ProNews-10-Q3 - 波仕特生物科技股份有限公司
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波 仕 特 季 刊<br />
波 仕 特 網 頁 全 新 改 版 !<br />
http://www.bio-protech.com.tw<br />
養 細 胞 不 一 定 要 加 血 清<br />
─ 無 血 清 細 胞 培 養 專 題<br />
20<strong>10</strong> <strong>Q3</strong><br />
CELLNTEC<br />
─ 無 血 清 的 前 驅 細 胞 培 養<br />
Athena E.S.<br />
─ Serum Free Medium Cell Culture 相 關 系 列 產 品<br />
波 仕 特 新 品 快 報<br />
─ Plant Cell Technology : Plant Preservative Mixture<br />
─ Lucigen : Expresso T7 Cloning and Expression System<br />
─ DNR : MicroChemi 冷 光 影 像 系 統<br />
波 仕 特 生 物 科 技 有 限 公 司 http://www.bio-protech.com.tw<br />
Protech Technology Enterprise Co., LTD<br />
tech@bio-protech.com.tw service@bio-protech.com.tw<br />
台 北 02-2655-7677 新 竹 037-680-138<br />
高 雄 07-342-5707 台 中 04-2262-4883 花 蓮 038-463-953<br />
北 部 0800-231-530 中 部 0800-555-650 南 部 0800-268-266
Precision Media and Models<br />
來 自 瑞 士 的 CELLNTEC<br />
── 上 皮 前 驅 細 胞 專 用 PCT 培 養 基 及 3D 細 胞 培 養 的 專 家<br />
梁 成 芝 撰<br />
什 麼 是 前 驅 細 胞 <br />
幹 細 胞 在 再 生 醫 學 上 的 前 景 可 謂 眾 所 皆 知 , 但 許 多 相 關 的 機 制 仍 不 明 確 。 為 了 進 行 相 關 研 究 ,<br />
原 本 十 分 困 難 的 in vitro 幹 細 胞 培 養 , 變 成 了 進 行 這 類 研 究 的 入 門 工 具 。 以 往 幹 細 胞 的 來 源 主 要 是<br />
具 有 分 化 全 能 性 (Pluripotent ) 的 胚 胎 幹 細 胞 (Embryonic Stem Cell)。 但 近 年 研 究 發 現 了 成 體 幹 細 胞<br />
(Adult Stem Cell) 的 存 在 。 成 體 幹 細 胞 會 分 化 為 前 驅 細 胞 (Progenitor cell), 再 分 化 為 各 種 特 化 的 細<br />
胞 , 並 同 時 停 止 細 胞 分 裂 。 前 驅 細 胞 是 和 幹 細 胞 同 樣 具 有 可 分 裂 (Proliferating) 及 未 分 化<br />
(Undifferentiated) 特 性 的 細 胞 ; 但 其 只 能 分 化 成 一 種 或 少 數 幾 種 細 胞 (Oligopotent), 且 無 法 像 幹 細<br />
胞 一 樣 無 限 制 的 進 行 細 胞 分 裂 。 人 體 或 動 物 各 組 織 都 會 保 留 一 小 群 前 驅 細 胞 , 在 組 織 需 要 更 新 或 修<br />
復 時 發 揮 功 能 。 因 此 , 由 各 種 組 織 中 即 可 分 離 出 各 種 不 同 的 前 驅 細 胞 , 在 in vitro 的 狀 態 下 培 養 並<br />
研 究 。<br />
Symmetric Division & Asymmetric Division<br />
Stem cell<br />
Progenitor cell<br />
Symmetric Division<br />
Asymmetric Division<br />
幹 細 胞 的 分 裂 可 以 分 為 兩 種 。<br />
一 種 是 對 稱 分 裂 (Symmetric Division),<br />
另 一 種 是 不 對 稱 分 裂<br />
(Asymmetric Division)。 對 稱 分 裂 時 ,<br />
一 個 幹 細 胞 會 變 成 兩 個 相 同 的 幹 細<br />
胞 ; 不 對 稱 分 裂 時 , 一 個 幹 細 胞 會<br />
分 裂 成 一 個 幹 細 胞 和 另 一 個 前 驅 細<br />
胞 (Progenitor Cell)。 前 驅 細 胞 的 分<br />
裂 同 樣 可 以 分 為 對 稱 及 不 對 稱 分 裂<br />
兩 種 。 對 稱 分 裂 可 以 增 加 前 驅 細 胞<br />
的 數 量 , 不 對 稱 分 裂 則 會 使 前 驅 細<br />
胞 開 始 分 化 為 更 為 特 化 (Specific)<br />
的 細 胞 。<br />
1<br />
CELLNTEC Advanced Cell Systems<br />
http://www.cellntec.com
Precision Media and Models<br />
為 何 要 用 初 代 培 養 的 方 式 分 離 前 驅 細 胞 <br />
直 接 從 組 織 中 分 離 細 胞 進 行 in vitro 培 養 的 方 式 , 稱 為 初 代 培 養 (Primary Culture)。 一 般 培 養 的<br />
不 死 細 胞 株 (Immortal Cell Line), 不 是 由 原 本 就 能 無 限 生 長 的 癌 細 胞 分 離 出 來 , 就 是 因 為 細 胞 株 已<br />
經 轉 型 (Transformed), 因 此 才 能 無 限 的 生 長 。 這 樣 的 細 胞 株 並 不 能 真 實 的 表 現 此 細 胞 處 於 in vivo 時<br />
的 狀 態 , 因 此 , 用 這 樣 的 細 胞 株 進 行 實 驗 的 結 果 , 自 然 容 易 和 in vivo 實 驗 有 所 差 距 。 相 較 之 下 ,<br />
初 級 培 養 雖 然 技 術 門 檻 較 高 , 但 卻 能 較 真 實 的 反 應 細 胞 處 於 in vivo 的 狀 態 。<br />
前 驅 細 胞 分 裂 的 次 數 有 限 , 因 此 , 在 細 胞 株 沒 有 轉 型 的 狀 況 下 , 必 須 以 初 代 培 養 的 方 式 , 才 能<br />
取 得 細 胞 在 in vitro 狀 態 下 培 養 。 以 往 取 得 前 驅 細 胞 的 方 式 , 分 離 出 的 細 胞 原 本 就 不 多 , 分 離 後 又<br />
必 須 使 用 feeder’s layer 來 培 養 , 培 養 上 十 分 麻 煩 。CELLNTEC 廠 牌 針 對 此 一 情 形 , 提 出 了 不 同 以 往<br />
的 觀 點 及 對 應 的 商 品 ─ PCT 培 養 基 (Progenitor Cell Targeting Medium), 讓 前 驅 細 胞 的 分 離 及 培 養<br />
更 容 易 。<br />
細 胞 分 離 太 困 難 <br />
CELLNTEC 原 廠 提 供 多 種 細 胞 分 離 protocol 可 供 參 考 。 如 有 興 趣 , 可 至 原 廠 網 頁 查 詢 。<br />
(http://www.cellntec.com/resources/protocols)<br />
除 此 之 外 , 也 可 參 考 20<strong>10</strong> Q2 波 仕 特 季 刊 。Worthington 廠 牌 提 供 各 種 細 胞 分 離 用 酵 素 。<br />
此 外 還 有 肝 臟 細 胞 、 心 肌 細 胞 和 神 經 細 胞 的 專 用 細 胞 分 離 套 組 。<br />
2<br />
CELLNTEC Advanced Cell Systems<br />
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Precision Media and Models<br />
CELLNTEC 三 大 產 品 線 :<br />
1. PCT (Progenitor Cell Targeting) 培 養 基<br />
2. Human Primary Cell & Long-Term Animal Cell<br />
3. 3D 細 胞 培 養 model<br />
一 、PCT 培 養 基 簡 介 :<br />
PCT (Progenitor Cell Targeted) 培 養 基 是 CELLNTEC 公 司 的 主 力 產 品 之 一 。 CELLNTEC 研 發 團<br />
隊 , 以 其 對 cell signal pathway 的 了 解 為 基 礎 , 模 擬 前 驅 細 胞 在 in vivo 狀 態 下 所 處 的 微 環 境 (Micro<br />
Environment), 研 發 出 專 門 用 來 分 離 (Cell Isolation) 及 培 養 前 驅 細 胞 的 專 用 培 養 基 。<br />
由 於 前 驅 細 胞 和 幹 細 胞 (Stem Cell) 不 同 , 並 不 能 無 限 制 的 進 行 細 胞 分 裂 。 因 此 , 若 想 要 得 到<br />
更 多 的 前 驅 細 胞 來 進 行 後 續 實 驗 , 主 要 有 兩 種 方 法 : 一 是 提 高 細 胞 分 離 效 率 , 分 離 出 更 多 的 細 胞 ;<br />
