2012å¹´
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第 三 讲<br />
生 物 信 息 的 传 递<br />
( 上 ) 从 DNA 到 RNA
Crick 的 中 心 法 则 (central dogma)<br />
DNA<br />
1957 年 transcription<br />
RNA<br />
translation<br />
Reverse<br />
transcription<br />
DNA<br />
RNA<br />
1970 年<br />
Protein<br />
Protein
From DNA to Protein<br />
DNA 序 列 是 遗 传 信 息<br />
的 贮 存 者 , 它 通 过 自<br />
主 复 制 得 到 永 存 , 并<br />
通 过 转 录 生 成 信 使<br />
RNA, 翻 译 生 成 蛋 白<br />
质 的 过 程 来 控 制 生 命<br />
现 象 。
基 因 表 达 包 括 转 录 (transcription) 和<br />
翻 译 (translation) 两 个 阶 段 。<br />
转 录 是 指 拷 贝 出 一 条 与 DNA 链 序 列 完 全 相<br />
同 ( 除 了 T→U 之 外 ) 的 RNA 单 链 的 过 程 , 是<br />
基 因 表 达 的 核 心 步 骤 。<br />
翻 译 是 指 以 新 生 的 mRNA 为 模 板 , 把 核 苷 酸<br />
三 联 遗 传 密 码 子 翻 译 成 氨 基 酸 序 列 、 合 成 多<br />
肽 链 的 过 程 , 是 基 因 表 达 的 最 终 目 的 。
• Replication: synthesis of two DNA strands<br />
using both parental DNA strands as<br />
templates. Duplication of a DNA molecule<br />
1 DNA molecule 2 DNA molecules<br />
•Transcription: synthesis of one RNA molecule<br />
using one of the two DNA strands as a<br />
template.
Transcription vs. Replication<br />
Transcription is chemically and<br />
enzymatically very similar to<br />
DNA replication.<br />
6
Some important differences:<br />
1. RNA is made of ribonucleotides.<br />
2. RNA polymerase catalyzes the reaction,<br />
which does not require a primer (de novo<br />
synthesis).<br />
3. The RNA product does not remain basepaired<br />
to the template DNA strand.<br />
4. Less accurate (error rate: 10 -4 ).<br />
7
RNA 的 化 学 结 构 与 DNA 有 略 微 差 异
RNA 主 要 以 单 链 形 式 存 在 于 生 物 体 内
RNA 分 子 能 够 形 成 分 子 内 的 碱 基 配 对 ,<br />
进 而 折 叠 成 特 殊 的 结 构
Secondary structure of RNA<br />
hairpin<br />
bulge<br />
loop<br />
RNA chains fold back on themselves to<br />
form local regions of double helix.
A-,B-,Z- 型 DNA 三 种 结 构 比 较<br />
A<br />
B Z<br />
外 型 粗 短 适 中 细 长<br />
螺 旋 方 向 右 手 右 手 左 手<br />
螺 旋 直 径<br />
碱 基 直 升<br />
2.55nm 2.37nm 1.84nm<br />
0.23nm 0.34nm 0.38nm<br />
每 圈 碱 基 数 11 10 12<br />
碱 基 倾 角 20 0 0 0 7 0<br />
大 沟 很 窄 很 深 很 宽 较 深 平 坦<br />
小 沟 很 宽 、 浅 窄 、 深 较 窄 很 深
The double helical structure of RNA<br />
resembles the A-form structure of DNA<br />
The minor groove is wide and shallow, but<br />
offers little sequence-specific information.<br />
The major groove is so narrow and deep that<br />
it is not very accessible to amino acid side<br />
chains from interacting proteins. Thus RNA<br />
structure is less well suited for sequencespecific<br />
interactions with proteins.
Pseudoknot<br />
Pseudoknots are complex structure resulted from<br />
base pairing of discontinuous RNA segments
G:U base pair<br />
Non-Watson-Crick G:U base pairs represent<br />
additional regular base pairing in RNA, which<br />
enriched the capacity for self-complementarity
Schematic illustration of transcription<br />
Transcription bubble<br />
The length of the bubble is ~12-14 bp, and the length of<br />
RNA-DNA hybrid within it is ~8-9 bp.
电 镜 下 观 察 到 的 rRNA 转 录<br />
许 多 RNA 聚 合 酶 分 子 同 时 转 录 两 个 相 邻 的 基 因 .
细 胞 内 产 生 的 RNA 种 类<br />
细 胞 内 总 RNA<br />
编 码 RNA<br />
占 总 量 的 2%<br />
非 编 码 RNA<br />
占 总 量 的 98%<br />
前 mRNA(hnRNA)<br />
非 编 码 RNA 前 rRNA 前 tRNA snRNA snoRNA scRNA tmRNA 等<br />
mRNA<br />
rRNA<br />
tRNA<br />
所 有 生 物 仅 真 核 生 物 仅 细 菌
Functions of RNAs<br />
• Functions in protein synthesis<br />
a. mRNA: as the intermediate between the gene and the proteinsynthesizing<br />
machinery.<br />
b. tRNA: as an adaptor between the codons in the mRNA and amino<br />
acids.<br />
c. rRNA: play a structural role, as in the case of the RNA<br />
components of the ribosome.<br />
• As genetic material<br />
Serving as a template for its own replication in certain viruses<br />
• RNA as catalysts (ribozyme)<br />
Some RNAs (including one of the structural RNAs of the ribosome)<br />
are enzymes that catalyze essential reactions in the cell.<br />
• RNA is a regulatory molecule<br />
Small non-coding RNA which through sequence complementarily<br />
binds to, and interferes with the translation of certain mRNAs.
