-‏ β2AR ע"י ISO גורם להיווצרות מהירה<br />

מאוד של cAMP שמגיעה לשיא תוך<br />

הפוספודיאסטראזות<br />

30 שניות,‏<br />

.(PDE)<br />

אחריהן נצפית ירידה הדרגתית,‏ בעיקר הודות לשפעול<br />

הדגרה מוקדמת של התאים עם טעמנים השונים למשך<br />

3 דקות ‏(או 10<br />

דקות עבור כינין)‏ גרמה לעלייה מובהקת סטטיסטית ברמת ה-‏ cAMP כבר לאחר 30 שניות של גירוי<br />

‏(עלייה של פי<br />

,1.3-1.8<br />

בהתאם לטעמן).‏ ניתן היה לצפות בהבדלים מובהקים גם לאחר 2 דקות של גירוי,‏<br />

ואף לאחר 5 דקות בחלק מן המקרים.‏<br />

עקומת ה-‏ cAMP מתנהגת שונה במקרה של קפאין<br />

,(CAFF)<br />

IBMX למערכת.‏<br />

אחר,‏<br />

בשל הוספת מעכב הפוספודיאסטראזות<br />

קפאין ידוע ומשמש במחקרים רבים כמעכב פוספודיאסטראזות,‏ ובשל כך,‏ מעלה את<br />

רמות ה-‏ cAMP בהקשר שונה מזה הנידון במחקר הנוכחי.‏ על מנת לנטרל השפעה זו בניסויים שלנו<br />

ולבחון את השפעת הקפאין על פעילות הקולטן עצמו,‏ הודגרו תאי ה-‏ HeLa עם מעכב פוספודיאסטראזות<br />

,IBMX<br />

משמעותית ברמות ה-‏<br />

בטרם נחשפו לקפאין וגורו עם<br />

.ISO<br />

ההדגרה המוקדמת עם<br />

IBMX<br />

cAMP<br />

אשר הגיעו לאחר גירוי הקולטן למאות<br />

fmole/µg protein<br />

גרמה לעלייה<br />

לעומת<br />

עשרות בלבד בנוכחות הטעמנים האחרים.‏ ובכל זאת ניתן לראות שבנוכחות קפאין נצפתה עלייה מובהקת<br />

ברמת ה-‏ cAMP בהשוואה לביקורת שהכילה IBMX בלבד.‏ יכולתם של הטעמנים להגביר את רמות<br />

3.4B. לאחר גירוי הקולטן נמצאה גם תלוית ריכוז,‏ כפי שניתן לראות באיור cAMP<br />

3.3.2.2<br />

- הטעמנים האמפיפטיים אינם פועלים כליגנדים אנדוגניים<br />

Zubare-Samuelov et al.<br />

וסכרין לשמש ליגנדים לקולטנים שונים מסוג<br />

(185) דיווחו בעבר על יכולתם של מספר טעמנים אמפיפטיים כגון נרינגין<br />

,GPCR<br />

לשלול בעבודה זו אפשרות של גירוי קולטנים אנדוגניים ב-‏<br />

ובכך להשפיע על רמות<br />

cAMP בתא.‏<br />

,HeLa<br />

על מנת<br />

ושל הקולטן ה-‏ β2AR בפרט,‏ ע"י<br />

הטעמנים,‏ נבחנו רמות בסיסיות של cAMP בהיעדר ובנוכחות טעמן בלבד ללא גירוי של הקולטן ה -<br />

β2AR<br />

עצמו ע"י<br />

.ISO<br />

התוצאות באיור<br />

3.5A<br />

מראות שלטעמנים<br />

סכרין,‏ ,NHD<br />

,D-TRP<br />

נרינגין<br />

וכינין לא הייתה שום השפעה על הרמות הבסיסיות של .cAMP במקרה של קפאין התקבלה עלייה של כ-‏<br />

45%, שנגרמה בשל השפעתו על פעילות ה-‏ .PDE<br />

52

A<br />

B<br />

3.4 איור<br />

.ISO עי"‏ β2AR<br />

– טעמנים אמפיפטיים מגבירים את רמות השליח המשני cAMP לאחר גירוי הקולטן ה-‏<br />

HeLa<br />

.3.2<br />

(A) הגברת רמות ה-‏ cAMP ע"י הטעמנים השונים לאחר גירוי הקולטן ע"י ISO הינה תלויה בזמן.‏ תאי<br />

אשר ביטאו את הקולטן ה-‏ β2AR הודגרו בהיעדר ‏(סמנים מלאים)‏ או בנוכחות ‏(סמנים ריקים)‏ כל אחד מחמשת<br />

הטעמנים,‏ לזמנים וריכוזים המצוינים בטבלה במקרה של קפאין,‏ התאים הודגרו קודם לכן עם IBMX<br />

לזמנים<br />

20 דקות לעיכוב פוספודיאסטראזות.‏ בהמשך גורה הקולטן ה-‏<br />

שונים של עד בסופן ה-‏ cAMP התוך תאי מוצה וכומת בשיטת ה-‏ .RIA התוצאות הינן ממוצע<br />

התקן של לפחות 6 חזרות מתוך ניסוי אשר בוצע 2-3 פעמים.‏<br />

(B) השפעת הטעמנים על רמות cAMP הינה תלוית-ריכוז.‏ תאים נחשפו לריכוזים שונים של הטעמנים לזמנים<br />

כמות ה-‏ cAMP התוך תאי נקבעה כמתואר ב -<br />

המצויינים בטבלה 3.2 ולאחר מכן ל-‏ ISO<br />

20 דקות לפני שהודגרו עם קפאין.‏ התוצאות מובאות<br />

גם כאן,‏ התאים נחשפו ל-‏ IBMX<br />

כאחוז יחסי לביקורת המתאימה כאשר הביקורת מהווה 100%, ומייצגת רמות cAMP בהיעדר טעמנים.‏ התוצאות<br />

מציינות עלייה מובהקת<br />

הינן ממוצע ± שגיאת תקן של לפחות 6 חזרות של ניסוי אשר בוצע<br />

בהתאמה)‏ ברמות ה-‏ cAMP בין הביקורת לטיפול.‏<br />

סטטיסטית<br />

(150<br />

(10 µM) ISO עם β2AR<br />

± שגיאת<br />

2-3 פעמים.‏ * ו-‏ **<br />

µM) 10) במשך דקה.‏<br />

µM) (150 למשך<br />

ו-‏ 0.01>p,<br />

5 דקות,‏<br />

p

3.3.2.3<br />

- פראינקובציה של הטעמן עם התאים הינה הכרחית להשפעתו על יצירת cAMP בתגובה<br />

לגירוי הקולטן ה-‏ β2AR<br />

בהמשך,‏ נבחנה יכולתם של הטעמנים האמפיפטיים להגביר את רמות ה-‏<br />

cAMP<br />

β2AR ע"י ISO<br />

לאחר גירוי הקולטן ה-‏<br />

כתלות בזמן החשיפה של התאים לאותם הטעמנים.‏ לשם כך התאים הודגרו עם<br />

הטעמנים השונים למשך דקה,‏ 5 דקות ו-‏<br />

10 דקות,‏<br />

בטרם גורו עם ISO למשך דקה.‏ על פי התוצאות<br />

המסוכמות באיור 3.5B, פראינקובציה של לפחות 5 דקות עם הטעמנים הייתה הכרחית על מנת לראות<br />

את השפעתם על רמות ה-‏ cAMP מאחר ולחלק ניכר מן הטעמנים לא נראתה כלל השפעה לאחר חשיפה<br />

של דקה בלבד ‏(חוץ מנרינגין).‏ בנוסף,‏ ככל שזמן החשיפה לטעמן היה ארוך יותר כך התעצמה השפעתו.‏<br />

A<br />

B<br />

β2AR<br />

(<br />

)<br />

– 3.5<br />

cAMP<br />

והשפעתם על רמות<br />

טעמנים אמפיפטיים אינם פועלים כליגנדים לקולטני ה-‏ איור לאחר גירוי ה-‏ β2AR תלויה בחדירתם לתא.‏<br />

(A) הטעמנים האמפיפטיים אינם פועלים כליגנדים לקולטן ה-‏ .β2AR תאי HeLa אשר מבטאים את הקולטן ה -<br />

‏(מלבד<br />

הטעמנים השונים לזמנים וריכוזים המצויים בטבלה או בנוכחות הודגרו בהיעדר לאחר מיצוי תוכן התאים,‏ הרמות הבזליות של<br />

ללא גירוי נוסף ע"י בשיטת RIA ‏(כמתואר בסעיף 2.2.9.3).<br />

תלויה במשך ההדגרה המוקדמת<br />

לאחר גירוי הקולטן ה-‏ β2AR (B) השפעת הטעמנים על<br />

הודגרו בהיעדר ‏(ביקורת)‏ או בנוכחות<br />

של התאים עם הטעמנים.‏ תאים אשר מבטאים את הקולטן ה - לאחר גירוי הקולטן עם ISO למשך דקה,‏ תוכן התאים<br />

הטעמנים האמפיפטיים לזמנים שונים<br />

מוצה וכמות ה-‏ cAMP נקבעה בשיטת .RIA התוצאות הינן ממוצע ± שגיאת תקן של לפחות 6 חזרות בכל טיפול.‏<br />

בהתאמה)‏ ברמות ה-‏ cAMP יחסית לביקורת.‏<br />

מציינות עלייה מובהקת סטטיסטית<br />

3.2<br />

cAMP נקבעו<br />

ב-‏ ISO<br />

β2AR<br />

ו-‏ 0.01>p,<br />

( )<br />

.ISO<br />

,1) 5 ו-‏ 10 דקות).‏<br />

p

3.3.2.4<br />

- השפעת הטעמנים איננה תלויה ב-‏ PDE<br />

או ב-‏ .PKA<br />

מטרה מרכזית בעבודה זו היא חקר יכולתם של טעמנים חודרי ממברנות להשפיע על מסלול<br />

הדסנסיטיזציה של הקולטן ה-‏ .β2AR מאידך,‏ ייתכן והשפעת הטעמנים על רמות<br />

cAMP<br />

נובעת מעיכוב<br />

של פוספודיאסטראזות ע"י הטעמנים עצמם,‏ בדומה לקפאין,‏ וזאת למרות שבניגוד לקפאין,‏ הטעמנים<br />

סכרין,‏ ,NHD<br />

,D-TRP<br />

נרינגין וכינין לא השפיעו על הרמות הבסיסיות של<br />

פעילות PDE נצפה בעיקר לאחר גירוי הקולטן והיווצרות ה-‏ .cAMP<br />

.cAMP<br />

מצד שני,‏ עיכוב<br />

A<br />

B<br />

היווצרות cAMP<br />

3.6<br />

בעקבות גירוי ה-‏ β2AR אינה תלויה בפעילותם<br />

איור – השפעת הטעמנים על<br />

של פוספודיאסטראזות א)‏ ו ב-‏ .PKA<br />

השפעת הטעמנים אינה תלויה ב-‏ רמות ה-‏ הבזליות ולאחר גירוי הקולטן ע"י<br />

בהיעדר או בנוכחות מעכב פוספודיאסטראזות 150) µM) IBMX בשילוב עם היעדר או נוכחות טעמן.‏<br />

(B) השפעת הטעמנים אינה תלויה ב-‏ .PKA רמות ה-‏ cAMP לאחר גירוי הקולטן ע"י ISO נבחנו בהיעדר או<br />

בשילוב או בהיעדר טעמן.‏ * מציינות עלייה מובהקת סטטיסטית<br />

בנוכחות מעכב ,PKA<br />

בהתאמה)‏ ברמות ה-‏ cAMP יחסית לביקורת המתאימה.‏<br />

ISO נבחנו<br />

ו-‏ **<br />

cAMP<br />

.PDE<br />

PDE)<br />

(A)<br />

,(20 µM) H89<br />

,p

במטרה לשלול את האפשרות הזו,‏ נבחנה השפעתם של הטעמנים בהיעדר ובנוכחות .IBMX תאי<br />

HeLa<br />

אשר ביטאו את הקולטן ה-‏ β2AR הודגרו עם 150) µM) IBMX למשך 20 דקות בטרם נחשפו למשך<br />

10 דקות לטעמן (3 דקות לכינין)‏ ואחר כך ל-‏ ISO במשך דקה.‏ מן התוצאות<br />

‏(איור 3.6A)<br />

ניתן לראות<br />

שבכל המקרים,‏ ההגברה ברמות ה-‏ cAMP ‏(לאחר גירוי הקולטן)‏ התקבלה גם בהיעדר וגם בנוכחות<br />

.IBMX<br />

נוכחותו של מעכב הפוספודיאסטראזות אומנם גרמה לקפיצה משמעותית ברמות ה-‏ ,cAMP אך<br />

מידת ההגברה שהתקבלה בעקבות חשיפת התאים לטעמנים האמפיפטיים נשארה דומה לזו שבהיעדר<br />

המעכב<br />

‏(פי 1.5-2).<br />

מכיוון שמסלול הדסנסיטיזציה של הקולטן ה-‏ β2AR מערב קינאזות מסוג<br />

GRKs<br />

אך גם ,PKA נשאלה<br />

השאלה אם לא מסתתר מאחורי השפעת הטעמנים עיכוב של קינאז ה-‏ .PKA על מנת לברר נקודה זו,‏<br />

נבחנה השפעתם של הטעמנים על רמות<br />

נוכחות<br />

cAMP<br />

בהיעדר ובנוכחות מעכב<br />

PKA בשם .H89<br />

H89<br />

כצפוי,‏<br />

µM) 20) גרמה לעלייה ברמות ה-‏ cAMP לאחר גירוי עם ISO ‏(איור 3.6B), בשל עיכוב<br />

מסלול הדסנסיטיזציה של הקולטן,‏ אשר כולל בין היתר שפעול חלבון G i ועיכוב אדניליל ציקלאז<br />

,32)<br />

.(123<br />

למרות זאת הדגרה של התאים עם הטעמנים השונים גרמה להגברה ברמות ה-‏<br />

לגירוי הקולטן ע"י ,ISO בין אם H89 היה נוכח לבין אם לא.‏<br />

cAMP בתגובה<br />

3.3.3<br />

ISO<br />

- השפעת הטעמנים על זרחון הקולטן ה-‏ β2AR ע ‏"י GRK2/5 בעקבות גירוי<br />

ע ‏"י<br />

על מנת לבחון את השערת העבודה לפיה טעמנים אמפיפטיים מעכבים את מסלול הדסנסיטיזציה של<br />

קולטני GPCR ע"י עיכוב אינטרצלולרי של הקינאזות ממשפחת ה-‏<br />

נבדקה השפעת הטעמנים על זרחון הקולטן ה-‏<br />

האחראיות על<br />

הדסנסיטיזציה של הקולטן ה-‏<br />

,GRKs<br />

,GRK5 ו-‏ GRK2 .β2AR<br />

,β2AR<br />

מתבטאות<br />

אנדוגנית בתאי<br />

נעשו ניסויים נוספים בהם<br />

שתי הקינאזות העיקריות<br />

.HeLa<br />

בניסויים<br />

המתוארים להלן נעשה שימוש בקולטן ה-‏ β2AR אשר קשור לסמן HA ‏(להלן .(β2HA לאחר גירוי<br />

הקולטן ע"י<br />

ISO<br />

לזמנים שונים בהיעדר או בנוכחות טעמן,‏<br />

התאים נקצרו בבופר איזוטוני<br />

RIPA<br />

לשמירה על שלמותם של חלבונים ממברנליים ‏(כגון קולטנים).‏ לאחר השקעה אימונית של הקולטן,‏ זיהוי<br />

הקולטנים המזורחנים נעשה ע"י שימוש בנוגדן אשר מזהה ספציפית עמדות המזורחנות ע"י<br />

GRK2 ו -<br />

,3.7A באיור .GRK5<br />

כאשר שיא הזרחון נראה בערך לאחר<br />

ניתן לראות שקולטני ה-‏ β2HA מזורחנים בתנאים רגילים<br />

(CON) במהירות,‏<br />

5-10<br />

דקות לאחר תחילת הגירוי.‏ בהמשך נצפית ירידה ברמת<br />

הזרחון,‏ כנראה הודות לשפעול פוספטאזות,‏ כך שלאחר 20 דקות רוב הקולטנים נמצאים בצורה הלא-‏<br />

מזורחנת שלהם.‏ להפתעתנו,‏ חשיפה של התאים לכל אחד מששת הטעמנים השונים גרמה לא רק לירידה<br />

ברמת הזרחון של הקולטן אלא גם לאיחור בהופעתו.‏ זרחון הקולטן נצפה רק לאחר<br />

15 דקות<br />

,NHD<br />

סכרין,‏ כינין וקפאין ולאחר<br />

20 דקות<br />

בנוכחות D-TRP ונרינגין.‏<br />

עיבוד התוצאות ע"י תוכנת ImageJ לכימות עוצמת הכתמים בכל נקודת זמן<br />

‏(איור 3.7B)<br />

בנוכחות<br />

מראה בצורה<br />

גרפית את השהיית הופעת הזרחון מ-‏ 5 דקות עבור הביקורת ל-‏ 10-20 דקות בנוכחות ששת הטעמנים.‏<br />

