Biophysical studies of membrane proteins/peptides. Interaction with ...

para diferentes grupos polares de lípidos, são practicamente idênticos aos obtidos com
espectroscopia de ressonância paramagnética eletrónica (ESR) para a mesma proteína,
ainda que num estado agregado. Esta concordância estabelece esta metodologia para
quantificação da selectividade de proteínas para lípidos como uma alternativa ao uso de
ESR. Esta metodologia de FRET foi também aplicada ao estudo da selectividade da
mcp para diferentes comprimentos de cadeias acilo. Surpreendentemente, os resultados
revelaram constantes de selectividade baixas para um lípido de conformidade hidrófoba,
em bicamadas mais finas e mais espessas que o domínio hidrófobo da proteína.
Duas estratégias diferentes foram utilizadas no estudo da ligação de drogas a
proteínas de membrana. No Capítulo III, uma aproximação reducionista foi escolhida.
Um péptido correspondente ao quarto domínio transmembranar da subunidade c do V-
ATPase foi utilizado em estudos de ligação aos inibidores do V-ATPase, bafilomicina e
SB242784. Era esperado que este domínio transmembranar compreendesse o local de
ligação a estes inibidores. SB242784 foi desenvolvido para utilização terapêutica em
pacientes com osteoporose. Este inibidor apresenta grande selectividade para a forma
osteoclática do V-ATPase que é parcialmente responsável pela degradação óssea. A
bafilomicina apresenta níveis de toxicidade muito elevados devido à ausência de
selectividade para uma forma particular do enzima. FRET foi novamente utilizada para
determinar ligação entre inibidor e péptido (a tirosina do péptido foi o dador e os
inibidores os aceitantes) e os resultados indiciam uma interacção de baixa afinidade
entre a bafilomicina e o péptido. Já a ligação de SB242784 ao péptido não foi detectada.
Globalmente, os resultados indicam que os requesitos moleculares para ligação aos
inibidores na subunidade c incluem provavelmente contribuições dos restantes domínios
transmembranares, reflectindo uma visão mais complexa do mecanismo de inibição do
V-ATPase do que inicialmente considerado.
No Capítulo IV, descreve-se um estudo de ligação entre o antibiótico ciprofloxacin
(CP) e um trímero purificado de uma porina da membrane externa, OmpF. O
mecanismo de entrada do CP na célula, requer a interacção do CP com a OmpF. Neste
caso, a estratégia escolhida envolveu o uso da estrutura nativa da proteína. FRET foi
novamente aplicada, desta vez fazendo uso da presença de dois tipos de Trp no
monómero de OmpF (como dadores) e das propriedades de absorção no ultravioleta do
CP (como aceitante). A análise da extinção de fluorescência de aminoácidos intrínsecos
de proteínas de grandes dimensões por FRET pode revelar-se difícil, uma vez que cada
uma das populações de dadores pode estar sujeita a diferentes distribuições de