ProNews-10-Q3 - 波仕特生物科技股份有限公司

波 仕 特 季 刊
波 仕 特 網 頁 全 新 改 版 !
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養 細 胞 不 一 定 要 加 血 清
─ 無 血 清 細 胞 培 養 專 題
2010 Q3
CELLNTEC
─ 無 血 清 的 前 驅 細 胞 培 養
Athena E.S.
─ Serum Free Medium Cell Culture 相 關 系 列 產 品
波 仕 特 新 品 快 報
─ Plant Cell Technology : Plant Preservative Mixture
─ Lucigen : Expresso T7 Cloning and Expression System
─ DNR : MicroChemi 冷 光 影 像 系 統
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來 自 瑞 士 的 CELLNTEC
── 上 皮 前 驅 細 胞 專 用 PCT 培 養 基 及 3D 細 胞 培 養 的 專 家
梁 成 芝 撰
什 麼 是 前 驅 細 胞
幹 細 胞 在 再 生 醫 學 上 的 前 景 可 謂 眾 所 皆 知 , 但 許 多 相 關 的 機 制 仍 不 明 確 。 為 了 進 行 相 關 研 究 ,
原 本 十 分 困 難 的 in vitro 幹 細 胞 培 養 , 變 成 了 進 行 這 類 研 究 的 入 門 工 具 。 以 往 幹 細 胞 的 來 源 主 要 是
具 有 分 化 全 能 性 (Pluripotent ) 的 胚 胎 幹 細 胞 (Embryonic Stem Cell)。 但 近 年 研 究 發 現 了 成 體 幹 細 胞
(Adult Stem Cell) 的 存 在 。 成 體 幹 細 胞 會 分 化 為 前 驅 細 胞 (Progenitor cell), 再 分 化 為 各 種 特 化 的 細
胞 , 並 同 時 停 止 細 胞 分 裂 。 前 驅 細 胞 是 和 幹 細 胞 同 樣 具 有 可 分 裂 (Proliferating) 及 未 分 化
(Undifferentiated) 特 性 的 細 胞 ; 但 其 只 能 分 化 成 一 種 或 少 數 幾 種 細 胞 (Oligopotent), 且 無 法 像 幹 細
胞 一 樣 無 限 制 的 進 行 細 胞 分 裂 。 人 體 或 動 物 各 組 織 都 會 保 留 一 小 群 前 驅 細 胞 , 在 組 織 需 要 更 新 或 修
復 時 發 揮 功 能 。 因 此 , 由 各 種 組 織 中 即 可 分 離 出 各 種 不 同 的 前 驅 細 胞 , 在 in vitro 的 狀 態 下 培 養 並
研 究 。
Symmetric Division & Asymmetric Division
Stem cell
Progenitor cell
Symmetric Division
Asymmetric Division
幹 細 胞 的 分 裂 可 以 分 為 兩 種 。
一 種 是 對 稱 分 裂 (Symmetric Division),
另 一 種 是 不 對 稱 分 裂
(Asymmetric Division)。 對 稱 分 裂 時 ,
一 個 幹 細 胞 會 變 成 兩 個 相 同 的 幹 細
胞 ; 不 對 稱 分 裂 時 , 一 個 幹 細 胞 會
分 裂 成 一 個 幹 細 胞 和 另 一 個 前 驅 細
胞 (Progenitor Cell)。 前 驅 細 胞 的 分
裂 同 樣 可 以 分 為 對 稱 及 不 對 稱 分 裂
兩 種 。 對 稱 分 裂 可 以 增 加 前 驅 細 胞
的 數 量 , 不 對 稱 分 裂 則 會 使 前 驅 細
胞 開 始 分 化 為 更 為 特 化 (Specific)
的 細 胞 。
1
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為 何 要 用 初 代 培 養 的 方 式 分 離 前 驅 細 胞
直 接 從 組 織 中 分 離 細 胞 進 行 in vitro 培 養 的 方 式 , 稱 為 初 代 培 養 (Primary Culture)。 一 般 培 養 的
不 死 細 胞 株 (Immortal Cell Line), 不 是 由 原 本 就 能 無 限 生 長 的 癌 細 胞 分 離 出 來 , 就 是 因 為 細 胞 株 已
經 轉 型 (Transformed), 因 此 才 能 無 限 的 生 長 。 這 樣 的 細 胞 株 並 不 能 真 實 的 表 現 此 細 胞 處 於 in vivo 時
的 狀 態 , 因 此 , 用 這 樣 的 細 胞 株 進 行 實 驗 的 結 果 , 自 然 容 易 和 in vivo 實 驗 有 所 差 距 。 相 較 之 下 ,
初 級 培 養 雖 然 技 術 門 檻 較 高 , 但 卻 能 較 真 實 的 反 應 細 胞 處 於 in vivo 的 狀 態 。
前 驅 細 胞 分 裂 的 次 數 有 限 , 因 此 , 在 細 胞 株 沒 有 轉 型 的 狀 況 下 , 必 須 以 初 代 培 養 的 方 式 , 才 能
取 得 細 胞 在 in vitro 狀 態 下 培 養 。 以 往 取 得 前 驅 細 胞 的 方 式 , 分 離 出 的 細 胞 原 本 就 不 多 , 分 離 後 又
必 須 使 用 feeder’s layer 來 培 養 , 培 養 上 十 分 麻 煩 。CELLNTEC 廠 牌 針 對 此 一 情 形 , 提 出 了 不 同 以 往
的 觀 點 及 對 應 的 商 品 ─ PCT 培 養 基 (Progenitor Cell Targeting Medium), 讓 前 驅 細 胞 的 分 離 及 培 養
更 容 易 。
細 胞 分 離 太 困 難
CELLNTEC 原 廠 提 供 多 種 細 胞 分 離 protocol 可 供 參 考 。 如 有 興 趣 , 可 至 原 廠 網 頁 查 詢 。
(http://www.cellntec.com/resources/protocols)
除 此 之 外 , 也 可 參 考 2010 Q2 波 仕 特 季 刊 。Worthington 廠 牌 提 供 各 種 細 胞 分 離 用 酵 素 。
此 外 還 有 肝 臟 細 胞 、 心 肌 細 胞 和 神 經 細 胞 的 專 用 細 胞 分 離 套 組 。
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CELLNTEC 三 大 產 品 線 :