DNA-mRNA-the encoded peptide<br />
(sense strand)<br />
(antisense strand)<br />
编 码 链 (coding strand): 与 mRNA 序 列 相 同 的 那 条 DNA 链 , 或<br />
称 有 意 义 链 (sense strand).<br />
模 板 链 (template strand): 根 据 碱 基 互 补 原 则 指 导 mRNA 合<br />
成 的 DNA 链 , 或 称 反 义 链 (antisense strand)。
5’<br />
coding strand*<br />
positive strand<br />
Crick strand<br />
sense strand<br />
3’<br />
GTAC<br />
3’<br />
5’<br />
new RNA strand<br />
CATG<br />
GUAC<br />
3’<br />
Watson strand<br />
negative strand<br />
template strand*<br />
5’<br />
antisense strand
A transcription unit is a sequence of DNA<br />
transcribed into a single RNA, starting at the<br />
promoter and ending at the terminator.
Key terms related to transcription<br />
RNA polymerases are enzymes that synthesize<br />
RNA using a DNA template (formally described<br />
as DNA-dependent RNA polymerases).<br />
Promoter is a region of DNA where RNA<br />
polymerase binds to initiate transcription.<br />
Startpoint (Startsite) refers to the position on<br />
DNA corresponding to the first base<br />
incorporated into RNA.<br />
Terminator is a sequence of DNA that causes RNA<br />
polymerase to terminate transcription.<br />
Transcription unit is the distance between sites of<br />
initiation and termination by RNA polymerase.
Upstream identifies sequences proceeding in the<br />
opposite direction from expression; for example,<br />
the bacterial promoter is upstream of the<br />
transcription unit, the initiation codon is<br />
upstream of the coding region.<br />
Downstream identifies sequences proceeding<br />
farther in the direction of expression; for<br />
example, the coding region is downstream of the<br />
initiation codon.<br />
Primary transcript is the original unmodified RNA<br />
product corresponding to a transcription unit.
• How does RNA polymerase find<br />
promoters on DNA? ( how do proteins<br />
distinguish their specific binding sites in<br />
DNA from other sequences?)<br />
• How do regulatory proteins interact<br />
with RNA polymerase to activate or to<br />
repress specific steps in the initiation,<br />
elongation, or termination of<br />
transcription?
RNA 的 转 录<br />
(Transcription)
RNA 合 成 的 特 点<br />
1. RNA 是 以 5’3’ 方 向 合 成 的 , 它 的 序 列 是 与<br />
DNA 编 码 链 ( 意 义 链 ) 相 同 。<br />
2. RNA 的 合 成 是 以 反 义 链 ( 模 板 链 ) 为 模 板 。<br />
3. 同 在 DNA 中 一 样 , 形 成 磷 酸 二 脂 键<br />
( Phosphodiester bonds)。<br />
4. 必 需 的 成 分 :<br />
RNA polymerase, rNTPs, transcription<br />
factors, promoter & terminator/template
转 录 的 基 本 过 程<br />
1、 模 板 识 别 (Template Recognition)<br />
2、 转 录 起 始 (Initiation)<br />
3、 转 录 的 延 伸 (Elongation)<br />
4、 转 录 的 终 止 (Termination)
基 因 序 列 上 的 信 号 指 示 细 菌 RNA 聚 合 酶 起 始<br />
和 终 止 转 录
模 板 识 别<br />
1、RNA 聚 合 酶 与 启 动 子 DNA 双 链 相 互 作 用<br />
并 与 之 相 结 合 的 过 程 。<br />
2、 转 录 起 始 前 , 启 动 子 附 近 的 DNA 双 链 分<br />
开 形 成 转 录 泡 以 促 使 底 物 核 糖 核 苷 酸 与 模 板<br />
DNA 的 碱 基 配 对 。
转 录 起 始<br />
转 录 起 始 就 是 RNA 链 上 第 一 个 核 苷 酸 键 的 产<br />
生 。<br />
1. 在 起 始 位 点 合 成 RNA 链 : 第 一 个 核 苷 酸 键 的<br />
产 生 , 该 位 点 被 称 为 position +1 。<br />
2. 转 录 起 始 后 直 到 形 成 9 个 核 苷 酸 短 链 是 通 过 启<br />
动 子 阶 段 。<br />
3. 通 过 启 动 子 的 时 间 代 表 一 个 启 动 子 的 强 弱 : 时<br />
间 越 短 , 转 录 起 始 的 频 率 也 越 高 。
一 般 情 况 下 , 转 录 起 始 复 合 物 可 以 进 入 两<br />
条 不 同 的 反 应 途 径 :<br />
• 合 成 并 释 放 2-9 个 核 苷 酸 的 短 RNA 转 录 物 , 即<br />
所 谓 的 流 产 式 起 始 ;<br />
• 一 旦 RNA 聚 合 酶 成 功 地 合 成 9 个 以 上 核 苷 酸 , 尽<br />
快 释 放 σ 亚 基 ,RNA 聚 合 酶 离 开 启 动 子 区 , 转<br />
录 就 进 入 正 常 的 延 伸 阶 段 。 转 录 起 始 复 合 物 通<br />
过 上 游 启 动 子 区 并 生 成 由 核 心 酶 、DNA 和 新 生<br />
RNA 所 组 成 的 转 录 延 伸 复 合 物 。
Transcription initiation involves<br />
three defined steps<br />
封 闭 复 合 物 (closed complex)<br />
开 放 复 合 物 (open complex)<br />
三 元 复 合 物 (ternary complex)
封 闭 复 合 物 (closed complex)<br />
•The initial binding of polymerase to a promoter.<br />
•DNA remains double stranded.<br />
•The enzyme is bound to one face of the helix.