二 是 增 加 細 胞 分 裂 次 數 , 分 裂 出 更 多 細 胞 。PCT 培 養 基 和 傳 統 培 養 基 相 比 , 無 論 是 在 細 胞 分 離 效<br />
率 , 或 是 繼 代 後 的 前 驅 細 胞 分 裂 活 性 等 等 , 都 有 較 好 的 表 現 。 此 外 ,PCT 培 養 基 也 可 添 加 BPE<br />
(Bovine Pituitary Extract; 牛 腦 下 垂 體 萃 取 物 ) 來 促 進 細 胞 分 裂 , 得 到 更 多 數 量 的 前 驅 細 胞 。<br />
PCT 培 養 基 的 優 點 :<br />
1. 固 定 配 方 :<br />
PCT 培 養 基 為 固 定 配 方 , 不 像 血 清 或<br />
BPE 等 添 加 物 , 即 使 是 同 一 廠 牌 的 產 品 ,<br />
不 同 批 號 間 , 效 果 也 常 有 落 差 。 固 定 配 方<br />
培 養 基 , 就 沒 有 此 問 題 。 不 同 批 號 間 , 效<br />
果 也 不 會 相 差 太 多 。 使 培 養 基 來 源 穩 定 ,<br />
實 驗 重 覆 性 更 高 。<br />
2. 更 好 的 細 胞 分 離 效 率 :<br />
和 傳 統 培 養 基 相 比 ,PCT 培 養 基 即 使<br />
沒 有 添 加 血 清 或 BPE, 在 分 離 細 胞 時 也 能<br />
得 到 更 多 的 前 驅 細 胞 (Fig. 1.)。<br />
3<br />
Fig. 1. 初 代 培 養 的 表 皮 角 化 細 胞 (Epidermal keratinocytes), 細 胞 代<br />
數 1。CnT-07 (PCT 培 養 基 ) 和 兩 種 競 爭 廠 牌 的 比 較 結 果 。 使 用 CnT<br />
-07 培 養 基 分 離 出 的 細 胞 數 量 更 多 , 且 細 胞 形 態 較 為 正 常 。 競 爭 廠 牌<br />
分 別 為 : 添 加 血 清 及 fibroblast conditioned medium 的 EMEM 培 養<br />
基 ; 以 及 添 加 BPE 的 KGM 培 養 基 。<br />
CELLNTEC Advanced Cell Systems<br />
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Precision Media and Models<br />
細 胞 群 落 形 成 (Colony Formation) 可 以 反 映 出 細 胞 分<br />
裂 的 能 力 , 形 成 的 群 落 越 多 , 表 示 具 有 分 裂 能 力 的 前 驅 細<br />
胞 越 多 。 以 不 同<br />
培 養 基 分 離 出 的 細 胞 進 行 細 胞 群 落 形 成 實 驗 (Fig.<br />
2.)。 固 定 配 方 的 PCT 培 養 基 在 細 胞 代 數 1 時 即 可 形 成 細 胞<br />
群 落 ; 添 加 少 量 BPE 後 , 細 胞 群 落 形 成 數 量 更 是 遠 大 於 添<br />
加 大 量 BPE 的 競 爭 廠 牌 培 養 基 。 此 實 驗 結 果 顯 示 , 除 了 分<br />
離 出 的 細 胞 總 量 更 多 之 外 ,PCT 培 養 基 還 能 分 離 出 更 多 真<br />
正 具 有 細 胞 分 裂 能 力 的 前 驅 細 胞 。<br />
3. 更 持 久 的 細 胞 分 裂 能 力 :<br />
細 胞 分 裂 能 力 會 隨 著 前 驅 細 胞 開 始 分 化 而 下 降 , 當 前<br />
驅 細 胞 完 全 分 化 的 同 時 , 細 胞 分 裂 也 隨 之 停 止 。 因 此 , 細<br />
胞 分 裂 能 力 也 可 以 當 作 判 斷 細 胞 是 否 開 始 分 化 的 依 據 。<br />
Fig. 2. 初 代 培 養 表 皮 角 化 細 胞 , 細 胞 代 數 1, 細 胞<br />
群 落 形 成 分 析 (Colony Formation Assay)。CnT-07<br />
(PCT 培 養 基 )、CnT-57 ( 含 少 量 BPE 的 PCT 培 養<br />
基 ) 及 一 種 競 爭 廠 牌 培 養 基 的 細 胞 群 落 形 成 分 析<br />
比 較 結 果 。 CnT-57 (PCT, Low-BPE) 形 成 最 多 細<br />
胞 群 落 。<br />
不 同 細 胞 代 數 的 細 胞 群 落 形 成 分 析 (Fig. 3.) 顯 示 ,<br />
PCT 培 養 基 無 論 是 否 添 加 少 量 BPE , 到 細 胞 代 數 5 時 仍 然<br />
能 維 持 良 好 的 細 胞 分 裂 能 力 。 相 較 之 下 , 競 爭 廠 牌 到 細 胞<br />
代 數 5 時 , 細 胞 分 裂 能 力 已 開 始 下 降 , 表 示 細 胞 可 能 已 經<br />
40<br />
30<br />
CnT - 57 (PCT - low BPE)<br />
CnT - 07 (PCT - defined)<br />
KSFM (Invitrogen - BPE)<br />
分 化 , 甚 至 進 入 細 胞 凋 亡 (Apoptosis) 的 階 段 了 。<br />
PCT 培 養 基 可 以 延 長 前 驅 細 胞 保 持 在 未 分 化 狀 態 的<br />
時 間 並 增 加 細 胞 分 裂 的 次 數 。 也 就 是 說 , 可 延 長 初 級 培 養<br />
CFE (%)<br />
20<br />
<strong>10</strong><br />
的 細 胞 壽 命 (Longevity), 並 由 細 胞 分 裂 得 到 更 多 的 前 驅 細<br />
胞 來 進 行 實 驗 。<br />
0<br />
P0 P1 P3 P5<br />
Passage<br />
4. 提 高 前 驅 細 胞 純 度 :<br />
前 驅 細 胞 也 如 同 許 多 細 胞 , 會 表 現 特 定 的 表 面 標 記<br />
(Surface Marker), 並 可 利 用 這 些 標 記 來 判 定 細 胞 種 類 。Fig.<br />
4. 即 為 使 用 CD34 及 Alpha-6 integrin 兩 種 細 胞 表 面 標 記 來<br />
判 斷 前 驅 細 胞 在 所 培 養 細 胞 中 所 佔 的 比 例 。 結 果 顯 示 ,PCT<br />
培 養 基 能 隨 著 繼 代 次 數 增 加 而 提 高 前 驅 細 胞 的 純 度 。 因 此 ,<br />
Fig. 3. 不 同 細 胞 代 數 細 胞 群 落 形 成 效 率 (CFE;<br />
Cell Formation Efficiency)。CnT-57 ( 含 少 量 BPE<br />
的 PCT 培 養 基 ) 在 細 胞 代 數 1-5 都 表 現 出 最 高 的<br />
CFE。CnT-07 (PCT 培 養 基 ) 的 CFE 則 在 細 胞 代 數<br />
2 之 後 明 顯 增 加 , 到 細 胞 代 數 5 時 已 接 近 CnT-57。<br />
競 爭 廠 牌 為 添 加 BPE 的 KDFM 培 養 基 。<br />
不 需 要 特 別 的 挑 選 或 cell sorting 等 步 驟 , 只 要 隨 著 繼 代 次<br />
數 的 增 加 , 前 驅 細 胞 佔 的 百 分 比 即 可 明 顯 提 升 。<br />
4<br />
CELLNTEC Advanced Cell Systems<br />
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Precision Media and Models<br />
Fig. 4. 老 鼠 初 代 培 養 表 皮 角 化 細 胞 , 前<br />
驅 細 胞 表 面 標 記 CD34/Alpha-6 integrin<br />
的 FACS (Fluorescence Activated<br />
Cell Sorting) 分 析 。 使 用 CnT-07<br />
(PCT 培 養 基 ) 繼 代 3 代 之 後 ,CD34 及<br />
Alpha-6 integrin 兩 種 表 面 標 記 都 有 表<br />
現 的 細 胞 比 例 , 從 細 胞 分 離 後 的 6% 增<br />
加 到 68%。<br />
5. 提 供 分 化 用 的 Non-PCT 培 養 基 :<br />
更 換 培 養 基 通 常 需 要 一 段 讓 細 胞 適 應 的 時 間 , 且 有 時 會 對 細 胞 造 成 無 法 預 期 的 影 響 。 為 了 避 免 時 間<br />
的 浪 費 及 增 加 不 必 要 的 實 驗 變 因 ,CELLNTEC 原 廠 提 供 了 成 份 與 PCT 培 養 基 相 近 的 分 化 用 培 養 基 ─ Non<br />
-PCT 培 養 基 。<br />
Non-PCT 培 養 基 提 供 一 個 細 胞 分 化 的 理 想 環 境 。 且 可 依 據 實 驗 需 求 , 添 加 誘 導 細 胞 分 化 的 誘 導 物 。<br />
CELLNTEC 的 三 種 培 養 基 及 用 途 :<br />
CELLNTEC 原 廠 提 供 三 種 培 養 基 , 分 別 為 : PCT 培 養 基 (Defined)、PCT 培 養 基 (Low-BPE)、<br />
及 Non-PCT 培 養 基 。 兩 種 PCT 培 養 基 都 是 用 於 分 離 及 培 養 前 驅 細 胞 ,Non-PCT 培 養 基 則 是 用 於 細<br />
胞 分 化 時 , 又 可 分 為 2D 細 胞 或 3D 細 胞 分 化 使 用 的 培 養 基 。<br />