1. PCT (Progenitor Cell Targeting) 培 養 基
2. Human Primary Cell & Long-Term Animal Cell
3. 3D 細 胞 培 養 model
一 、PCT 培 養 基 簡 介 :
PCT (Progenitor Cell Targeted) 培 養 基 是 CELLNTEC 公 司 的 主 力 產 品 之 一 。 CELLNTEC 研 發 團
隊 , 以 其 對 cell signal pathway 的 了 解 為 基 礎 , 模 擬 前 驅 細 胞 在 in vivo 狀 態 下 所 處 的 微 環 境 (Micro
Environment), 研 發 出 專 門 用 來 分 離 (Cell Isolation) 及 培 養 前 驅 細 胞 的 專 用 培 養 基 。
由 於 前 驅 細 胞 和 幹 細 胞 (Stem Cell) 不 同 , 並 不 能 無 限 制 的 進 行 細 胞 分 裂 。 因 此 , 若 想 要 得 到
更 多 的 前 驅 細 胞 來 進 行 後 續 實 驗 , 主 要 有 兩 種 方 法 : 一 是 提 高 細 胞 分 離 效 率 , 分 離 出 更 多 的 細 胞 ;
二 是 增 加 細 胞 分 裂 次 數 , 分 裂 出 更 多 細 胞 。PCT 培 養 基 和 傳 統 培 養 基 相 比 , 無 論 是 在 細 胞 分 離 效
率 , 或 是 繼 代 後 的 前 驅 細 胞 分 裂 活 性 等 等 , 都 有 較 好 的 表 現 。 此 外 ,PCT 培 養 基 也 可 添 加 BPE
(Bovine Pituitary Extract; 牛 腦 下 垂 體 萃 取 物 ) 來 促 進 細 胞 分 裂 , 得 到 更 多 數 量 的 前 驅 細 胞 。
PCT 培 養 基 的 優 點 :
1. 固 定 配 方 :
PCT 培 養 基 為 固 定 配 方 , 不 像 血 清 或
BPE 等 添 加 物 , 即 使 是 同 一 廠 牌 的 產 品 ,
不 同 批 號 間 , 效 果 也 常 有 落 差 。 固 定 配 方
培 養 基 , 就 沒 有 此 問 題 。 不 同 批 號 間 , 效
果 也 不 會 相 差 太 多 。 使 培 養 基 來 源 穩 定 ,
實 驗 重 覆 性 更 高 。
2. 更 好 的 細 胞 分 離 效 率 :
和 傳 統 培 養 基 相 比 ,PCT 培 養 基 即 使
沒 有 添 加 血 清 或 BPE, 在 分 離 細 胞 時 也 能
得 到 更 多 的 前 驅 細 胞 (Fig. 1.)。
3
Fig. 1. 初 代 培 養 的 表 皮 角 化 細 胞 (Epidermal keratinocytes), 細 胞 代
數 1。CnT-07 (PCT 培 養 基 ) 和 兩 種 競 爭 廠 牌 的 比 較 結 果 。 使 用 CnT
-07 培 養 基 分 離 出 的 細 胞 數 量 更 多 , 且 細 胞 形 態 較 為 正 常 。 競 爭 廠 牌
分 別 為 : 添 加 血 清 及 fibroblast conditioned medium 的 EMEM 培 養
基 ; 以 及 添 加 BPE 的 KGM 培 養 基 。
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細 胞 群 落 形 成 (Colony Formation) 可 以 反 映 出 細 胞 分
裂 的 能 力 , 形 成 的 群 落 越 多 , 表 示 具 有 分 裂 能 力 的 前 驅 細
胞 越 多 。 以 不 同
培 養 基 分 離 出 的 細 胞 進 行 細 胞 群 落 形 成 實 驗 (Fig.
2.)。 固 定 配 方 的 PCT 培 養 基 在 細 胞 代 數 1 時 即 可 形 成 細 胞
群 落 ; 添 加 少 量 BPE 後 , 細 胞 群 落 形 成 數 量 更 是 遠 大 於 添
加 大 量 BPE 的 競 爭 廠 牌 培 養 基 。 此 實 驗 結 果 顯 示 , 除 了 分
離 出 的 細 胞 總 量 更 多 之 外 ,PCT 培 養 基 還 能 分 離 出 更 多 真
正 具 有 細 胞 分 裂 能 力 的 前 驅 細 胞 。
3. 更 持 久 的 細 胞 分 裂 能 力 :
細 胞 分 裂 能 力 會 隨 著 前 驅 細 胞 開 始 分 化 而 下 降 , 當 前
驅 細 胞 完 全 分 化 的 同 時 , 細 胞 分 裂 也 隨 之 停 止 。 因 此 , 細
胞 分 裂 能 力 也 可 以 當 作 判 斷 細 胞 是 否 開 始 分 化 的 依 據 。
Fig. 2. 初 代 培 養 表 皮 角 化 細 胞 , 細 胞 代 數 1, 細 胞
群 落 形 成 分 析 (Colony Formation Assay)。CnT-07
(PCT 培 養 基 )、CnT-57 ( 含 少 量 BPE 的 PCT 培 養
基 ) 及 一 種 競 爭 廠 牌 培 養 基 的 細 胞 群 落 形 成 分 析
比 較 結 果 。 CnT-57 (PCT, Low-BPE) 形 成 最 多 細
胞 群 落 。
不 同 細 胞 代 數 的 細 胞 群 落 形 成 分 析 (Fig. 3.) 顯 示 ,
PCT 培 養 基 無 論 是 否 添 加 少 量 BPE , 到 細 胞 代 數 5 時 仍 然
能 維 持 良 好 的 細 胞 分 裂 能 力 。 相 較 之 下 , 競 爭 廠 牌 到 細 胞
代 數 5 時 , 細 胞 分 裂 能 力 已 開 始 下 降 , 表 示 細 胞 可 能 已 經
40
30
CnT - 57 (PCT - low BPE)
CnT - 07 (PCT - defined)
KSFM (Invitrogen - BPE)
分 化 , 甚 至 進 入 細 胞 凋 亡 (Apoptosis) 的 階 段 了 。
PCT 培 養 基 可 以 延 長 前 驅 細 胞 保 持 在 未 分 化 狀 態 的
時 間 並 增 加 細 胞 分 裂 的 次 數 。 也 就 是 說 , 可 延 長 初 級 培 養
CFE (%)
20
10
的 細 胞 壽 命 (Longevity), 並 由 細 胞 分 裂 得 到 更 多 的 前 驅 細
胞 來 進 行 實 驗 。
0
P0 P1 P3 P5
Passage
4. 提 高 前 驅 細 胞 純 度 :
前 驅 細 胞 也 如 同 許 多 細 胞 , 會 表 現 特 定 的 表 面 標 記
(Surface Marker), 並 可 利 用 這 些 標 記 來 判 定 細 胞 種 類 。Fig.
