OPA IgG Blot - Milenia Biotec GmbH

OPA IgG Blot 

Dot Blot for the qualitative detection of 

onconeural/paraneoplastic amphiphysine I, Yo, Ri, HuD, 

Ma-1, Ta and recoverine specific IgG autoantibodies 

English: Page 1-8 

Dot-Blot zum qualitativen Nachweis von 

onkoneuralen/paraneoplastischen Amphiphysin I, Yo, Ri, HuD, 

Ma-1, Ta und Recoverin spezifischen IgG Autoantikörpern 

Deutsch: Seite 14 

Dot Blot pour la détection qualitative des auto-anticorps (IgG) 

anti-onconeuronaux/paranéoplastiques amphiphysine I, Yo, Ri, 

HuD, Ma-1, Ta et recoverine 

Français : Page 15-21 

REF: 

MKOPA 1 (Z) 

24 (8) 

Manufacturer: Privates Institut für Immunologie 

Hersteller: 

und Molekulargenetik GmbH 

Fabricant: Kriegsstraße 99 

D-76133 Karlsruhe, Germany 

Telefon: +49 (721) 85 000 – 0 

Telefax: +49 (721) 85 000 115 

http://www.laborseelig.de 

Distribution/Service: Milenia Biotec GmbH 

Vertrieb/Service: Versailler Str. 1 

Distribution/Service: 35394 Gießen, Germany 

Telefon: +49 (641) 948883 – 0 

Telefax: +49 (641) 948883 – 80 

E-mail: info@milenia-biotec.de 

http://www.milenia-biotec.de 

MKOPA / A / 2010-02-18

- 2 - 

Explanation of Symbols 

Symbols (GB) / Symbole (D) / Symboles (F) 

REF 

Explanation / Erklärung / Signification 

Expiry date 

Haltbarkeitsdatum 

Date de péremption 

In Vitro Diagnostic Medical Device 

In Vitro Diagnostikum 

Diagnostic in vitro 

Batch code 

Los-Bezeichnung 

Lote 

Catalogue number 

Artikel-Nummer 

Référence 

Storage conditions 

Lagerungsbedingungen 

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Nombre de tests par trousse 

Manufacturer 

Hersteller 

Fabriqué par 

Only for evaluation purposes 

Nur zur Leistungsbewertung 

Pour évaluation uniquement 

OPA IgG Blot (MKOPA)

- 3 - 

Materials Supplied, Storage and Stability 

Components Cat.-No. Content Preparation Store at Shelf life 

OPA Dotblot Strips, 

nitrocellulose strips coated 

with recombinant 

onconeural/paraneoplastic 

antigens Amphiphysin I, Yo, 

Ri, HuD, Ma-1, Ta and 

Recoverine 

OPA Control Sera, 

negative control 

positive control 

OPA Enzyme Conjugate, 

polyclonal (goat) anti-hu-IgG 

antibodies, labeled with 

alkaline phosphatase 

OPA Buffered Wash 

Solution, Concentrate (5x) 

Substrate Solution, 

contains 5-Brom-4-chloro-3- 

indolyl phosphate and 4-Nitrobluetetrazoliumchloride 

MOPADS 24 (8) ready to use 2 - 8 °C 

Protect from 

moisture! 

Store together 

with desiccant 

in the tube! 

Do not touch 

with fingers! 

MOPAC1/2 1 set 

2 vials à 

100 (30) 

µL 

MEOPA 2 (1) 

vial(s) 

à 15 mL 

MWBOPA 

1 vial 

50 mL 

MSOPA 2 (1) 

vial(s) 

à 15 mL 

Disposable incubation trays MOPAP 3 (1) 

Evaluation Sheet OPAA 1 (1) 

see expiry 

date 

ready to use 2 – 8 °C see expiry 

date 

ready to use 2 - 8 °C see expiry 

date 

Dilute before 

use: e.g. add to 

10 mL 5 x wash 

buffer to 40 mL 

dest. water 

ready to use 2 - 8 °C 

Protect from 

light! 

2 - 8 °C 30 days after 

opening, 5 

days after 

dilution 

Material Safety Data Sheets are available on request (see also www.milenia-biotec.de). 

30 days after 

opening, resp. 

until the 

expiry date 

Materials Required 

• horizontal Shaker 

• vortex mixer 

• destilled water 

• graduated cylinder for 250 mL; storage flasks for the wash buffer 

• pipettes for 10, 50 and 1000 µL 

• reaction tubes for predilution of the samples 

• optional: Westernblot Processor 


- 4 - 

Specimen Collection and Preparation 

Serum, plasma (EDTA, citrated, heparinized) and cerebrospinal fluid (CSF) can be used as sample 

materials. All serum/plasma samples and controls provided with the kit should be diluted 1:100 with 

wash buffer; e.g. 10 µL sample is mixed with 990 µL wash buffer, in order to give final dilution of 

1:100. 