开 放 复 合 物 (open complex)<br />
• The DNA strand separate over a distance<br />
of ~14 bp (-11 to +3 ) around the start<br />
site (+1 site)<br />
• Transcription bubble forms<br />
35
三 元 复 合 物 (ternary complex )<br />
• The enzyme escapes from the promoter<br />
• The transition to the elongation phase<br />
• Stable ternary complex<br />
=DNA +RNA + enzyme
RNA 合 成 的 起 始<br />
RNA 聚 合 酶 全 酶 + 启 动 子<br />
DNA 处 于 双 链 状 态<br />
聚 合 酶 全 酶 所 结 合 的 DNA 序<br />
列 中 有 一 小 段 双 链 被 解 开<br />
RNA 聚 合 酶 、DNA 和 新 生 RNA
转 录 的 延 伸<br />
RNA 聚 合 酶 离 开 启 动 子 ,<br />
沿 DNA 链 移 动 并 使 新 生<br />
RNA 链 不 断 伸 长 的 过 程 就<br />
是 转 录 的 延 伸 。<br />
• 共 价 地 向 生 长 RNA 链 的 3’ 端 添 加 核 糖 核 苷 酸<br />
• RNA 聚 合 酶 是 以 5’ 3’ 方 向 来 延 长 RNA 链<br />
• RNA 聚 合 酶 本 身 沿 着 反 义 链 以 3’ 5’ 方 向 移 动
• 大 肠 杆 菌 RNA 聚 合 酶 的 活 性 一 般 为 每 秒 50-90 个<br />
核 苷 酸 。<br />
• 随 着 RNA 聚 合 酶 的 移 动 ,DNA 双 螺 旋 持 续 解 开<br />
, 暴 露 出 新 的 单 链 DNA 模 板 , 新 生 RNA 链 的 3’ 末<br />
端 不 断 延 伸 , 在 解 链 区 形 成 RNA-DNA 杂 合 物 。
转 录 的 终 止<br />
• 合 成 的 终 止 : 当 RNA 链 延 伸 到 转 录 终 止 位 点<br />
时 ,RNA polymerase 和 RNA 链 均 从 DNA 模<br />
板 上 释 放 出 来 。<br />
• Terminator: 通 常 含 有 自 我 互 补 区 域 (selfcomplementary<br />
regions) , 在 RNA 产 物 中 可<br />
以 形 成 stem-loop 或 hairpin 结 构 。
Two types of terminators in E. coli<br />
• 不 依 赖 于 ρ 因 子 的 终 止<br />
intrinsic terminator ( 内 在 )<br />
• 依 赖 于 ρ 因 子 的 终 止
Rho 非 依 赖 型 终 止 子 的 序 列<br />
由 两 个 序 列 原 件 组 成 :<br />
• 一 段 短 的 反 向 重 复 序 列<br />
( 大 约 20 个 核 苷 酸 );<br />
• 其 后 是 一 段 大 约 8 个 A:T<br />
碱 基 对 的 序 列 。<br />
由 它 转 录 出 mRNA 可 形<br />
成 茎 环 结 构 , 可 阻 止<br />
RNA pol 的 前 进 。
不 依 赖 于 ρ 因 子<br />
的 终 止 子 ( 内 在<br />
终 止 子 )<br />
Weakest base<br />
pairing: A:U make<br />
the dissociation<br />
easier
依 赖 于 ρ 因 子 的 终 止<br />
提 纯 的 RNA 聚 合 酶 并 不 能 识 别 特 异 性 的 转 录 终<br />
止 信 号 , 而 加 入 大 肠 杆 菌 ρ 因 子 后 该 聚 合 酶 就<br />
能 在 DNA 模 板 上 准 确 地 终 止 转 录 。<br />
• 只 含 有 自 我 互 补 区 域 , 可 形 成 茎 环 结 构 , 但 在 茎 中 的<br />
G.C 含 量 少 , 茎 环 易 打 开 。<br />
• 其 终 止 需 要 ρ 因 子 的 参 与 。<br />
•ρ 因 子 与 ssRNA 的 特 定 位 点 结 合 (C 丰 富 ,G 缺 乏 )。<br />
• ρ 通 过 催 化 NTP 的 水 解 促 使 新 生 RNA 链 从 三 元 转 录 复<br />
合 物 中 解 离 。
ρ 因 子<br />
ρ 因 子 是 一 个 相 对 分<br />
子 质 量 为 2.0×10 5 的 六<br />
聚 体 蛋 白 。<br />
其 功 能 是 作 为 RNA<br />
pol 的 一 种 辅 助 因 子 ,<br />
当 其 浓 度 为 RNA pol<br />
浓 度 的 10% 时 在 体 外<br />
可 发 挥 最 高 的 活 性 。
ρ 因 子 参 与 的 RNA 合 成 终 止 模 式<br />
“ 穷 追 ”(hot pursuit) 模 型<br />
ρ 结 合 到 RNA 链 终 止 子 上 游 的<br />