4. 即 為 使 用 CD34 及 Alpha-6 integrin 兩 種 細 胞 表 面 標 記 來
判 斷 前 驅 細 胞 在 所 培 養 細 胞 中 所 佔 的 比 例 。 結 果 顯 示 ,PCT
培 養 基 能 隨 著 繼 代 次 數 增 加 而 提 高 前 驅 細 胞 的 純 度 。 因 此 ,
Fig. 3. 不 同 細 胞 代 數 細 胞 群 落 形 成 效 率 (CFE;
Cell Formation Efficiency)。CnT-57 ( 含 少 量 BPE
的 PCT 培 養 基 ) 在 細 胞 代 數 1-5 都 表 現 出 最 高 的
CFE。CnT-07 (PCT 培 養 基 ) 的 CFE 則 在 細 胞 代 數
2 之 後 明 顯 增 加 , 到 細 胞 代 數 5 時 已 接 近 CnT-57。
競 爭 廠 牌 為 添 加 BPE 的 KDFM 培 養 基 。
不 需 要 特 別 的 挑 選 或 cell sorting 等 步 驟 , 只 要 隨 著 繼 代 次
數 的 增 加 , 前 驅 細 胞 佔 的 百 分 比 即 可 明 顯 提 升 。
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Fig. 4. 老 鼠 初 代 培 養 表 皮 角 化 細 胞 , 前
驅 細 胞 表 面 標 記 CD34/Alpha-6 integrin
的 FACS (Fluorescence Activated
Cell Sorting) 分 析 。 使 用 CnT-07
(PCT 培 養 基 ) 繼 代 3 代 之 後 ,CD34 及
Alpha-6 integrin 兩 種 表 面 標 記 都 有 表
現 的 細 胞 比 例 , 從 細 胞 分 離 後 的 6% 增
加 到 68%。
5. 提 供 分 化 用 的 Non-PCT 培 養 基 :
更 換 培 養 基 通 常 需 要 一 段 讓 細 胞 適 應 的 時 間 , 且 有 時 會 對 細 胞 造 成 無 法 預 期 的 影 響 。 為 了 避 免 時 間
的 浪 費 及 增 加 不 必 要 的 實 驗 變 因 ,CELLNTEC 原 廠 提 供 了 成 份 與 PCT 培 養 基 相 近 的 分 化 用 培 養 基 ─ Non
-PCT 培 養 基 。
Non-PCT 培 養 基 提 供 一 個 細 胞 分 化 的 理 想 環 境 。 且 可 依 據 實 驗 需 求 , 添 加 誘 導 細 胞 分 化 的 誘 導 物 。
CELLNTEC 的 三 種 培 養 基 及 用 途 :
CELLNTEC 原 廠 提 供 三 種 培 養 基 , 分 別 為 : PCT 培 養 基 (Defined)、PCT 培 養 基 (Low-BPE)、
及 Non-PCT 培 養 基 。 兩 種 PCT 培 養 基 都 是 用 於 分 離 及 培 養 前 驅 細 胞 ,Non-PCT 培 養 基 則 是 用 於 細
胞 分 化 時 , 又 可 分 為 2D 細 胞 或 3D 細 胞 分 化 使 用 的 培 養 基 。
三 種 培 養 基 的 成 份 彼 此 相 似 , 因 此 細 胞 培 養 時 , 培 養 基 間 的 轉 換 十 分 容 易 。 使 用 “PCT 培 養 基
(Defined)” 或 “PCT 培 養 基 (Low-BPE)” 分 離 出 來 的 前 驅 細 胞 , 皆 可 直 接 轉 換 為 “Non-PCT 培 養 基 ”
來 進 行 細 胞 分 化 實 驗 。 此 外 , 由 於 “PCT 培 養 基 (Low-BPE)” 在 分 離 細 胞 時 的 效 率 和 形 成 細 胞 群 落
的 能 力 較 好 , 因 此 有 些 實 驗 室 會 採 用 “PCT 培 養 基 (Low-BPE)” 來 分 離 細 胞 , 在 繼 代 2 代 之 後 再 改
用 “PCT 培 養 基 (Defined)” 培 養 。
三 種 培 養 基 的 簡 易 用 途 說 明 , 及 培 養 基 選 擇 列 表 請 見 下 頁 。
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CELLNTEC 不 同 組 織 及 用 途 專 用 PCT 培 養 基 列 表
PCT 培 養 基 (Defined)
── 固 定 配 方 , 用 於 分 離 及 培 養 前 驅 細 胞
PCT 培 養 基 (Low-BPE)
── 非 固 定 配 方 , 添 加 BPE 刺 激 細 胞 分 裂 , 用 於 分 離 及 培 養 前 驅 細 胞
Non-PCT 培 養 基 (Differentiation)
── 固 定 配 方 , 分 化 前 驅 細 胞 時 使 用 的 培 養 基 。
Tissue
表 皮 (Epidermis)
前 列 腺 (Prostate)
氣 管 (Airway)
Species
PCT
(Defined)
PCT
(Low-BPE)
Non-PCT
(Differentiation)
H/M CnT-07 CnT-57 CnT-02
R CnT-03 CnT-33
D CnT-09* CnT-09*
S CnT-08* CnT-08*
H CnT-12 CnT-52
R
CnT-11
H/M CnT-17 CnT-23
R CnT-14 CnT-34
R CnT-15 CnT-35
乳 腺 (Mammary) H CnT-27 CnT-54 CnT-22
角 膜 (Cornea) H/M CnT-20 CnT-50 CnT-30
口 腔 (Oral) H/M CnT-24 CnT-32
陰 道 (Vagina)
H CnT-19 CnT-55 CnT-39
R CnT-03 CnT-33
膀 胱 (Bladder)
H CnT-18 CnT-58 CnT-21
R CnT-16 CnT-36
真 皮 (Dermis) H/M/R CnT-05*
H: Human, M: Mouse, R: Rat, D: Dog, S: Sheep. * 表 示 培 養 基 含 血 清
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CELLNTEC PCT 培 養 基 初 次 使 用 注 意 事 項
CELLNTEC 提 供 多 種 100 mL 包 裝 的 培 養 基 組 合 給 初 次 使 用 的 客 戶 。 由 於 細 胞 培 養 實 驗 中 , 影
響 細 胞 生 長 狀 態 的 因 素 繁 多 , 因 此 針 對 初 次 使 用 CELLNTEC 產 品 的 客 戶 , 原 廠 提 供 了 下 列 幾 點 注
意 事 項 , 希 望 能 協 助 各 位 在 使 用 CELLNTEC 產 品 時 , 能 更 快 上 手 , 並 且 更 公 平 的 比 較 CELLNTEC
與 他 牌 的 產 品 。
Media Testing Recommendations
1. Switching Media
生 物 細 胞 之 間 常 會 有 彼 此 影 響 的 情 況 , 也 可 稱 細 胞 間 交 互 作 用 (Extracellular Signal
Interaction)。 因 此 , 一 般 實 驗 室 所 使 用 的 培 養 基 , 尤 其 是 含 有 FBS 或 BPE 等 含 有 細 胞 間 訊
息 傳 導 分 子 (Extracellular Signal Molecules) 的 成 份 時 , 常 會 對 所 培 養 細 胞 的 訊 息 傳 導
(Signal Pathway) 產 生 影 響 。 此 種 影 響 常 會 造 成 一 種 篩 選 的 壓 力 , 使 細 胞 群 中 比 較 適 應 此 一
環 境 的 亞 群 體 (Sub-Population) 數 量 急 遽 增 加 。 此 種 情 況 若 發 生 , 則 亞 群 體 會 較 難 適 應 其 他
環 境 , 也 就 是 說 , 如 果 在 細 胞 適 應 一 種 培 養 基 之 後 , 貿 然 更 換 培 養 基 , 往 往 會 產 生 不 好 的
效 果 。 這 種 不 良 反 應 並 非 因 為 新 的 培 養 基 品 質 較 差 , 而 是 因 為 培 養 環 境 的 驟 然 改 變 , 使 得
已 經 適 應 原 本 環 境 的 細 胞 亞 群 體 無 所 適 從 的 原 故 。 為 了 避 免 此 情 況 影 響 新 舊 培 養 基 比 較 的
公 平 性 , 建 議 可 採 用 兩 種 方 法 來 避 免 此 一 情 況 。 方 法 一 , 將 新 的 培 養 基 以 系 列 稀 釋 的 方 式 ,
逐 步 添 加 至 舊 的 培 養 基 中 , 直 到 細 胞 適 應 新 環 境 之 後 , 再 比 較 新 舊 培 養 基 所 培 養 細 胞 的 各
種 表 現 ; 方 法 二 , 直 接 從 組 織 分 離 新 的 細 胞 , 並 以 新 舊 兩 種 培 養 基 培 養 。 如 果 組 織 來 源 並
不 是 很 難 取 得 , 方 法 二 顯 然 是 較 為 直 觀 又 公 平 的 比 較 方 法 。
2. Seeding Density
使 用 PCT 培 養 基 並 不 需 要 額 外 添 加 Feeder’s Layer、Conditioned Medium、Plate