During transportation, patient samples may be stored at room temperature for up to 24 hours. For 

short term storage the samples can be stored at 2-8 °C for up to 5 days. For long term storage the 

samples should be dispensed and stored frozen at < -18°C. Avoid repeated freeze-thaw cycles. 

Warnings and Precautions 

All reagents of this test kit are strictly intended for in vitro diagnostic use only. This test should be 

carried out only by persons who are familiar in performing in vitro diagnostic procedures. Please follow 

strictly the sequence of pipetting steps provided in this protocol. 

All control samples included in the kit are tested for HCV, HIV1,2 and HbS antigen by a CE marked kit 

and found to be negative. However a 100% garantee to be negative can not be given. Therefore all 

control samples and all patient samples should be handled as potentially infectious in a laminar flow 

clean bench. 

Method and Test Principle 

The OPA IgG Blot is an immunoassay in a dot blot format for the qualitative detection of human IgG 

autoantibodies against the onconeuronal/paraneoplastic antigens amphiphysine I, Yo, Ri, HuD, Ma-1, 

Ta and recoverine. Human recombinant proteins amphiphysine I, Yo, Ri, HuD, Ma-1, Ta and 

recoverine are immobilized on fixed locations of a nitrocellulose membrane; in addition anti-human 

IgG antibodies are immobilized as functional control. 

The ready to use sample is pipetted to the prewetted antigen coated carrier membrane. During the 

first incubation period the autoantibodies present in the patient’s samples will bind according to their 

antigen specificity. In the following step unbound serum components are washed away. Bound 

immune complexes are labelled with alkaline phosphatase conjugated anti-human IgG during the next 

incubation period. Surplus of conjugate is removed by washing the strips. Finally, immunocomplexes 

are visualized by the addition of the colorless enzym substrate BCIP/NBT which forms a blue 

precipitate line. Type of antibodies in the sample are then identified by comparing their position with 

the reference bands on the evaluation sheet. 


- 5 - 

Test Performance 

Important notes: 

• Do not interchange components of different lots and assays. 

• Do not use kit components beyond their expiration dates. 

• All components should be prewarmed at room temperature (18 – 28 °C) before use. 

• Dilute concentrates at least 30 minutes prior to use. Mix well, but prevent foam formation. 

• To avoid carryover contamination carefully aspirate fluids; take particularly care on patient sample 

containing fluids! 

1. Using tweezers, place the required number 

of strips in the incubation tray (labeling 

must face up). 

2. Overlay the strips with 990 µl wash buffer 

(500 µl for CSF) and incubate for 5 

minutes at room temperature (18-28 °C) on 

a shaker. Do not aspirate; wash buffer 

remains in the reservoirs ! 

3. Add 10 µl patient serum/plasma (undiluted) 

and controls (undiluted) or 500 µl 

cerebrospinal fluid (undiluted). 

Incubate for 90 minutes on shaker. 

4. Aspirate and wash the strips with 1000 µL wash buffer. Do it by carefully mixing and aspiration. 

5. Add 1000 µL of wash buffer and shake for 5 minutes. Aspirate the wash buffer. Repeat this 

step once. 

6. Pipet 1000 µL Enzyme Conjugate solution and incubate for 60 minutes on a shaker. 

7. Aspirate and wash the strips with 1000 µL wash buffer. Do it by carefully mixing and aspiration. 

8. Add 1000 µL of wash buffer and shake for 5 minutes. Aspirate fluid. Repeat this step once. 

9. Pipet 1000 µL of Substrate Solution and incubate 5-15 minutes on a shaker. Control the color 

development after 5 minutes. The functional control should be a clearly visible band on all 

strips. Especially the positive control should show eight clearly visible bands. 

10. Aspirate Substrate Solution and wash twice with 1000 µL of distilled water. 

11. Remove the strips from their reservoir using tweezers. Airdry on adsorbent paper for about 30 

minutes. 

12. Interpret the band pattern according the evaluation sheet provided with the kit. 


- 6 - 

Interpretation of Results 

After complete drying, the strips will be placed according their functional control on the evaluation 

sheet (see interpretation sample) with the numbers on top and the ends of the strips fixed with 

adhesive film. The position of the antigen bands may slightly vary from lot to lot, but they always lay 

within the indicated marks of the evaluation sheet. The blue color of the antigen bands will fade, if the 

dry strips are exposed to air and light for a longer time. 

M: marker for position of antigens. 

1. negative control 

2. positive control 

3 - 8. example of patient sera. 

Antigen M 1 2 3 4 5 6 7 8 

Amphiphysine I 

Yo 

Ri 

HuD 

Ma 

Ta 

Recoverine 

Functional Control 

Test results are interpreted by comparing locations and color intensities of the bands with those of the 

control supplied with the kit. 