三 種 培 養 基 的 成 份 彼 此 相 似 , 因 此 細 胞 培 養 時 , 培 養 基 間 的 轉 換 十 分 容 易 。 使 用 “PCT 培 養 基<br />
(Defined)” 或 “PCT 培 養 基 (Low-BPE)” 分 離 出 來 的 前 驅 細 胞 , 皆 可 直 接 轉 換 為 “Non-PCT 培 養 基 ”<br />
來 進 行 細 胞 分 化 實 驗 。 此 外 , 由 於 “PCT 培 養 基 (Low-BPE)” 在 分 離 細 胞 時 的 效 率 和 形 成 細 胞 群 落<br />
的 能 力 較 好 , 因 此 有 些 實 驗 室 會 採 用 “PCT 培 養 基 (Low-BPE)” 來 分 離 細 胞 , 在 繼 代 2 代 之 後 再 改<br />
用 “PCT 培 養 基 (Defined)” 培 養 。<br />
三 種 培 養 基 的 簡 易 用 途 說 明 , 及 培 養 基 選 擇 列 表 請 見 下 頁 。<br />
5<br />
CELLNTEC Advanced Cell Systems<br />
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Precision Media and Models<br />
CELLNTEC 不 同 組 織 及 用 途 專 用 PCT 培 養 基 列 表<br />
PCT 培 養 基 (Defined)<br />
── 固 定 配 方 , 用 於 分 離 及 培 養 前 驅 細 胞<br />
PCT 培 養 基 (Low-BPE)<br />
── 非 固 定 配 方 , 添 加 BPE 刺 激 細 胞 分 裂 , 用 於 分 離 及 培 養 前 驅 細 胞<br />
Non-PCT 培 養 基 (Differentiation)<br />
── 固 定 配 方 , 分 化 前 驅 細 胞 時 使 用 的 培 養 基 。<br />
Tissue<br />
表 皮 (Epidermis)<br />
前 列 腺 (Prostate)<br />
氣 管 (Airway)<br />
Species<br />
PCT<br />
(Defined)<br />
PCT<br />
(Low-BPE)<br />
Non-PCT<br />
(Differentiation)<br />
H/M CnT-07 CnT-57 CnT-02<br />
R CnT-03 CnT-33<br />
D CnT-09* CnT-09*<br />
S CnT-08* CnT-08*<br />
H CnT-12 CnT-52<br />
R<br />
CnT-11<br />
H/M CnT-17 CnT-23<br />
R CnT-14 CnT-34<br />
R CnT-15 CnT-35<br />
乳 腺 (Mammary) H CnT-27 CnT-54 CnT-22<br />
角 膜 (Cornea) H/M CnT-20 CnT-50 CnT-30<br />
口 腔 (Oral) H/M CnT-24 CnT-32<br />
陰 道 (Vagina)<br />
H CnT-19 CnT-55 CnT-39<br />
R CnT-03 CnT-33<br />
膀 胱 (Bladder)<br />
H CnT-18 CnT-58 CnT-21<br />
R CnT-16 CnT-36<br />
真 皮 (Dermis) H/M/R CnT-05*<br />
H: Human, M: Mouse, R: Rat, D: Dog, S: Sheep. * 表 示 培 養 基 含 血 清<br />
6<br />
CELLNTEC Advanced Cell Systems<br />
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Precision Media and Models<br />
CELLNTEC PCT 培 養 基 初 次 使 用 注 意 事 項<br />
CELLNTEC 提 供 多 種 <strong>10</strong>0 mL 包 裝 的 培 養 基 組 合 給 初 次 使 用 的 客 戶 。 由 於 細 胞 培 養 實 驗 中 , 影<br />
響 細 胞 生 長 狀 態 的 因 素 繁 多 , 因 此 針 對 初 次 使 用 CELLNTEC 產 品 的 客 戶 , 原 廠 提 供 了 下 列 幾 點 注<br />
意 事 項 , 希 望 能 協 助 各 位 在 使 用 CELLNTEC 產 品 時 , 能 更 快 上 手 , 並 且 更 公 平 的 比 較 CELLNTEC<br />
與 他 牌 的 產 品 。<br />
Media Testing Recommendations<br />
1. Switching Media<br />
生 物 細 胞 之 間 常 會 有 彼 此 影 響 的 情 況 , 也 可 稱 細 胞 間 交 互 作 用 (Extracellular Signal<br />
Interaction)。 因 此 , 一 般 實 驗 室 所 使 用 的 培 養 基 , 尤 其 是 含 有 FBS 或 BPE 等 含 有 細 胞 間 訊<br />
息 傳 導 分 子 (Extracellular Signal Molecules) 的 成 份 時 , 常 會 對 所 培 養 細 胞 的 訊 息 傳 導<br />
(Signal Pathway) 產 生 影 響 。 此 種 影 響 常 會 造 成 一 種 篩 選 的 壓 力 , 使 細 胞 群 中 比 較 適 應 此 一<br />
環 境 的 亞 群 體 (Sub-Population) 數 量 急 遽 增 加 。 此 種 情 況 若 發 生 , 則 亞 群 體 會 較 難 適 應 其 他<br />
環 境 , 也 就 是 說 , 如 果 在 細 胞 適 應 一 種 培 養 基 之 後 , 貿 然 更 換 培 養 基 , 往 往 會 產 生 不 好 的<br />
效 果 。 這 種 不 良 反 應 並 非 因 為 新 的 培 養 基 品 質 較 差 , 而 是 因 為 培 養 環 境 的 驟 然 改 變 , 使 得<br />
已 經 適 應 原 本 環 境 的 細 胞 亞 群 體 無 所 適 從 的 原 故 。 為 了 避 免 此 情 況 影 響 新 舊 培 養 基 比 較 的<br />
公 平 性 , 建 議 可 採 用 兩 種 方 法 來 避 免 此 一 情 況 。 方 法 一 , 將 新 的 培 養 基 以 系 列 稀 釋 的 方 式 ,<br />
逐 步 添 加 至 舊 的 培 養 基 中 , 直 到 細 胞 適 應 新 環 境 之 後 , 再 比 較 新 舊 培 養 基 所 培 養 細 胞 的 各<br />
種 表 現 ; 方 法 二 , 直 接 從 組 織 分 離 新 的 細 胞 , 並 以 新 舊 兩 種 培 養 基 培 養 。 如 果 組 織 來 源 並<br />
不 是 很 難 取 得 , 方 法 二 顯 然 是 較 為 直 觀 又 公 平 的 比 較 方 法 。<br />
2. Seeding Density<br />
使 用 PCT 培 養 基 並 不 需 要 額 外 添 加 Feeder’s Layer、Conditioned Medium、Plate<br />
Coating, 或 其 他 添 加 物 (Supplement), 即 可 分 離 或 培 養 前 驅 細 胞 。 但 如 果 細 胞 密 度 太 低 時 ,<br />
上 述 這 些 方 法 卻 可 能 對 細 胞 生 長 有 所 助 益 。 請 參 考 原 廠 網 頁 提 供 的 Protocol, 或 視 實 驗 需<br />
求 決 定 是 否 在 使 用 PCT 培 養 基 時 , 搭 配 上 述 的 方 法 。<br />
7<br />
CELLNTEC Advanced Cell Systems<br />
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Precision Media and Models<br />
3. Supplementation<br />
大 部 分 的 細 胞 培 養 添 加 物 , 都 含 有 刺 激 細 胞 分 裂 或 生 長 的 細 胞 間 訊 息<br />
傳 導 分 子 , 例 如 BPE 或 是 FBS。 如 果 原 本 的 培 養 基 含 有 此 類 添 加 物 , 或 是<br />
包 含 了 PCT 培 養 基 中 的 成 份 , 如 EGF、FGF 等 等 , 建 議 在 試 用 時 , 同 時 測<br />
試 含 有 和 不 含 添 加 物 的 組 合 , 才 能 客 觀 的 判 斷 使 用 PCT 培 養 基 是 否 讓 細 胞<br />
生 長 狀 況 改 善 。<br />
4. Trypsinization<br />
血 清 中 含 有 胰 蛋 白 酶 抑 制 物 (Trypsin Inhibitor) 能 抑 制 胰 蛋 白 酶 的 反 應 。<br />
使 用 含 有 血 清 的 傳 統 培 養 基 培 養 時 , 繼 代 完 只 需 加 入 培 養 基 , 即 可 終 止 胰 蛋<br />
白 酶 的 反 應 。 但 由 於 PCT 培 養 基 屬 於 無 血 清 培 養 基 , 繼 代 後 如 果 沒 有 加 入 適<br />
當 的 胰 蛋 白 酶 抑 制 物 , 是 無 法 終 止 胰 蛋 白 酶 反 應 的 , 因 此 使 用 PCT 培 養 基<br />
時 , 原 廠 建 議 搭 配 大 豆 胰 蛋 白 酶 (Soybean Trypsin Inhibitor) 來 抑 制 胰 蛋 白 酶<br />
反 應 。<br />
5. Other Variables<br />
細 胞 分 離 效 率 及 細 胞 培 養 生 長 狀 況 也 受 到 很 多 其 他 因 素 的 影 響 , 如 組<br />