56

3.7 איור<br />

.ISO<br />

(A)<br />

– טעמנים אמפיפטיים מעכבים את הופעתו של זרחון הקולטן ה-‏ β2AR לאחר גירוי עם<br />

(β2HA) HA<br />

.(2.2.10.1<br />

,10%<br />

β2AR<br />

הודגרו בהיעדר או<br />

אשר קשור לחלבון מזהה<br />

תאים אשר מבטאים את הקולטן ה-‏ התאים נקצרו והקולטן<br />

בנוכחות טעמן ולאחר מכן גורו עם ISO לזמנים שונים ‏(כמתואר בסעיף הועברו לממברנת<br />

SDS‏-אקרילאמיד הדוגמאות הורצו בג'ל נוקה משאר חלבוני התאים.‏ בוצע ע"י שימוש בנוגדן מכוון כנגד עמדות סרינים המזורחנות<br />

ניטרוצלולוז וזיהוי הקולטנים המזורחנים זיהוי כמויות כלליות של β2HA נעשה ע"י<br />

‏(מיהול על ידי<br />

שימוש בנוגדן מכוון נגד HA ‏(מיהול 1:1000).<br />

בכל נקודת זמן עבור כל טיפול,‏ נעשה בעזרת תוכנת<br />

כימות עוצמת הכתמים מתוך הערכים הינם הממוצע<br />

לדמיין את העיכוב בהופעתו של הזרחון בנוכחות הטעמנים יחסית לביקורת שגיאת התקן ביחידות שרירותיות של שלוש חזרות של<br />

ה -<br />

ImageJ ומאפשר<br />

±<br />

.(CON)<br />

.(1:600<br />

.(A)<br />

β2HA<br />

(pβ2AR)<br />

,anti-phosphoSer(355-356) ,GRK2/5<br />

,(A)<br />

(B)<br />

57

3.3.4<br />

- השפעת הטעמנים על מנגנון האינטרנליזציה של הקולטן ה-‏ β2AR<br />

אם אכן טעמנים אמפיפטיים מעכבים את זרחון הקולטן ע"י עיכוב<br />

,GRKs<br />

קיימת סבירות גבוהה<br />

שתהליכים ביולוגיים התלויים בזרחון זה יימצאו מעוכבים גם הם.‏ אחד מהם הינו מנגנון האינטרנליזציה<br />

של הקולטן אשר תלוי בקשירת β-arrestin לקולטן המזורחן.‏ במטרה לבחון את השפעת הטעמנים על<br />

תהליך האינטרנליזציה נעשתה טרנספקציה של β2AR בתאי<br />

,HeLa<br />

ולאחר הדגרה של התאים בהיעדר<br />

או בנוכחות טעמן,‏ הקולטן גורה עם ISO לזמנים שונים,‏ התאים קובעו ומיקומם של הקולטנים ‏(ממברנלי<br />

או ציטוזולי)‏ נבדק במיקרוסקופיה קונפוקלית.‏ ניתן לראות ‏(איור 3.8A) שלפני גירוי ‏(זמן<br />

β2AR נראה בצורה ברורה וחדה על גבי הממברנה הפלסמטית של התאים.‏<br />

,(0<br />

הקולטן ה -<br />

A<br />

B<br />

ISO<br />

β2AR<br />

מעוכב ע ‏"י קפאין<br />

בעקבות גירוי עם איור 3.8- מנגנון האינטרנליזציה של הקולטן ה-‏ וסכרין.‏<br />

בהיעדר או בנוכחות קפאין<br />

(A) תאים אשר ביטאו את הקולטן ה-‏ ,β2AR הודגרו במשך ואז גורו עם ISO לזמנים שונים.‏ התאים צולמו תחת מיקרוסקופ קונפוקלי לאחר קיבוע וצביעת<br />

סכרין התמונות מייצגות את מצבם של רוב<br />

‏(כמתואר בסעיף התאים עם נוגדן כנגד הקולטן ה-‏ ה-‏ התאים אשר נצפו בנקודת הזמן הספציפית.‏<br />

mM) (5 או<br />

10 דקות<br />

.(2.3.11<br />

β2AR<br />

(10 mM)<br />

58

ISO<br />

β2AR נחשפו<br />

15<br />

0<br />

לשני ריכוזים של קפאין או סכרין בטרם גורו ע"י<br />

(B) תאים אשר ביטאו את הקולטן ה-‏<br />

לזמנים שבין ל-‏ דקות.‏ לאחר קיבוע התאים,‏ מיקומם של הקולטנים ‏(ממברנלי או ציטוזולי)‏ נקבע תחת<br />

מיקרוסקופ קונפוקלי.‏ התוצאות מובאות כאחוז התאים אשר הכילו קולטן ממברנלי יחסית לביקורת ‏(זמן<br />

התוצאות הינן ממוצע ± שגיאת התקן של כל אחת של כ-‏ מתוך ניסוי אשר<br />

נעשה לפחות פעמיים.‏ * מציינות עלייה מובהקת סטטיסטית ו-‏ בהתאמה)‏ באחוז התאים<br />

המכילים קולטן ממברנלי יחסית לביקורת המתאימה.‏<br />

(0<br />

300 תאים,‏<br />

,p

דרך נוספת להעריך את השפעתם של טעמנים אמפיפטיים על מנגנון האינטרנליזציה היא בעזרת<br />

פרקציונציה של התא.‏ בשיטה זו מופרדת הפרקציה הציטוזלית מן הפרקציה הממברנלית,‏ ונוכחות ו/או<br />

כמות חלבון מסוים ‏(במקרה זה הקולטן ה-‏<br />

ספציפי.‏ באיור<br />

(β2AR<br />

נבדקות בשיטת<br />

Western blot<br />

,3.10<br />

ניתן לראות בפרקציה הממברנלית של הביקורת<br />

(CON)<br />

ושימוש בנוגדן<br />

את הירידה ההדרגתית<br />

בכמות הקולטן ככל שמתארך הגירוי ע"י ,ISO לעומת עלייה הדגרתית מקבילה בפרקציה הציטוזולית.‏<br />

לעומת זאת,‏ הדגרה מוקדמת של התאים עם כל אחד מששת הטעמנים בטרם גורו עם ISO גרמה לירידה<br />

הרבה יותר מתונה בכמות הקולטן בפרקציה הממברנלית,‏ במיוחד במקרים של קפאין ונרינגין,‏ כך שלאחר<br />

20 דקות נוכחותו של הקולטן בפרקציה זו הייתה עדיין ברורה.‏<br />

A<br />

B<br />

(A)<br />

איור 3.10- הטעמנים האמפיפטיים מעכבים את הופעתו של הקולטן ה-‏ β2AR בפרקציה הציטוזולית<br />

של התאים בעקבות גירוי עם .ISO<br />

לאחר הדגרה של התאים בהיעדר או בנוכחות טעמנים וגירוי הקולטן ה-‏ עם לזמנים שונים,‏<br />

הממברנה הפלסמטית של התאים הופרדה מן התוכן הציטוזולי בעזרת שרשרת של סרכוזים במהירויות שונות<br />

‏(כמתואר בסעיף בסוף הסרכוז האחרון הפרקציה הציטוזולית הופרדה והמשקע הורחף בבופר<br />

להמסת הממברנות.‏ שתי הפקרציות הורתחו בנוכחות sample buffer ודוגמה מכל פרקציה הורצה על ג'ל<br />

נוכחות הקולטן נקבעה ע"י שימוש בנוגדן המכוון כנגד HA ‏(מיהול<br />

כימות עוצמת הכתמים מתוך בכל נקודת זמן עבור כל טיפול,‏ נעשה בעזרת תוכנת הירידה<br />

ההדרגתית בכמות הקולטן הממברנלי אשר נראית בביקורת (CON) ככל שמתארך הגירוי,‏ מעוכבת בנוכחות כל<br />

אחד מהטעמנים האמפיפטיים.‏ התוצאות המובאות מייצגות ניסויים אשר נעשו לפחות פעמיים.‏<br />

ISO<br />

RIPA<br />

- SDS<br />

1:1000 ב-‏ .(TBST<br />

.ImageJ<br />

β2HA<br />

,(A)<br />

.(2.2.13<br />

אקרילאמיד 12%.<br />

(B)<br />

60

3.3.5<br />

– השפעת חשיפת התאים לטעמנים על מסלול העברת האותות של ERK<br />

בתגובה לגירוי עם .ISO<br />

מחקרים רבים בשנים האחרונות מצביעים על יכולתו של הקולטן ה-‏ β2AR לעורר מספר מסלולי העברת<br />

אותות נוספים לזה העובר דרך החלבון<br />

,G s<br />

וביניהם מסלול ה-‏ (ERK) MAPK<br />

.(100 ,99 ,92)<br />

שתי דרכים בהן β2AR גורם לשפעול של :ERK לאחר זרחון ע"י PKA בטווח זמנים של<br />

ולאחר זרחון ע"י GRKs בטווח זמנים ארוך יותר של<br />

ישנן<br />

2-5 דקות<br />

10-30 דקות.‏<br />

הקודמים מצביעות על יכולתם של הטעמנים לעכב את פעילותן של<br />

של הטעמנים על שפעולו של<br />

מכיוון שהתוצאות שלנו מהניסויים<br />

,GRKs<br />

.ERK<br />

בנוכחות טעמן ולאחר מכן גורו ע"י ISO לזמנים שבין<br />

לאחר שתאים המבטאים את הקולטן<br />

בשלב זה נבחנה השפעתם<br />

β2AR<br />

2 ל-‏ 30 דקות,‏<br />

הודגרו בהיעדר או<br />

רמת הזרחון של ERK נבדקה<br />

בשיטת Western blot ע"י שימוש בנוגדן ספציפי.‏ כפי שנראה באיור 3.11A, הטעמנים לא השפיעו על<br />

רמת הזרחון הבסיסית של ERK ‏(ללא גירוי הקולטן),‏ חוץ מקפאין אשר נראה בעל השפעה מעכבת.‏ דבר<br />

זה מצביע על כך שלפחות לטעמנים סכרין,‏ ,NHD<br />

,D-TRP<br />

MAPK<br />

עצמו.‏ על מנת לוודא שחוסר התגובה של<br />

כלשהי בתאים,‏ תאי ה-‏<br />

האנדוגני<br />

ERK<br />

EGF גורו עם HeLa<br />

(EGF Receptor) EGFR<br />

נרינגין וכינין אין השפעה על מסלול ה-‏<br />

לטעמנים אינו נובע מחוסר תפקודו מסיבה<br />

Factor) (Epidermal Growth אשר משפעל את הקולטן<br />

בתאים אלה,‏ ו-‏<br />

ERK<br />

ידוע כאחד ממסלולי העברת האותות<br />

העיקרי שלו.‏ ואכן ניתן לראות באיור 3.11A את השפעול החזק של ERK בתגובה ל-‏<br />

גירוי הקולטן ה-‏<br />

.EGF<br />

β2AR ע"י ,ISO<br />

דקות)‏ ונמוך יותר בטווח הזמנים הארוך יותר<br />

התקבל שפעול חזק יחסית של<br />

ERK<br />

בטווח הזמנים הקצר<br />

לאחר<br />

2-5)<br />

30 עד 10)<br />

.(155)<br />

של<br />

בנוכחות הטעמנים,‏ השפעול של<br />

ERK<br />

בטווח הזמנים של<br />

דקות)‏ בדומה לדיווחים קודמים מהספרות<br />

2-5<br />

דקות לא נראה מושפע ‏(חוץ<br />

מקפאין).‏ לעומת זאת,‏ הדגרה של התאים עם כל ששת הטעמנים גרמה לעיכוב של ERK בטווח הזמנים<br />

10-30 דקות,‏<br />

אשר תלוי בזרחון הקולטן ע"י GRK ‏(איור 3.11B). קפאין עיכב בצורה משמעותית<br />

של השפעול של ERK גם בטווח הקצר וגם בטווח הארוך,‏ דבר אשר מעיד על יכולתו של טעמן זה לעכב<br />

את שני מסלולי הדסנסיטיזציה.‏<br />

61

3.11- איור<br />

.GRKs עי"‏ β2AR<br />

(A)<br />

הטעמנים האמפיפטיים מעכבים את שפעול<br />

ERK<br />

HeLa .ERK<br />

– 3 דקות)‏<br />

,pERK) מזורחן ERK<br />

אשר תלוי בזרחונו של הקולטן ה -<br />

הטעמנים האמפיפטיים אינם משפעלים את תאי המבטאים את הקולטן ה-‏ נחשפו β2AR<br />

לטעמנים השונים במשך ‏(כינין ומיד לאחר מכן,‏ תוכן התאים מוצה.‏ 20 µg הורצו בכל באר<br />

מיהול מול כמות ה-‏<br />

של ג'ל SDS ‏-אקרילאמיד 12% וזיהוי נוכחות<br />

נעשה ע"י שימוש בנוגדנים ספציפיים.‏<br />

הכללית<br />

(B) הטעמנים האמפיפטיים מעכבים את מסלול שפעולו של ERK אשר תלוי ב-‏ לאחר הדגרה של התאים<br />

בהיעדר או בנוכחות טעמן ושפעול הקולטן ה-‏ β2AR ע"י ISO לזמנים שונים,‏ נמדדה רמת השפעול של ERK<br />

בכל נקודת זמן כמתואר ב-‏ A. התוצאות המובאות מייצגות ניסויים אשר נערכו לפחות שלוש פעמים.‏ בצד ימין,‏<br />

מוצגים גרפית ההבדלים בעוצמת הכתמים בכל נקודת זמן,‏ בהיעדר (□) או בנוכחות טעמן,‏ כאשר זמן<br />

שרירותית כ-‏‎1‎‏.‏ ו-‏ מציינות עלייה מובהקת סטטיסטית במבחן דו-כיווני וחד כיווני,‏<br />

בהתאמה)‏ ברמות הזרחון של ERK יחסית לביקורת המתאימה.‏ ‏(נעשה בשיתוף עם גברת עינב מלאך).‏<br />

ERK<br />

0 הוגדר<br />

(1:40,000<br />

.GRKs<br />

(■)<br />

t-test<br />

,p

4. דיון ומסקנות<br />

תגליות חשובות בעשור האחרון הביאו לפריצת דרך אדירה בהבנת התהליכים הביולוגיים שמאחורי<br />

חישת הטעם.‏ הוכח שקולטנים ממשפחת ה-‏<br />

המתוקים והאוממים שבמזון<br />

GPCRs<br />

.(119 ,118 ,24)<br />

הינם אחראים על קשירת הטעמנים המרים,‏<br />

למרות שמסלולי העברת אותות אפשריים נחקרו שנים<br />

רבות קודם לכן,‏ שימוש בביולוגיה מולקולרית ועכברים מהונדסים גנטית אפשר לשפוך אור על<br />

המרכיבים החיוניים לחישת שלושת הטעמים האלו<br />

.(183)<br />

הלאה למערכת העצבית התגלה כשונה מרוב המערכות הידועות<br />

בנוסף,‏ מנגנון העברת המידע מתא הטעם<br />

.(143 ,28)<br />

בניגוד למנגנונים האחראים<br />

על העברת המידע מהקולטן הלאה,‏ מנגנון סיום העברת המידע לא נחקר כלל בספרות.‏ בנוסף,‏ לא הוסברו<br />

עד כה תופעות כגון השאריתיות המורגשת לאחר טעימת טעמנים מרים או ממתיקים לא סוכריים.‏ על<br />

בסיס מספר מחקרים שנערכו,‏ נראה שתופעת השאריתיות בטעם נובעת מהעברת אינפורמציה ממושכת<br />

מהרגיל מתאי הטעם אל תאי העצב<br />

.(160 ,59)<br />

ההשערה אשר הועלתה מציעה שמסיבה כלשהי מנגנון<br />

כיבוי העברת האותות של קולטני הטעם ‏(דסנסיטיזציה)‏ אינו מתפקד במלואו ולכן העברת האינפורמציה<br />

מתמשכת לתקופה ארוכה יותר.‏ טעמנים מרים וממתיקים לא סוכריים רבים הינם מולקולות אמפיפטיות.‏<br />

השערת העבודה הנוכחית הינה שהודות לתכונת האמפיפטיות שלהן,‏ מולקולות אלו מסוגלות לעבור את<br />

הממברנה הפלסמטית של תאי הטעם ומרגע שהגיעו לתוך ציטוזול התאים,‏ מעכבות את תהליך<br />

הדסנסיטיזציה של קולטני<br />

מטרות:‏<br />

GPCRs<br />

(1<br />

כולל אלה של הטעם.‏ על מנת להוכיח השערה זו,‏ הוצבו שלוש<br />

להוכיח שטעמנים אמפיפטיים,‏ מרים ומתוקים,‏ מסוגלים לחדור לתוך ציטוזול תאי הטעם<br />

בתנאים פיזיולוגיים ‏(תנאי הכרחי על מנת שיוכלו להשפיע על תהליכים ציטוזוליים),‏<br />