Positive Result Negative Result Borderline 

only samples with a stronger or similar no bands or very weak lower intensities than that of 

color intensity as the signal obtained with bands are interpreted as the positive control but more 

the positive control from the kit are clearly negative 

intensive than that of the 

positive 

negative control are 

borderline 

In principle, the results of this immuno dot blot should be interpreted for diagnosis only in context with 

the patient´s clinical state of health and other diagnostic and epidemiologic data. 


- 7 - 

Quality Control 

The functional control on each strip (internal reaction control) has to display an intensive color. The 

negative control must show only the functional control band; in very rare cases very faint bands can be 

seen, which have no importance. 

The positive control must always show an intensive staining of the seven antigens (amphiphysine I, 

Yo, Ri, HuD, Ma-1, Ta and recoverine) and the functional control; if not, the test has to be repeated. 

Assay Characteristics 

Sample material: 

Time for test procedure: 

Specificity: 

serum, plasma, cerebrospinal fluid 

3.5 hours 

by probing 100 healthy blood donors none tested serum was found to be 

positive. 


- 8 - 

Short Instruction: OPA IgG Blot 

(all sample volumes are given in µL) 

Steps Solution Sample Controls: 

negative/positive 

Pipet to the strips Wash Buffer 990 µl 

Incubate for 5 min at room temperature 

(18-28 °C) on a shaker; do not aspirate 

the solution! 

Add 

control 

(undiluted) 

(500 µl 

for CSF) 

990 µl 

- 10 µl 

Add 

sample 

(undiluted) 

10 µl - 

or add CSF(undiluted) 500 µl - 

Incubate for 90 min at RT on a shaker 

Aspirate; wash the strips with 1000 µl 

wash buffer by mixing gently and aspirate 

again 

Add 1000 µl of wash buffer to each strip 

and incubate for 5 min at RT on a shaker; 

aspirate 

Repeat this step once 

Add 

Incubate for 60 min at RT on a shaker 

Aspirate; wash the strips with 1000 µl 

wash buffer by mixing gently and aspirate 

again 

Add 1000 µl of wash buffer to each strip 

and incubate for 5 min at RT on a shaker; 

aspirate 

Repeat this step once 

Add 

Incubate for 5 – 15 min at RT on a shaker 

Decant and wash the strips twice with 

1000 µl destilled water 

Remove the strips with tweezers and airdry 

on adsorbent paper for about 30 min 

Analyze the band pattern using the 

evaluation sheet 

Enzyme 

Conjugate 

Substrate 

Solution 

1000 µl 1000 µl 

1000 µl 1000 µl 

For a detailed description of the procedure see also page 5. 


- 9 - 


Dot Blot for the qualitative detection of onconeural/ 

paraneoplastic amphiphysine I, Yo, Ri, HuD, Ma-1, Ta and 

recoverine specific IgG autoantibodies 


Dot-Blot zum qualitativen Nachweis von onkoneuralen/ 

paraneoplastischen Amphiphysin I, Yo, Ri, HuD, Ma-1, Ta 

und Recoverin spezifischen IgG Autoantikörpern 

Deutsch: Seite 14 

Dot Blot pour la détection qualitative des auto-anticorps (IgG) 

anti-onconeuronaux/paranéoplastiques amphiphysine I, Yo, Ri, 

HuD, Ma-1, Ta et recoverine 


REF: 


24 (8) 


Hersteller: 




Telefon: +49 (721) 85 000 – 0 

Telefax: +49 (721) 85 000 115 





Telefon: +49 (641) 948883 – 0 

Telefax: +49 (641) 948883 – 80 




- 10 - 

Kitbestandteile, Lagerung und Stabilität 

Komponente Art.-Nr. Inhalt Vorbereitung Lagerung bei Haltbarkeit 

OPA Dot-Blot Streifen 

(OPA Dotblot Strips), 

Nitrozellulose-Streifen 

beschichtet mit 

rekombinanten 

onkoneuralen/ 

paraneoplastischen 

Antigenen Amphiphysin I, 

Yo, Ri, HuD, Ma-1, Ta und 

Recoverin 

MOPADS 24 (8) gebrauchsfertig 2 - 8 °C 

Vor 

Feuchtigkeit 

schützen! 

Zusammen mit 

Trocknungsmittel 

in dem Röhrchen 

aufbewahren 

Nicht mit den 

Fingern 

anfassen! 

bis zum 

Verfallsdatum 

OPA Kontroll-Sera 

(OPA Control Serum), 

Negativkontrolle 

Positivkontrolle 

MOPAC1/ 

2/ 

1 Set 

2 Fl. à 

100 (30) µl 

gebrauchsfertig 2 – 8 °C bis zum 

Verfallsdatum 

OPA Enzym-Konjugat 

(OPA Enzyme Conjugate), 

polyklonaler (Ziegen) antihu-IgG 

Antikörper, markiert 

mit alkalischer 

Phosphatase 

OPA Waschpuffer 

(OPA Buffered Wash 

Solution), 

Konzentrat (5x) 

Substrat-Lösung 

(Substrate Solution), 

enthält 5-Brom-4-Chlor-3- 

Indolyl-Phosphat und 4- 

Nitro-Blautetrazoliumchlorid 

MEOPA 

MWBOPA 

MSOPA 

2 (1) Fl. 