織 來 源 、 組 織 來 源 的 生 物 體 年 齡 、 物 種 、 及 動 物 品 系 (Animal Strain) 等 等 。<br />
如 需 要 原 廠 其 他 技 術 支 援 , 歡 迎 與 我 們 聯 絡<br />
(tech@bio-protech.com.tw)。<br />
www.cellntec.com<br />
8<br />
CELLNTEC Advanced Cell Systems<br />
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二 、Human Primary Cell & Long-Term Animal Cell<br />
人 類 初 代 培 養 細 胞 (Primary Human Cells):<br />
人 類 組 織 取 得 受 到 法 規 的 限 制 , 若 沒 有 特 定 的 來 源 , 有 時 候 不<br />
易 取 得 組 織 來 分 離 前 驅 細 胞 。 因 此 ,CELLNTEC 原 廠 也 提 供 “ 人 類<br />
初 代 培 養 細 胞 ”。CELLNTEC 使 用 PCT 培 養 基 分 離 “ 人 類 初 代 培 養<br />
細 胞 ”, 讓 使 用 者 免 去 細 胞 分 離 的 步 驟 及 組 織 來 源 的 困 擾 , 且 得 到 的<br />
細 胞 擁 有 前 述 各 項 使 用 PCT 培 養 基 的 優 點 。<br />
原 廠 販 售 的 包 裝 包 括 1 瓶 500mL 建 議 使 用 的 PCT 培 養 基 及<br />
1 管 冷 凍 保 存 的 細 胞 。 細 胞 量 有 兩 種 包 裝 可 選 擇 ,> 5 x <strong>10</strong> 5 個 細 胞<br />
或 > 1.5 x <strong>10</strong> 6 個 細 胞 。<br />
由 於 細 胞 繼 代 代 數 會 受 到 繼 代 週 期 長 短 的 影 響 , 因 此<br />
CELLNTEC 原 廠 採 用 較 為 準 確 的 細 胞 倍 增 次 數 來 當 作 細 胞 品 質 的<br />
指 標 。 原 廠 保 證 販 售 的 細 胞 倍 增 (Cell Doubling) 次 數 至 少 可 達 20<br />
次 , 且 通 常 可 達 25 次 以 上 。<br />
Fig. 5. CELLNTEC 原 廠 使 用<br />
PCT 培 養 基 分 離 出 的 人 類 表 皮 角<br />
化 細 胞 (PHEK; Primary Human<br />
Epidermal Keratinocytes)。<br />
動 物 長 期 培 養 細 胞 株 (Long-Term Animal Cell):<br />
CELLNTEC 原 廠 除 了 初 代 培 養 細 胞 之 外 , 也 提 供 “ 動 物 長 期 培 養 細 胞 株 ”。 這 些 細 胞 株 是 由 一<br />
般 的 組 織 分 離 出 來 後 , 經 過 持 續 的 繼 代 培 養 , 到 細 胞 展 現 出 穩 定 生 長 的 性 狀 為 止 。 這 些 細 胞 株 仍 然<br />
會 表 現 未 分 化 細 胞 的 細 胞 表 面 標 記 , 也 可 以 經 由 誘 導 而 分 化 成 更 為 特 化 的 細 胞 。<br />
原 廠 販 售 的 包 裝 包 括 1 瓶 500mL 建 議 使 用 的 PCT 培 養 基 及 1 管 冷 凍 保 存 的 細 胞 株 。 細 胞 量<br />
為 > 6.5 x <strong>10</strong> 5 個 細 胞 。 細 胞 株 的 平 均 細 胞 代 數 為 25。 原 廠 保 證 販 售 的 細 胞 株 可 以 持 續 生 長 至 少 6<br />
個 月 , 且 通 常 可 生 長 更 久 的 時 間 。 建 議 搭 配 冷 凍 保 存 技 術 , 即 可 長 期 培 養 。<br />
原 廠 建 議 細 胞 培 養 條 件 :<br />
無 論 是 初 代 培 養 細 胞 或 長 期 培 養 細 胞 株 ,CELLNTEC 原 廠 都 提 供 了 詳 盡 的 細 胞 培 養 protocol,<br />
內 容 包 括 細 胞 解 凍 及 冷 凍 條 件 、 建 議 的 繼 代 後 細 胞 密 度 (Seeding Density after Passaging) 及 針 對 各<br />
種 不 同 細 胞 培 養 的 建 議 。 詳 細 資 料 請 上 原 廠 網 站 下 載 (http://www.cellntec.com/resources/protocols)。<br />
9<br />
CELLNTEC Advanced Cell Systems<br />
http://www.cellntec.com
Precision Media and Models<br />
CELLNTEC 各 種 初 代 培 養 細 胞 或 細 胞 株 及 專 用 PCT 培 養 基 列 表<br />
Cat# Product Title Species Culture Medium<br />
CPEK Dog Epidermal Keratinocyte Progenitors Dog CnT-09<br />
DF-BALBC Mouse (BalbC) Fibroblasts Mouse CnT-05<br />
DF-R Rat (Wistar) Fibroblasts Rat CnT-05<br />
HBEP.05 Human Bladder Epithelium Progenitors, Single Donor Human CnT-58<br />
HBEP.15 Human Bladder Epithelium Progenitors, Single Donor Human CnT-58<br />
HCEP.05 Human Corneal Epithelium Progenitors, Single Donor Human CnT-20<br />
HCEP.15 Human Corneal Epithelium Progenitors, Single Donor Human CnT-20<br />
HDFs.05 Human Dermal Fibroblasts, Single Donor Human CnT-05<br />
HGEPp.05 Human Gingival Epithelium Progenitors, Pooled Human CnT-24<br />
HGEPp.15 Human Gingival Epithelium Progenitors, Pooled Human CnT-24<br />
HGEPs.05 Human Gingival Epithelium Progenitors, Single Donor Human CnT-24<br />
HPEKp.05 Human Epidermal Keratinocyte Progenitors, Pooled Human CnT-57<br />
HPEKp.15 Human Epidermal Keratinocyte Progenitors, Pooled Human CnT-57<br />
HPEKs.05 Human Epidermal Keratinocyte Progenitors, Single Donor Human CnT-57<br />
HPEKs.15 Human Epidermal Keratinocyte Progenitors, Single Donor Human CnT-57<br />
MPEK-129 Mouse (129) Epidermal Keratinocyte Progenitors Mouse CnT-02<br />
MPEK-BL6 Mouse (C57BL/6) Epidermal Keratinocyte Progenitors Mouse CnT-02<br />
RBLAK-WIS Rat (Wistar) Bladder Epithelium Progenitors Rat CnT-16<br />
RLAK-WIS Rat (Wistar) Large Airway Epithelium Progenitors Rat CnT-15<br />
RPEK-WIS Rat (Wistar) Epidermal Keratinocyte Progenitors Rat CnT-03<br />
RPROK-WIS Rat (Wistar) Prostate Epithelium Progenitors Rat CnT-11<br />
RPVAK-WIS Rat (Wistar) Vaginal Keratinocyte Progenitors Rat CnT-03<br />
RSAK-WIS Rat (Wistar) Small Airway Epithelium Progenitors Rat CnT-14<br />
<strong>10</strong><br />
CELLNTEC Advanced Cell Systems<br />
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Precision Media and Models<br />
三 、 獨 特 的 3D 細 胞 培 養 Model<br />
一 般 的 in vitro 細 胞 培 養 大 多 屬 於 2D (2-<br />
Dimensional) 培 養 , 是 單 層 細 胞 貼 覆 的 形 式 , 因 此 難<br />
以 模 擬 in vivo 狀 態 下 , 由 不 同 細 胞 構 成 的 立 體 構 造 。<br />
CELLNTEC 利 用 PCT 培 養 基 的 技 術 為 基 礎 , 研 發 出<br />
in vitro 3D 細 胞 培 養 系 統 , 將 分 離 出 的 前 驅 細 胞 , 分<br />