某 一 点<br />
ρ 因 子 结 合 以 后 延 着 RNA 向 3′<br />
端 移 动 , 跟 踪 聚 合 酶<br />
ρ 追 上 在 终 止 位 点 暂 停 的 RNA<br />
聚 合 酶<br />
终 止 --- 三 元 复 合 物 解 体
常 识 数 据<br />
• 转 录 生 成 mRNA 的 速 度 大 约 是 每 分 钟 2500 个<br />
核 苷 酸 (14 个 密 码 子 / 秒 ), 与 翻 译 速 度 (15aa/ 秒 )<br />
基 本 相 等 , 但 比 DNA 复 制 的 速 度 要 慢 得 多<br />
(800bp / 秒 ) 。<br />
• 基 因 开 始 表 达 →mRNA 的 间 隔 约 为 2.5 分 钟 ,<br />
而 再 过 半 分 钟 就 能 在 细 胞 内 测 到 相 应 的 蛋 白<br />
质 。
RNA 聚 合 酶 (RNA polymerase)<br />
RNA 聚 合 酶 是 转 录 过 程 中 最 关 键 的 酶 。<br />
1. 主 要 以 双 链 DNA 为 模 板 , 以 4 种 核 苷 三 磷 酸 作<br />
为 活 性 前 体 。<br />
2. 需 要 Mg 2+ /Mn 2+ 为 辅 助 因 子 。<br />
3. 它 不 需 要 任 何 引 物 。<br />
4. 以 5’ 3’ 方 向 合 成 RNA 链 。<br />
5. 缺 乏 3’ 5’ 外 切 酶 活 性 。<br />
6. 是 一 个 含 有 多 个 亚 单 位 (multi-subunit) 的 酶 。
RNA 聚 合 酶 需 执 行 的 功 能<br />
(1) 识 别 DNA 双 链 上 的 起 始 子 ;<br />
(2) 使 DNA 变 性 在 启 动 子 处 解 旋 成 单 链 ;<br />
(3) 通 过 阅 读 启 动 子 序 列 ,RNA pol 确 定 它 自<br />
己 的 转 录 方 向 和 模 板 链 。<br />
(4) 最 后 当 它 达 到 终 止 子 时 , 通 过 识 别 停 止 转<br />
录 。
原 核 和 真 核 生 物 的 RNA 聚 合 酶 虽 然 都 能<br />
催 化 RNA 的 合 成 , 但 在 其 分 子 组 成 、 种<br />
类 和 生 化 特 性 上 各 有 特 色 。
原 核 生 物 (E.coli) 的 RNA 聚 合 酶<br />
2 alpha (α) subunit,<br />
1 beta (β) subunit,<br />
1 beta prime (β’) subunit,<br />
1 omega (ω) subunit,<br />
1 sigma (σ) subunit<br />
Core<br />
enzyme Holoenzyme<br />
聚 合 酶 全 酶<br />
155 KD<br />
36.5 KD<br />
11 KD<br />
36.5 KD<br />
70 KD<br />
相 对 分 子 量 :4.65×10 5<br />
只 与 转 录 的<br />
起 始 有 关<br />
151 KD<br />
参 与 转 录 延 伸
原 核 生 物 (E.coli) 的 RNA 聚 合 酶<br />
• E. coli 只 有 一 个 DNA-directed RNA 聚 合 酶 ,<br />
来 合 成 所 有 类 型 的 RNA。<br />
• 是 细 胞 中 最 大 的 酶 之 一 。<br />
• 由 5 种 subunits 组 成 聚 合 酶 全 酶 (holoenzyme),<br />
包 括 2 α, 1 β, 1β’, 1 ω 以 及 1 σ subunits 。<br />
• 形 状 象 一 个 圆 筒 状 通 道 , 可 以 直 接 与 16 bp<br />
DNA 结 合 。 整 个 聚 合 酶 可 结 合 60 bp DNA。<br />
• RNA 合 成 速 率 :<br />
40 nt / 秒 , 37 o C 。
E. coli RNA polymerase :αsubunit<br />
• 是 核 心 酶 中 的 两 个 相 同 的 亚 单 位<br />
• 由 rpoA 基 因 编 码<br />
• 与 核 心 酶 的 组 装 有 关<br />
• 参 与 RNA 聚 合 酶 和 部 分 调 节 因 子 的 相 互 作 用
E. coli RNA polymerase :β &β’ subunit<br />
•β 和 β’ 分 别 由 rpoB 和 rpoC 基 因 编 码 。<br />
• 由 β 和 β’ 亚 基 组 成 了 聚 合 酶 的 催 化 中 心 。<br />
• 它 们 在 序 列 上 与 真 核 生 物 RNA 聚 合 酶 的 两<br />
个 大 亚 基 有 同 源 性 。<br />
•β 亚 基 能 与 模 板 DNA、 新 生 RNA 链 及 核 苷<br />
酸 底 物 相 结 合 。 rpoB 和 rpoC 基 因 的 突 变<br />
会 影 响 转 录 所 有 的 阶 段 。
The β and β’ subunit<br />
of RNA polymerase<br />
have a channel for the<br />
DNA template.