à 15 ml 

1 Fl. 

50 ml 

2 (1) Fl. 

à 15 ml 

Einweg-Inkubationswannen MOPAP 3 (1) 

Auswertebogen OPAA 1 (1) 

gebrauchsfertig 2 - 8 °C bis zum 

Verfallsdatum 

Vor Gebrauch 

verdünnen: z.B. 

zu 10 ml 

Waschpuffer- 

Konzentrat 

40 ml dest. 

Wasser 

zugeben 

gebrauchsfertig 2 - 8 °C 

Vor Licht 

schützen! 

2 - 8 °C 30 Tage nach 

dem Öffnen, 5 

Tage nach 

dem 

Verdünnen, 

bzw. bis zum 

Verfallsdatum 

30 Tage nach 

dem Öffnen 

bzw. bis zum 

Verfallsdatum 

Sicherheitsdatenblätter sind auf Anfrage erhältlich (siehe auch unter www.milenia-biotec.de). 

Erforderliche Hilfsmittel 

• Horizontal-Schüttler 

• Wirbelmischer (Vortex) 

• destilliertes Wasser 

• Messzylinder für 250 ml; Plastikgefäße zur Aufbewahrung des Waschpuffers 

• Mikropipetten für 10, 50 und 1000 µl 

• Reaktionsgefäße zur Probenverdünnung 

• Optional: Westernblot Prozessor 


- 11 - 

Probenentnahme und -vorbereitung 

Als Probenmaterial können Serum, Plasma (EDTA, Citrat, Heparin) und Liquor cerebrospinalis 

verwendet werden. Alle Serum-/Plasmaproben und die im Kit befindlichen Kontrollen werden 1:100 

mit Waschpuffer verdünnt; dazu wird beispielsweise 10 µl Probe zu 990 µl Wasch-Puffer gegeben, 

was eine Endverdünnung der Probe von 1:100 ergibt. Liquor kann unverdünnt eingesetzt werden. 

Für den Transport kann das Untersuchungsmaterial bis zu 24 Stunden bei Raumtemperatur gelagert 

werden. Die Proben können gekühlt bei 2-8 °C bis zu 5 Tage aufbewahrt werden. Ist eine längere 

Lagerung beabsichtigt, sollten die Proben aliquotiert und bei < -18 °C tiefgefroren werden. Wiederholte 

Einfrier- und Auftauzyklen sind zu vermeiden. 

Hinweise und Vorsichtsmassnahmen 

Alle Reagenzien dieser Testpackung dürfen ausschließlich zur in vitro-Diagnostik verwendet werden. 

Die Anwendung sollte durch Personal erfolgen, das speziell in Verfahren von in vitro-Diagnostika 

unterrichtet und ausgebildet wurde. Die Einhaltung des vorgeschriebenen Protokolls zur Durchführung 

des Tests ist unbedingt erforderlich. 

Alle im Kit enthaltenen Kontrollseren wurden auf HCV, HIV1,2 and HbS Antigen getestet und für 

negativ befundet. Da aber ein hundertprozentige Sicherheit nicht garantriert werden kann, sind alle im 

Kit enthaltenen Seren sowie das Untersuchungsmaterial von Patienten stets als potentiell infektiös 

einzustufen und sollten stets in einer Sicherheitswerkbank weiterbearbeitet werden. 

Methodik und Testprinzip 

Der OPA IgG Blot Test ist ein Immunoassay im Dot-Blot-Verfahren zur qualitativen Bestimmung von 

humanen IgG-Autoantikörpern gegen die neuronalen/paraneoplastischen Antigene Amphiphysin I, Yo, 

Ri, HuD, Ma-1, Ta und Recoverin. Die rekombinanten humanen Proteine Amphiphysin I, Yo, Ri, HuD, 

Ma-1, Ta und Recoverin sind auf einer Nitrozellulose-Membran an fixen Stellen aufgetragen; 

zusätzlich sind anti-human-IgG-Antikörper als Funktionskontrolle aufgetragen. 

Die Patientenprobe wird zu der Antigen-beladenen Trägermembran pipettiert. Während der ersten 

Inkubation binden die in der Patientenprobe vorhandenen Autoantikörper entsprechend ihrer Antigen- 

Spezifität. Im nächsten Schritt werden ungebundene Serumbestandteile weggewaschen. Während der 

nächsten Inkubation werden die gebundenen Immunkomplexe mit anti-human-IgG, das mit alkalischer 

Phosphatase konjugiert ist, markiert. Überschüssiges Konjugat wird durch Waschen der Streifen 

entfernt. Schließlich werden die Immunkomplexe sichtbar gemacht, indem sich durch Zugabe von 

farblosem Enzymsubstrat (BCIP/NBT) eine blaue Präzipitat-Linie bildet. Die Antikörper-Typen der 

Probe werden durch den Vergleich der Positionen mit denen der Referenzbanden auf der 

Auswerteschablone identifiziert. 