化 成 由 不 同 細 胞 構 成 的 多 層 細 胞 構 造 , 有 效 模 擬 細 胞<br />
處 於 in vivo 的 狀 態 。<br />
3D 細 胞 培 養 , 關 係 到 複 雜 的 細 胞 間 交 互 作 用 , 因<br />
此 , 對 培 養 基 的 需 求 也 十 分 挑 剔 。3D 培 養 基 的 成 份 必<br />
須 讓 表 層 細 胞 達 到 完 全 分 化 的 狀 態 , 卻 又 必 須 保 持 最<br />
裡 層 有 一 部 份 細 胞 仍 處 於 可 分 裂 狀 態 , 如 此 才 能 維 持<br />
整 個 3D Model 的 持 續 發 展 。 這 些 矛 盾 的 需 求 是 傳 統<br />
培 養 基 難 以 達 成 的 。 傳 統 培 養 基 雖 然 可 維 持 細 胞 的 可<br />
分 裂 性 , 卻 無 法 顧 及 3D 細 胞 培 養 必 須 要 讓 表 層 細 胞<br />
達 到 完 全 分 化 的 需 求 。PCT 培 養 基 的 原 理 是 模 擬 前<br />
驅 細 胞 在 in vivo 狀 態 下 所 處 的 微 環 境 , 並 依 此 設 計<br />
培 養 基 配 方 , 因 此 獨 特 的 培 方 能 促 使 細 胞 在 in vitro<br />
狀 態 下 形 成 正 確 的 3D 構 造 。<br />
Fig. 6. 表 皮 3D 細 胞 培 養 第 7, 14, 28 天 細 胞<br />
結 構 切 片 。<br />
CELLNTEC 3D 細 胞 培 養 套 組<br />
Cat# Product Title Species Culture Medium<br />
3D-HPEK-25 3D Keratinocyte Starter Kit including Human Primary Keratinocytes Human<br />
CnT-02-3DP1<br />
CnT-57<br />
3D-HPEK-50 3D Keratinocyte Starter Kit including Human Primary Keratinocytes Human<br />
CnT-02-3DP5<br />
CnT-57<br />
3D-K-25 3D Keratinocyte Starter Kit without Human Primary Keratinocytes Human<br />
CnT-02-3DP1<br />
CnT-57<br />
3D-K-50 3D Keratinocyte Starter Kit without Human Primary Keratinocytes Human<br />
CnT-02-3DP5<br />
CnT-57<br />
11<br />
CELLNTEC Advanced Cell Systems<br />
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By Tiffany Lin<br />
在 分 子 生 物 實 驗 上 , 細 胞 研 究 一 直 都 是 最 重 要 的 一 個 環 節 。 動 物 細 胞 的 培 養 技 術 最 初 起 源 於<br />
1907 年 ,Harrison 將 青 蛙 的 胚 胎 組 織 培 養 於 顯 微 鏡 的 載 玻 片 上 並 觀 察 細 胞 的 生 長 。 由 於 初 期 細 胞<br />
培 養 常 常 因 為 微 生 物 的 污 染 導 致 培 養 和 觀 察 失 敗 , 所 以 到 1913 年 Carrel 將 外 科 醫 生 的 無 菌 操 作 技<br />
術 應 用 在 動 物 細 胞 培 養 上 , 細 胞 才 能 在 長 期 培 養 的 情 況 下 而 不 受 污 染 。1916 年 Rous 及 Jones 利<br />
用 胰 蛋 白 酶 (trypsin) 由 組 織 中 分 離 細 胞 , 隨 後 發 展 出 貼 附 性 細 胞 (adherent cell) 的 繼 代 培 養<br />
法 (subculture)。1960 年 代 開 始 在 細 胞 培 養 液 中 額 外 添 加 抗 生 素 , 此 步 驟 更 進 一 步 的 降 低 污 染<br />
機 率 , 也 使 得 細 胞 培 養 技 術 日 漸 普 及 並 被 廣 泛 應 用 。 在 1948 年 到 1952 年 間 ,Mouse L 和 HeLa<br />
兩 種 細 胞 株 先 後 被 建 立 。1955 年 Eagle 開 發 出 配 方 的 細 胞 培 養 液 來 取 代 先 前 的 體 液 培 養 , 更 讓 細<br />
胞 培 養 便 的 容 易 。1975 年 Kohler 和 Milstein 研 發 出 融 合 瘤 (hybridoma) 技 術 , 之 後 被 廣 用 於<br />
單 株 抗 體 的 製 備 。<br />
目 前 動 物 細 胞 可 依 照 三 種 定 義 來 分 類 : 性 質 、 形 態 及 培 養 特 質 。 依 性 質 來 說 細 胞 可 以 分 為 初<br />
級 細 胞 (primary cell)、 正 常 一 般 細 胞 (normal cell) 及 具 持 續 性 培 養 特 性 的 細 胞 株 (continue<br />
cell line) 三 種 。 初 級 細 胞 是 直 接 以 胰 蛋 白 酶 將 動 物 組 織 或 器 官 分 解 並 分 離 出 細 胞 而 得 來 ; 正 常 一<br />
般 細 胞 是 指 具 有 成 對 的 染 色 體 , 單 層 長 滿 後 即 不 再 增 生 , 可 以 用 胰 蛋 白 酶 使 細 胞 脫 離 附 著 面 並 進 行<br />
繼 代 培 養 , 不 過 normal cell 無 法 一 直 培 養 。 若 想 要 可 以 持 續 培 養 , 目 前 只 有 cell line 可 以 選 擇 ,<br />
但 cell line 基 本 上 都 是 從 tumor 所 分 離 出 的 cancer cell, 因 為 tumor 的 特 性 為 細 胞 會 持 續 分 裂 ,<br />
不 會 走 向 細 胞 死 亡 的 路 徑 。<br />
動 物 細 胞 依 其 外 觀 形 態 可 以 分 類 為 纖 維 狀 (fibroblast-like) 及 表 皮 狀 (epithelial-like) 兩<br />
種 不 同 的 細 胞 。 細 胞 若 以 培 養 時 是 否 會 貼 附 的 特 性 , 又 可 以 分 為 懸 浮 性 (suspension) 及 貼 附 性<br />
(adherent) 兩 種 細 胞 , 懸 浮 性 細 胞 如 monocyte, 適 合 的 培 養 方 法 為 懸 浮<br />
培 養 ; 而 大 多 數 的 cell line 為 貼 附 性 細 胞 , 培 養 方 法 為 貼 附 培 養 , 有 時 可 以<br />
在 培 養 前 先 前 處 理 培 養 皿 , 例 如 使 用 collagen、growth factor、protein 或<br />
一 可 以 增 加 細 胞 貼 附 性 的 產 品 , 例 如 AthenaES 的 FNC Coating Mix, 這 些<br />
方 法 都 可 以 增 加 細 胞 的 貼 附 性 , 進 而 增 加 細 胞 的 存 活 率 。<br />
12<br />
Athena Enzyme Systems www.athenaes.com
動 物 細 胞 的 培 養 條 件<br />
動 物 細 胞 的 培 養 條 件 應 盡 量 模 擬 來 源 動 物 體 內 的 條 件 , 而 且 在 培 養 中 保 持 不 變 。 對 大 多 數 動 物 細<br />
胞 而 言 , 培 養 液 合 適 的 pH 為 7.2 ~ 7.4, 滲 透 壓 為 270 ~ 300 mOsM, 最 適 的 溶 氧 值 為 60% 以<br />
上 。 目 前 動 物 細 胞 的 培 養 技 術 已 經 從 天 然 培 養 基 階 段 進 步 到 合 成 培 養 基 階 段 , 近 年 來 更 走 向 無 血<br />
清 培 養 階 段 。<br />
為 何 要 使 用 Serum-Free Media 因 為 血 清 有 可 能 引 發 以 下 的 問 題 :<br />
(1) 因 為 血 清 內 有 bovine protein, 會 影 響 細 胞 實 驗 後 續 的 判 讀 , 例 如 抗 體 的 辨 識 、<br />
transfection 的 效 率 、ELISA 等 等 實 驗 。<br />
(2) 血 清 有 批 號 (lot) 間 的 差 異 , 因 為 血 清 來 源 為 動 物 體 , 有 未 知 成 分 的 問 題 存 在 , 而 且 現 在 又<br />
有 狂 牛 症 的 問 題 , 所 以 動 物 性 來 源 的 產 品 容 易 影 響 細 胞 培 養 。<br />
(3) 血 清 易 感 染 漿 黴 菌 (Mycoplasma)。<br />
無 血 清 培 養 基 的 優 點 及 其 應 用<br />
(1) 可 避 免 血 清 批 次 間 的 品 質 變 動 , 提 高 細 胞 培 養 和 實 驗 結 果 的 重 復 性 。<br />
(2) 避 免 血 清 對 細 胞 的 毒 性 作 用 和 血 清 來 源 性 污 染 。<br />
(3) 避 免 血 清 成 分 對 實 驗 研 究 的 影 響 。<br />
(4) 有 利 於 體 外 培 養 細 胞 的 分 化 。<br />
(5) 可 提 高 產 品 的 表 達 水 準 並 使 細 胞 產 品 易 於 純 化 。<br />
已 經 應 用 的 領 域 有 :<br />
(1) 研 究 細 胞 分 化 的 條 件 。<br />
(2) 用 於 生 長 因 子 、 激 素 和 藥 物 等 等 與 細 胞 之 間 相 互 作 用 關 係 的 研 究 。<br />