נוכחותן של קינאזות ממשפחת ה-‏<br />

(2<br />

GRKs<br />

חיוני לקיום מנגנון הדסנסיטיזציה ההומולוגית של קולטני ה-‏<br />

לבחון את<br />

בתאי פקיעית הטעם,‏ בידיעה שקינאזות אלו מהוות מרכיב<br />

(3 ,GPCRs<br />

לבחון את השפעתם של<br />

טעמנים אמפיפטיים על תפקודה והתקדמותה של הדסנסיטיזציה ההומולוגית של קולטני ה-‏<br />

במערכת תאית אשר תהווה מודל לתאי הטעם וקולטני הטעם.‏<br />

GPCRs<br />

- חדירת טעמנים אמפיפטיים לתוך תאי הטעם<br />

4.1<br />

במחקרים קודמים הוכח שטעמנים אמפיפטיים חודרים ממברנות של ליפוזומים וגם לתוך תאי טעם<br />

מפקיעיות טעם מבודדות או פפילות טעם מבודדות<br />

של<br />

.(132)<br />

הבעיתיות המרכזית בניסויים אשר נערכו עד<br />

כה הינה שתנאי הניסוי אינם תואמים תנאים פיזיולוגיים.‏ כאשר פפילת הטעם מעוגנת בתוך הלשון,‏ הצד<br />

האפיקלי בלבד של תאי הטעם נמצא באינטראקציה עם הטעמנים,‏ דרך ה-‏<br />

.taste pore<br />

tight junctions<br />

בנוסף,‏ נוכחותם<br />

המחברים בין התאים בצד האפיקלי של הפקיעית מהווים מחסום,‏ כך שתאי<br />

הפקיעית אינם צפויים לפגוש בשום מקרה את מרכיבי המזון ‏(טעמנים)‏ בצד הבזולטרלי שלהם.‏ תנאים<br />

63

אלו אינם נשמרים כאשר פפילת הטעם מופרדת מרקמות חיבור ושריר לאחר טיפול אנזימטי.‏ לכן השלב<br />

הראשון של עבודה זו הוקדש לבחינת חדירתם של טעמנים אמפיפטיים לתוך תאי פקיעית הטעם בתנאים<br />

פיזיולוגיים.‏ מעקב דינמי אחר חדירת טעמנים אמפיפטיים תוך כדי הדגרתם עם פפילת<br />

שלמה CV<br />

במיקרוסקופ קונפוקלי היתה אחת השיטות לחקור את מידת חדירתם לתוך פפילת הטעם.‏ העלייה עם הזמן<br />

ברמת הפלואורסצנציה בדיוק באזור ה-‏ inner trench של פפילת ה-‏ CV ‏(איור<br />

(3.1<br />

מעידה על חדירה<br />

והצטברות הדרגתית של הטעמנים לתוך תאי פקיעיות הטעם עצמן.‏ נוכחות פלואורסצנציה גם ברקמה<br />

האפיתליאלית המקיפה את פפילת הטעם מעידה על יכולתם של אותם הטעמנים לחדור גם לתוך תאים לא<br />

סנסוריים.‏ שימוש ב-‏<br />

ל-‏<br />

,KI<br />

אשר פועל כמדעיך פלואורסצנטי אך אינו חודר ממברנות,‏ הוכיח כי העלייה<br />

ברמת הפלואורסצנציה נובעת מחדירה אמיתית של הטעמנים לתוך פקיעיות הטעם ולא מתוך הצטברות<br />

חיצונית לתוך תעלת הפפילה או ספיחה חיצונית על פני האפיתל.‏ העובדה ש-‏ KI גרם לדעיכה מיידית<br />

ומוחלטת של PI ‏(אשר אינו חודר ממברנות)‏ אך לא שינה את רמת הפלואורסצנציה של הטעמנים הוכיחה<br />

שהטעמנים אכן נמצאים בתוך ציטוזול התאים או לפחות עמוק בתוך הממברנה הפלסמטית שלהם,‏ שם אין<br />

KI גישה.‏<br />

קינאזות ה-‏ ,GRKs שפעילותן בנוכחות טעמנים נחקרה בעבודה זו,‏ נמצאות חלקן מעוגנות<br />

בתוך הממברנה הפלסמטית הודות להוספת חומצות שומן בקצה ה-‏ C‏-טרמינלי שלהן,‏ או לפחות ממוקמות<br />

בסמוך לצד הציטוזולי של המבברנה הודות לאפיניות שלהן לפוספוליפידים או חלבונים אחרים כגון תת -<br />

היחידה βγ של חלבון ה-‏ G. לכן ייתכן והטעמנים מסוגלים לבוא במגע עם אותן ה-‏ GRKs גם מבלי<br />

לחדור עמוק לתוך ציטוזול התא אלא גם כאשר הם פונים כלפי הצד הציטוזולי של הממברנה הפלסמטית.‏<br />

מנגנון חדירת הטעמנים לתוך תאי הטעם איננו ידוע.‏ בהיותם מולקולות אמפיפטיות,‏ ההשערה הראשונה<br />

שהועלתה הייתה שטעמנים אלו חודרים בעזרת דיפוזיה פסיבית דרך הממברנה הפלסמטית.‏ ייתכן שהודות<br />

לשילוב של קבוצות הידרופוביות וקבוצות הידרופיליות שבתוכן,‏ מולקולות הטעמנים מסוגלות להתקרב<br />

ולהיצמד לממברנה הפלסמטית ואף לנוע בתוכה ולעבור לצד הציטוזולי שלה.‏ תמיכה לתיאוריה זו מראה<br />

שטעמנים אמפיפטיים אכן מסוגלים לחדור לתוך ליפוזומים המורכבים מפוספוליפידים וכולסטרול בלבד<br />

.(132)<br />

למרות שתיאוריה זו אפשרית,‏ קצב חדירת הטעמנים נמצא מהיר יותר מזה שמאפשרת דיפוזיה<br />

פסיבית.‏ מצד שני,‏ נראה שלא מדובר גם כן בניצול של תעלה אקטיבית ע"י הטעמנים.‏ למרות שמעכב<br />

האנרגיה<br />

CCCP<br />

עיכב את כניסתם של סכרין ו-‏<br />

D-TRP<br />

לתוך תאי טעם מפפילה מבודדת,‏ נמצא<br />

שהסיבה לכך הייתה בגלל שינוי בפוטנציאל הממברנה ולא בגלל חוסר במולקולות<br />

מעכב האנרגיה<br />

ATP<br />

oligomycin<br />

לא עיכב את חדירתם של הטעמנים סכרין,‏<br />

,D-TRP<br />

.(117) cyclo(Leu-Trp)<br />

יחד,‏ תוצאות אלו פסלו את האפשרות של ניצול נשא אקטיבי<br />

בתא.‏ ואכן,‏<br />

כינין והפפטיד<br />

(transporter)<br />

להחדרת טעמנים אלו פנימה אל הציטוזול.‏<br />

ייתכן וחדירתם של הטעמנים דרך הממברנה מתאפשרת הודות לתופעה בה מספר מולקולות מתארגנות<br />

יחד ליצירת פורות<br />

,(pores)<br />

כאשר הקבוצות ההידרופיליות פונות לצד אחד והקבוצות ההידרופוביות<br />

פונות לצד שני.‏ כך,‏ מולקולות אמפיפטיות ‏"בונות"‏ לעצמן דרך מעבר בתוך הממברנה הליפידית ועוברות<br />

אותה.‏<br />

64

אם אכן הטעמנים חודרים לתוך תאי הטעם בכוחות עצמם ‏(דרך דיפוזיה או בניית פורות)‏ ולא דרך תעלה<br />

אקטיבית,‏ איך ניתן להסביר את הצטברות הטעמנים כנגד מפל הריכוזים אשר נראתה גם בעבודה זו<br />

בניסויי ה-‏<br />

בעבודות אחרות<br />

in-vivo<br />

עבור כינין וקפאין ‏(טבלה<br />

(3.1<br />

?(185 ,132)<br />

בתוך אורגנלות התא כגון הגרעין<br />

ותוארה גם עבור טעמנים אמפיפטיים אחרים<br />

ייתכן והסבר אפשרי טמון ביכולתם של הטעמנים לחדור ולהצטבר גם<br />

.(132)<br />

חדירת הטעמנים לתוך אורגנלות התא יכולה לגרום למצב בו<br />

הריכוז הציטוזולי עצמו אינו עולה על הריכוז החוץ תאי ולכן הטעמן ממשיך לחדור פנימה,‏ וכך מצטבר<br />

בהדרגתיות בתוך התא.‏<br />

מטרת ניסויי ה-‏<br />

in-vivo<br />

בחולדות מורדמות הייתה לחקות מצב של שתייה המתמשכת כ-‏<br />

שניות,‏ 90<br />

ולבחון בסופן נוכחות של טעמנים בתאי פפילת ה-‏ .CV על מנת להפריד את התוכן הציטוזולי של תאי<br />

הטעם בתום ה-‏<br />

90 שניות,‏<br />

בקולגנאז אשר ארך כ-‏<br />

בתמיסת<br />

25<br />

.TGPP<br />

מכיוון שה-‏<br />

היה צורך להפריד את פפילת ה-‏ CV מן הלשון בעזרת ניתוח וטיפול אנזימטי<br />

דקות.‏ לאורך כל זמן הניתוח,‏ הלשון ולאחר מכן הפפילה עצמה נמצאו<br />

TGPP<br />

לא הכיל בעצמו טעמן,‏ ניתן לצפות שחלק מהטעמנים אשר היו<br />

בתאי הפפילה ‏"יברחו"‏ החוצה כתוצאה מהפיכת מפל הריכוזים או ע"י שפעול טרנספורטרים ממשפחת ה-‏<br />

.(multidrug resistance protein) mdr<br />

טרנספורטרים ממשפחה זו אחראים על הוצאת תרכובות זרות<br />

או רעילות מתוך ציטוזול התא,‏ ומחקרים הראו כי mdr1 מתבטא בפפילת ה-‏ CV<br />

.(71)<br />

לפיכך חושב<br />

עבור כל טעמן פקטור אשר יהווה אומדן למידת הבריחה של הטעמנים השונים בזמן הניתוח.‏ בריחה זו<br />

הוערכה בין<br />

64% ל-‏ ,86%<br />

ולפיה חושב הריכוז התוך תאי של הטעמנים לאחר<br />

90<br />

שניות שתייה.‏<br />

הריכוזים התוך תאיים אשר נמצאו בניסוי זה הרבה יותר נמוכים משל אלה אשר דווחו בניסויים שנערכו<br />

בפפילות מבודדות.‏ למשל,‏ ריכוזו התוך תאי של D-TRP הוערך כ-‏ 6.4 mM בניסוי ה-‏<br />

in-vivo במקום<br />

60-65 mM<br />

בפפילה מבודדת.‏ ריכוזו של כינין נמצא<br />

5.5 mM<br />

במקום<br />

20 mM<br />

0.96 mM cyclo(Leu-Trp)<br />

במקום<br />

.3.5 mM<br />

והפפטיד המר<br />

תוצאות אלו היו צפויות מאחר ובתנאי הניסוי<br />

הנוכחיים,‏ תאי הטעם אינם חשופים לתמיסת הטעמנים אלא מהצד האפיקלי בלבד,‏ דרך ה-‏<br />

אזור בעל שטח מצומצם מאוד.‏ מכל מקום,‏ ניסויי ה-‏<br />

,taste pore<br />

in-vivo<br />

הוכיחו כי טעמנים אמפיפטיים מסוגלים<br />

בתנאים פיזיולוגיים לחדור לתוך תאי פקיעית הטעם ואף להצטבר בהם כנגד מפל הריכוזים ‏(במקרה של<br />

כינין וקפאין).‏ מעבר לכך,‏ נראה שטעמנים חודרים לכל סוגי התאים ‏,סנסוריים או לא,‏ מאחר והם נמצאו<br />

גם בתאי האפיתל שמסביב לפפילת ה-‏<br />

.CV<br />

בנוסף,‏ יש להניח כי הטעמנים חודרים במידה שווה בכל<br />

התאים המרכיבים את פקיעית הטעם ולכן הריכוזים התוך תאיים שחושבו נחשבים לנכונים בכל סוגי<br />

התאים שבפקיעית הטעם,‏ וביניהם תאי הטעם עצמם<br />

.(taste receptor cells)<br />

65

4.2<br />

- איפיון ביטוי קינאזות ממשפחת ה-‏<br />

GRKs בתאי פפילת ה -<br />

CV בחולדה<br />

השערת העבודה הינה שמרגע הגעתם אל ציטוזול התאים,‏ הטעמנים האמפיפטיים משבשים את מהלך<br />

מנגנון הדסנסיטיזציה של הקולטנים לטעם,‏ ובכך גורמים למסלול העברת האותות להימשך זמן רב יותר.‏<br />

מכיוון שהקולטנים לטעם המר<br />

(T2Rs)<br />

והמתוק<br />

(T1Rs)<br />

משתייכים למשפחת ה-‏<br />

,GPCRs<br />

סביר להניח<br />

שמנגנון הדסנסיטיזציה שלהם יהיה דומה לזה של שאר הקולטנים ממשפחה זו,‏ כלומר באמצעות זרחון<br />

של הקצה ה-‏ C‏-טרמינלי ע"י לפחות אחת מהקינאזות ממשפחת ה-‏<br />

GRK5 זוהה באפיתל הלשון<br />

.GRKs<br />

.(136)<br />

,GRKs<br />

ידוע ממחקרים קודמים כי<br />

מכיוון שמטרתנו לחקור את השפעת הטעמנים על פעילותם של ה -<br />

נרצה קודם לאפיין אילו איזופורמים מהמשפחה הזו מתבטאים בתאי הטעם.‏<br />

ראשית,‏ נבדק ביטויים של<br />

GRK5 ,GRK3 ,GRK2 ,GRK1<br />

GRK6 ו-‏<br />

בפפילת ה-‏<br />

CV<br />

בשיטת ,GRK7 .RT-PCR<br />

לא נבדקו.‏ תוצאות ה-‏<br />

אשר אינו מתבטא בחולדה ו-‏<br />

,GRK4<br />

RT-PCR<br />

הראו שהקינאזות<br />

בפפילת ה-‏ ,CV אך גם באפיתל הלא סנסורי<br />

GRK5 ,GRK3 ,GRK2<br />

מחולדה<br />

אשר מתבטא בעיקר במוח ואשכים,‏<br />

GRK6 ו-‏<br />

(EP)<br />

הסמוך לפפילת ה-‏ CV בלשון ‏(איור<br />

מתבטאות<br />

GRK1 .(3.2<br />

אשר מתבטא באופן ייחודי במערכת הראייה לא היה צפוי להתבטא בפפילת ה-‏ ,CV ואכן לא נמצא בה.‏<br />

על מנת לוודא כי פפילת ה-‏ CV אכן בודדה באופן נקי מרקמת האפיתל הלא סנסורי של הלשון,‏ נבדקו גם<br />

ביטויים של הקולטנים למר<br />

באפיתל הלא סנסורי.‏<br />

ארבעת הקינאזות,‏<br />

.(T1R3) ולמתוק (T2R4)<br />

GRK5 ,GRK3 ,GRK2<br />

,GRK6 ו-‏<br />

הקולטנים נמצאו אכן רק ברקמת ה-‏ CV ולא<br />

מתבטאות בכלל אברי הגוף<br />

ולכן לא (48)<br />

מפתיע למצוא אותן גם ברקמה הסנסורית והלא סנסורית.‏ סביר גם להניח שלחלק מהן תפקיד שונה בשתי<br />

רקמות אלו.‏ מציאת הקולטנים למר ולמתוק יחד עם ארבעת ה-‏ GRKs בשיטת ה-‏ RT-PCR אינה עדות<br />

לכך שכל החלבונים האלו אכן מתבטאים יחד באותם התאים.‏ בניסוי מסוג זה ביטוים של החלבונים<br />

השונים נבדק בכלל התאים שבפפילת ה-‏ .CV ידוע כיום כי הקולטנים למר והקולטנים למתוק מתבטאים<br />

בתאי טעם שונים<br />

,(183 ,114 ,62)<br />

ובאותה מידה ייתכן וה-‏ GRKs השונים מתבטאים גם הם בסוגים<br />

שונים של תאים מתוך הפפילה ופקיעית הטעם.‏ בנוסף,‏ פפילת הטעם אינה מורכבת אך ורק מפקיעיות<br />

טעם:‏ תאי אפיתל לא סנסוריים מקיפים את פקיעיות הטעם ויוצרים את רקמת הפפילה.‏ חלק מהרנ"א אשר<br />

הופק לאחר ריסוק רקמת הפפילה מקורו מתאים אפיתליאלים לא סנסוריים אלו.‏ על מנת לוודא את<br />

מיקומם של ה-‏ GRKs השונים בתוך פפילת ה-‏ ,CV נעשתה צביעה אימונית של חתכי פפילת CV עם<br />

נוגדנים ייחודים אשר סונתזו כנגד כל אחד מן ה-‏<br />

.(3.3 ‏(איור GRKs<br />

מצביעה זו נראה ש-‏<br />

GRK5<br />

מתבטא בעיקר בתוך פקיעית הטעם.‏ לעומתו,‏ GRK2 נראה גם בפקיעיות הטעם וגם באפיתל הלא סנסורי<br />

המקיף אותן,‏ אך GRK6 נראה בעיקר מחוץ לפקיעיות הטעם.‏ תוצאות אלו ממקדות בעיקר את<br />