- 12 - 

Testdurchführung 

Wichtige Hinweise 

• Einzelne Komponenten verschiedener Chargen und Testbestecke dürfen nicht ausgetauscht 

werden. 

• Kitbestandteile dürfen nach Ablauf des Haltbarkeitsdatums nicht benutzt werden. 

• Alle Komponenten müssen vor Gebrauch auf Raumtemperatur (18-28 °C) erwärmt werden. 

• Die Konzentrate müssen mindestens 30 Minuten vor Gebrauch verdünnt werden. Gut mischen, 

Schaumbildung vermeiden. 

• Um Kreuzkontaminationen zu vermeiden Flüssigkeiten vorsichtig absaugen; das gilt vor allem für 

die Patientenproben-haltigen Flüssigkeiten! 

1. Mit einer Pinzette die benötigte Anzahl an 

Streifen in die Inkubationswannen legen 

(Beschriftung nach oben). 

2. Streifen mit 990 µl Waschpuffer (500 µl für 

Liquor) überschichten und 5 Minuten bei 

Raumtemperatur (18-28 °C) auf einem Schüttler 

inkubieren. Nicht Absaugen, Waschpuffer 

verbleibt in den Reservoirs! 

3. 10 µl Serum/Plasma (unverdünnt) und 

Kontrollen (unverdünnt) oder 500 µl Liquor 

(unverdünnt) zugeben. 

90 Minuten auf einem Schüttler inkubieren. 

4. Absaugen und die Streifen mit 1000 µl Waschpuffer waschen. Dabei vorsichtig schwenken und 

dann wieder absaugen. 

5. 1000 µl Waschpuffer hinzugeben, 5 Minuten schütteln. Waschpuffer absaugen. Diesen Schritt 

einmal wiederholen. 

6. 1000 µl Enzymkonjugat-Lösung zupipettieren und 60 Minuten auf einem Schüttler inkubieren. 

7. Absaugen und die Streifen mit 1000 µl Waschpuffer waschen. Dabei vorsichtig schwenken und 

dann wieder absaugen. 

8. 1000 µl Waschpuffer hinzugeben, 5 Minuten schütteln. Waschpuffer absaugen. Diesen Schritt 

einmal wiederholen. 

9. 1000 µl Substrat-Lösung zupipettieren und 5 - 15 Minuten unter Schütteln inkubieren. Nach 

5 Minuten die Farbentwicklung kontrollieren. Die Funktionskontrolle sollte auf allen Streifen als 

intensive Bande sichtbar sein. Insbesondere soll die Positivkontrolle acht deutlich sichtbare 

Banden aufweisen. 

10. Substratlösung absaugen und Streifen zweimal mit 1000 µl dest. Wasser waschen. 

11. Streifen mit einer Pinzette der Wanne entnehmen und für ca. 30 Minuten auf Filterpapier 

lufttrocknen. 

12. Das Bandenmuster mit dem im Kit vorhandenen Auswertebogen interpretieren. 


- 13 - 

Auswertung der Ergebnissse 

Die komplett getrockneten Streifen werden anhand der Funktionskontrolle auf dem Auswertebogen 

(siehe Auswertebeispiel) mit der Nummerierung nach oben ausgerichtet und mit Tesafilm an ihren 

Enden befestigt. Die Position der Antigene auf den Streifen kann chargenabhängig geringgradig 

variieren, sie liegen aber stets in dem Bereich der auf dem Auswertebogen befindlichen 

Markierungen. Die blaue Färbung der Antigen-Banden verblaßt, wenn die trockenen Streifen Luft und 

Licht für längere Zeit ausgesetzt sind. 

M: Positionsmarker der Antigene 

Antigen M 1 2 3 4 5 6 7 8 

1. Negativ-Kontrollserum 

2. Positiv-Kontrollserum 

3 - 8. Beispiele für Patientenseren 

Amphiphysin I 

Yo 

Ri 

HuD 

Ma 

Ta 

Recoverin 

Funktions Kontrolle 

Die Testergebnisse werden anhand von Lokalisation und Farbintensität der Banden mit den Kontrollen 

aus dem Kit verglichen und entsprechend ausgewertet. 

Positives Ergebnis Negatives Ergebnis Grenzwertig 

Nur Proben mit einer kräftigen oder Keine oder ganz schwache Geringere Intensitäten als die 

ähnlichen Bandenintensität wie die der Banden sind als negativ zu der Positivkontrolle, aber 

Positivkontrolle sind eindeutig Antikörperpositiv! 