Coating, 或 其 他 添 加 物 (Supplement), 即 可 分 離 或 培 養 前 驅 細 胞 。 但 如 果 細 胞 密 度 太 低 時 ,
上 述 這 些 方 法 卻 可 能 對 細 胞 生 長 有 所 助 益 。 請 參 考 原 廠 網 頁 提 供 的 Protocol, 或 視 實 驗 需
求 決 定 是 否 在 使 用 PCT 培 養 基 時 , 搭 配 上 述 的 方 法 。
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3. Supplementation
大 部 分 的 細 胞 培 養 添 加 物 , 都 含 有 刺 激 細 胞 分 裂 或 生 長 的 細 胞 間 訊 息
傳 導 分 子 , 例 如 BPE 或 是 FBS。 如 果 原 本 的 培 養 基 含 有 此 類 添 加 物 , 或 是
包 含 了 PCT 培 養 基 中 的 成 份 , 如 EGF、FGF 等 等 , 建 議 在 試 用 時 , 同 時 測
試 含 有 和 不 含 添 加 物 的 組 合 , 才 能 客 觀 的 判 斷 使 用 PCT 培 養 基 是 否 讓 細 胞
生 長 狀 況 改 善 。
4. Trypsinization
血 清 中 含 有 胰 蛋 白 酶 抑 制 物 (Trypsin Inhibitor) 能 抑 制 胰 蛋 白 酶 的 反 應 。
使 用 含 有 血 清 的 傳 統 培 養 基 培 養 時 , 繼 代 完 只 需 加 入 培 養 基 , 即 可 終 止 胰 蛋
白 酶 的 反 應 。 但 由 於 PCT 培 養 基 屬 於 無 血 清 培 養 基 , 繼 代 後 如 果 沒 有 加 入 適
當 的 胰 蛋 白 酶 抑 制 物 , 是 無 法 終 止 胰 蛋 白 酶 反 應 的 , 因 此 使 用 PCT 培 養 基
時 , 原 廠 建 議 搭 配 大 豆 胰 蛋 白 酶 (Soybean Trypsin Inhibitor) 來 抑 制 胰 蛋 白 酶
反 應 。
5. Other Variables
細 胞 分 離 效 率 及 細 胞 培 養 生 長 狀 況 也 受 到 很 多 其 他 因 素 的 影 響 , 如 組
織 來 源 、 組 織 來 源 的 生 物 體 年 齡 、 物 種 、 及 動 物 品 系 (Animal Strain) 等 等 。
如 需 要 原 廠 其 他 技 術 支 援 , 歡 迎 與 我 們 聯 絡
(tech@bio-protech.com.tw)。
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二 、Human Primary Cell & Long-Term Animal Cell
人 類 初 代 培 養 細 胞 (Primary Human Cells):
人 類 組 織 取 得 受 到 法 規 的 限 制 , 若 沒 有 特 定 的 來 源 , 有 時 候 不
易 取 得 組 織 來 分 離 前 驅 細 胞 。 因 此 ,CELLNTEC 原 廠 也 提 供 “ 人 類
初 代 培 養 細 胞 ”。CELLNTEC 使 用 PCT 培 養 基 分 離 “ 人 類 初 代 培 養
細 胞 ”, 讓 使 用 者 免 去 細 胞 分 離 的 步 驟 及 組 織 來 源 的 困 擾 , 且 得 到 的
細 胞 擁 有 前 述 各 項 使 用 PCT 培 養 基 的 優 點 。
原 廠 販 售 的 包 裝 包 括 1 瓶 500mL 建 議 使 用 的 PCT 培 養 基 及
1 管 冷 凍 保 存 的 細 胞 。 細 胞 量 有 兩 種 包 裝 可 選 擇 ,> 5 x 10 5 個 細 胞
或 > 1.5 x 10 6 個 細 胞 。
由 於 細 胞 繼 代 代 數 會 受 到 繼 代 週 期 長 短 的 影 響 , 因 此
CELLNTEC 原 廠 採 用 較 為 準 確 的 細 胞 倍 增 次 數 來 當 作 細 胞 品 質 的
指 標 。 原 廠 保 證 販 售 的 細 胞 倍 增 (Cell Doubling) 次 數 至 少 可 達 20
次 , 且 通 常 可 達 25 次 以 上 。
Fig. 5. CELLNTEC 原 廠 使 用
PCT 培 養 基 分 離 出 的 人 類 表 皮 角
化 細 胞 (PHEK; Primary Human
Epidermal Keratinocytes)。
動 物 長 期 培 養 細 胞 株 (Long-Term Animal Cell):
CELLNTEC 原 廠 除 了 初 代 培 養 細 胞 之 外 , 也 提 供 “ 動 物 長 期 培 養 細 胞 株 ”。 這 些 細 胞 株 是 由 一
般 的 組 織 分 離 出 來 後 , 經 過 持 續 的 繼 代 培 養 , 到 細 胞 展 現 出 穩 定 生 長 的 性 狀 為 止 。 這 些 細 胞 株 仍 然
會 表 現 未 分 化 細 胞 的 細 胞 表 面 標 記 , 也 可 以 經 由 誘 導 而 分 化 成 更 為 特 化 的 細 胞 。
原 廠 販 售 的 包 裝 包 括 1 瓶 500mL 建 議 使 用 的 PCT 培 養 基 及 1 管 冷 凍 保 存 的 細 胞 株 。 細 胞 量
為 > 6.5 x 10 5 個 細 胞 。 細 胞 株 的 平 均 細 胞 代 數 為 25。 原 廠 保 證 販 售 的 細 胞 株 可 以 持 續 生 長 至 少 6
個 月 , 且 通 常 可 生 長 更 久 的 時 間 。 建 議 搭 配 冷 凍 保 存 技 術 , 即 可 長 期 培 養 。
原 廠 建 議 細 胞 培 養 條 件 :
無 論 是 初 代 培 養 細 胞 或 長 期 培 養 細 胞 株 ,CELLNTEC 原 廠 都 提 供 了 詳 盡 的 細 胞 培 養 protocol,
內 容 包 括 細 胞 解 凍 及 冷 凍 條 件 、 建 議 的 繼 代 後 細 胞 密 度 (Seeding Density after Passaging) 及 針 對 各
種 不 同 細 胞 培 養 的 建 議 。 詳 細 資 料 請 上 原 廠 網 站 下 載 (http://www.cellntec.com/resources/protocols)。
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CELLNTEC 各 種 初 代 培 養 細 胞 或 細 胞 株 及 專 用 PCT 培 養 基 列 表
Cat# Product Title Species Culture Medium
CPEK Dog Epidermal Keratinocyte Progenitors Dog CnT-09
DF-BALBC Mouse (BalbC) Fibroblasts Mouse CnT-05
DF-R Rat (Wistar) Fibroblasts Rat CnT-05
HBEP.05 Human Bladder Epithelium Progenitors, Single Donor Human CnT-58
HBEP.15 Human Bladder Epithelium Progenitors, Single Donor Human CnT-58
HCEP.05 Human Corneal Epithelium Progenitors, Single Donor Human CnT-20
HCEP.15 Human Corneal Epithelium Progenitors, Single Donor Human CnT-20
HDFs.05 Human Dermal Fibroblasts, Single Donor Human CnT-05
HGEPp.05 Human Gingival Epithelium Progenitors, Pooled Human CnT-24
HGEPp.15 Human Gingival Epithelium Progenitors, Pooled Human CnT-24
HGEPs.05 Human Gingival Epithelium Progenitors, Single Donor Human CnT-24
HPEKp.05 Human Epidermal Keratinocyte Progenitors, Pooled Human CnT-57
HPEKp.15 Human Epidermal Keratinocyte Progenitors, Pooled Human CnT-57
HPEKs.05 Human Epidermal Keratinocyte Progenitors, Single Donor Human CnT-57
HPEKs.15 Human Epidermal Keratinocyte Progenitors, Single Donor Human CnT-57
MPEK-129 Mouse (129) Epidermal Keratinocyte Progenitors Mouse CnT-02
MPEK-BL6 Mouse (C57BL/6) Epidermal Keratinocyte Progenitors Mouse CnT-02