GRK5<br />

אך גם GRK2 כקינאזות פוטנציאליות המעורבות במנגנון הדסנסיטיזציה של תהליכים אשר קורים בתאי<br />

פקיעיות הטעם,‏ וביניהם תאי הטעם.‏ תוצאה זו מתנגשת קצת עם פרסומים אחרונים אשר דיווחו כי<br />

66

GRK2 בלבד נמצא בפקיעיות הטעם של פפילת ה-‏ CV בעכברים<br />

התוצאות נובע משונות בין בעלי חיים ‏(עכבר מול חולדה).‏<br />

,(103)<br />

אך ייתכן שמקור השוני בין<br />

נוגדן כנגד GRK3 לא גרם לצביעה הנראית לעין של חתכי פפילת ה-‏ .CV מכיוון שעל פי שיטת ה -<br />

GRK3 ,RT-PCR<br />

נמוכה במיוחד של<br />

מתבטא ברקמה זו,‏ ייתכן כי התוצאה השלילית בצביעה האימונית נובעת מרמת ביטוי<br />

,GRK3<br />

מתחת לסף רגישות השיטה.‏ על מנת לקבוע במדויק אלו<br />

יחד באותו תא עם קולטנים למר או למתוק,‏ יידרשו ניסויים נוספים כגון<br />

GRKs מתבטאים<br />

in-situ hybridization בהם<br />

נבדקת נוכחותם של רנ"א מגנים שונים בתאים.‏ ניסויים מסוג זה שימשו על מנת לקבוע שחלבונים כגון<br />

PLCβ2 ,gustducin או<br />

TRPM5 מתבטאים יחד עם קולטנים למר או למתוק<br />

.(183)<br />

נראה כי צביעה<br />

של רנ"א הינה יותר ספציפית ומאפשרת צביעה והבחנה של תאים בודדים מתוך מצבור התאים<br />

שבפקיעית הטעם.‏ לחילופין RT-PCR של תא בודד יכול לספק מידע על גנים המתבטאים בכל סוג תא<br />

בפקיעית הטעם.‏ למרות רגישותן הגבוהה של שתי שיטות אלו,‏ חסרון מסוים נעוץ בכך שהבדיקה נעשית<br />

ברמת הרנ"א וידוע מכמה מערכות שרנ"א אינו תמיד אומדן נאמן לרמת החלבון בתא.‏<br />

- 4.3<br />

טעמנים אמפיפטיים מעכבים את הדסנסיטיזציה של קולטני<br />

ה-‏ GPCRs על ידי עיכוב פעילותן של קינאזות ה-‏<br />

.GRKs<br />

לאחר שנמצא כי טעמנים אמפיפטיים יכולים לחדור בתנאים פיזיולוגיים לתוך תאי הטעם ושקיימות<br />

קינאזות ממשפחת ה-‏ GRKs באותם התאים,‏ מטרת חלק זה של העבודה הייתה לבחון האם ביכולתם של<br />

אותם הטעמנים האמפיפטיים לעכב את תהליך הדסנסיטיזציה של קולטנים ממשפחת ה-‏<br />

אינטראקציה עם מרכיבים ציטוזוליים כגון קינאזות ה-‏<br />

GPCRs<br />

.GRKs<br />

ע"י<br />

על מנת להוכיח טענה זו,‏ התעורר הצורך<br />

לעבוד במערכת מודל עם קולטן אחר מקולטני הטעם,‏ וזאת ממספר סיבות.‏ ראשית,‏ תהליך הדסנסיטיזציה<br />

של הקולטנים לטעם,‏ מר או מתוק,‏ לא נחקר עד כה.‏ בניגוד לרוב קולטני ה-‏<br />

,GPCRs<br />

זהותם ותפקודם<br />

של הקולטנים לטעם התבררו רק בשנים האחרונות ומנגנון הדסנסיטיזציה שלהם אינו ידוע עדיין.‏ שנית,‏<br />

ולמרות השיפורים הטכנולוגיים בשנים האחרונות,‏ לא נמצאה עד כה שיטה המאפשרת לגדל תאי טעם<br />

בתרבית מבלי לגרום עיוות לתאים או מוות לאחר זמן קצר<br />

.(126 ,85)<br />

מסיבה זו,‏ חקירת תפקודם של<br />

הקולטנים לטעם דורשת ביטוי מלאכותי שלהם בשורות תאים ‏(טרנספקציה).‏ אומנם ביטוי שכזה נעשה<br />

במספר רב של עבודות,‏ ע"י שימוש בתאים כגון תאי<br />

בעיקר לביטוי ציטוזולי של הקולטן<br />

מחסום משמעותי עבורנו.‏<br />

או HEK293 ,COS-7<br />

,(24 ,18)<br />

אך ידוע כי שיטה זו מביאה<br />

ומכאן לקולטן לא פונקציונלי לרוב,‏ דבר אשר מהווה<br />

ובכל זאת,‏ מכיוון שהקולטנים לטעם המר והמתוק משתייכים למשפחת ה-‏<br />

מנגנון הדסנסיטיזציה עבורם יהיה דומה לזה אשר תואר בסעיף<br />

מסוג<br />

,GPCRs<br />

,1.6<br />

GRK<br />

ולאחר מכן אינטרנליזציה.‏ מסיבות אלו,‏ נבחר הקולטן ה-‏<br />

סביר להניח כי<br />

זאת אומרת דרך זרחון ע"י קינאזה<br />

β2AR<br />

לשמש מודל במערכת<br />

שלנו.‏ β2AR הינו קולטן GPCR אשר מנגנון הדסנסיטיזציה שלו נחקר בהרחבה שנים רבות,‏ מרכיביו<br />

67

אופיינו והשפעותיו על תהליכים תוך תאיים אחרים הינם בעצמם מקור למחקרים רבים נוספים<br />

,99 ,48)<br />

.(175 ,174 ,155 ,153 ,100<br />

בנוסף,‏ ידוע כי קולטן זה מזורחן ע"י<br />

אשר זוהו בתוך תאי פקיעית הטעם של פפילת ה-‏ CV ‏(סעיף<br />

במערכת כזו רלוונטית גם למערכת חישת הטעם.‏<br />

GRK2 ו-‏<br />

,(4.2<br />

,GRK5 שתי הקינאזות<br />

ולכן השפעה אפשרית של הטעמנים<br />

על מנת להשתמש בקולטן ה-‏ β2AR ככלי במחקר זה,‏ היה צורך לבטא אותו בתאים הגדלים בתרבית.‏<br />

תאי ה-‏<br />

HeLa<br />

נבחרו למטרה זו ממספר סיבות:‏ ראשית אלה תאים ממקור אפיתליאלי,‏ בדומה לתאי<br />

הטעם בפקיעית הטעם.‏ בנוסף,‏ על מנת להוכיח השפעה אפשרית של הטעמנים האמפיפטיים על מרכיבים<br />

תוך תאיים,‏ ישנו צורך להשתמש בתאים שלתוכם טעמנים אמפיפטיים חודרים במידה הדומה לזו אשר<br />

נמצאה בתאי הטעם.‏ נמצא שאכן טעמנים אמפיפטיים חודרים במידה הרבה ביותר לתוך תאי ה-‏<br />

‏(בהשוואה לתאי<br />

HeLa<br />

COS7 ,HEK293<br />

או<br />

.(HCT/116<br />

בדומה למה שדווח בתאי טעם,‏ הטעמנים<br />

האמפיפטיים הצטברו גם כאן כנגד מפל הריכוזים.‏ למרות זאת,‏ התברר כי קצב החדירה של הטעמנים<br />

לתוך תאי HeLa הרבה יותר נמוך מזה שבתאי טעם.‏ 10 דקות חשיפה עם תאי ה-‏<br />

לקבל ריכוזים הדומים לאלו אשר נמצאו לאחר<br />

מבודדות<br />

HeLa נדרשו<br />

30<br />

.(132)<br />

כינין ידוע כחומר רעיל לתאים<br />

על מנת<br />

שניות חשיפה בלבד בתאי הטעם מפקיעיות טעם<br />

בנוסף תאי ה-‏ HeLa נמצאו הרבה יותר רגישים לתרכובת כינין מאשר תאי הטעם.‏<br />

.(184 ,120)<br />

אך בניגוד לתאי הטעם אשר יכלו להיחשף לריכוזים של<br />

1-<br />

2 mM ‏(טבלה ,3.1 ,((132)<br />

תאי ה-‏ HeLa לא שרדו ריכוזים העולים על 50. µM לכן ריכוזי הכינין<br />

בחלק זה של העבודה הינם בטווח של 10-50, µM וזמן החשיפה לתאים לפני גירוי הקולטן לא עלה על<br />

3 דקות ‏(טבלה 3.2).<br />

ריכוזי חמשת הטעמנים האחרים הינם ריכוזים המצויים במזון.‏<br />

על מנת לבחון את השפעת הטעמנים על תהליך הדסנסיטיזציה של הקולטן ה-‏<br />

פעילותו של הקולטן לאחר גירוי עם ליגנד ספציפי בשם<br />

,β2AR<br />

,(ISO) isoproterenol<br />

נבחנה תחילה<br />

כאשר התאים נחשפו<br />

קודם לכן לטעמנים אמפיפטיים.‏ במידה ולטעמנים השפעה מעכבת על התקדמותו של תהליך<br />

הדסנסיטיזציה,‏ היינו מצפים לפעילות ארוכה יותר של הקולטן,‏ אשר תתורגם ברמות שליחים משניים<br />

גבוהות יותר לזמנים ארוכים יותר.‏ מידת הפעילות של הקולטן נבחנה כאן ע"י מדידת רמות השליח המשני<br />

cAMP<br />

אשר נוצר כתוצאה משפעול חלבון<br />

G s<br />

ואדניליל ציקלאז ע"י הקולטן ה-‏<br />

.β2AR<br />

ואכן נמצא<br />

שחשיפה מוקדמת של התאים לטעמנים האמפיפטיים השונים גרמה לעלייה משמעותית ברמות ה-‏ cAMP<br />

שנוצרו בתגובה ל-‏ ISO והמשיכה גם 2 דקות לאחר גירוי הקולטן.‏ הגברה זו ברמות ה-‏<br />

תלויה בריכוז הטעמן ‏(איור<br />

cAMP הייתה<br />

.(3.4<br />

תוצאות אלו היוו אינדיקציה ראשונית לכך שטעמנים אמפיפטיים אכן<br />

גורמים לקולטן להיות ‏"פעיל יותר".‏<br />

מחקרים קודמים הראו שטעמנים אמפיפטיים יכולים להשפיע על מערכות אשר אינן קשורות לטעם,‏ בין<br />

היתר ע"י קשירה לקולטנים שאינם קולטני טעם והפעלתם.‏ למשל,‏ הטעמן NHD נמצא מסוגל לפעול<br />

כליגנד לקולטן האדרנרגי מסוג<br />

כליגנדים לקולטן המלטונין<br />

לקולטן לסרוטונין<br />

,(α2AR) α2<br />

לעומת טעמנים כגון סכרין ו-‏<br />

D-TRP<br />

.(185) (MT1/2)<br />

.(166) 5-HT3<br />

אשר פועלים<br />

לעומת זאת,‏ הטעמן המר כינין נמצא פועל כאנטגוניסט<br />

לאור עובדות אלו,‏ נעשו מספר ניסויים על מנת להוכיח כי השינוי<br />

68

ברמות ה-‏ cAMP נבע מפעילות ציטוזולית של הטעמנים ולא בגלל קשירה חוץ תאית לקולטן ה-‏ β2AR<br />

באופן אשר יידמה ליגנד.‏ הניסויים הראו כי בהיעדר ,ISO אין לטעמנים עצמם כל השפעה על רמות ה-‏<br />

ISO לאחר גירוי הקולטן עם cAMP הבזליות בתא,‏ ויותר מכך,‏ שמידת השפעתם על רמות ה-‏ cAMP<br />

הינה תלויה בזמן החשיפה של התאים אליהם ‏(איור 3.5). תוצאות אלו מוכיחות כי הטעמנים אינם פועלים<br />

כליגנדים לקולטן ה-‏<br />

בתאי<br />

,β2AR<br />

HeLa<br />

וקשור לחלבוני<br />

G s או .G i<br />

,HeLa<br />

או לכל קולטן אחר ממשפחת ה-‏ GPCR אשר מתבטא בצורה אנדוגנית<br />

גם אם סביר להניח כי קולטני α2AR למשל יתבטאו בתאי<br />

נראה כי רמת הביטוי שלהם נמוכה מכדי שטעמנים כגון NHD ישפיעו במידה משמעותית על<br />

רמות ה-‏ .cAMP התלות באורך החשיפה של תאים לטעמנים מוכיחה כי חדירתם ונוכחותם של הטעמנים<br />

בתוך ציטוזול התא בריכוז גבוה מספיק הינם חיוניים על מנת שתתקבל הגברה בפעילות הקולטן,‏ כלומר<br />

שהשפעת הטעמנים הינה תוך תאית ולא רצפטורלית.‏<br />

בנוסף לקשירתם לקולטנים שונים,‏ ידוע כי תרכובות אמפיפטיות מסוגלות גם להשפיע על פעילותם של<br />

מרכיבים ציטוזולים כגון פוספודיאסטראזות ‏(קפאין<br />

חלבונים ממברנליים כגון תעלות ‏(נרינגין<br />

,((64)<br />

פקטורי שעתוק ‏(פלבונואידים<br />

,((108)<br />

,(156 ,6)<br />

כינין<br />

.((170 ,31)<br />

או<br />

לכן נדרשו צעדים נוספים על<br />

מנת להוכיח כי ההגברה שנראתה ברמות ה-‏ cAMP אכן נובעת מהשפעת הטעמנים על פעילות הקולטן<br />

ולא בדרך עקיפה על מרכיבים ציטוזולים אשר עיכובם יגרום גם הוא לעלייה ברמת ה-‏ cAMP בתא.‏ שני<br />

שחקנים אשר יכלו להשפיע על רמות שליחים משניים היו ,PDE אשר אחראי על פירוק שליחים משניים<br />

ו-‏ PKA אשר מעורב בדסנסיטיזציה ההטרולוגית של הקולטן ה-‏ .β2AR ואכן,‏ נוכחותם של מעכב PDE<br />

בשם IBMX או מעכב PKA בשם H89 במערכת גרמו,‏ לאחר גירוי הקולטן,‏<br />

לרמות cAMP<br />

גבוהות פי<br />

10-15 מאשר בתנאים זהים בהיעדרם.‏ אך התוצאות הראו כי ההגברה ברמות ה-‏ cAMP לאחר חשיפת<br />

התאים לטעמנים קרתה גם בנוכחות IBMX או<br />

,H89<br />

ובמידה דומה לזו שבהיעדר המעכבים ‏(איור<br />

,(3.6<br />

ומהוות הוכחה לכך שההשפעה של הטעמנים על רמות ה-‏ cAMP לא נבעה מהשפעה כלשהי על PDE או<br />

,PKA<br />

בהתאמה.‏<br />

הטעמן היחיד אשר התנהג שונה היה קפאין.‏ קפאין הינו תרכובת הידועה כמשפיעה על פעילותם של מגוון<br />

רחב ביותר של אנזימים,‏ תעלות וקולטנים.‏ קפאין פועל כאנטגוניסט ל-‏<br />

,78) adenosine receptor<br />

,(138<br />

גורם לשחרור סידן תוך תאי<br />

,(177)<br />

מעכב תעלות אשלגן<br />

מעכב (55),<br />

(139) ATM ו-‏ PKC<br />

והרשימה עוד ארוכה.‏ אך אחת מההשפעות הידועות ביותר של קפאין ‏(כמו של המטבוליט שלו תאופילין)‏<br />

הינה עיכוב .PDE זו הסיבה לכך שבנוכחותו,‏ רמות ה-‏ cAMP לאחר גירוי הקולטן ה-‏ β2AR ע"י ISO<br />

גבוהות בהרבה ‏(בערך פי<br />

(5<br />

ושהירידה ברמות ה-‏ cAMP אשר נראית במצב רגיל לאחר 30 שניות אינה<br />

מתקיימת.‏ לכן,‏ במטרה לבחון את השפעת קפאין על פעילות הקולטן בלבד,‏ הוסף למערכת הניסוי<br />

.IBMX<br />

ואכן נמצא כי השפעתו של קפאין על רמות ה-‏<br />

cAMP<br />

β2AR<br />

להגברת רמות<br />

אינה תלויה ב-‏<br />

.PDE<br />

cAMP פי ,5<br />

שנוצרו בעקבות גירוי הקולטן ה-‏<br />

למרות זאת,‏ ניתן לראות כי אם קפאין לבד גורם לאחר גירוי הקולטן<br />

השפעתו על פעילות הקולטן עצמו ‏(ז"א<br />

בנוכחות (IBMX<br />

יורדת לפי<br />

1.5-<br />

2 בלבד<br />

‏,בדומה לשאר הטעמנים שנבדקו.‏<br />

69

בכדי לבחון אם השפעתם של הטעמנים על רמות<br />

cAMP<br />

נובעת מעיכוב מנגנון הדסנסיטיזציה<br />

ההומולוגית של הקולטן,‏ נבחנה מידת הזרחון של הקולטן לאחר גירוי בנוכחות הטעמנים.‏<br />