Negativkontrolle, sind als 

interpretieren 

intensivere als die der 

grenzwertig zu interpretieren 

Prinzipiell sollten die Ergebnisse des Immunoblots zur Diagnosestellung nur im Zusammenhang mit 

dem klinischen Bild und anderen diagnostischen und epidemiologischen Daten interpretiert werden. 

Qualitätskontrolle 

Die auf jedem Streifen vorhandene Funktionskontrolle (interne Reaktionskontrolle) muß kräftig gefärbt 

sein. Die Negativ-Kontrolle darf nur die Färbung der Funktionskontrolle aufweisen; in wenigen 

seltenen Fällen treten sehr schwache Banden auf, denen keine Bedeutung zukommt. 

Die Positiv-Kontrolle muß immer eine kräftige Färbung der sieben Antigene (Amphiphysin I, Yo, Ri, 

HuD, Ma-1, Ta und Recoverin) und der Funktionskontrolle zeigen; falls nicht, muß der Test wiederholt 

werden. 

Testcharakteristika 

Probenmaterial: 

Zeit zur Testdurchführung: 

Spezifität: 

Serum, Plasma, Liquor 

3,5 Stunden 

Bei der Testung von 100 gesunden Blutspendern wurde für keines der 

untersuchten Seren ein positives Ergebnis gefunden 


- 14 - 

Kurzanleitung: OPA IgG Blot 

(alle Volumenangaben in µl) 

Schritte Lösung Probe Kontrolle 

negativ/positiv 

Zu den Streifen pipettieren Waschpuffer 990 µl 

5 min bei Raumtemperatur (18-28 °C) auf 

einem Schüttler inkubieren; 

die Lösungen nicht absaugen! 

(500 µl 

für 

Liquor) 

990 µl 

Zugeben Kontrolle - 10 µl 

Zugeben 

90 min bei Raumtemperatur (RT) auf einem 

Schüttler inkubieren 

Absaugen; die Streifen mit 1000 µl 

Waschpuffer durch vorsichtiges Mischen 

waschen und wieder absaugen 

1000 µl Waschpuffer zu jedem Streifen 

zugeben und für 5 min bei RT auf einem 

Schüttler inkubieren; absaugen 

Diesen Schritt einmal wiederholen 

Zugeben 

60 min bei RT auf einem Schüttler 

inkubieren 

Absaugen; die Streifen mit 1000 µl 

Waschpuffer durch vorsichtiges Mischen 

waschen und wieder absaugen 

1000 µl Waschpuffer zu jedem Streifen 

zugeben und für 5 min bei RT auf einem 

Schüttler inkubieren; absaugen 

Diesen Schritt einmal wiederholen 

Zugeben 

5 – 15 min bei RT auf einem Schüttler 

inkubieren 

Absaugen und zweimal mit 1000 µl dest. 

Wasser waschen 

Die Streifen mit einer Pinzette entfernen und 

auf einem Papier ca. 30 min lufttrocknen 

lassen 

Die Bandenmuster anhand des 

Auswertebogens analysieren 

unverdünnte 

Probe 

(Liquor 

unverdünnt) 

Enzym- 

Konjugat 

Substrat- 

Lösung 

10 µl 

(500 µl) 

1000 µl 1000 µl 

1000 µl 1000 µl 

Vgl. auch Seite 2-13 für eine detaillierte Beschreibung der Testdurchführung. 

- 


- 15 - 


Dot Blot for the qualitative detection of 

onconeural/paraneoplastic Amphiphysin I, Yo, Ri, HuD, Ma-1, 

Ta and Recoverin specific IgG autoantibodies 


Dot-Blot zum qualitativen Nachweis von 

onkoneuralen/paraneoplastischen Amphiphysin I, Yo, Ri, HuD, 

Ma-1, Ta und Recoverin spezifischen IgG Autoantikörpern 

Deutsch: Seite 9-14 

Dot Blot pour la détection qualitative des auto-anticorps 

(IgG) anti-onconeuronaux/paranéoplastiques 

amphiphysine I, Yo, Ri, HuD, Ma-1, Ta et recoverine 


REF: 


24 (8) 


Hersteller: 




Telefon: +49 (721) 85 000 – 0 

Telefax: +49 (721) 85 000 115 





Telefon: +49 (641) 948883 – 0 

Telefax: +49 (641) 948883 – 80 




- 16 - 

Contenu du kit, stockage et stabilité 

Composants Cat.-No. Quantité Préparation Conservatio Durée de vie 

Bandelettes Dotblot OPA 

(OPA Dotblot Strips), 

Bandelettes de nitrocellulose 

coatées avec des antigènes 

onco-neuronaux/paranéoplastiques 

recombinants 

amphiphysine I, Yo, Ri, 

HuD, Ma-1, Ta et 

recoverine 

Sérum de contrôle OPA 

(OPA Control Serum), 

contrôle négatif 

contrôle positif 

Conjugué enzymatique OPA 

(OPA Enzyme Conjugate), 

Anticorps polyclonal (de 

chèvre) anti IgG humaines, 

couplé à de la phosphatase 

alcaline 

Solution de lavage OPA 

(OPA Buffered Wash 

Solution), 

Concentrée (5x) 

Solution de substrat 

(Substrate Solution), 

Substrat: 5-bromo-4-chloro-3- 

indolyl phosphate (BCIP) et 

nitrobleu de tétrazolium (NBT) 

MOPADS 24 (8) Prêt à l’emploi 2 - 8 °C 

Protéger de 

l’humidité ! 