E. coli RNA polymerase : σfactor<br />
负 责 模 板 链 的 选 择 和 转 录 的 起 始 :<br />
• 与 σ 因 子 的 结 合 使 RNA 聚 合 酶 从 核 心 酶 转 变 为 聚<br />
合 酶 全 酶 。<br />
• 是 启 动 子 识 别 的 关 键 的 酶 , 不 仅 增 加 聚 合 酶 对 启<br />
动 子 的 亲 和 力 ( 提 高 10 3 倍 ), 还 可 降 低 它 对 非 专 一<br />
位 点 的 亲 和 力 ( 降 低 10 4 倍 ), 使 酶 底 复 合 物 的 半 衰<br />
期 小 于 1s。<br />
• 在 细 胞 中 对 σ 因 子 量 的 需 求 少 于 聚 合 酶 中 其 它 亚<br />
单 位 。
The conformational change in σ<br />
at open complex formation
真 核 生 物 的 RNA 聚 合 酶<br />
• 有 3 类 RNA 聚 合 酶 ;<br />
• 结 构 比 大 肠 杆 菌 RNA 聚 合 酶 复 杂 ;<br />
• 在 细 胞 核 中 的 位 置 不 同 ;<br />
• 负 责 转 录 的 基 因 不 同 , 对 α- 鹅 膏 蕈 碱 的 敏 感<br />
性 也 不 同 。<br />
• 真 核 生 物 RNA 聚 合 酶 一 般 有 8-14 个 亚 基 所 组<br />
成 , 相 对 分 子 质 量 超 过 5×10 5 。
真 核 细 胞 中 三 类 RNA 聚 合 酶 特 性 比 较<br />
酶<br />
细 胞 内<br />
定 位<br />
转 录 产<br />
物<br />
相 对 活<br />
性<br />
对 α- 鹅 膏<br />
蕈 碱 的 敏<br />
感 程 度<br />
RNA 聚 合<br />
酶 I<br />
核 仁<br />
rRNA<br />
(28S,18S,<br />
5.8S)<br />
50%-<br />
70%<br />
不 敏 感<br />
RNA 聚 合<br />
酶 II<br />
核 质<br />
hnRNA*,<br />
snRNA,<br />
mRNA<br />
20%-<br />
40%<br />
敏 感<br />
RNA 聚 合<br />
酶 III<br />
核 质<br />
tRNA<br />
5SRNA<br />
某 些 涉 及<br />
RNA 加 工 的<br />
snRNA<br />
约<br />
10%<br />
*hnRNA: heterogeneous muclearRNA, 核 内 不 均 一 RNA, RNA 的 前 体<br />
存 在 物 种<br />
特 异 性
转 录 的 抑 制 剂<br />
抑 制 剂<br />
利 福 霉 素<br />
链 霉 溶 菌 素<br />
放 射 线 素 D<br />
α- 鹅 膏 蕈<br />
靶 酶<br />
细 菌 全 酶<br />
细 菌 核 心 酶<br />
真 核 PolⅠ<br />
真 核 PolⅡ<br />
抑 制 作 用<br />
和 β 亚 基 结 合 , 抑 制<br />
起 始<br />
和 β 亚 基 结 合 , 抑 制<br />
起 始<br />
和 DNA 结 合 , 阻 止 延<br />
伸<br />
和 RNA PolⅡ 结 合<br />
RNA 合 成 抑 制 剂 主 要 分 两 类 :<br />
1. 模 板 结 合 抑 制 剂<br />
2. 聚 合 酶 抑 制 剂
• 在 动 、 植 物 及 昆 虫 的 细 胞 中 ,RNA pol Ⅱ<br />
的 活 性 可 被 低 浓 度 的 α- 鹅 膏 蕈 碱 所 抑<br />
制 。 但 却 不 抑 制 pol Ⅰ。<br />
• Pol Ⅲ 对 α- 鹅 膏 蕈 的 反 应 , 不 同 的 生 物<br />
有 所 差 异 。 在 动 物 细 胞 中 高 浓 度 的 α- 鹅<br />
膏 蕈 可 抑 制 转 录 , 在 昆 虫 中 不 受 抑 制 。
真 核 生 物 RNA 聚 合 酶 的 主 要 特 征<br />
• 聚 合 酶 中 有 两 个 相 对 分 子 质 量 超 过 1×10 5<br />
的 大 亚 基 ;<br />
• 同 种 生 物 3 类 聚 合 酶 有 “ 共 享 ” 小 亚 基 的 倾<br />
向 , 即 有 几 个 小 亚 基 是 其 中 3 类 或 2 类 聚 合<br />
酶 所 共 有 的 。
真 核 生 物 RNA 聚 合 酶 的 亚 基<br />
RNA 聚 合 酶 I<br />
RPA 1<br />
RPA 2<br />
RPC 5<br />
RPC 9<br />
RPB 6<br />
其 它 9 个 亚 基<br />
RNA 聚 合 酶 II<br />
RPB 1 (’)<br />
RPB 2 ( )<br />
RPB 3(α I )<br />
RPB 11 (α II )<br />
RP 6 (ω)<br />
其 它 7 个 亚 基<br />
RNA 聚 合 酶 III<br />
RPC 1<br />
RPC 2<br />
RPC 5<br />
RPC 9<br />
RPB 6<br />
其 它 11 个 亚 基<br />
注 : 亚 基 按 照 分 子 量 由 大 到 小 的 顺 序 排 列 。<br />
真 核 生 物 RNA 聚 合 酶 一 般 有 8-16 个 亚 基 所 组 成 , 相 对 分<br />
子 质 量 超 过 5×10 5 。
真 核 生 物 线 粒 体 和 叶 绿 体 中 存 在<br />
不 同 的 RNA 聚 合 酶<br />
线 粒 体 中 RNA 聚 合 酶 :<br />
• 只 有 一 条 多 肽 链 , 相 对 分 子 量 小 于 7 X 10 4 , 是 已 知<br />
最 小 的 RNA 聚 合 酶 之 一 ;<br />
• 与 T7 噬 菌 体 RNA 聚 合 酶 有 同 源 性 。<br />
叶 绿 体 中 RNA 聚 合 酶 :<br />
• 比 较 大 ;<br />
• 结 构 上 与 细 菌 中 的 聚 合 酶 相 似 , 由 多 个 亚 基 组 成 ,<br />
部 分 亚 基 由 叶 绿 体 基 因 编 码 。<br />
线 粒 体 和 叶 绿 体 RNA 聚 合 酶 活 性 不 受 α- 鹅 膏<br />
蕈 碱 所 抑 制 。
prokaryotic<br />
<br />
’<br />
<br />
“Crab claw”<br />
shape of RNAP<br />
<br />
eukaryotic<br />
<br />
The same color indicate<br />
the homologous of the<br />
two enzymes<br />