RBLAK-WIS Rat (Wistar) Bladder Epithelium Progenitors Rat CnT-16
RLAK-WIS Rat (Wistar) Large Airway Epithelium Progenitors Rat CnT-15
RPEK-WIS Rat (Wistar) Epidermal Keratinocyte Progenitors Rat CnT-03
RPROK-WIS Rat (Wistar) Prostate Epithelium Progenitors Rat CnT-11
RPVAK-WIS Rat (Wistar) Vaginal Keratinocyte Progenitors Rat CnT-03
RSAK-WIS Rat (Wistar) Small Airway Epithelium Progenitors Rat CnT-14
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Precision Media and Models
三 、 獨 特 的 3D 細 胞 培 養 Model
一 般 的 in vitro 細 胞 培 養 大 多 屬 於 2D (2-
Dimensional) 培 養 , 是 單 層 細 胞 貼 覆 的 形 式 , 因 此 難
以 模 擬 in vivo 狀 態 下 , 由 不 同 細 胞 構 成 的 立 體 構 造 。
CELLNTEC 利 用 PCT 培 養 基 的 技 術 為 基 礎 , 研 發 出
in vitro 3D 細 胞 培 養 系 統 , 將 分 離 出 的 前 驅 細 胞 , 分
化 成 由 不 同 細 胞 構 成 的 多 層 細 胞 構 造 , 有 效 模 擬 細 胞
處 於 in vivo 的 狀 態 。
3D 細 胞 培 養 , 關 係 到 複 雜 的 細 胞 間 交 互 作 用 , 因
此 , 對 培 養 基 的 需 求 也 十 分 挑 剔 。3D 培 養 基 的 成 份 必
須 讓 表 層 細 胞 達 到 完 全 分 化 的 狀 態 , 卻 又 必 須 保 持 最
裡 層 有 一 部 份 細 胞 仍 處 於 可 分 裂 狀 態 , 如 此 才 能 維 持
整 個 3D Model 的 持 續 發 展 。 這 些 矛 盾 的 需 求 是 傳 統
培 養 基 難 以 達 成 的 。 傳 統 培 養 基 雖 然 可 維 持 細 胞 的 可
分 裂 性 , 卻 無 法 顧 及 3D 細 胞 培 養 必 須 要 讓 表 層 細 胞
達 到 完 全 分 化 的 需 求 。PCT 培 養 基 的 原 理 是 模 擬 前
驅 細 胞 在 in vivo 狀 態 下 所 處 的 微 環 境 , 並 依 此 設 計
培 養 基 配 方 , 因 此 獨 特 的 培 方 能 促 使 細 胞 在 in vitro
狀 態 下 形 成 正 確 的 3D 構 造 。
Fig. 6. 表 皮 3D 細 胞 培 養 第 7, 14, 28 天 細 胞
結 構 切 片 。
CELLNTEC 3D 細 胞 培 養 套 組
Cat# Product Title Species Culture Medium
3D-HPEK-25 3D Keratinocyte Starter Kit including Human Primary Keratinocytes Human
CnT-02-3DP1
CnT-57
3D-HPEK-50 3D Keratinocyte Starter Kit including Human Primary Keratinocytes Human
CnT-02-3DP5
CnT-57
3D-K-25 3D Keratinocyte Starter Kit without Human Primary Keratinocytes Human
CnT-02-3DP1
CnT-57
3D-K-50 3D Keratinocyte Starter Kit without Human Primary Keratinocytes Human
CnT-02-3DP5
CnT-57
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CELLNTEC Advanced Cell Systems
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By Tiffany Lin
在 分 子 生 物 實 驗 上 , 細 胞 研 究 一 直 都 是 最 重 要 的 一 個 環 節 。 動 物 細 胞 的 培 養 技 術 最 初 起 源 於
1907 年 ,Harrison 將 青 蛙 的 胚 胎 組 織 培 養 於 顯 微 鏡 的 載 玻 片 上 並 觀 察 細 胞 的 生 長 。 由 於 初 期 細 胞
培 養 常 常 因 為 微 生 物 的 污 染 導 致 培 養 和 觀 察 失 敗 , 所 以 到 1913 年 Carrel 將 外 科 醫 生 的 無 菌 操 作 技
術 應 用 在 動 物 細 胞 培 養 上 , 細 胞 才 能 在 長 期 培 養 的 情 況 下 而 不 受 污 染 。1916 年 Rous 及 Jones 利
用 胰 蛋 白 酶 (trypsin) 由 組 織 中 分 離 細 胞 , 隨 後 發 展 出 貼 附 性 細 胞 (adherent cell) 的 繼 代 培 養
法 (subculture)。1960 年 代 開 始 在 細 胞 培 養 液 中 額 外 添 加 抗 生 素 , 此 步 驟 更 進 一 步 的 降 低 污 染
機 率 , 也 使 得 細 胞 培 養 技 術 日 漸 普 及 並 被 廣 泛 應 用 。 在 1948 年 到 1952 年 間 ,Mouse L 和 HeLa
兩 種 細 胞 株 先 後 被 建 立 。1955 年 Eagle 開 發 出 配 方 的 細 胞 培 養 液 來 取 代 先 前 的 體 液 培 養 , 更 讓 細
胞 培 養 便 的 容 易 。1975 年 Kohler 和 Milstein 研 發 出 融 合 瘤 (hybridoma) 技 術 , 之 後 被 廣 用 於
單 株 抗 體 的 製 備 。
目 前 動 物 細 胞 可 依 照 三 種 定 義 來 分 類 : 性 質 、 形 態 及 培 養 特 質 。 依 性 質 來 說 細 胞 可 以 分 為 初
級 細 胞 (primary cell)、 正 常 一 般 細 胞 (normal cell) 及 具 持 續 性 培 養 特 性 的 細 胞 株 (continue
cell line) 三 種 。 初 級 細 胞 是 直 接 以 胰 蛋 白 酶 將 動 物 組 織 或 器 官 分 解 並 分 離 出 細 胞 而 得 來 ; 正 常 一
般 細 胞 是 指 具 有 成 對 的 染 色 體 , 單 層 長 滿 後 即 不 再 增 生 , 可 以 用 胰 蛋 白 酶 使 細 胞 脫 離 附 著 面 並 進 行
繼 代 培 養 , 不 過 normal cell 無 法 一 直 培 養 。 若 想 要 可 以 持 續 培 養 , 目 前 只 有 cell line 可 以 選 擇 ,
但 cell line 基 本 上 都 是 從 tumor 所 分 離 出 的 cancer cell, 因 為 tumor 的 特 性 為 細 胞 會 持 續 分 裂 ,
不 會 走 向 細 胞 死 亡 的 路 徑 。
動 物 細 胞 依 其 外 觀 形 態 可 以 分 類 為 纖 維 狀 (fibroblast-like) 及 表 皮 狀 (epithelial-like) 兩
種 不 同 的 細 胞 。 細 胞 若 以 培 養 時 是 否 會 貼 附 的 特 性 , 又 可 以 分 為 懸 浮 性 (suspension) 及 貼 附 性
(adherent) 兩 種 細 胞 , 懸 浮 性 細 胞 如 monocyte, 適 合 的 培 養 方 法 為 懸 浮
培 養 ; 而 大 多 數 的 cell line 為 貼 附 性 細 胞 , 培 養 方 法 為 貼 附 培 養 , 有 時 可 以
在 培 養 前 先 前 處 理 培 養 皿 , 例 如 使 用 collagen、growth factor、protein 或
一 可 以 增 加 細 胞 貼 附 性 的 產 品 , 例 如 AthenaES 的 FNC Coating Mix, 這 些
方 法 都 可 以 增 加 細 胞 的 貼 附 性 , 進 而 增 加 細 胞 的 存 活 率 。
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動 物 細 胞 的 培 養 條 件
動 物 細 胞 的 培 養 條 件 應 盡 量 模 擬 來 源 動 物 體 內 的 條 件 , 而 且 在 培 養 中 保 持 不 變 。 對 大 多 數 動 物 細
胞 而 言 , 培 養 液 合 適 的 pH 為 7.2 ~ 7.4, 滲 透 壓 為 270 ~ 300 mOsM, 最 適 的 溶 氧 值 為 60% 以
上 。 目 前 動 物 細 胞 的 培 養 技 術 已 經 從 天 然 培 養 基 階 段 進 步 到 合 成 培 養 基 階 段 , 近 年 來 更 走 向 無 血
清 培 養 階 段 。