Stocker avec 

du dessicant ! 

Ne pas 

toucher avec 

les doigts! 

MOPAC1/ 

2/ 

1 jeu de 

2 flacons de 

100 µl (30) 

chacun 

MEOPA 2 (1) 

flacon(s) 

de 15 ml 

chacun 

MWBOPA 1 flacon 

de 50 ml 

MSOPA 2 (1) 

flacon(s) 

de 15 ml 

chacun 

Plateau d’incubation MOPAP 3 (1) 

Fiche d’évaluation OPAA 1 (1) 

Voir date de 

péremption 

Prêt à l’emploi 2 – 8 °C Voir date de 

péremption 

Prêt à l’emploi 2 - 8 °C Voir date de 

péremption 

Diluer avant 

usage : 10 ml de 

solution de lavage 

concentrée dans 

40 ml d’eau 

distillée 

Prêt à l’emploi 2 - 8 °C 

Protéger de la 

lumière ! 

2 - 8 °C 30 jours après 

ouverture, 5 

jours après 

dilution ou 

jusqu'à la date 

de péremption 

30 jours après 

ouverture ou 

jusqu'à la date 

de péremption 

Les fiches de sécurité sont disponibles sur demande (voir également sur www.milenia-biotec.de). 

Matériel requis 

• Agitateur horizontal 

• Vortex 

• Eau distillée 

• Eprouvette graduée de 250 ml; flacon pour stocker la solution de lavage 

• Pipettes de 10, 50 et 1000 µl 

• Tubes à essais pour la prédilution des échantillons 

• Optionnel: automate de western-blot 


- 17 - 

Echantillon et Préparation 

Le sérum, le plasma (sur EDTA, citrate, héparine) et le liquide cérébrospinal (CSF) peuvent être 

employés pour ce test. Tous les échantillons de sérum et de plasma ainsi que les contrôles fournis 

avec le kit doivent être prédilués au 1:100 avec la solution de lavage; ex: 10 µl d’échantillon mélangé 

à 990 µl de solution de lavage, ce qui produit une dilution finale de l´échantillon de 1:100. Le CSF 

peut être utilisé sans dilution. 

Pendant le transport, les échantillons peuvent être stockés à température ambiante pendant 24 

heures. Pour le stockage à court terme (5 jours maximum), les échantillons peuvent être conservés à 

2-8°C. Pour une conservation à plus long terme, aliquotez les échantillons et congelez les à

- 18 - 

Mode opératoire 

Important : 

• Ne pas échanger les composants de différents lots. 

• Ne pas utiliser après la date de péremption. 

• Tous les composants doivent être à température ambiante (18 – 28 °C) avant usage. 

• Diluer les concentrés au moins 30 minutes avant usage. Bien mélanger mais éviter la formation de 

mousse. 

• Pipeter soigneusement pour éviter les contaminations par transfert ! 

1. En utilisant des pincettes, placer le nombre de 

bandelettes requis sur le plateau d’incubation 

(marquage vers le haut). 

2. Recouvrir les bandelettes de 990 µl de solution 

de lavage (500 µl pour CSF) et incuber 

5 minutes à température ambiante (18-28°C) 

sous agitation. Ne pas aspirer; la solution de 

lavage reste dans les barquettes ! 

3. Ajouter 10 µl d’échantillon non dilué 

(sérum/plasma) ainsi que les contrôles positif, 

négatif et valeur seuil non dilués, ou 500 µl de 

liquide cérébrospinal non dilué. 

Incuber 90 minutes sous agitation. 

Réservoir 

Aspirer 

Chambre d´incubation 

Adjonction de réactifs 

4. Aspirer le liquide et laver les bandelettes avec 1000 µl de solution de lavage. Mélanger et 

aspirer soigneusement. 

5. Ajouter 1000 µl de solution de lavage et agiter 5 minutes. Aspirer la solution de lavage. 

Répéter l’opération de lavage encore une fois. 

6. Ajouter 1000 µl de conjugué et incuber 60 minutes sous agitation. 

7. Aspirer le liquide et laver les bandelettes avec 1000 µl de solution de lavage. Mélanger et 

aspirer soigneusement. 

8. Ajouter 1000 µl de solution de lavage et agiter 5 minutes. Aspirer la solution de lavage. 

Répéter l’opération de lavage encore une fois. 