(3) 用 於 從 多 種 細 胞 混 雜 的 培 養 基 中 選 擇 目 的 細 胞 。<br />
(4) 腫 瘤 病 理 學 和 病 因 學 的 研 究 。<br />
(5) 用 於 生 產 疫 苗 、monoclonal antibody 和 生 物 活 性 蛋 白 等 生 物 製 品 。<br />
缺 點 : 可 以 使 用 細 胞 的 適 用 範 圍 窄 , 但 可 以 用 screening SFM mediums 的 方 式 來 找 到 合 適 的 培<br />
養 液 。<br />
13<br />
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一 般 的 細 胞 培 養 , 使 用 含 serum 的 培 養 液 , 例 如 DMEM+<strong>10</strong>% FBS<br />
從 原 culture medium 慢 慢 轉 換 成 Serum-Free Medium.<br />
比 例 : 2:1 → 1:1 → 1:4 → 1:6 → 1:<strong>10</strong> → 完 全 為 serum-free medium<br />
Serum-Free Medium cell culture<br />
請 選 擇 AthenaES 的 serum-free medium 系 列 產 品 來 培 養 細 胞<br />
增 加 貼 附 性 細 胞 的 貼 附 性 和 存 活 率<br />
可 以 使 用 AthenaES 的 FNC Coating Mix 來 增 加 貼 附 性 細 胞 的 貼 附<br />
性 , 增 加 細 胞 的 存 活 率<br />
細 胞 繼 代 (cell passage / cell dissociation)<br />
大 多 用 trypsin 將 細 胞 從 dish/flask 分 離 下 來 , 使 用 方 法 為 放 在 37 度<br />
incubate 1 分 鐘 , 因 為 過 長 的 時 間 trypsin 會 對 細 胞 造 成 傷 害 。<br />
可 以 使 用 AthenaES 的 PET 來 取 代 trypsin, 減 少 對 細 胞 的 傷 害<br />
細 胞 保 存 (cell storage / cell dissociation)<br />
大 多 用 DMSO 加 上 medium, 但 處 理 不 當 易 造 成 細 胞 存 活 率 下 降 。<br />
可 以 使 用 AthenaES 的 Freezing Media Pair 搭 配 PET 使 用<br />
增 加 細 胞 解 凍 後 的 存 活 率<br />
14<br />
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Serum-Free Medium 系 列 產 品<br />
皆 為 antibiotic-free medium<br />
BRFF-BMZERO TM Catalog No. 0401 500mL<br />
適 合 的 細 胞 : Human Breast Cells<br />
應 用 範 圍 : 從 Human breast tissue 建 立 新 的 epithelial cell lines<br />
Used by major cancer research centers<br />
BRFF-EPM2 TM Catalog No. 0402 500mL<br />
適 合 的 細 胞 : Human Esophageal Epithelial Cells (Epidermal-like Cells)<br />
應 用 範 圍 : 從 Human skin 和 食 道 所 分 離 的 epithelial cells<br />
Used by major cancer research centers<br />
BRFF-HPC1 TM Catalog No. 0403 500mL<br />
適 合 的 細 胞 : Human Prostate Cells<br />
應 用 範 圍 : 從 Human prostatic hyperplasia 和 prostatic carcinoma 所 分 離 的<br />
epithelial cells 來 建 立 新 的 Epithelial cell lines<br />
Used by major cancer research centers<br />
BRFF-P4-8F TM Catalog No. 0404 500mL<br />
適 合 的 細 胞 : Human Normal Prostate Cells / Prostate Cancer Cell Lines<br />
應 用 範 圍 : 267-B1, PC-3<br />
Used by major cancer research centers<br />
DMEM F/12 TM Catalog No. 04<strong>10</strong> 500mL<br />
適 合 的 細 胞 : Wide range of cells<br />
Ready-to-use medium, 內 含 L-glutamine, Hepes, BRP 和 EGF<br />
為 1:1 的 DMEM 和 Ham's F12 medium<br />
不 含 phenol red<br />
IMDM TM Catalog No. 0411 500mL<br />
適 合 的 細 胞 : Wide range of cells<br />
Ready-to-use medium, 內 含 L-glutamine, Hepes, BRP 和 EGF<br />
Standard medium<br />
不 含 phenol red<br />
15<br />
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Serum-Free Medium 系 列 產 品<br />
皆 為 antibiotic-free medium<br />
PET TM Catalog No. 0405 <strong>10</strong>0mL<br />
目 的 : 將 單 層 細 胞 從 flask / dish 解 離 下 來 (cell dissociation)<br />
使 用 方 法 : 單 層 細 胞 先 用 HBS (Hepes Buffered Saline) wash, 再 加 入 3 ml ice cold<br />
PET, 靜 置 於 室 溫 至 細 胞 開 始 從 flask / dish 底 部 分 離 , 然 後 將 大 部 分 的 PET 移 除 , 繼 續<br />
靜 置 至 細 胞 飄 起 , 之 後 再 加 入 cold HBS 內 含 5% FBS 來 停 止 tryptic action, 離 心 去 除<br />
上 清 液 , 加 入 AthenaES serum-free medium 來 培 養 細 胞 。<br />
內 含 Polyvinylpyrrolidone, EGTA 和 Trypsin<br />
亦 可 稱 PET 為 Cold Trypsin<br />
Freezing Media Pair Catalog No. 0406 各 25mL<br />
目 的 : 冷 凍 細 胞 用<br />
使 用 方 法 : 以 4X<strong>10</strong> 6 cells/ml 為 例 :<br />
以 1ml 的 ice-cold Freezing Medium A 將 細 胞 打 散 , 在 加 入 等 量 的 Freezing<br />
Medium B 混 合 均 勻 後 , 慢 慢 降 溫 到 -80 度 ( 依 每 分 鐘 一 度 的 下 降 方 式 ), 之 後 也 可<br />
以 將 細 胞 保 存 在 液 態 氮 中 。<br />
內 含 A, B 兩 種 Freezing Medium<br />
解 凍 後 的 細 胞 存 活 率 高<br />
FNC Coating Mix ® Catalog No. 0407 50mL<br />
目 的 : 增 加 細 胞 的 貼 附 性<br />
內 含 coating fibronectin, collagen 和 albumin<br />
使 用 方 法 : 以 T25 為 例 :<br />
加 入 5ml FNC coating mix ( 以 蓋 過 flask / dish 表 面 為 主 ), 靜 至 於 室 溫 30 秒 後 移 除<br />
( 也 可 以 在 要 培 養 細 胞 前 1 小 時 先 準 備 好 ), 不 需 wash 即 可 直 接 將 細 胞 seeding<br />
Hepes Buffered Saline (with phenol red) Catalog No. 0408 500mL<br />
Hepes Buffered Saline (without phenol red) Catalog No. 0407 500mL<br />
目 的 : wash cell<br />
搭 配 PET 使 用 來 使 細 胞 分 離 和 收 細 胞<br />
16<br />
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Serum-Free Medium 系 列 產 品<br />
皆 為 antibiotic-free medium<br />
Serum-Free Medium Screening Kit Catalog No. 0415 1 Kit<br />
適 合 的 細 胞 : Human Cells<br />
應 用 範 圍 : 主 要 為 screening cell medium 用<br />