為 何 要 使 用 Serum-Free Media 因 為 血 清 有 可 能 引 發 以 下 的 問 題 :
(1) 因 為 血 清 內 有 bovine protein, 會 影 響 細 胞 實 驗 後 續 的 判 讀 , 例 如 抗 體 的 辨 識 、
transfection 的 效 率 、ELISA 等 等 實 驗 。
(2) 血 清 有 批 號 (lot) 間 的 差 異 , 因 為 血 清 來 源 為 動 物 體 , 有 未 知 成 分 的 問 題 存 在 , 而 且 現 在 又
有 狂 牛 症 的 問 題 , 所 以 動 物 性 來 源 的 產 品 容 易 影 響 細 胞 培 養 。
(3) 血 清 易 感 染 漿 黴 菌 (Mycoplasma)。
無 血 清 培 養 基 的 優 點 及 其 應 用
(1) 可 避 免 血 清 批 次 間 的 品 質 變 動 , 提 高 細 胞 培 養 和 實 驗 結 果 的 重 復 性 。
(2) 避 免 血 清 對 細 胞 的 毒 性 作 用 和 血 清 來 源 性 污 染 。
(3) 避 免 血 清 成 分 對 實 驗 研 究 的 影 響 。
(4) 有 利 於 體 外 培 養 細 胞 的 分 化 。
(5) 可 提 高 產 品 的 表 達 水 準 並 使 細 胞 產 品 易 於 純 化 。
已 經 應 用 的 領 域 有 :
(1) 研 究 細 胞 分 化 的 條 件 。
(2) 用 於 生 長 因 子 、 激 素 和 藥 物 等 等 與 細 胞 之 間 相 互 作 用 關 係 的 研 究 。
(3) 用 於 從 多 種 細 胞 混 雜 的 培 養 基 中 選 擇 目 的 細 胞 。
(4) 腫 瘤 病 理 學 和 病 因 學 的 研 究 。
(5) 用 於 生 產 疫 苗 、monoclonal antibody 和 生 物 活 性 蛋 白 等 生 物 製 品 。
缺 點 : 可 以 使 用 細 胞 的 適 用 範 圍 窄 , 但 可 以 用 screening SFM mediums 的 方 式 來 找 到 合 適 的 培
養 液 。
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一 般 的 細 胞 培 養 , 使 用 含 serum 的 培 養 液 , 例 如 DMEM+10% FBS
從 原 culture medium 慢 慢 轉 換 成 Serum-Free Medium.
比 例 : 2:1 → 1:1 → 1:4 → 1:6 → 1:10 → 完 全 為 serum-free medium
Serum-Free Medium cell culture
請 選 擇 AthenaES 的 serum-free medium 系 列 產 品 來 培 養 細 胞
增 加 貼 附 性 細 胞 的 貼 附 性 和 存 活 率
可 以 使 用 AthenaES 的 FNC Coating Mix 來 增 加 貼 附 性 細 胞 的 貼 附
性 , 增 加 細 胞 的 存 活 率
細 胞 繼 代 (cell passage / cell dissociation)
大 多 用 trypsin 將 細 胞 從 dish/flask 分 離 下 來 , 使 用 方 法 為 放 在 37 度
incubate 1 分 鐘 , 因 為 過 長 的 時 間 trypsin 會 對 細 胞 造 成 傷 害 。
可 以 使 用 AthenaES 的 PET 來 取 代 trypsin, 減 少 對 細 胞 的 傷 害
細 胞 保 存 (cell storage / cell dissociation)
大 多 用 DMSO 加 上 medium, 但 處 理 不 當 易 造 成 細 胞 存 活 率 下 降 。
可 以 使 用 AthenaES 的 Freezing Media Pair 搭 配 PET 使 用
增 加 細 胞 解 凍 後 的 存 活 率
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Serum-Free Medium 系 列 產 品
皆 為 antibiotic-free medium
BRFF-BMZERO TM Catalog No. 0401 500mL
適 合 的 細 胞 : Human Breast Cells
應 用 範 圍 : 從 Human breast tissue 建 立 新 的 epithelial cell lines
Used by major cancer research centers
BRFF-EPM2 TM Catalog No. 0402 500mL
適 合 的 細 胞 : Human Esophageal Epithelial Cells (Epidermal-like Cells)
應 用 範 圍 : 從 Human skin 和 食 道 所 分 離 的 epithelial cells
Used by major cancer research centers
BRFF-HPC1 TM Catalog No. 0403 500mL
適 合 的 細 胞 : Human Prostate Cells
應 用 範 圍 : 從 Human prostatic hyperplasia 和 prostatic carcinoma 所 分 離 的
epithelial cells 來 建 立 新 的 Epithelial cell lines
Used by major cancer research centers
BRFF-P4-8F TM Catalog No. 0404 500mL
適 合 的 細 胞 : Human Normal Prostate Cells / Prostate Cancer Cell Lines
應 用 範 圍 : 267-B1, PC-3
Used by major cancer research centers
DMEM F/12 TM Catalog No. 0410 500mL
適 合 的 細 胞 : Wide range of cells
Ready-to-use medium, 內 含 L-glutamine, Hepes, BRP 和 EGF
為 1:1 的 DMEM 和 Ham's F12 medium
不 含 phenol red
IMDM TM Catalog No. 0411 500mL
適 合 的 細 胞 : Wide range of cells
Ready-to-use medium, 內 含 L-glutamine, Hepes, BRP 和 EGF
Standard medium
不 含 phenol red
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Serum-Free Medium 系 列 產 品
皆 為 antibiotic-free medium
PET TM Catalog No. 0405 100mL
目 的 : 將 單 層 細 胞 從 flask / dish 解 離 下 來 (cell dissociation)
使 用 方 法 : 單 層 細 胞 先 用 HBS (Hepes Buffered Saline) wash, 再 加 入 3 ml ice cold
PET, 靜 置 於 室 溫 至 細 胞 開 始 從 flask / dish 底 部 分 離 , 然 後 將 大 部 分 的 PET 移 除 , 繼 續
靜 置 至 細 胞 飄 起 , 之 後 再 加 入 cold HBS 內 含 5% FBS 來 停 止 tryptic action, 離 心 去 除
上 清 液 , 加 入 AthenaES serum-free medium 來 培 養 細 胞 。
內 含 Polyvinylpyrrolidone, EGTA 和 Trypsin
亦 可 稱 PET 為 Cold Trypsin
Freezing Media Pair Catalog No. 0406 各 25mL
目 的 : 冷 凍 細 胞 用
使 用 方 法 : 以 4X10 6 cells/ml 為 例 :
以 1ml 的 ice-cold Freezing Medium A 將 細 胞 打 散 , 在 加 入 等 量 的 Freezing
Medium B 混 合 均 勻 後 , 慢 慢 降 溫 到 -80 度 ( 依 每 分 鐘 一 度 的 下 降 方 式 ), 之 後 也 可
以 將 細 胞 保 存 在 液 態 氮 中 。
內 含 A, B 兩 種 Freezing Medium
解 凍 後 的 細 胞 存 活 率 高
FNC Coating Mix ® Catalog No. 0407 50mL
目 的 : 增 加 細 胞 的 貼 附 性
內 含 coating fibronectin, collagen 和 albumin
使 用 方 法 : 以 T25 為 例 :
加 入 5ml FNC coating mix ( 以 蓋 過 flask / dish 表 面 為 主 ), 靜 至 於 室 溫 30 秒 後 移 除
( 也 可 以 在 要 培 養 細 胞 前 1 小 時 先 準 備 好 ), 不 需 wash 即 可 直 接 將 細 胞 seeding