RPB2<br />
RPB3<br />
Active center cleft<br />
RPB11<br />
RPB6<br />
RPB1
酵 母 RNA 聚 合 酶 II 晶 体 结 构<br />
By Roger Kornberg
模 板 DNA 进 入 转 录 复 合 体 的 路 径<br />
There are various channels allowing DNA, RNA and ribonucleotides<br />
(rNTPs) into and out of the enzyme’s active center cleft
RNA polymerase/transcription<br />
and DNA polymerase/replication<br />
Template<br />
Require primer<br />
Initiation<br />
elongation<br />
Exonuclease<br />
activity<br />
terminator<br />
RNA pol<br />
dsDNA<br />
No<br />
promoter<br />
40 nt/ sec<br />
No<br />
Synthesized<br />
RNA<br />
DNA pol<br />
dsDNA<br />
Yes<br />
origin<br />
900 bp/sec<br />
Yes<br />
Template<br />
DNA
前 起 始 复 合 物<br />
(preinitiation transcription complex, PIC)<br />
真 核 生 物 RNA 聚 合 酶 不 能 直 接 识 别 基 因 的 启<br />
动 子 区 , 需 要 一 些 被 称 为 转 录 调 控 因 子 的 辅<br />
助 蛋 白 质 按 特 定 顺 序 结 合 于 启 动 子 上 ,RNA<br />
聚 合 酶 才 能 与 之 相 结 合 并 形 成 复 杂 的 前 起 始<br />
复 合 物 (PIC) 以 保 证 有 效 地 起 始 转 录 。
真 核 生 物 RNA 聚 合 酶 II 需 形 成 转 录 起 始 复 合 物
Assembly of the pre-initiation complex in<br />
presence of mediator, nucleosome modifiers<br />
and remodelers, and transcriptional activators
Mediator consists of many<br />
subunits, some conserved<br />
from yeast to human.<br />
Only subunit Srb4<br />
is essential for<br />
transcription of<br />
essentially all Pol<br />
II genes in vivo.
PNAS 2007 vol. 104 no. 32 12955–12961
转 录 单 元 (transcription unit)<br />
转 录 起 点 是 指 与 新 生 RNA 链 第 一 个 核 苷 酸 相 对 应<br />
DNA 链 上 的 碱 基 , 通 常 为 嘌 呤 。<br />
把 起 点 5’ 末 端 的 序 列 称 为 上 游 (upstream),<br />
把 其 3’ 末 端 的 序 列 称 为 下 游 (downstream)。
转 录 起 始 位 点 (Transcription start site)<br />
• 在 原 核 中 90% 为 嘌 呤 ,A 或 G;<br />
• 位 置 固 定 ;<br />
• 通 常 在 起 始 核 苷 酸 的 两 侧 为 C 和 T<br />
(i.e. CGT or CAT)
启 动 子 区 的 基 本 结 构<br />
启 动 子 是 一 段 位 于 结 构 基 因 5’ 端 上 游 区 的 保 守 的<br />
DNA 序 列 , 能 活 化 RNA 聚 合 酶 , 使 之 与 模 板 DNA<br />
准 确 地 相 结 合 并 具 有 转 录 起 始 的 特 异 性 。
启 动 子 与 转 录 起 始<br />
大 肠 杆 菌 RNA 聚 合 酶 与 启 动 子 的 相 互 作 用 主<br />
要 包 括 :<br />
• 启 动 子 区 的 识 别 ;<br />
• 酶 与 启 动 子 的 结 合 ;<br />
• σ 因 子 的 结 合 与 解 离 。
原 核 生 物 的 启 动 子
-10 区 (Pribnow 区 ) 的 发 现<br />
1975 年 ,Pribnow 和 Schaller 将 RNA<br />
聚 合 酶 全 酶 与 模 板 DNA 结 合 后 , 用<br />
DNaseI 降 解 DNA, 得 到 41~44 个 核<br />
苷 酸 对 的 DNA 片 段 。<br />
序 列 分 析 发 现 , 在 被 保 护 区 内 有 一<br />
个 由 5 个 核 苷 酸 组 成 的 保 守 序 列 ,<br />
是 聚 合 酶 结 合 位 点 , 称 为 Pribnow<br />
区 , 其 中 央 大 约 位 于 起 点 上 游 10bp<br />
处 , 所 以 又 称 为 –10 区 。
-10 序 列 (Pribnow 框 盒 )<br />
• 其 保 守 序 列 为 TATAAT, 位 于 -10bp 左 右 ,<br />
其 中 3′ 端 的 “T” 十 分 保 守 。<br />
• A.T 较 丰 富 , 易 于 解 链 。<br />
• 它 和 转 录 起 始 位 点 I 一 般 相 距 5bp。<br />
功 能 :<br />
(1) RNA pol 紧 密 结 合 ;<br />
(2) 形 成 开 放 启 动 复 合 体 ;<br />
(3) 使 RNA pol 定 向 转 录 。
如 果 把 Pribnow 区 从 TATAAT 变 成 AATAAT 就 会<br />
使 该 启 动 子 发 生 下 降 突 变 (down mutation);<br />
如 果 增 加 Pribnow 区 的 共 同 序 列 , 将 乳 糖 操 纵 子 的<br />
启 动 子 中 的 TATGTT 变 成 TATATT, 就 会 提 高 启<br />
动 子 的 效 率 , 称 为 上 升 突 变 (up mutation)。
提 纯 被 保 护 的 片 段 后 却<br />
发 现 ,RNA 聚 合 酶 并 不<br />
能 重 新 结 合 或 并 不 能 选<br />
择 正 确 的 起 始 点 , 表 明<br />
在 保 护 区 外 可 能 还 存 在<br />
与 RNA 聚 合 酶 对 启 动 子<br />
的 识 别 有 关 的 序 列 。<br />
?