內 含 BRFF-BMZERO, BRFF-EPM2, BRFF-P4-8F, DMEM/F12, IMDM 各 <strong>10</strong>0mL 及<br />
FNC Caoting Mix 25mL<br />
Used by major cancer research centers<br />
此 實 驗 為 將 267-B1 seeding 在 有<br />
用 FNC coating mix 處 理 過 的<br />
T25, 在 加 入 不 同 的 serum-free<br />
medium 來 培 養 24 小 時 後 的 結<br />
果 , 由 結 果 可 得 知 BRFF-BMZERO<br />
最 適 合 267-B1 生 長 。<br />
Reference<br />
Iype, E. L., Michael, M., Verma, M. and Iype, P. T. 1998. Development and characterization of<br />
new immortalized human breast cell lines. Cytotechnology. 26:207‐218.<br />
Iype, P. T., Stoner, G. D., Gabriel, B. W., and Kaighn, M. E. 1993. A serum‐free medium for human<br />
epidermal‐like cells. In Vitro Cell Dev. Biol. 29A:94‐96.<br />
Iype, P. T., Iype, L. E. Verma, M., and Kaighn, M. E. 1998. Establishment and characterization of<br />
immortalized human cell lines from prostatic carcinoma and benign prostatic hyperplasia. Intl.<br />
J. Oncology. 12:257‐263.<br />
Kaighn, M. E., Reddel, R. R., Lechner, J. F., Peehl, D. M., Camalier, R. F., Brash, D. E., Saffiotti, U.<br />
and Harris, C. C. 1989. Transformation of human neonatal prostate epithelial cells by strontium<br />
phosphate transfection with a plasmid containing SV40 early region genes. Cancer Res.<br />
49:3050‐3056.<br />
17<br />
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By Tiffany Lin<br />
植 物 組 織 培 養 的 理 論 起 源 於 1902 年 Haberlandt 所 提 出 來 的 植 物 細 胞 全 能 性 理 論 , 這 個 理 論<br />
主 要 是 說 明 任 何 的 細 胞 均 含 有 完 整 的 基 因 , 進 而 可 以 分 化 再 生 成 為 一 個 完 整 的 個 體 。 不 過<br />
Haberlandt 只 有 提 出 但 並 未 證 實 此 理 論 , 所 以 才 有 許 多 學 者 相 繼 投 入 研 究 植 物 組 織 培 養 的 研 究 ,<br />
研 究 學 者 有 White、Gautheret、Skoog、Reinert 等 人 , 一 直 到 1958 年 F.C. Steward 利 用 胡 蘿<br />
蔔 的 韌 皮 部 誘 導 分 化 出 幼 植 株 才 成 功 證 明 此 一 理 論 的 可 行 性 。 往 後 的 研 究 學 者 就 利 用 這 些 成 果 與<br />
基 礎 技 術 繼 續 進 行 研 究 , 植 物 組 織 培 養 才 進 入 生 產 應 用 的 階 段 。<br />
植 物 組 織 培 養 是 一 種 將 植 物 體 的 部 分 細 胞 或 組 織 與 母 體 分 離 , 在 適 當 的 條 件 下 加 以 培 養 , 使<br />
它 們 能 夠 生 長 、 發 育 、 分 化 與 增 殖 的 技 術 。 原 理 是 來 自 植 物 細 胞 的 全 能 性 分 化 能 力 , 也 就 是 植 物 體<br />
內 的 某 一 類 細 胞 , 能 夠 獨 立 發 育 並 且 分 化 成 為 完 整 的 植 物 成 體 。 植 物 組 織 培 養 能 夠 以 少 量 的 母 體 培<br />
養 出 大 量 的 植 物 , 這 使 植 物 組 織 培 養 有 許 多 的 用 途 , 例 如 基 礎 值 物 學 與 遺 傳 學 研 究 , 以 及 農 業 上 的<br />
育 種 與 品 種 保 留 。 一 般 來 說 會 先 誘 導 出 癒 傷 組 織 (callus) 培 養 , 進 而 再 添 加 植 物 激 素 來 長 葉 發 根 ,<br />
形 成 植 株 。<br />
植 物 組 織 培 養 的 方 法 , 一 般 進 行 組 培 時 必 須 在 無 菌 操 作 台 上 進 行 , 所 有 使 用 的 器 具 如 鑷 子 、<br />
培 養 瓶 、 刀 片 等 等 都 需 要 經 過 殺 菌 滅 菌 消 毒 才 可 使 用 , 避 免 所 要 培 養 的 組 織 受 到 細 菌 和 真 菌 的 感<br />
染 , 因 為 微 生 物 的 感 染 是 最 常 見 的 組 培 失 敗 原 因 。 常 用 的 組 培 材 料 為 根 、 莖 、 葉 、 花 藥 、 種 子 與 胚<br />
等 等 。 一 般 來 說 植 物 生 長 所 需 的 培 養 基 通 常 還 有 醣 類 ( 例 如 蔗 糖 )、 維 生 素 、 植 物 激 素 ( 例 如 細 胞 分 裂<br />
素 、 秋 水 仙 素 ) 以 及 一 些 大 量 元 素 與 微 量 元 素 , 添 加 的 方 式 為 以 化 合 物 的 形 式 溶 入 培 養 基 ( 例 如<br />
NH 4 NO 3 ), 有 些 培 養 基 也 會 加 入 活 性 炭 , 來 模 擬 根 的 生 長 環 境 。<br />
目 前 植 物 組 織 培 養 的 應 用 如 下 : 一 、 建 立 健 康 種 苗 生 產 體 系 ; 二 、 利<br />
用 組 織 培 養 技 術 繁 殖 特 定 用 途 之 種 苗 ; 三 、 利 用 細 胞 培 養 生 產 二 次 代<br />
謝 物 ; 四 、 利 用 體 胚 繁 殖 技 術 生 產 人 工 種 子 。 這 些 應 用 可 以 使 得 稀 有<br />
植 株 得 予 復 育 , 具 經 濟 價 值 的 二 次 代 謝 物 得 以 量 產 , 例 如 紫 杉 醇 、<br />
ginsenosides、berberine、tanshinones, 這 些 具 有 藥 用 價 值 的 產 物<br />
產 量 是 和 培 養 基 成 分 和 方 法 具 極 大 的 相 關 性 。 且 台 灣 在 花 卉 上 的 種 苗<br />
育 種 和 農 產 品 的 育 種 上 因 為 組 織 培 養 而 得 到 國 際 間 的 讚 賞 且 具 一 席 之 地 , 且 在 分 子 生 物 的 科 學 研<br />
究 上 也 屢 屢 得 到 國 際 間 的 肯 定 , 加 上 政 府 的 大 力 支 持 推 廣 , 使 得 植 物 組 織 培 養 在 台 灣 是 日 趨 重 要<br />
的 。 18<br />
Plant Cell Technology www.ppm4plant‐tc.com
植 物 組 織 培 養 可 以 依 階 段 區 分 為 : 一 、 引 發 癒 傷 組 織 (callus), 因 為 只 有 callus 可 以 進 行 組<br />
織 培 養 。 二 、 從 callus 誘 導 成 根 或 芽 。 組 培 的 方 式 可 以 分 為 三 種 : 一 、 固 體 培 養 , 將 植 物 組 織<br />
放 至 於 固 體 的 培 養 基 上 , 通 常 培 養 在 玻 璃 瓶 或 塑 膠 瓶 內 。 二 、 平 板 培 養 , 將 植 物 組 織 埋 於 固 體 培<br />
養 基 中 , 並 且 培 養 在 培 養 皿 。 三 、 液 體 培 養 , 將 植 物 組 織 培 養 在 液 體 培 養 基 中 , 一 般 來 說 培 養 在<br />
生 物 反 應 器 內 , 可 以 在 細 分 為 靜 止 培 養 、 懸 浮 培 養 和 漂 浮 培 養 。 在 整 個 組 織 培 養 的 過 程 , 最 擔 心<br />
的 就 是 微 生 物 的 汙 染 , 所 以 Plant Cell Technology 研 發 出 一 個 嶄 新 用 於 植 物 組 織 培 養 的 抗 菌 與<br />
抗 真 菌 劑 ,PPM (Plant Preservative Mixture)。PPM 為 酸 性 的 溶 液 (pH3.8), 特 性 為 對 熱 很<br />
穩 定 , 可 以 和 medium 一 起 滅 菌 , 或 是 培 養 基 滅 菌 後 加 入 , 且 可 以 阻 止 bacteria 和 fungi 發 芽<br />
生 長 , 降 低 endogenous contamination。 一 般 建 議 使 用 量 為 0.05~0.2%,PPM 的 儲 存 溫 度<br />
為 4 度 。<br />
產 品 編 號 與 包 裝 : PPM_30 ml / <strong>10</strong>0 ml / 250 ml / 500 ml / 1 L / 2 L<br />
使 用 方 法<br />
For callus : 一 般 PPM 濃 度 為 0.05~0.075% (1L 培 養 基 加 入 0.5~0.75ml PPM)<br />