Hepes Buffered Saline (with phenol red) Catalog No. 0408 500mL
Hepes Buffered Saline (without phenol red) Catalog No. 0407 500mL
目 的 : wash cell
搭 配 PET 使 用 來 使 細 胞 分 離 和 收 細 胞
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Serum-Free Medium 系 列 產 品
皆 為 antibiotic-free medium
Serum-Free Medium Screening Kit Catalog No. 0415 1 Kit
適 合 的 細 胞 : Human Cells
應 用 範 圍 : 主 要 為 screening cell medium 用
內 含 BRFF-BMZERO, BRFF-EPM2, BRFF-P4-8F, DMEM/F12, IMDM 各 100mL 及
FNC Caoting Mix 25mL
Used by major cancer research centers
此 實 驗 為 將 267-B1 seeding 在 有
用 FNC coating mix 處 理 過 的
T25, 在 加 入 不 同 的 serum-free
medium 來 培 養 24 小 時 後 的 結
果 , 由 結 果 可 得 知 BRFF-BMZERO
最 適 合 267-B1 生 長 。
Reference
Iype, E. L., Michael, M., Verma, M. and Iype, P. T. 1998. Development and characterization of
new immortalized human breast cell lines. Cytotechnology. 26:207‐218.
Iype, P. T., Stoner, G. D., Gabriel, B. W., and Kaighn, M. E. 1993. A serum‐free medium for human
epidermal‐like cells. In Vitro Cell Dev. Biol. 29A:94‐96.
Iype, P. T., Iype, L. E. Verma, M., and Kaighn, M. E. 1998. Establishment and characterization of
immortalized human cell lines from prostatic carcinoma and benign prostatic hyperplasia. Intl.
J. Oncology. 12:257‐263.
Kaighn, M. E., Reddel, R. R., Lechner, J. F., Peehl, D. M., Camalier, R. F., Brash, D. E., Saffiotti, U.
and Harris, C. C. 1989. Transformation of human neonatal prostate epithelial cells by strontium
phosphate transfection with a plasmid containing SV40 early region genes. Cancer Res.
49:3050‐3056.
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By Tiffany Lin
植 物 組 織 培 養 的 理 論 起 源 於 1902 年 Haberlandt 所 提 出 來 的 植 物 細 胞 全 能 性 理 論 , 這 個 理 論
主 要 是 說 明 任 何 的 細 胞 均 含 有 完 整 的 基 因 , 進 而 可 以 分 化 再 生 成 為 一 個 完 整 的 個 體 。 不 過
Haberlandt 只 有 提 出 但 並 未 證 實 此 理 論 , 所 以 才 有 許 多 學 者 相 繼 投 入 研 究 植 物 組 織 培 養 的 研 究 ,
研 究 學 者 有 White、Gautheret、Skoog、Reinert 等 人 , 一 直 到 1958 年 F.C. Steward 利 用 胡 蘿
蔔 的 韌 皮 部 誘 導 分 化 出 幼 植 株 才 成 功 證 明 此 一 理 論 的 可 行 性 。 往 後 的 研 究 學 者 就 利 用 這 些 成 果 與
基 礎 技 術 繼 續 進 行 研 究 , 植 物 組 織 培 養 才 進 入 生 產 應 用 的 階 段 。
植 物 組 織 培 養 是 一 種 將 植 物 體 的 部 分 細 胞 或 組 織 與 母 體 分 離 , 在 適 當 的 條 件 下 加 以 培 養 , 使
它 們 能 夠 生 長 、 發 育 、 分 化 與 增 殖 的 技 術 。 原 理 是 來 自 植 物 細 胞 的 全 能 性 分 化 能 力 , 也 就 是 植 物 體
內 的 某 一 類 細 胞 , 能 夠 獨 立 發 育 並 且 分 化 成 為 完 整 的 植 物 成 體 。 植 物 組 織 培 養 能 夠 以 少 量 的 母 體 培
養 出 大 量 的 植 物 , 這 使 植 物 組 織 培 養 有 許 多 的 用 途 , 例 如 基 礎 值 物 學 與 遺 傳 學 研 究 , 以 及 農 業 上 的
育 種 與 品 種 保 留 。 一 般 來 說 會 先 誘 導 出 癒 傷 組 織 (callus) 培 養 , 進 而 再 添 加 植 物 激 素 來 長 葉 發 根 ,
形 成 植 株 。
植 物 組 織 培 養 的 方 法 , 一 般 進 行 組 培 時 必 須 在 無 菌 操 作 台 上 進 行 , 所 有 使 用 的 器 具 如 鑷 子 、
培 養 瓶 、 刀 片 等 等 都 需 要 經 過 殺 菌 滅 菌 消 毒 才 可 使 用 , 避 免 所 要 培 養 的 組 織 受 到 細 菌 和 真 菌 的 感
染 , 因 為 微 生 物 的 感 染 是 最 常 見 的 組 培 失 敗 原 因 。 常 用 的 組 培 材 料 為 根 、 莖 、 葉 、 花 藥 、 種 子 與 胚
等 等 。 一 般 來 說 植 物 生 長 所 需 的 培 養 基 通 常 還 有 醣 類 ( 例 如 蔗 糖 )、 維 生 素 、 植 物 激 素 ( 例 如 細 胞 分 裂
素 、 秋 水 仙 素 ) 以 及 一 些 大 量 元 素 與 微 量 元 素 , 添 加 的 方 式 為 以 化 合 物 的 形 式 溶 入 培 養 基 ( 例 如
NH 4 NO 3 ), 有 些 培 養 基 也 會 加 入 活 性 炭 , 來 模 擬 根 的 生 長 環 境 。
目 前 植 物 組 織 培 養 的 應 用 如 下 : 一 、 建 立 健 康 種 苗 生 產 體 系 ; 二 、 利
用 組 織 培 養 技 術 繁 殖 特 定 用 途 之 種 苗 ; 三 、 利 用 細 胞 培 養 生 產 二 次 代
謝 物 ; 四 、 利 用 體 胚 繁 殖 技 術 生 產 人 工 種 子 。 這 些 應 用 可 以 使 得 稀 有
植 株 得 予 復 育 , 具 經 濟 價 值 的 二 次 代 謝 物 得 以 量 產 , 例 如 紫 杉 醇 、
ginsenosides、berberine、tanshinones, 這 些 具 有 藥 用 價 值 的 產 物
產 量 是 和 培 養 基 成 分 和 方 法 具 極 大 的 相 關 性 。 且 台 灣 在 花 卉 上 的 種 苗
育 種 和 農 產 品 的 育 種 上 因 為 組 織 培 養 而 得 到 國 際 間 的 讚 賞 且 具 一 席 之 地 , 且 在 分 子 生 物 的 科 學 研
究 上 也 屢 屢 得 到 國 際 間 的 肯 定 , 加 上 政 府 的 大 力 支 持 推 廣 , 使 得 植 物 組 織 培 養 在 台 灣 是 日 趨 重 要
的 。 18
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植 物 組 織 培 養 可 以 依 階 段 區 分 為 : 一 、 引 發 癒 傷 組 織 (callus), 因 為 只 有 callus 可 以 進 行 組
織 培 養 。 二 、 從 callus 誘 導 成 根 或 芽 。 組 培 的 方 式 可 以 分 為 三 種 : 一 、 固 體 培 養 , 將 植 物 組 織
放 至 於 固 體 的 培 養 基 上 , 通 常 培 養 在 玻 璃 瓶 或 塑 膠 瓶 內 。 二 、 平 板 培 養 , 將 植 物 組 織 埋 於 固 體 培
養 基 中 , 並 且 培 養 在 培 養 皿 。 三 、 液 體 培 養 , 將 植 物 組 織 培 養 在 液 體 培 養 基 中 , 一 般 來 說 培 養 在
生 物 反 應 器 內 , 可 以 在 細 分 為 靜 止 培 養 、 懸 浮 培 養 和 漂 浮 培 養 。 在 整 個 組 織 培 養 的 過 程 , 最 擔 心
的 就 是 微 生 物 的 汙 染 , 所 以 Plant Cell Technology 研 發 出 一 個 嶄 新 用 於 植 物 組 織 培 養 的 抗 菌 與