לשם כך,‏ השתמשנו בנוגדן אשר פותח בשנים האחרונות ומזהה אתרי סרינים המזורחנים ספציפית ע"י<br />

GRK2/5<br />

לאחר גירוי הקולטן,‏ והן העמדות<br />

Ser355 ו-‏ Ser356<br />

.(153)<br />

נוגדן זה שימש במספר מחקרים והוכח כספציפי<br />

.(168) GRK2 ו-‏<br />

HeLa<br />

בקצה ה-‏ C‏-טרמינלי של הקולטן<br />

GRK5 מתבטאים בצורה<br />

אנדוגנית בתאי ולכן לא נדרשה טרנספקציה נוספת להפעלת מנגנון הדסנסיטיזציה של הקולטן<br />

בתאים אלו.‏ מן התוצאות ניתן לראות כי זרחון הקולטן אכן הושפע מנוכחות טעמנים אך באופן לא צפוי.‏<br />

בנוסף לירידה ברמת הזרחון של הקולטן,‏ התקבלה דחייה בזמן הופעתו:‏ אם במצב רגיל ‏(ביקורת)‏ הקולטן<br />

נמצא מזורחן בעיקר<br />

‏(איור<br />

של<br />

5-10 דק'‏<br />

לאחר הגירוי,‏ בנוכחות הטעמנים זרחון זה הופיע רק לאחר<br />

10-20 דק'‏<br />

.(3.7<br />

תופעה זו איננה שגרתית במובן זה שעיכוב של אנזים מתורגם בירידה בפעילותו ואילו<br />

במקרה שלנו,‏ פעילותם של ה-‏ GRK2/5 נראית כמושהית ל-‏<br />

5-10 דק'‏<br />

in-vitro kinase assay<br />

הראו כי עיכוב פעילותם של<br />

מתחרות על אתר הקשירה לסובסטרט או על אתר הקשירה ל-‏<br />

GRK2 ו-‏<br />

,(186) ATP<br />

ומתחדשת לאחר מכן.‏ ניסויים<br />

GRK5 ע"י הטעמנים אינו נובע<br />

ומנגנון העיכוב לא פוענח<br />

עד כה.‏ אבל הסבר אפשרי לדחייה בזמן הופעת הזרחון של הקולטן יכול להיות בכך שלאחר הצטברותם<br />

לתוך ציטוזול התאים,‏ הטעמנים ‏"נעלמים"‏ בדרך כלשהי.‏ פירוק אנזימטי לא נראה סביר ולא ידוע על<br />

פעילות<br />

.HeLa בתאי cytochrome P450<br />

המצטברות בציטוזול התא הינו שפעול טרנספורטרים ממשפחת ה-‏<br />

לעומת זאת,‏ מנגנון ידוע אשר מוציא החוצה תרכובות ‏"זרות"‏<br />

(multi-drug resistance mdr<br />

.transporters)<br />

משפחה זו של טרנספורטרים,‏ הקיימת בתאים אאוקריוטים<br />

(130)<br />

,(76)<br />

כמו פרוקריוטים<br />

אחראית על הוצאת תרופות או חומרים רעילים מתוך התאים ומונעת בדרך זו את מותם.‏<br />

טרנספורטרים אלו פעילים במיוחד בתאי סרטן ‏(וגורמים כך לעמידות לתרופות אנטי-סרטניות<br />

ומתבטאים גם בתאי<br />

,((125)<br />

.(165) HeLa<br />

ניתן לחשוב כי בזמן גירוי הקולטן ‏(אשר ארך עד<br />

המשיכו להצטבר בתוך ציטוזול התא מעבר לריכוזים אשר דווחו בטבלה<br />

גבוהים הפעילו את הטרנספורטרים מסוג<br />

20 דק'),‏<br />

.3.2<br />

mdr<br />

הטעמנים<br />

ייתכן כי ריכוזים כה<br />

ובכך גרמו להוצאתם של הטעמנים מהציטוזול.‏ תוצאה<br />

ישירה תהיה ירידה מתמדת בריכוז הטעמנים בציטוזול.‏ מרגע זה,‏ העיכוב שהפעילו הטעמנים על ה-‏<br />

GRKs נעלם ולכן הקינאזות מסוגלות לפעול מחדש ולזרחן ‏"באיחור"‏ את הקולטן.‏<br />

אם אכן הטעמנים מעכבים את זרחון הקולטן ע"י<br />

,GRK2/5<br />

ישנה סבירות גבוהה כי תהליכים אשר<br />

תלויים בזרחון זה יימצאו גם הם מעוכבים,‏ וביניהם קשירה של מולקולת β-arrestin לקולטן המזורחן.‏<br />

כתוצאה מקשירה זו מופעלים מספר תהליכים:‏ הראשון הינו אינטרנליזציה של הקולטן לתוך ציטוזול התא<br />

והשני שפעול מסלולי העברת אותות חדשים.‏ לכן השפעת הטעמנים על שני תהליכים אלה נבחנה בהמשך.‏<br />

מידת האינטרנליזציה של הקולטן ה - β2AR לאחר גירוי עם ,ISO בהיעדר או נוכחות טעמנים,‏ נבחנה<br />

קודם כל במיקרוסקופיה פלואורסצנטית.‏ התוצאות הראו כי בעקבות פראינקובציה של התאים עם<br />

הטעמנים וגירוי הקולטן ה-‏ β2AR<br />

ב-‏ ISO<br />

.(3.8<br />

תוצאות אלו ביחד עם תוצאות השהייה בהופעת הזרחון ‏(איור<br />

חלה עלייה באחוז התאים אשר הכילו קולטן ממברנלי ‏(איור<br />

(3.7<br />

מתארות יפה את התהליך אשר<br />

70

עובר הקולטן:‏ בהיעדר טעמן,‏ הקולטן מזורחן כבר לאחר 5 דק'‏ של גירוי ובמקביל ניתן לראות את תחילת<br />

האינטרנליזציה שלו לתוך הציטוזול.‏ אחרי<br />

15 דק',‏<br />

רוב התאים מכילים קולטן ציטוזולי.‏ בתוך הציטוזול,‏<br />

הקולטן עובר תהליך של דה-פוספורילציה ‏(הורדת זרחנים ע"י פוספטאזות),‏ אשר מתבטא בירידה<br />

בעוצמת הפסים המתקבלים עם הנוגדן ה-‏ .anti-phosphoSer(355-356) β2AR לעומת זאת בנוכחות<br />

הטעמנים,‏ הקולטן אינו מזורחן באופן בולט גם לאחר<br />

10 דק'‏<br />

עדיין מכילים קולטן ממברנלי בזמן זה.‏ הזרחון מופיע בעיקר לאחר<br />

גירוי,‏ דבר המתבטא בכך שרוב התאים<br />

15 דק'‏<br />

גירוי וכך גם מתחיל להופיע<br />

אחוז גבוה יותר של אינטרנליזציה.‏ השפעת הטעמנים על קצב האינטרנליזציה של הקולטן נמצאה גם כן<br />

תלוית-ריכוז ‏(איור<br />

.(3.9<br />

מכיוון שהסתכלות על תאים דרך מיקרוסקופ אינה מאפשרת להעריך את כמות<br />

הקולטן אשר נמצא עדיין על ממברנת התא,‏ נעשתה פרקציונציה של התא ונבדקה נוכחות הקולטן<br />

בממברנה הפלסמטית ובתוכן הציטוזולי והוכיחה שוב כי חלה ירידה בקצב תהליך האינטרליזציה בנוכחות<br />

הטעמנים<br />

‏(איור 3.10).<br />

התהליך השני אשר תלוי בזרחון הקולטן ע"י<br />

GRKs וקשירת<br />

.(92) MAPK<br />

β-arrestin לקולטן הינו שפעול מסלול ה -<br />

מסלול זה מאופיין בקיום תגובת שרשרת בה קינאזה אחת מזרחנת את השנייה ובכך<br />

משפעלת אותה.‏ התגלו מספר רב של מסלולי<br />

מביניהם הינם<br />

ה-‏<br />

MAPK<br />

.ERK1/2 ו-‏ JNK ,p38<br />

:ERK<br />

הדרך הראשונה תלויה בזרחון הקולטן ע"י<br />

אשר מפעילים אפקטורים שונים,‏ הידועים<br />

ישנן שתי דרכים דרכן הקולטן ה-‏ β2AR משפעל את מסלול<br />

PKA<br />

‏(קורה בטווח של<br />

הקולטן)‏ והשנייה תלויה ביצירת הקומפלקס קולטן/‏β-arrestin ‏(קורה בטווח של<br />

2-5<br />

5-45 דק'‏<br />

.(155)<br />

דק'‏ אחרי גירוי<br />

לאחר גירוי<br />

הקולטן)‏ לכן בשלב הבא,‏ נבחנה השפעתם של הטעמנים על שפעול .ERK ראשית,‏ ללא גירוי<br />

הקולטן,‏ לא הייתה לטעמנים כל השפעה על רמת הזרחון הבזלית של דבר אשר מעיד על כך<br />

שלטעמנים אין כל השפעה על קולטנים מסוג ה-‏<br />

,ERK<br />

tyrosine kinase receptor<br />

כגון קולטן ה-‏<br />

EGF<br />

,(EGFR)<br />

אך גם לא על מרכיבים ציטוזולים אשר יכולים לשפעל את מסלול ה-‏ ,MAPK<br />

נראה שלטעמנים השפעה מעכבת על שפעול ERK רק בטווח של<br />

כגון .PKC<br />

10-30 דק'.‏<br />

ERK<br />

מעכבת על<br />

בזמנים של<br />

2-5<br />

,PKA<br />

לעומת זאת שפעול ה-‏<br />

דקות לא נראה מושפע כלל.‏ תוצאה זו מעידה על כך שלטעמנים אין השפעה<br />

דבר אשר תומך בתוצאות שהתקבלו בניסויי מדידות ה-‏<br />

הגבירו את רמות השליח המשני גם בנוכחות<br />

cAMP<br />

‏(איור H89<br />

הטעמנים עיכבו את המסלול אשר תלוי בזרחון הקולטן ע"י ה-‏<br />

.(3.6<br />

כאשר הטעמנים<br />

לעומת זאת,‏ ובהתאם לציפיותינו,‏<br />

GRKs<br />

וקשירת<br />

β-arrestin<br />

לקולטן<br />

המזורחן.‏ קפאין היה שוב במקרה זה הטעמן היחיד אשר התנהג אחרת מכל האחרים.‏ קפאין לא רק עיכב<br />

את שפעול ה-‏<br />

ERK<br />

התלוי ב-‏<br />

β-arrestin<br />

אלא גם את השפעול התלוי ב-‏<br />

.PKA<br />

קיימים בספרות<br />

דיווחים רבים על השפעת קפאין על מסלולים התלויים ב-‏ ,PKA אך עובדה מפתיעה ביותר הינה כי על<br />

פי סוג התאים או סוג המערכת נמצאו לקפאין השפעות הפוכות.‏ מספר מאמרים דיווחו על שפעול PKA<br />

ע"י קפאין<br />

,(63 ,3)<br />

לעומת מחקרים אחרים אשר דיווחו על השפעה מעכבת על<br />

.(186 ,148) PKA<br />

מתוצאות המחקר הנוכחי,‏ נראה כי קפאין פעל כמעכב .PKA זו יכולה גם להיות הסיבה לכך שקפאין הינו<br />

הטעמן היחיד מבין השישה אשר גרם לירידה ברמת הזרחון הבזלית של .ERK<br />

71

לסיכום תוצאות הניסויים בחלק זה מצביעות על כך שכתוצאה מחדירתם לתוך ציטוזול התאים,‏ הטעמנים<br />

האמפיפטיים גורמים לקולטן ה-‏ β2AR להיות פעיל לתקופה ארוכה יותר ע"י עיכוב קינאזות ה-‏<br />

האחראיות על תהליך הדסנסיטיזציה ההומולוגית שלו.‏<br />

GRKs<br />

הטעמנים מצטיירים כמעכבים פחות ספציפיים ורגישים ממעכבים הידועים עבור קינאזות אחרות<br />

ממשפחת ה-‏<br />

(PKA עבור H89 ‏(כגון serine/threonine kinases<br />

ואף קינאזות ממשפחת ה-‏<br />

tyrosine<br />

.(bcr/abl עבור imatinib ‏(כמו kinases<br />

ריכוזי הטעמנים אשר נדרשו על מנת לקבל השפעה היו ברמות<br />

המילימולרים,‏ לעומת רמות של µM הדרושות עבור רוב המעכבים המשווקים מסחרית.‏ מצד שני,‏ לא<br />

נמצאו עד כה מעכבים ספציפים ל-‏<br />

GRKs<br />

וחקר פעילותה הייחודית של כל אחת מן הקינאזות הללו<br />

נעשה עד היום ע"י פגיעה בביטוי הקינאזה,‏ למשל ע"י שימוש ב-‏ .siRNA בנוסף,‏ בהשוואה למעכבים<br />

אחרים הדורשים זמן חשיפה ממוצע לתאים של<br />

20 עד 45 דקות<br />

‏(אך יכול להגיע גם לשעות),‏ הטעמנים<br />

האמפיפטיים חודרים במהירות לתוך ציטוזול התאים ומגיעים לריכוזים אפקטיביים תוך זמן קצר יחסית<br />

(10 דקות בלבד).‏<br />

מכיוון ש-‏<br />

GRK2 ו-‏<br />

ה-‏ ,β2AR<br />

להשפיע בתנאי<br />

GRK5 הינן שתי הקינאזות האחראיות על הדסנסיטיזציה ההומולוגית של הקולטן<br />

התוצאות שתוארו כאן מתייחסות לשתי הקינאזות האלו בלבד.‏ בחינת יכולתם של הטעמנים<br />

in-vivo<br />

על קינאזות אחרות מתוך המשפחה תדרוש שימוש במודלים אחרים.‏ בנוסף,‏<br />

תוצאות המחקר אינן מאפשרות לדעת אם הטעמנים השפיעו במידה שונה על כל אחת משתי הקינאזות.‏<br />

ולמרות זאת,‏ שתי הקינאזות GRK2 ו-‏ GRK5 מעורבות במנגנון הדסנסיטיזציה של המגוון הרחב ביותר<br />

של קולטנים ולכן,‏ על אף שהקולטן ה-‏ β2AR שימש במחקר זה מודל בלבד לקולטני הטעם,‏ תוצאות<br />

המחקר הן בעלות משמעות רחבה יותר.‏<br />

רשימה ארוכה של קולטנים אשר משתייכים למשפחת ה-‏ GPCR התגלו בתאי פקיעית הטעם:‏ בין היתר<br />

הקולטנים לנוירוטרנסמיטורים סרוטונין<br />

,(67) (5-HT)<br />

אצטילכולין<br />

,(122) (mAChR1)<br />

(mGluR4)<br />

ו-‏<br />

(25) בעלי חשיבות רבה בתקשורת בין תאית.‏ הקולטן לכולציסטוכינין<br />

וגלוטמאט<br />

(61) (CCK-A)<br />

,β<br />

מתבטא אף הוא בתאי פקיעית הטעם ומשחק כנראה תפקיד בתחושת השובע.‏ מספר קולטנים אדרנרגים α<br />

וביניהם הקולטן ה-‏ β2AR<br />

,(60)<br />

מתבטאים גם בתאי פקיעית הטעם,‏ ותפקידם שם עדיין מעורפל.‏<br />

כל הקולטנים הללו משתייכים למשפחת ה-‏ GPCRs וברובם התגלה כי<br />

בתהליך הדסנסיטיזציה שלהם<br />

GRK2 ו/או GRK5 מעורבים<br />

.(54 ,50 ,33)<br />

לכן ניתן להניח כי לטעמנים האמפיפטיים יכולת להשפיע<br />

על תיפקודם של כל אחד מהקולטנים הללו במידה ותהיה להם גישה לציטוזול התאים בהם הם מתבטאים.‏<br />

רבים מן הקולטנים אשר הוזכרו כאן מתבטאים לא רק בתאי הטעם<br />

,(type II)<br />

אלא גם בתאים מסוג<br />

III<br />

,(type III)<br />

אשר אחראים על פי מחקרים אחרונים על שחרור נוירוטרנסמיטור ותקשורת עם תאי העצב.‏<br />

הטעמנים האמפיפטיים צפויים לחדור לתוך כל סוגי התאים שבתוך פקיעית הטעם באותה מידה,‏ ולכן גם<br />

לתוך תאים אשר מבטאים את הקולטנים הללו.‏ על פי תוצאות המחקר הנוכחי,‏ ייתכן והטעמנים<br />

האמפיפטיים משפיעים על תחושת הטעם לא רק ע"י שיבוש מנגנון הדסנסיטיזציה של הקולטנים לטעם<br />

72

עצמם אלא גם בדרך עקיפה ע"י השפעה על תפקודם של קולטני GPCRs אחרים האחראים על תהליכים<br />

פיזיולוגים מגוונים כגון העברת המידע מתא הטעם הלאה.‏<br />

על פי אותו היגיון,‏ ניתן להניח כי לטעמנים האמפיפטיים יכולת להשפיע על כל תהליך פיזיולוגי התלוי<br />