For Endogenous Contamination :<br />
< For seeds> 添 加 2~3% PPM 在 一 般 習 慣 使 用 的 medium, 但 千 萬 不 要 添 加 Tween 20<br />
和 pH 調 整 劑 在 裡 頭 ,stir 8~12 小 時 , 之 後 直 接 拿 出 放 入 含 有 PPM 的 培 養 基 裡 , 若 是<br />
herbaceous plants 換 至 0.05~0.1% PPM 的 germination medium 即 可 ; 而 woody<br />
plants 則 換 至 0.2%PPM 的 germination medium。<br />
< For explants> 以 1cm explants 為 例 , 添 加 4~5% PPM in full MS strength basal<br />
salts , 但 千 萬 不 要 添 加 Tween 20 和 pH 調 整 劑 在 裡 頭 ,stir 4~12 小 時 , 之 後 直 接 拿 出 ,<br />
插 入 含 有 PPM 的 培 養 基 裡 , 若 是 herbaceous plants 換 至 0.05~0.1% PPM 的<br />
germination medium 即 可 ; 而 woody plants 則 換 至 0.2%PPM 的 germination<br />
medium。<br />
19<br />
Plant Cell Technology www.ppm4plant‐tc.com
All plants shown were grown in a medium containing 1-2 ml PPM per liter.<br />
References<br />
V. M. Jimenez., J. Castillo., E. Tavares., E. Guevara., M. Montiel. 2006. In vitro propagation<br />
of the neotropical giant bamboo, Guadua angustifolia Kunth, through axillary shoot<br />
proliferation. Plant Cell Tiss. Organ Cult. (2006)86:389 – 395.<br />
Compton, Michael E. and Jennifer M. Koch. 1999. Influence of Plant Preservative Mixture<br />
(PPM) on adventitous organogenesis. In Vitro - Plant 35(3): 40-A.<br />
Compton Michael E. and Jenniffer M. Koch 2001. Influence of Plant Preservative Mixture<br />
( PPM ) on adventitious organogenesis in melon, petunia and tobacco. In Vitro Cell Dev.<br />
Biol.- Plant 37: 259-261.<br />
Guri, Assaf Z. and Kishor N. Patel. 1998. Compositions and methods to prevent microbial<br />
contamination of plant tissue culture media. United States Patent 5,750,402 (Go to: and<br />
type in "Guri" in the search box in the US patent office patent website).<br />
Guri, Assaf Z. 1998. Advances in Controlling Plant Tissue Culture Contamination Using<br />
the New Biocide PPM (Poster Presentation). XXXVII Congresso Viterbo 28-30 Septembre<br />
1998, Societa Italiana di Fisiologia Vegetale.<br />
20<br />
Plant Cell Technology www.ppm4plant‐tc.com
Feature<br />
By Tiffany Lin<br />
不 需 使 用 enzyme 來 做 ligation, 為 recombinant 方 式<br />
PCR product 不 需 純 化 , 可 以 直 接 和 linear vector<br />
(pETite) 一 起 送 入 HI-Control <strong>10</strong>G Chemically Competent<br />
Cells 內 做 recombination<br />
重 組 效 率 達 90% 以 上 , 為 T7 promoter<br />
到 挑 colony 只 需 三 步 驟 , 效 率 和 時 間 遠 超 過 傳 統 法<br />
有 N-His 和 C-His 兩 種 vector 可 以 選 擇 , 若 不 需 His 則<br />
選 擇 C-His vector 並 在 reverse primer 上 設 計 TAA 即 可<br />
每 組 kit 還 有 附 大 量 表 現 的 HI-Control BL21(DE3) cells<br />
操 作 流 程<br />
insert 的 primer set 前 後 兩 端 需 設 計 和 vector 上 一 樣 的 序 列 18mer+21mer of insert!!<br />
Step 1. Amplify target gene<br />
Step 2. Mix: unpurified PCR product (1-3ul/25-<strong>10</strong>0ng) + linear vector (25ng/2ul)<br />
into HI-Control <strong>10</strong>G Chemically Competent Cells<br />
Step 3. Transform cells on YT—Kan agar plate<br />
Step 4. Colony PCR Screening<br />
Step 5. Protein expression in HI-Control BL21(DE3) cells<br />
產 品 規 格 包 裝 產 品 編 號<br />
21<br />
Expresso T7 Cloning and Expression System, N-His<br />
Expresso T7 Cloning and Expression System, C-His<br />
Expresso T7 Cloning and Expression System, N/C-His<br />
Combo, 5 of each N-His and C-His<br />
5 reaction<br />
<strong>10</strong> reaction<br />
5 reaction<br />
<strong>10</strong> reaction<br />
49001-1<br />
49001-2<br />
49002-1<br />
49002-2<br />
<strong>10</strong> reaction 49000-1<br />
Lucigen www.lucigen.com
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MicroChemi ─ 全 新 冷 光 影 像 系 統<br />
梁 成 芝 彙 整<br />
外 型 輕 巧 、 操 作 簡 便 、 功 能 齊 全 、 靈 敏 度 高<br />
DNR 公 司 全 新 冷 光 影 像 系 統 ─ MicroChemi<br />
外 型 輕 巧 不 占 空 間 , 影 像 系 統 高 達 800 萬 畫 素 , 雙 製 冷 片 冷 卻<br />
系 統 , 最 低 冷 卻 溫 度 可 達 – 60℃, 曝 光 時 間 最 長 可 達 24 hr。<br />
ECL 呈 色 靈 敏 度 可 達 0.6 pg (Actin)。<br />
MicroChemi 產 品 詳 細 規 格<br />
Applications :<br />
感 光 元 件 Type CCD<br />
冷 卻 系 統<br />
雙 製 冷 片 (Peltier) 冷 卻 系 統<br />
最 低 可 達 - 60℃<br />
Resolution 1200x1600; 800 萬 畫 素<br />
Pixel size<br />
7.4 x 7.4 um<br />
Gradation 16bit (65536 色 灰 階 )<br />
Dynamic Range 4.6 倍<br />
Exposure Time 0.5s ~ 24 hr<br />
Lens<br />
F/0.95<br />
Binning<br />
1x1 ~ 8x8<br />
Dark Chamber 雙 層 避 光 暗 箱<br />
光 源<br />
頂 部 白 光<br />
Field of View <strong>10</strong> x 14 cm<br />
Size<br />
W 35 x L 32 x H 64 cm<br />
Weight<br />
19 kg<br />
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