-35 区 的 发 现<br />
科 学 家 又 从 噬 菌 体 的 左 、 右 启 动 子 P L<br />
及 P R<br />
和 SV40 启 动 子 的 –35 bp 附 近 找 到 了<br />
另 一 段 共 同 序 列 :TTGACA。
-35 序 列 (Sextama 盒 )<br />
• 其 保 守 序 列 为 TTGACA,<br />
• 与 -10 序 列 相 隔 16-19bp。<br />
功 能 :<br />
(1) 为 RNA pol 的 识 别 位 点 。<br />
(2)RNA Pol 的 核 心 酶 只 能 起 到 和 模 板 结 合 和<br />
催 化 的 功 能 , 并 不 能 识 别 -35 序 列 , 只 有 σ 亚<br />
基 才 能 识 别 -35 序 列 , 为 转 录 选 择 模 板 链 。
100 个 E.coli 的 不 同 启 动 子 的 序 列 测 定 结 果<br />
–35 区 –10 区<br />
……T 85 T 83 G 81 A 61 C 69 A 52 ……T 89 A 89 T 50 A 65 A 100 ……<br />
• 大 部 分 启 动 子 都 存 在 这 两 段 共 同 序 列 , 即 位<br />
于 –10 bp 处 的 TATA 区 和 –35 bp 处 的<br />
TTGACA 区 。<br />
• 它 们 是 RNA 聚 合 酶 与 启 动 子 的 结 合 位 点 , 能 与<br />
σ 因 子 相 互 识 别 而 具 有 很 高 的 亲 和 力 。
-10 区 和 -35 区 的 最 佳 距 离<br />
• 在 原 核 生 物 中 , -10 区 和 -35 区 的 最 佳 距 离<br />
大 约 是 16~19 bp。<br />
• 过 大 或 过 小 都 会 降 低 转 录 活 性 。<br />
这 可 能 是 因 为 RNA Pol 本 身 的 大 小 和 空 间 结<br />
构 有 关 。
promoter 40-80bp<br />
5’<br />
1 2 3<br />
-50 -40 -30 -20 -10 1 10<br />
gene<br />
TTGACA<br />
AACTGT<br />
Recognition site<br />
TATAATPu<br />
ATATTAPy<br />
Binding site<br />
Pribnow box<br />
transcribed<br />
initiation site<br />
(1) 结 构 典 型 , 都 含 有 识 别 (R), 结 合 (B) 和 起 始 (I) 三 个 位 点 ;<br />
(2) 序 列 保 守 , 如 -35 序 列 ,-10 序 列 结 构 都 十 分 保 守 ;<br />
(3) 位 置 和 距 离 都 比 较 恒 定 ;<br />
(4) 直 接 和 多 聚 酶 相 结 合 ;<br />
(5) 常 和 操 纵 子 相 邻 ;<br />
(6) 都 在 其 控 制 基 因 的 5′ 端 ; 的 共 同 的 特 点<br />
(7) 决 定 转 录 的 启 动 和 方 向 。<br />
原 核 生 物 启 动 子
真 核 生 物 启 动 子 的 结 构 特 点
真 核 生 物 RNA 聚 合 酶 II 所 识 别 的 启 动 子 区<br />
Hogness 等 发 现 类 似 Pribnow 区 的 Hogness 区 ,<br />
在 转 录 起 始 点 上 游 –25~–30 bp 处 , 保 守 序 列 为<br />
TATAAA, 也 称 TATA 区 。<br />
在 起 始 位 点 上 游 –70~–78 bp 处 还 有 另 一 段 共 同<br />
序 列 CCAAT, 称 为 CAAT 区 (CAAT box)。
1. 核 心 元 件<br />
真 核 基 因 的 启 动 子<br />
TATA box: –25~–30 bp 区<br />
启 始 子 (initiator,Inr) : 转 录 起 始 位 点 附 近<br />
2. 上 游 启 动 子 元 件 (UPE)<br />
CAAT box :–70~–80 区 CCAAT 序 列<br />
GC box: –80~–110 含 有 GCCACACCC<br />
或 GGGCGGG 序 列 。
上 游 启 动 子 元 件<br />
(upstream promoter element,UPE):<br />
将 TATA 区 上 游 的 保 守 序 列 称 为 上 游 启<br />
动 子 元 件 或 称 上 游 激 活 序 列 (upstream<br />
activating sequence,UAS)。
真 核 生 物 启 动 子 对 转 录 的 影 响<br />
• TATA 区 -- 使 转 录 精 确 地 起 始 :<br />
如 果 除 去 TATA 区 或 进 行 碱 基 突 变 , 转 录 产 物 下 降<br />
的 相 对 值 不 如 CAAT 区 或 GC 区 突 变 后 明 显 , 但 发<br />