בקולטני GPCRs במידה ובאפשרותם לחדור לתוך ציטוזול התאים המבטאים אותם.‏ ידוע כי תרכובות<br />

אמפיפטיות רבות,‏ כגון סכרין,‏ נרינגין או קפאין,‏ אינן מפונות מהגוף ביעילות לאחר צריכתן,‏ וניתן למצוא<br />

אותן בריכוזים שונים בין היתר במערכת העיכול,‏ במערכת השתן ואף בדם.‏ סכרין למשל נספג תוך<br />

דקות בתוך המעי (105) וניתן למצוא אותו כמעט בכל איבר בגוף שעה לאחר הצריכה<br />

הוא מגיע לדם ע"י ספיגה מהירה מאוד דרך המעי<br />

15<br />

.(93)<br />

,(83)<br />

ומכאן מגיע לכל אברי הגוף<br />

.(11)<br />

קפאין גם<br />

לכן ייתכן כי<br />

לטעמנים האלה גישה לתאים מאיברים שונים בגוף.‏ בגלל אופיים האמפיפטי,‏ ישנה סבירות לפיה<br />

הטעמנים האלו חודרים לתוך ציטוזול התאים של איברים שונים,‏ שם הם יכולים להשפיע על מערכות<br />

אשר אינן קשורות כלל למערכת חישת הטעם.‏ אחד האיברים אשר יכול להיות מושפע יותר מאחרים הינו<br />

המעי,‏ אשר אחראי על ספיגת תרכובות מהמזון.‏ מעניין לציין כי מחקרים הראו לאחרונה שהקולטנים<br />

לטעם המתוק וחלבון ה-‏<br />

ספיגת הסוכרים ותחושת השובע<br />

gustducin G<br />

.(102 ,72)<br />

מתבטאים בתאי המעי ונראה שהם מווסתים שם את תהליך<br />

בקרה לא נכונה של תהליכים אלו ידועה במחלות כגון<br />

סכרת והשמנת יתר.‏ ייתכן כי הטעמנים,‏ בתוך ציטוזול תאי המעי,‏ יכולים להשפיע על התהליכים להם<br />

קולטני הטעם אחראים בתאים אלו,‏ ובכך להשפיע על תהליכים פיזיולוגיים כגון רמות סוכר בדם,‏<br />

התכווצויות המעי ותחושת השובע.‏<br />

73

רשימת ספרות<br />

1. Abaffy T, Trubey KR, and Chaudhari N. Adenylyl cyclase expression and<br />

modulation of cAMP in rat taste cells. Am J Physiol Cell Physiol 284: C1420-1428,<br />

2003.<br />

2. Adler E, Hoon MA, Mueller KL, Chandrashekar J, Ryba NJP, and Zuker<br />

CS. A novel family of mammalian taste receptors. Cell 100: 693-702, 2000.<br />

3. Al-Wadei HA, Takahashi T, and Schuller HM. Caffeine stimulates the<br />

proliferation of human lung adenocarcinoma cells and small airway epithelial cells via<br />

activation of PKA, CREB and ERK1/2. Oncol Rep 15: 431-435, 2006.<br />

4. Avenet P, Hofmann F, and Lindemann B. Signalling in taste receptor cells:<br />

cAMP-dependent protein kinase causes depolarization by closure of 44 pS K-<br />

channels. Comp Biochem Physiol A 90: 681-685, 1988.<br />

5. Bachmanov AA, Li X, Reed DR, Ohmen JD, Li S, Chen Z, Tordoff MG,<br />

de Jong PJ, Wu C, West DB, Chatterjee A, Ross DA, and Beauchamp GK.<br />

Positional cloning of the mouse saccharin preference (Sac) locus. Chem Senses 26:<br />

925-933, 2001.<br />

6. Bailey DG, Dresser GK, Leake BF, and Kim RB. Naringin is a major and<br />

selective clinical inhibitor of organic anion-transporting polypeptide 1A2 (OATP1A2)<br />

in grapefruit juice. Clin Pharmacol Ther 81: 495-502, 2007.<br />

7. Barone JJ, and Roberts HR. Caffeine consumption. Food Chem Toxicol 34:<br />

119-129, 1996.<br />

8. Behrens M, Brockhoff A, Kuhn C, Bufe B, Winnig M, and Meyerhof W.<br />

The human taste receptor hTAS2R14 responds to a variety of different bitter<br />

compounds. Biochem Biophys Res Commun 319: 479-485, 2004.<br />

9. Bernhardt SJ, Naim M, Zehavi U, and Lindemann B. Changes in IP3 and<br />

cytosolic Ca2+ in response to sugars and non-sugar sweeteners in transduction of<br />

sweet taste in the rat. J Physiol 490 (Pt 2): 325-336, 1996.<br />

10. Bezencon C, le Coutre J, and Damak S. Taste-signaling proteins are<br />

coexpressed in solitary intestinal epithelial cells. Chem Senses 32: 41-49, 2007.<br />

11. Biaggioni I, Paul S, and Robertson D. A simple liquid-chromatographic<br />

method applied to determine caffeine in plasma and tissues. Clin Chem 34: 2345-<br />

2348, 1988.<br />

12. Bo X, Alavi A, Xiang Z, Oglesby I, Ford A, and Burnstock G. Localization<br />

of ATP-gated P2X2 and P2X3 receptor immunoreactive nerves in rat taste buds.<br />

Neuroreport 10: 1107-1111, 1999.<br />

13. Boguski MS, and McCormick F. Proteins regulating Ras and its relatives.<br />

Nature 366: 643-654, 1993.<br />

14. Bohn LM, Gainetdinov RR, Sotnikova TD, Medvedev IO, Lefkowitz RJ,<br />

Dykstra LA, and Caron MG. Enhanced rewarding properties of morphine, but not<br />

cocaine, in beta(arrestin)-2 knock-out mice. J Neurosci 23: 10265-10273, 2003.<br />

15. Bohn LM, Lefkowitz RJ, Gainetdinov RR, Peppel K, Caron MG, and Lin<br />

FT. Enhanced morphine analgesia in mice lacking beta-arrestin 2. Science 286: 2495-<br />

2498, 1999.<br />

16. Boughter JD, Jr., Pumplin DW, Yu C, Christy RC, and Smith DV.<br />

Differential expression of alpha-gustducin in taste bud populations of the rat and<br />

hamster. J Neurosci 17: 2852-2858, 1997.<br />

74

17. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of<br />

microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal<br />

Biochem 72: 248-254, 1976.<br />

18. Bufe B, Hofmann T, Krautwurst D, Raguse JD, and Meyerhof W. The<br />

human TAS2R16 receptor mediates bitter taste in response to beta-glucopyranosides.<br />

Nat Genet 32: 397-401, 2002.<br />

19. Caicedo A, Kim KN, and Roper SD. Individual mouse taste cells respond to<br />

multiple chemical stimuli. J Physiol 544: 501-509, 2002.<br />

20. Caicedo A, Pereira E, Margolskee RF, and Roper SD. Role of the G-<br />

protein subunit alpha-gustducin in taste cell responses to bitter stimuli. J Neurosci 23:<br />

9947-9952, 2003.<br />

21. Caicedo A, and Roper SD. Taste receptor cells that discriminate between<br />

bitter stimuli. Science 291: 1557-1560, 2001.<br />

22. Castaing M, Brouant P, Loiseau A, Santelli-Rouvier C, Santelli M,<br />

Alibert-Franco S, Mahamoud A, and Barbe J. Membrane permeation by<br />

multidrug-resistance-modulators and non-modulators: effects of hydrophobicity and<br />

electric charge. J Pharm Pharmacol 52: 289-296, 2000.<br />

23. Chandrashekar J, Hoon MA, Ryba NJP, and Zuker CS. The receptors and<br />

cells for mammalian taste. Nature 444: 288-294, 2006.<br />

24. Chandrashekar J, Mueller KL, Hoon MA, Adler E, Feng L, Guo W,<br />

Zuker CS, and Ryba NJP. T2Rs function as bitter taste receptors. Cell 100: 703-<br />

711, 2000.<br />

25. Chaudhari N, Landin AM, and Roper SD. A metabotropic glutamate<br />

receptor variant functions as a taste receptor. Nat Neurosci 3: 113-119, 2000.<br />

26. Cho EY, Cho DI, Park JH, Kurose H, Caron MG, and Kim KM. Roles of<br />

protein kinase C and actin-binding protein 280 in the regulation of intracellular<br />

trafficking of dopamine D3 receptor. Mol Endocrinol 21: 2242-2254, 2007.<br />

27. Chou KH, and Bell LN. Caffeine content of prepackaged national-brand and<br />

private-label carbonated beverages. J Food Sci 72: C337-342, 2007.<br />

28. Clapp TR, Medler KF, Damak S, Margolskee RF, and Kinnamon SC.<br />

Mouse taste cells with G protein-coupled taste receptors lack voltage-gated calcium<br />

channels and SNAP-25. BMC Biol 4: 7, 2006.<br />

29. Cong M, Perry SJ, Lin FT, Fraser ID, Hu LA, Chen W, Pitcher JA, Scott<br />

JD, and Lefkowitz RJ. Regulation of membrane targeting of the G protein-coupled<br />

receptor kinase 2 by protein kinase A and its anchoring protein AKAP79. J Biol Chem<br />

276: 15192-15199, 2001.<br />

30. Conn PJ, and Pin JP. Pharmacology and functions of metabotropic glutamate<br />

receptors. Annu Rev Pharmacol Toxicol 37: 205-237, 1997.<br />

31. Cummings TA, and Kinnamon SC. Apical K+ channels in Necturus taste<br />

cells. Modulation by intracellular factors and taste stimuli. J Gen Physiol 99: 591-613,<br />

1992.<br />

32. Daaka Y, Luttrell LM, and Lefkowitz RJ. Switching of the coupling of the<br />

beta2-adrenergic receptor to different G proteins by protein kinase A. Nature 390: 88-<br />

91, 1997.<br />

33. Dale LB, Bhattacharya M, Anborgh PH, Murdoch B, Bhatia M,<br />

Nakanishi S, and Ferguson SS. G protein-coupled receptor kinase-mediated<br />

desensitization of metabotropic glutamate receptor 1A protects against cell death. J<br />

Biol Chem 275: 38213-38220, 2000.<br />

34. Damak S, Rong M, Yasumatsu K, Kokrashvili Z, Perez CA, Shigemura<br />

N, Yoshida R, Mosinger B, Jr., Glendinning JI, Ninomiya Y, and Margolskee<br />

75

RF. Trpm5 null mice respond to bitter, sweet, and umami compounds. Chem Senses<br />

31: 253-264, 2006.<br />

35. Day PW, Carman CV, Sterne-Marr R, Benovic JL, and Wedegaertner<br />

PB. Differential interaction of GRK2 with members of the G alpha q family.<br />

Biochemistry 42: 9176-9184, 2003.<br />

36. DeFazio RA, Dvoryanchikov G, Maruyama Y, Kim JW, Pereira E, Roper<br />

SD, and Chaudhari N. Separate populations of receptor cells and presynaptic cells in<br />

mouse taste buds. J Neurosci 26: 3971-3980, 2006.<br />

37. DerMardirossian C, Rocklin G, Seo JY, and Bokoch GM. Phosphorylation<br />

of RhoGDI by Src regulates Rho GTPase binding and cytosol-membrane cycling. Mol<br />

Biol Cell 17: 4760-4768, 2006.<br />

38. Deshpande DA, Pascual RM, Wang SW, Eckman DM, Riemer EC, Funk<br />

CD, and Penn RB. PKC-dependent regulation of the receptor locus dominates<br />

functional consequences of cysteinyl leukotriene type 1 receptor activation. Faseb J<br />

21: 2335-2342, 2007.<br />

39. DeSimone JA, Callaham EM, and Heck GL. Chorda tympani taste response<br />

of rat to hydrochloric acid subject to voltage-clamped lingual receptive field. Am J<br />

Physiol 268: C1295-1300, 1995.<br />

40. DeSimone JA, Heck GL, and DeSimone SK. Active ion transport in dog<br />

tongue: a possible role in taste. Science 214: 1039-1041, 1981.<br />

41. Doolin RE, and Gilbertson TA. Distribution and characterization of<br />

functional amiloride-sensitive sodium channels in rat tongue. J Gen Physiol 107: 545-<br />

554, 1996.<br />

42. Dulac C. The physiology of taste, vintage 2000. Cell 100: 607-610, 2000.<br />

43. Elorza A, Sarnago S, and Mayor F, Jr. Agonist-dependent modulation of G<br />

protein-coupled receptor kinase 2 by mitogen-activated protein kinases. Mol<br />

Pharmacol 57: 778-783, 2000.<br />

44. Fan G, Shumay E, Malbon CC, and Wang H. c-Src tyrosine kinase binds<br />

the beta 2-adrenergic receptor via phospho-Tyr-350, phosphorylates G-protein-linked<br />

receptor kinase 2, and mediates agonist-induced receptor desensitization. J Biol Chem<br />

276: 13240-13247, 2001.<br />

45. Finger TE, Danilova V, Barrows J, Bartel DL, Vigers AJ, Stone L,<br />

Hellekant G, and Kinnamon SC. ATP signaling is crucial for communication from<br />

taste buds to gustatory nerves. Science 310: 1495-1499, 2005.<br />

46. Gainetdinov RR, Bohn LM, Sotnikova TD, Cyr M, Laakso A, Macrae<br />

AD, Torres GE, Kim KM, Lefkowitz RJ, Caron MG, and Premont RT.<br />

Dopaminergic supersensitivity in G protein-coupled receptor kinase 6-deficient mice.<br />

Neuron 38: 291-303, 2003.<br />

47. Gainetdinov RR, Bohn LM, Walker JK, Laporte SA, Macrae AD, Caron<br />

MG, Lefkowitz RJ, and Premont RT. Muscarinic supersensitivity and impaired<br />

receptor desensitization in G protein-coupled receptor kinase 5-deficient mice.<br />

Neuron 24: 1029-1036, 1999.<br />

48. Gainetdinov RR, Premont RT, Bohn LM, Lefkowitz RJ, and Caron MG.<br />

Desensitization of G protein-coupled receptors and neuronal functions. Annu Rev<br />

Neurosci 27: 107-144, 2004.<br />

49. Galindo-Cuspinera V, Winnig M, Bufe B, Meyerhof W, and Breslin PA.<br />

A TAS1R receptor-based explanation of sweet 'water-taste'. Nature 441: 354-357,<br />

2006.<br />

76

50. Gates LK, Ulrich CD, and Miller LJ. Multiple kinases phosphorylate the<br />

pancreatic cholecystokinin receptor in an agonist-dependent manner. Am J Physiol<br />

264: G840-847, 1993.<br />

51. Gilbertson TA. The physiology of vertebrate taste reception. Curr Opin<br />

Neurobiol 3: 532-539, 1993.<br />

52. Gilbertson TA, Boughter JD, Jr., Zhang H, and Smith DV. Distribution of<br />

gustatory sensitivities in rat taste cells: whole-cell responses to apical chemical<br />

stimulation. J Neurosci 21: 4931-4941, 2001.<br />

53. Gilbertson TA, Fontenot DT, Liu L, Zhang H, and Monroe WT. Fatty acid<br />

modulation of K+ channels in taste receptor cells: gustatory cues for dietary fat. Am J<br />

Physiol 272: C1203-1210, 1997.<br />

54. Gray JA, Sheffler DJ, Bhatnagar A, Woods JA, Hufeisen SJ, Benovic JL,<br />

and Roth BL. Cell-type specific effects of endocytosis inhibitors on 5-<br />

hydroxytryptamine(2A) receptor desensitization and resensitization reveal an arrestin-<br />

, GRK2-, and GRK5-independent mode of regulation in human embryonic kidney 293<br />

cells. Mol Pharmacol 60: 1020-1030, 2001.<br />

55. Harinath S, and Sikdar SK. Inhibition of human TREK-1 channels by<br />

caffeine and theophylline. Epilepsy Res 64: 127-135, 2005.<br />

56. Harper JF, and Brooker G. Femtomole sensitive radioimmunoassay for<br />

cyclic AMP and cyclic GMP after 2'0 acetylation by acetic anhydride in aqueous<br />

solution. J Cyclic Nucleotide Res 1: 207-218, 1975.<br />

57. He W, Danilova V, Zou S, Hellekant G, Max M, Margolskee RF, and<br />

Damak S. Partial rescue of taste responses of alpha-gustducin null mice by transgenic<br />

expression of alpha-transducin. Chem Senses 27: 719-727, 2002.<br />

58. Heck GL, Mierson S, and DeSimone JA. Salt taste transduction occurs<br />

through an amiloride-sensitive sodium transport pathway. Science 223: 403-405,<br />

1984.<br />

59. Hellekant G, af Segerstad CH, Roberts T, van der Wel H, Brouwer JN,<br />

Glaser D, Haynes R, and Eichberg JW. Effects of gymnemic acid on the chorda<br />

tympani proper nerve responses to sweet, sour, salty and bitter taste stimuli in the<br />

chimpanzee. Acta Physiol Scand 124: 399-408, 1985.<br />

60. Herness S, Zhao FL, Kaya N, Lu SG, Shen T, and Sun XD. Adrenergic<br />

signalling between rat taste receptor cells. J Physiol 543: 601-614, 2002a.<br />