9. Ajouter 1000 µl de substrat et incuber 5-15 minutes sous agitation. Vérifier le développement 

de la couleur après 5 minutes. Le contrôle interne doit être clairement visible sur chaque 

bandelette. La bandelette contrôle positif doit présenter 8 lignes colorées nettement visibles. 

10. Aspirer le substrat et laver deux fois avec 1000 µl d’eau distillée. 

11. Retirer les bandelettes du plateau d’incubation en utilisant des pincettes. Laisser sécher à l’air 

sur du papier absorbant pendant 30 minutes. 

12. Interpréter le profil des bandelettes en vous référant à la fiche d’évaluation fournie avec le kit. 


- 19 - 

Interprétation des Résultats 

Après séchage complet, placer les bandelettes sur une feuille, numérotation vers le haut, en alignant 

le contrôle interne. Fixer les extrémités des bandelettes avec du ruban adhésif (voir l'exemple 

d'interprétation). La position des bandes d'antigène peut légèrement varier d’un lot à l’autre, mais elles 

sont toujours comprises entre les marques indiquées par la fiche d'évaluation. La couleur bleue des 

bandes d'antigènes peut pâlir si les bandelettes sont exposées trop longtemps à l'air et à la lumière. 

M: Marqueur de position 

pour les antigènes. 

1. contrôle négatif. 

2. contrôle positif. 

3-8. exemples de sérums de patient. 

Antigen M 1 2 3 4 5 6 7 8 

amphiphysine I 

Yo 

Ri 

HuD 

Ma 

Ta 

recoverine 

contrôle interne 

Les résultats du test sont interprétés en comparant les localisations et les intensités de couleur des 

bandes obtenues pour les échantillons issus de patients à celles qui sont obtenues pour les contrôles 

fournis avec le kit. 

Résultat positif Résultat négatif Résultat douteux 

Seuls les échantillons avec une intensité Pas de coloration ou une Des intensités de coloration 

plus forte ou semblable au signal obtenu coloration très faible est comprises entre celle du 

avec le contrôle positif du kit sont interprétée comme un contrôle négatif et celle du 

clairement positifs. 

résultat négatif. 

contrôle positif sont 

interprétées comme résultat 

douteux. 

Par principe, les résultats de cet immuno-dot blot doivent être interprétés uniquement en fonction de 

l’état clinique du patient et des autres données diagnostiques et épidémiologiques. 

Contrôle de Qualité 

Le contrôle interne de chaque bandelette doit être de couleur intense. Le contrôle négatif doit 

présenter une coloration uniquement au niveau du contrôle interne; dans de très rares cas des lignes 

d’intensité très faible peuvent y être visibles, sans aucune incidence sur le résultat. 

Le contrôle positif doit toujours présenter des colorations intenses pour les sept antigènes 

(amphiphysine I, Yo, Ri, HuD, Ma-1, Ta et recoverine) et pour le contrôle interne, sinon le test ne peut 

être interprété et doit être répété. 


- 20 - 

Caractéristiques du test 

Echantillons : 

Temps de manipulation : 

Spécificité : 

Sérum, plasma, liquide cérébrospinal (CSF) 

3 h 30 min. 

Sur 100 donneurs sains testés aucun n’est apparu positif. 


- 21 - 

Protocole court: OPA IgG 

(Tous les volumes sont donnés en µl) 

Etapes Solution Echantillon Contrôles 

Ajouter sur les bandelettes solution de lavage 990 µl 

Incuber 5 min à température ambiante 

(18-28°C) sous agitation; 

ne pas aspirer la solution ! 

(500 µl pour 

du liquide 

cérébrospinal) 

négatif/positif 

990 µl 

Ajouter Contrôles - 10 µl 

Ajouter 


(RT) sous agitation 

Aspirer, laver les bandelettes avec 1000 

µl de solution de lavage, mélanger 

doucement et aspirer de nouveau. 

Ajouter 1000 µl de solution de lavage sur 

chaque bandelette et incuber 5 min à 

température ambiante sous agitation; 

aspirer 

Répéter l’opération une fois 

Ajouter 


sous agitation 

Aspirer; laver les bandelettes avec 1000 

µl de solution de lavage, mélanger 

doucement et aspirer 

Ajouter 1000 µl de solution de lavage 

sur chaque bandelette et incuber 5 min à 

température ambiante sous agitation; 

aspirer 

Répéter l’opération une fois 

Echantillons (CSF 

pur) 

Conjugué 

enzymatique 

10 µl 

(500) 

1000 µl 1000 µl 

Ajouter Substrat 1000µl 1000µl 

Incuber 5 – 15 min à température 

ambiante sous agitation 

Aspirer et laver les bandelettes 2 fois 

avec 1000 µl d’eau distillée. 

Enlever les bandelettes avec des 

pincettes et sécher 30 min à l’air sur du 

papier absorbant 

Analyser le profil des bandelettes en 

utilisant la fiche d’évaluation 

Pour plus de détails voir page 18-19. 

-

OPA IgG Blot - Milenia Biotec GmbH

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