抗 真 菌 劑 ,PPM (Plant Preservative Mixture)。PPM 為 酸 性 的 溶 液 (pH3.8), 特 性 為 對 熱 很
穩 定 , 可 以 和 medium 一 起 滅 菌 , 或 是 培 養 基 滅 菌 後 加 入 , 且 可 以 阻 止 bacteria 和 fungi 發 芽
生 長 , 降 低 endogenous contamination。 一 般 建 議 使 用 量 為 0.05~0.2%,PPM 的 儲 存 溫 度
為 4 度 。
產 品 編 號 與 包 裝 : PPM_30 ml / 100 ml / 250 ml / 500 ml / 1 L / 2 L
使 用 方 法
For callus : 一 般 PPM 濃 度 為 0.05~0.075% (1L 培 養 基 加 入 0.5~0.75ml PPM)
For Endogenous Contamination :
< For seeds> 添 加 2~3% PPM 在 一 般 習 慣 使 用 的 medium, 但 千 萬 不 要 添 加 Tween 20
和 pH 調 整 劑 在 裡 頭 ,stir 8~12 小 時 , 之 後 直 接 拿 出 放 入 含 有 PPM 的 培 養 基 裡 , 若 是
herbaceous plants 換 至 0.05~0.1% PPM 的 germination medium 即 可 ; 而 woody
plants 則 換 至 0.2%PPM 的 germination medium。
< For explants> 以 1cm explants 為 例 , 添 加 4~5% PPM in full MS strength basal
salts , 但 千 萬 不 要 添 加 Tween 20 和 pH 調 整 劑 在 裡 頭 ,stir 4~12 小 時 , 之 後 直 接 拿 出 ,
插 入 含 有 PPM 的 培 養 基 裡 , 若 是 herbaceous plants 換 至 0.05~0.1% PPM 的
germination medium 即 可 ; 而 woody plants 則 換 至 0.2%PPM 的 germination
medium。
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All plants shown were grown in a medium containing 1-2 ml PPM per liter.
References
V. M. Jimenez., J. Castillo., E. Tavares., E. Guevara., M. Montiel. 2006. In vitro propagation
of the neotropical giant bamboo, Guadua angustifolia Kunth, through axillary shoot
proliferation. Plant Cell Tiss. Organ Cult. (2006)86:389 – 395.
Compton, Michael E. and Jennifer M. Koch. 1999. Influence of Plant Preservative Mixture
(PPM) on adventitous organogenesis. In Vitro - Plant 35(3): 40-A.
Compton Michael E. and Jenniffer M. Koch 2001. Influence of Plant Preservative Mixture
( PPM ) on adventitious organogenesis in melon, petunia and tobacco. In Vitro Cell Dev.
Biol.- Plant 37: 259-261.
Guri, Assaf Z. and Kishor N. Patel. 1998. Compositions and methods to prevent microbial
contamination of plant tissue culture media. United States Patent 5,750,402 (Go to: and
type in "Guri" in the search box in the US patent office patent website).
Guri, Assaf Z. 1998. Advances in Controlling Plant Tissue Culture Contamination Using
the New Biocide PPM (Poster Presentation). XXXVII Congresso Viterbo 28-30 Septembre
1998, Societa Italiana di Fisiologia Vegetale.
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Feature
By Tiffany Lin
不 需 使 用 enzyme 來 做 ligation, 為 recombinant 方 式
PCR product 不 需 純 化 , 可 以 直 接 和 linear vector
(pETite) 一 起 送 入 HI-Control 10G Chemically Competent
Cells 內 做 recombination
重 組 效 率 達 90% 以 上 , 為 T7 promoter
到 挑 colony 只 需 三 步 驟 , 效 率 和 時 間 遠 超 過 傳 統 法
有 N-His 和 C-His 兩 種 vector 可 以 選 擇 , 若 不 需 His 則
選 擇 C-His vector 並 在 reverse primer 上 設 計 TAA 即 可
每 組 kit 還 有 附 大 量 表 現 的 HI-Control BL21(DE3) cells
操 作 流 程
insert 的 primer set 前 後 兩 端 需 設 計 和 vector 上 一 樣 的 序 列 18mer+21mer of insert!!
Step 1. Amplify target gene
Step 2. Mix: unpurified PCR product (1-3ul/25-100ng) + linear vector (25ng/2ul)
into HI-Control 10G Chemically Competent Cells
Step 3. Transform cells on YT—Kan agar plate
Step 4. Colony PCR Screening
Step 5. Protein expression in HI-Control BL21(DE3) cells
產 品 規 格 包 裝 產 品 編 號
21
Expresso T7 Cloning and Expression System, N-His
Expresso T7 Cloning and Expression System, C-His
Expresso T7 Cloning and Expression System, N/C-His
Combo, 5 of each N-His and C-His
5 reaction
10 reaction
5 reaction
10 reaction
49001-1
49001-2
49002-1
49002-2
10 reaction 49000-1
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MicroChemi ─ 全 新 冷 光 影 像 系 統
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系 統 , 最 低 冷 卻 溫 度 可 達 – 60℃, 曝 光 時 間 最 長 可 達 24 hr。
ECL 呈 色 靈 敏 度 可 達 0.6 pg (Actin)。
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Applications :
感 光 元 件 Type CCD
冷 卻 系 統
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最 低 可 達 - 60℃
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Pixel size
7.4 x 7.4 um
Gradation 16bit (65536 色 灰 階 )
Dynamic Range 4.6 倍
Exposure Time 0.5s ~ 24 hr
Lens
F/0.95
Binning
1x1 ~ 8x8
Dark Chamber 雙 層 避 光 暗 箱
光 源
頂 部 白 光
Field of View 10 x 14 cm
Size
W 35 x L 32 x H 64 cm
Weight
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