现 所 获 得 的 RNA 产 物 起 始 点 不 固 定 。<br />
• CAAT 区 和 GC 区 主 要 控 制 转 录 起 始 频<br />
率 :<br />
基 本 不 参 与 起 始 位 点 的 确 定 。
研 究 SV40 晚 期 基 因 启 动 子 发 现 , 上 游 激 活 区 的 存 在 与 否 , 对 该<br />
启 动 子 的 生 物 活 性 有 着 根 本 性 的 影 响 。<br />
若 将 该 基 因 5' 上 游 –21~–47 核 苷 酸 序 列 切 除 , 基 因 完 全 不 表 达 。
远 端 调 控 区<br />
增 强 子 (enhancer)<br />
1981 年 由 Benerji, Rusconi 小 组 和 Chambom<br />
等 发 现 的 , 又 称 远 上 游 序 列 (far upstream<br />
sequence)。<br />
已 在 SV40 的 转 录 单 元 上 发 现 其 转 录 起 始 位 点<br />
上 游 约 200bp 处 有 两 段 72bp 长 的 重 复 序 列 ,<br />
它 们 不 是 启 动 子 的 一 部 分 , 但 能 增 强 或 促 进<br />
转 录 的 起 始 , 因 此 , 称 这 种 能 强 化 转 录 起 始<br />
的 序 列 为 增 强 子 或 强 化 子 (enhancer)。
增 强 子 (Enhancer )<br />
增 强 子 很 可 能 通 过 影 响 染 色 质 DNA- 蛋 白 质 结 构 或 改 变<br />
超 螺 旋 的 密 度 而 改 变 模 板 的 整 体 结 构 , 从 而 使 得 RNA 聚<br />
合 酶 更 容 易 与 模 板 DNA 相 结 合 , 起 始 基 因 转 录 。
An enhancer can activate a promoter from<br />
upstream or downstream locations, and its<br />
sequence can be inverted relative to the promoter.
增 强 子 特 点<br />
1 具 有 远 距 离 效 应 。<br />
常 在 上 游 -200bp 处 , 但 可 增 强 远 处 启 动 子 的 转 录 , 即 使 相 距 十 几 Kb 也 能 发<br />
挥 其 作 用 ;<br />
2 无 方 向 性 。<br />
无 论 在 靶 基 因 的 上 游 , 下 游 或 内 部 都 可 发 挥 增 强 转 录 的 作 用 ;<br />
3 顺 式 调 节 。<br />
只 调 节 位 于 同 一 染 色 体 上 的 靶 基 因 , 而 对 其 它 染 色 体 上 的 基 因 无 作 用 ;<br />
4 无 物 种 和 基 因 的 特 异 性 ,<br />
可 以 接 到 异 源 基 因 上 发 挥 作 用 ;<br />
5 具 有 组 织 的 特 异 性 。<br />
SV40 的 增 强 子 在 3T3 细 胞 中 比 多 瘤 病 毒 的 增 强 子 要 弱 , 但 在 HeLa 细 胞 中<br />
SV40 的 增 强 子 比 多 瘤 病 毒 的 要 强 5 倍 。 增 强 子 的 效 应 需 特 定 的 蛋 白 质 因 子<br />
参 与 。<br />
6 有 相 位 性 。<br />
其 作 用 和 DNA 的 构 象 有 关 。<br />
7 有 的 增 强 子 可 以 对 外 部 信 号 产 生 反 应 。<br />
如 热 体 克 基 因 在 高 温 下 才 表 达 。 编 码 重 金 属 蛋 白 的 金 属 硫 蛋 白 基 因 在 镉 和<br />
锌 存 在 下 才 表 达 。 某 些 增 强 子 可 以 被 固 醇 类 激 素 所 激 活 。
真 核 生 物 的 启 动 子 特 点<br />
promoter<br />
5’<br />
-50 -40 -30 -20 -10 1 10<br />
gene<br />
GC box<br />
CAAT box<br />
TATA box<br />
Hogness box<br />
(1) 有 多 种 元 件 :TATA 框 ,GC 框 ,CATT 框 ,OCT 等 ;<br />
(2) 结 构 不 恒 定 。 有 的 有 多 种 框 盒 , 如 组 蛋 白 H2B; 有 的 只 有<br />
TATA 框 和 GC 框 , 如 SV40 早 期 转 录 蛋 白 ;<br />
(3) 它 们 的 位 置 、 序 列 、 距 离 和 方 向 都 不 完 全 相 同 ;<br />
(4) 有 的 有 远 距 离 的 调 控 元 件 存 在 , 如 增 强 子 ;<br />
(5) 这 些 元 件 常 常 起 到 控 制 转 录 效 率 和 选 择 起 始 位 点 的 作 用 ;<br />
(6) 不 直 接 和 RNA pol 结 合 。 转 录 时 先 和 其 它 转 录 激 活 因 子 相<br />
结 合 , 再 和 聚 合 酶 结 合 。
谢 谢 !