61. Herness S, Zhao FL, Lu SG, Kaya N, and Shen T. Expression and<br />

physiological actions of cholecystokinin in rat taste receptor cells. J Neurosci 22:<br />

10018-10029, 2002b.<br />

62. Hoon MA, Adler E, Lindemeier J, Battey JF, Ryba NJP, and Zuker CS.<br />

Putative mammalian taste receptors: a class of taste-specific GPCRs with distinct<br />

topographic selectivity. Cell 96: 541-551, 1999.<br />

63. Horrigan LA, Kelly JP, and Connor TJ. Caffeine suppresses TNF-alpha<br />

production via activation of the cyclic AMP/protein kinase A pathway. Int<br />

Immunopharmacol 4: 1409-1417, 2004.<br />

64. Howell LL, Coffin VL, and Spealman RD. Behavioral and physiological<br />

effects of xanthines in nonhuman primates. Psychopharmacology (Berl) 129: 1-14,<br />

1997.<br />

65. Huang AL, Chen X, Hoon MA, Chandrashekar J, Guo W, Trankner D,<br />

Ryba NJP, and Zuker CS. The cells and logic for mammalian sour taste detection.<br />

Nature 442: 934-938, 2006.<br />

66. Huang L, Shanker YG, Dubauskaite J, Zheng JZ, Yan W, Rosenzweig S,<br />

Spielman AI, Max M, and Margolskee RF. Ggamma13 colocalizes with gustducin<br />

77

in taste receptor cells and mediates IP3 responses to bitter denatonium. Nat Neurosci<br />

2: 1055-1062, 1999.<br />

67. Huang YJ, Maruyama Y, Lu KS, Pereira E, Plonsky I, Baur JE, Wu D,<br />

and Roper SD. Mouse taste buds use serotonin as a neurotransmitter. J Neurosci 25:<br />

843-847, 2005a.<br />

68. Huang YJ, Maruyama Y, Lu KS, Pereira E, Plonsky I, Baur JE, Wu D,<br />

and Roper SD. Using biosensors to detect the release of serotonin from taste buds<br />

during taste stimulation. Arch Ital Biol 143: 87-96, 2005b.<br />

69. Huang YJ, Maruyama Y, Lu KS, Pereira E, and Roper SD. Mouse taste<br />

buds release serotonin in response to taste stimuli. Chem Senses 30 Suppl 1: i39-i40,<br />

2005c.<br />

70. Jaber M, Koch WJ, Rockman H, Smith B, Bond RA, Sulik KK, Ross J,<br />

Jr., Lefkowitz RJ, Caron MG, and Giros B. Essential role of beta-adrenergic<br />

receptor kinase 1 in cardiac development and function. Proc Natl Acad Sci U S A 93:<br />

12974-12979, 1996.<br />

71. Jakob I, Hauser IA, Thevenod F, and Lindemann B. MDR1 in taste buds<br />

of rat vallate papilla: functional, immunohistochemical, and biochemical evidence.<br />

Am J Physiol 274: C182-191, 1998.<br />

72. Jang HJ, Kokrashvili Z, Theodorakis MJ, Carlson OD, Kim BJ, Zhou J,<br />

Kim HH, Xu X, Chan SL, Juhaszova M, Bernier M, Mosinger B, Margolskee<br />

RF, and Egan JM. Gut-expressed gustducin and taste receptors regulate secretion of<br />

glucagon-like peptide-1. Proc Natl Acad Sci U S A 104: 15069-15074, 2007.<br />

73. Jiang P, Cui M, Zhao B, Liu Z, Snyder LA, Benard LM, Osman R,<br />

Margolskee RF, and Max M. Lactisole interacts with the transmembrane domains of<br />

human T1R3 to inhibit sweet taste. J Biol Chem 280: 15238-15246, 2005a.<br />

74. Jiang P, Cui M, Zhao B, Snyder LA, Benard LM, Osman R, Max M, and<br />

Margolskee RF. Identification of the cyclamate interaction site within the<br />

transmembrane domain of the human sweet taste receptor subunit T1R3. J Biol Chem<br />

280: 34296-34305, 2005b.<br />

75. Jiang P, Ji Q, Liu Z, Snyder LA, Benard LM, Margolskee RF, and Max<br />

M. The cysteine-rich region of T1R3 determines responses to intensely sweet<br />

proteins. J Biol Chem 279: 45068-45075, 2004.<br />

76. Johnson R, Streicher EM, Louw GE, Warren RM, van Helden PD, and<br />

Victor TC. Drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Curr Issues Mol Biol 8:<br />

97-111, 2006.<br />

77. Johnston PV, and Roots BI. Fixation of the central nervous system by<br />

perfusion with aldehydes and its effect on the extracellular space as seen by electron<br />

microscopy. J Cell Sci 2: 377-386, 1967.<br />

78. Karcz-Kubicha M, Antoniou K, Terasmaa A, Quarta D, Solinas M,<br />

Justinova Z, Pezzola A, Reggio R, Muller CE, Fuxe K, Goldberg SR, Popoli P,<br />

and Ferre S. Involvement of adenosine A1 and A2A receptors in the motor effects of<br />

caffeine after its acute and chronic administration. Neuropsychopharmacology 28:<br />

1281-1291, 2003.<br />

79. Kawai M, Okiyama A, and Ueda Y. Taste enhancements between various<br />

amino acids and IMP. Chem Senses 27: 739-745, 2002.<br />

80. Kaya N, Shen T, Lu SG, Zhao FL, and Herness S. A paracrine signaling<br />

role for serotonin in rat taste buds: expression and localization of serotonin receptor<br />

subtypes. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 286: R649-658, 2004.<br />

81. Kim DJ, and Roper SD. Localization of serotonin in taste buds: a<br />

comparative study in four vertebrates. J Comp Neurol 353: 364-370, 1995.<br />

78

82. Kim MR, Kusakabe Y, Miura H, Shindo Y, Ninomiya Y, and Hino A.<br />

Regional expression patterns of taste receptors and gustducin in the mouse tongue.<br />

Biochem Biophys Res Commun 312: 500-506, 2003.<br />

83. King LA. Absorption of caffeine from beverages. Lancet 1: 1313, 1973.<br />

84. Kinnamon SC, Dionne VE, and Beam KG. Apical localization of K+<br />

channels in taste cells provides the basis for sour taste transduction. Proc Natl Acad<br />

Sci U S A 85: 7023-7027, 1988.<br />

85. Kishi M, Emori Y, Tsukamoto Y, and Abe K. Primary culture of rat taste<br />

bud cells that retain molecular markers for taste buds and permit functional expression<br />

of foreign genes. Neuroscience 106: 217-225, 2001.<br />

86. Kitagawa M, Kusakabe Y, Miura H, Ninomiya Y, and Hino A. Molecular<br />

genetic identification of a candidate receptor gene for sweet taste. Biochem Biophys<br />

Res Commun 283: 236-242, 2001.<br />

87. Kobayashi H, Narita Y, Nishida M, and Kurose H. Beta-arrestin2 enhances<br />

beta2-adrenergic receptor-mediated nuclear translocation of ERK. Cell Signal 17:<br />

1248-1253, 2005.<br />

88. Krizhanovsky V, Agamy O, and Naim M. Sucrose-stimulated subsecond<br />

transient increase in cGMP level in rat intact circumvallate taste bud cells. Am J<br />

Physiol Cell Physiol 279: C120-125, 2000.<br />

89. Kuhn C, Bufe B, Winnig M, Hofmann T, Frank O, Behrens M,<br />

Lewtschenko T, Slack JP, Ward CD, and Meyerhof W. Bitter taste receptors for<br />

saccharin and acesulfame K. J Neurosci 24: 10260-10265, 2004.<br />

90. Kumazawa T, and Kurihara K. Large synergism between monosodium<br />

glutamate and 5'-nucleotides in canine taste nerve responses. Am J Physiol 259: R420-<br />

426, 1990.<br />

91. Kumazawa T, Nakamura M, and Kurihara K. Canine taste nerve responses<br />

to umami substances. Physiol Behav 49: 875-881, 1991.<br />

92. Lefkowitz RJ, and Shenoy SK. Transduction of receptor signals by betaarrestins.<br />

Science 308: 512-517, 2005.<br />

93. Lethco EJ, and Wallace WC. The metabolism of saccharin in animals.<br />

Toxicology 3: 287-300, 1975.<br />

94. Li X, Staszewski L, Xu H, Durick K, Zoller M, and Adler E. Human<br />

receptors for sweet and umami taste. Proc Natl Acad Sci U S A 99: 4692-4696, 2002.<br />

95. Lin W, Finger TE, Rossier BC, and Kinnamon SC. Epithelial Na+ channel<br />

subunits in rat taste cells: localization and regulation by aldosterone. J Comp Neurol<br />

405: 406-420, 1999.<br />

96. Lush IE. The genetics of tasting in mice. VI. Saccharin, acesulfame, dulcin<br />

and sucrose. Genet Res 53: 95-99, 1989.<br />

97. Luttrell LM, Ferguson SS, Daaka Y, Miller WE, Maudsley S, Della Rocca<br />

GJ, Lin F, Kawakatsu H, Owada K, Luttrell DK, Caron MG, and Lefkowitz RJ.<br />

Beta-arrestin-dependent formation of beta2 adrenergic receptor-Src protein kinase<br />

complexes. Science 283: 655-661, 1999.<br />

98. Luttrell LM, Hawes BE, van Biesen T, Luttrell DK, Lansing TJ, and<br />

Lefkowitz RJ. Role of c-Src tyrosine kinase in G protein-coupled receptor- and<br />

Gbetagamma subunit-mediated activation of mitogen-activated protein kinases. J Biol<br />

Chem 271: 19443-19450, 1996.<br />

99. Luttrell LM, and Lefkowitz RJ. The role of beta-arrestins in the termination<br />

and transduction of G-protein-coupled receptor signals. J Cell Sci 115: 455-465, 2002.<br />

100. Ma L, and Pei G. Beta-arrestin signaling and regulation of transcription. J<br />

Cell Sci 120: 213-218, 2007.<br />

79

101. Mace OJ, Affleck J, Patel N, and Kellett GL. Sweet taste receptors in rat<br />

small intestine stimulate glucose absorption through apical GLUT2. J Physiol 582:<br />

379-392, 2007.<br />

102. Margolskee RF, Dyer J, Kokrashvili Z, Salmon KS, Ilegems E, Daly K,<br />

Maillet EL, Ninomiya Y, Mosinger B, and Shirazi-Beechey SP. T1R3 and<br />

gustducin in gut sense sugars to regulate expression of Na+-glucose cotransporter 1.<br />

Proc Natl Acad Sci U S A 104: 15075-15080, 2007.<br />

103. Masuho I, Tateyama M, and Saitoh O. Characterization of bitter taste<br />

responses of intestinal STC-1 cells. Chem Senses 30: 281-290, 2005.<br />

104. Matsunami H, Montmayeur JP, and Buck LB. A family of candidate taste<br />

receptors in human and mouse. Nature 404: 601-604, 2000.<br />

105. Matthews HB, Fields M, and Fishbein L. Saccharin: distribution and<br />

excretion of a limited dose in the rat. J Agric Food Chem 21: 916-919, 1973.<br />

106. Max M, Shanker YG, Huang L, Rong M, Liu Z, Campagne F, Weinstein<br />

H, Damak S, and Margolskee RF. Tas1r3, encoding a new candidate taste receptor,<br />

is allelic to the sweet responsiveness locus Sac. Nat Genet 28: 58-63, 2001.<br />

107. McLaughlin SK, McKinnon PJ, and Margolskee RF. Gustducin is a tastecell-specific<br />

G protein closely related to the transducins. Nature 357: 563-569, 1992.<br />

108. Min YD, Choi CH, Bark H, Son HY, Park HH, Lee S, Park JW, Park EK,<br />

Shin HI, and Kim SH. Quercetin inhibits expression of inflammatory cytokines<br />

through attenuation of NF-kappaB and p38 MAPK in HMC-1 human mast cell line.<br />

Inflamm Res 56: 210-215, 2007.<br />

109. Misaka T, Kusakabe Y, Emori Y, Arai S, and Abe K. Molecular cloning<br />

and taste bud-specific expression of a novel cyclic nucleotide-gated channel. Ann N Y<br />

Acad Sci 855: 150-159, 1998.<br />

110. Montmayeur JP, Liberles SD, Matsunami H, and Buck LB. A candidate<br />

taste receptor gene near a sweet taste locus. Nat Neurosci 4: 492-498, 2001.<br />

111. Montmayeur JP, and Matsunami H. Receptors for bitter and sweet taste.<br />

Curr Opin Neurobiol 12: 366-371, 2002.<br />

112. Moore CA, Milano SK, and Benovic JL. Regulation of receptor trafficking<br />

by GRKs and arrestins. Annu Rev Physiol 69: 451-482, 2007.<br />

113. Mori K, Nagao H, and Yoshihara Y. The olfactory bulb: coding and<br />

processing of odor molecule information. Science 286: 711-715, 1999.<br />

114. Mueller KL, Hoon MA, Erlenbach I, Chandrashekar J, Zuker CS, and<br />

Ryba NJP. The receptors and coding logic for bitter taste. Nature 434: 225-229,<br />

2005.<br />

115. Naim M, Ronen T, Striem BJ, Levinson M, and Zehavi U. Adenylate<br />

cyclase responses to sucrose stimulation in membranes of pig circumvallate taste<br />

papillae. Comp Biochem Physiol B 100: 455-458, 1991.<br />

116. Naim M, Seifert R, Nurnberg B, Grunbaum L, and Schultz G. Some taste<br />

substances are direct activators of G-proteins. Biochem J 297 ( Pt 3): 451-454, 1994.<br />

117. Naim M, Shaul ME, Spielman AI, Huang L, and Peri I. Permeation of<br />

amphipathic sweeteners into taste-bud cells and their interactions with post-receptor<br />

signaling components: possible implications for sweet-taste quality. In: Sweetness and<br />

Sweeteners: Biology, Chemistry and Psychophysics, edited by Weerasinghe DK, and<br />

DuBois GE. Washington, DC: American Chemical Society, 2007, p. In press.<br />

118. Nelson G, Chandrashekar J, Hoon MA, Feng L, Zhao G, Ryba NJP, and<br />

Zuker CS. An amino-acid taste receptor. Nature 416: 199-202, 2002.<br />

119. Nelson G, Hoon MA, Chandrashekar J, Zhang Y, Ryba NJP, and Zuker<br />

CS. Mammalian sweet taste receptors. Cell 106: 381-390, 2001.<br />

80

120. Nilkaeo A, Bhuvanath S, Praputbut S, and Wisessombat S. Induction of<br />

cell cycle arrest and apoptosis in JAR trophoblast by antimalarial drugs. Biomed Res<br />

27: 131-137, 2006.<br />

121. Ninomiya Y, Mizukoshi T, Nishikawa T, and Funakoshi M. Ion specificity<br />

of rat chorda tympani fibers to chemical and electrical tongue stimulations. Brain Res<br />

404: 350-354, 1987.<br />

122. Ogura T. Acetylcholine increases intracellular Ca2+ in taste cells via<br />

activation of muscarinic receptors. J Neurophysiol 87: 2643-2649, 2002.<br />

123. Okamoto T, Murayama Y, Hayashi Y, Inagaki M, Ogata E, and<br />

Nishimoto I. Identification of a Gs activator region of the beta 2-adrenergic receptor<br />

that is autoregulated via protein kinase A-dependent phosphorylation. Cell 67: 723-<br />

730, 1991.<br />

124. Oliet SH, and Bourque CW. Steady-state osmotic modulation of cationic<br />

conductance in neurons of rat supraoptic nucleus. Am J Physiol 265: R1475-1479,<br />

1993.<br />

125. Ozben T. Mechanisms and strategies to overcome multiple drug resistance in<br />

cancer. FEBS Lett 580: 2903-2909, 2006.<br />

126. Ozdener H, Yee KK, Cao J, Brand JG, Teeter JH, and Rawson NE.<br />

Characterization and long-term maintenance of rat taste cells in culture. Chem Senses<br />

31: 279-290, 2006.<br />

127. Ozeck M, Brust P, Xu H, and Servant G. Receptors for bitter, sweet and<br />

umami taste couple to inhibitory G protein signaling pathways. Eur J Pharmacol 489:<br />

139-149, 2004.<br />

128. Penn RB, Pronin AN, and Benovic JL. Regulation of G protein-coupled<br />

receptor kinases. Trends Cardiovasc Med 10: 81-89, 2000.<br />

129. Pérez-Ruiz T, Martínez-Lozano C, Tomás1 V, Sanz A, and Bravo E.<br />

Quantitative assay for neohesperidin dihydrochalcone in foodstuffs by capillary<br />

electrophoresis. Chromatographia 51: 385-389, 2000.<br />

130. Perez-Tomas R. Multidrug resistance: retrospect and prospects in anti-cancer<br />

drug treatment. Curr Med Chem 13: 1859-1876, 2006.<br />

131. Perez CA, Huang L, Rong M, Kozak JA, Preuss AK, Zhang H, Max M,<br />

and Margolskee RF. A transient receptor potential channel expressed in taste<br />

receptor cells. Nat Neurosci 5: 1169-1176, 2002.<br />

132. Peri I, Mamrud-Brains H, Rodin S, Krizhanovsky V, Shai Y, Nir S, and<br />

Naim M. Rapid entry of bitter and sweet tastants into liposomes and taste cells:<br />

implications for signal transduction. Am J Physiol Cell Physiol 278: C17-25, 2000.<br />

133. Porcar I, Codoner A, Gomez CM, Abad C, and Campos A. Interaction of<br />

quinine with model lipid membranes of different compositions. J Pharm Sci 92: 45-<br />

57, 2003.<br />

134. Prawitt D, Monteilh-Zoller MK, Brixel L, Spangenberg C, Zabel B, Fleig<br />

A, and Penner R. TRPM5 is a transient Ca2+-activated cation channel responding to<br />

rapid changes in [Ca2+]i. Proc Natl Acad Sci U S A 100: 15166-15171, 2003.<br />

135. Premont RT, and Gainetdinov RR. Physiological roles of G protein-coupled<br />

receptor kinases and arrestins. Annu Rev Physiol 69: 511-534, 2007.<br />

136. Premont RT, Koch WJ, Inglese J, and Lefkowitz RJ. Identification,<br />

purification, and characterization of GRK5, a member of the family of G proteincoupled<br />

receptor kinases. J Biol Chem 269: 6832-6841, 1994.<br />

137. Pronin AN, Tang H, Connor J, and Keung W. Identification of ligands for<br />

two human bitter T2R receptors. Chem Senses 29: 583-593, 2004.<br />

81

138. Quarta D, Ferre S, Solinas M, You ZB, Hockemeyer J, Popoli P, and<br />

Goldberg SR. Opposite modulatory roles for adenosine A1 and A2A receptors on<br />

glutamate and dopamine release in the shell of the nucleus accumbens. Effects of<br />

chronic caffeine exposure. J Neurochem 88: 1151-1158, 2004.<br />

139. Ravi D, Muniyappa H, and Das KC. Caffeine inhibits UV-mediated NFkappaB<br />

activation in A2058 melanoma cells: an ATM-PKCdelta-p38 MAPKdependent<br />

mechanism. Mol Cell Biochem 2007.<br />

140. Ribas C, Penela P, Murga C, Salcedo A, Garcia-Hoz C, Jurado-Pueyo M,<br />

Aymerich I, and Mayor F, Jr. The G protein-coupled receptor kinase (GRK)<br />

interactome: role of GRKs in GPCR regulation and signaling. Biochim Biophys Acta<br />

1768: 913-922, 2007.<br />

141. Richter TA, Caicedo A, and Roper SD. Sour taste stimuli evoke Ca2+ and<br />

pH responses in mouse taste cells. J Physiol 547: 475-483, 2003.<br />

142. Rinner O, Makhankov YV, Biehlmaier O, and Neuhauss SC. Knockdown<br />

of cone-specific kinase GRK7 in larval zebrafish leads to impaired cone response<br />

recovery and delayed dark adaptation. Neuron 47: 231-242, 2005.<br />

143. Roper SD. Cell communication in taste buds. Cell Mol Life Sci 63: 1494-<br />

1500, 2006.<br />

144. Rosenzweig S, Yan W, Dasso M, and Spielman AI. Possible novel<br />

mechanism for bitter taste mediated through cGMP. J Neurophysiol 81: 1661-1665,<br />

1999.<br />

145. Rossler P, Boekhoff I, Tareilus E, Beck S, Breer H, and Freitag J. G<br />

protein betagamma complexes in circumvallate taste cells involved in bitter<br />

transduction. Chem Senses 25: 413-421, 2000.<br />

146. Rossler P, Kroner C, Freitag J, Noe J, and Breer H. Identification of a<br />

phospholipase C beta subtype in rat taste cells. Eur J Cell Biol 77: 253-261, 1998.<br />

147. Ruiz-Avila L, McLaughlin SK, Wildman D, McKinnon PJ, Robichon A,<br />

Spickofsky N, and Margolskee RF. Coupling of bitter receptor to phosphodiesterase<br />

through transducin in taste receptor cells. Nature 376: 80-85, 1995.<br />

148. Sahir N, Mas C, Bourgeois F, Simonneau M, Evrard P, and Gressens P.<br />

Caffeine-induced telencephalic vesicle evagination in early post-implantation mouse<br />

embryos involves cAMP-dependent protein kinase (PKA) inhibition. Cereb Cortex<br />

11: 343-349, 2001.<br />

149. Sainz E, Cavenagh MM, Gutierrez J, Battey JF, Northup JK, and<br />

Sullivan SL. Functional characterization of human bitter taste receptors. Biochem J<br />

403: 537-543, 2007.<br />

150. Saito Y, Tetsuka M, Li Y, Kurose H, and Maruyama K. Properties of rat<br />

melanin-concentrating hormone receptor 1 internalization. Peptides 25: 1597-1604,<br />

2004.<br />

151. Sarnago S, Elorza A, and Mayor F, Jr. Agonist-dependent phosphorylation<br />

of the G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) by Src tyrosine kinase. J Biol<br />

Chem 274: 34411-34416, 1999.<br />

152. Sato T, and Beidler LM. Broad tuning of rat taste cells for four basic taste<br />

stimuli. Chem Senses 22: 287-293, 1997.<br />

153. Seibold A, Williams B, Huang ZF, Friedman J, Moore RH, Knoll BJ, and<br />

Clark RB. Localization of the sites mediating desensitization of the beta(2)-<br />

adrenergic receptor by the GRK pathway. Mol Pharmacol 58: 1162-1173, 2000.<br />

154. Shaul YD, and Seger R. ERK1c regulates Golgi fragmentation during<br />

mitosis. J Cell Biol 172: 885-897, 2006.<br />

82

155. Shenoy SK, Drake MT, Nelson CD, Houtz DA, Xiao K, Madabushi S,<br />

Reiter E, Premont RT, Lichtarge O, and Lefkowitz RJ. beta-arrestin-dependent, G<br />

protein-independent ERK1/2 activation by the beta2 adrenergic receptor. J Biol Chem<br />

281: 1261-1273, 2006.<br />

156. Shim CK, Cheon EP, Kang KW, Seo KS, and Han HK. Inhibition effect of<br />

flavonoids on monocarboxylate transporter 1 (MCT1) in Caco-2 cells. J Pharm<br />

Pharmacol 59: 1515-1519, 2007.<br />

157. Simon SA, Holland VF, Benos DJ, and Zampighi GA. Transcellular and<br />

paracellular pathways in lingual epithelia and their influence in taste transduction.<br />

Microsc Res Tech 26: 196-208, 1993.<br />

158. Soares NFF, and Hotchkiss JH. Bitterness reduction in grapefruit juice<br />

through active packaging. Packaging Technol Sci 11: 9-18, 1998.<br />

159. Spielman AI, Mody I, Brand JG, Whitney G, MacDonald JF, and Salter<br />

MW. A method for isolating and patch-clamping single mammalian taste receptor<br />

cells. Brain Res 503: 326-329, 1989.<br />

160. Spielman AI, Nagai H, Sunavala G, Dasso M, Breer H, Boekhoff I, Huque<br />

T, Whitney G, and Brand JG. Rapid kinetics of second messenger production in<br />

bitter taste. Am J Physiol 270: C926-931, 1996.<br />

161. Stevens DR, Seifert R, Bufe B, Muller F, Kremmer E, Gauss R, Meyerhof<br />

W, Kaupp UB, and Lindemann B. Hyperpolarization-activated channels HCN1 and<br />

HCN4 mediate responses to sour stimuli. Nature 413: 631-635, 2001.<br />

162. Stewart RE, DeSimone JA, and Hill DL. New perspectives in a gustatory<br />

physiology: transduction, development, and plasticity. Am J Physiol 272: C1-26,<br />

1997.<br />

163. Striem BJ, Naim M, and Lindemann B. Generation of cyclic AMP in taste<br />

buds of the rat circumvallate papilla in response to sucrose. Cell Physiol Biochem 1:<br />

46-54, 1991.<br />

164. Striem BJ, Pace U, Zehavi U, Naim M, and Lancet D. Sweet tastants<br />

stimulate adenylate cyclase coupled to GTP-binding protein in rat tongue membranes.<br />

Biochem J 260: 121-126, 1989.<br />

165. Takara K, Obata Y, Yoshikawa E, Kitada N, Sakaeda T, Ohnishi N, and<br />

Yokoyama T. Molecular changes to HeLa cells on continuous exposure to cisplatin<br />

or paclitaxel. Cancer Chemother Pharmacol 58: 785-793, 2006.<br />

166. Thompson AJ, Lochner M, and Lummis SC. The antimalarial drugs<br />

quinine, chloroquine and mefloquine are antagonists at 5-HT3 receptors. Br J<br />

Pharmacol 151: 666-677, 2007.<br />

167. Torii K, and Cagan RH. Biochemical studies of taste sensation. IX.<br />

Enhancement of L-[3H]glutamate binding to bovine taste papillae by 5'-<br />

ribonucleotides. Biochim Biophys Acta 627: 313-323, 1980.<br />

168. Tran TM, Friedman J, Qunaibi E, Baameur F, Moore RH, and Clark RB.<br />

Characterization of agonist stimulation of cAMP-dependent protein kinase and G<br />

protein-coupled receptor kinase phosphorylation of the beta2-adrenergic receptor<br />

using phosphoserine-specific antibodies. Mol Pharmacol 65: 196-206, 2004.<br />

169. Trubey KR, Culpepper S, Maruyama Y, Kinnamon SC, and Chaudhari<br />

N. Tastants evoke cAMP signal in taste buds that is independent of calcium signaling.<br />

Am J Physiol Cell Physiol 291: C237-244, 2006.<br />

170. Tsunenari T, Hayashi Y, Orita M, Kurahashi T, Kaneko A, and Mori T.<br />

A quinine-activated cationic conductance in vertebrate taste receptor cells. J Gen<br />

Physiol 108: 515-523, 1996.<br />

83

171. Ugawa S, Minami Y, Guo W, Saishin Y, Takatsuji K, Yamamoto T,<br />

Tohyama M, and Shimada S. Receptor that leaves a sour taste in the mouth. Nature<br />

395: 555-556, 1998.<br />

172. Valenti LP. Liquid chromatographic determination of quinine, hydroquinine,<br />

saccharin, and sodium benzoate in quinine beverages. J Assoc Off Anal Chem 68:<br />

782-784, 1985.<br />

173. Varkevisser B, and Kinnamon SC. Sweet taste transduction in hamster: role<br />

of protein kinases. J Neurophysiol 83: 2526-2532, 2000.<br />

174. Vaughan DJ, Millman EE, Godines V, Friedman J, Tran TM, Dai W,<br />

Knoll BJ, Clark RB, and Moore RH. Role of the G protein-coupled receptor kinase<br />

site serine cluster in beta2-adrenergic receptor internalization, desensitization, and<br />

beta-arrestin translocation. J Biol Chem 281: 7684-7692, 2006.<br />

175. Violin JD, Ren XR, and Lefkowitz RJ. G-protein-coupled receptor kinase<br />

specificity for beta-arrestin recruitment to the beta2-adrenergic receptor revealed by<br />

fluorescence resonance energy transfer. J Biol Chem 281: 20577-20588, 2006.<br />

176. Wong GT, Gannon KS, and Margolskee RF. Transduction of bitter and<br />

sweet taste by gustducin. Nature 381: 796-800, 1996.<br />

177. Wright DC, Hucker KA, Holloszy JO, and Han DH. Ca2+ and AMPK both<br />

mediate stimulation of glucose transport by muscle contractions. Diabetes 53: 330-<br />

335, 2004.<br />

178. Xu H, Staszewski L, Tang H, Adler E, Zoller M, and Li X. Different<br />

functional roles of T1R subunits in the heteromeric taste receptors. Proc Natl Acad<br />

Sci U S A 101: 14258-14263, 2004.<br />

179. Yan W, Sunavala G, Rosenzweig S, Dasso M, Brand JG, and Spielman<br />

AI. Bitter taste transduced by PLC-beta(2)-dependent rise in IP(3) and alphagustducin-dependent<br />

fall in cyclic nucleotides. Am J Physiol Cell Physiol 280: C742-<br />

751, 2001.<br />

180. Yang R, Crowley HH, Rock ME, and Kinnamon JC. Taste cells with<br />

synapses in rat circumvallate papillae display SNAP-25-like immunoreactivity. J<br />

Comp Neurol 424: 205-215, 2000.<br />

181. Ye Q, Heck GL, and DeSimone JA. Voltage dependence of the rat chorda<br />

tympani response to Na+ salts: implications for the functional organization of taste<br />

receptor cells. J Neurophysiol 70: 167-178, 1993.<br />

182. Zamah AM, Delahunty M, Luttrell LM, and Lefkowitz RJ. Protein kinase<br />

A-mediated phosphorylation of the beta 2-adrenergic receptor regulates its coupling to<br />

Gs and Gi. Demonstration in a reconstituted system. J Biol Chem 277: 31249-31256,<br />

2002.<br />

183. Zhang Y, Hoon MA, Chandrashekar J, Mueller KL, Cook B, Wu D,<br />

Zuker CS, and Ryba NJP. Coding of sweet, bitter, and umami tastes: different<br />

receptor cells sharing similar signaling pathways. Cell 112: 293-301, 2003.<br />

184. Zhou Q, McCracken MA, and Strobl JS. Control of mammary tumor cell<br />

growth in vitro by novel cell differentiation and apoptosis agents. Breast Cancer Res<br />

Treat 75: 107-117, 2002.<br />

185. Zubare-Samuelov M, Peri I, Tal M, Tarshish M, Spielman AI, and Naim<br />

M. Some sweet and bitter tastants stimulate inhibitory pathway of adenylyl cyclase<br />

via melatonin and alpha 2-adrenergic receptors in Xenopus laevis melanophores. Am J<br />

Physiol Cell Physiol 285: C1255-1262, 2003.<br />

186. Zubare-Samuelov M, Shaul ME, Peri I, Aliluiko A, Tirosh O, and Naim<br />

M. Inhibition of signal termination-related kinases by membrane-permeant bitter and<br />

84

sweet tastants: potential role in taste signal termination. Am J Physiol Cell Physiol<br />

289: C483-492, 2005.<br />

85

רשימת פרסומים ותקצירים<br />

1. Zubare-Samuelov M, Shaul ME, Peri I, Aliluiko A, Tirosh O, Naim M (2005).<br />

Inhibition of signal termination-related kinases by membrane-permeant bitter and<br />

sweet tastants: potential role in taste signal termination. Am J Physiol Cell Physiol<br />

289: C483-492.<br />

2. Naim M, Shaul ME, Spielman AI, Huang L, Peri I (2007). Permeation of<br />

amphipathic sweeteners into taste-bud cells and their interactions with post-receptor<br />

signaling components: possible implications for sweet-taste quality. In: Sweetness and<br />

Sweeteners: Biology, Chemistry and Psychophysics; ACS Symposium Series 979;<br />

Weerasinghe, D.K. and DuBois, G.E. Eds; American Chemical Society, Washington<br />

DC. In press.<br />

3. Naim M, Huang L, Spielman AI, Shaul ME, Aliluiko A (2006). Stimulation of<br />

taste cells by sweet taste compounds: receptors, downstream signal transduction<br />

components, and the implications to sweet taste quality. In: Optimizing Sweet Taste in<br />

Food, Spillane, W. Ed., Woodhead Publishing, Ltd. Cambridge, UK.<br />

4. Shaul ME, Peri I, Malach E, Huang L, Spielman AI, Seger R, Naim M (2008).<br />

Intracellular inhibition by some sweet and bitter tastants of β 2 -adrenergic receptor<br />

(β 2 AR) desensitization. Keystone Symposia, Alberta, Canada. Abstract.<br />

5. Naim M, Zubare-Samuelov M, Peri I, Shaul ME (2004). Amphipathic sweet and<br />

bitter tastants are inhibitors of G-protein-coupled receptor kinases (GRKs) in vitro:<br />

possible implication for delayed taste termination. FASEB J, 18(4): A313. Abstract.<br />

6. Naim M, Zubare-Samuelov M, Peri I, Shaul ME, Aliluiko A (2004). Amphipathic<br />

sweet and bitter tastants permeate cells in vivo and are inhibitors of G-protein-coupled<br />

receptor kinases (GRKs) in vitro: possible implication for delayed taste termination.<br />

ECRO, Dijon, France. Abstract.<br />

7. Shaul ME, Rodin S, Tarshish M, Nir S, Naim M (2003). Active and passive<br />

transport of sweet and bitter amphipathic tastants into taste cells. The Annual Meeting<br />

2003 ISBMB (The Isreali Society for Biochemistry and Molecular Biology), Tel-Aviv<br />

University, Tel-Aviv April 2003. Abstract.<br />

86

logo

products

Resources

Company

Terms of service
Privacy policy
Cookie policy
Cookie settings
Imprint
Change language
Made with love in Switzerland
© 2024 Yumpu.com all rights reserved

Hooray! Your file is uploaded and ready to be published.

Saved successfully!

Ooh no, something went wrong!