Rezumatul tezei de doctorat - USAMV Cluj-Napoca

Am mai testat o altă metodă de amplificare, care s-a efectuat într-un termocycler
Eppendorf, după următorul protocol de lucru, cu etapele:
- predenaturare: 5 minute la 95°C
- 35 cicluri: - denaturare 30 secunde la 95°C
- annealing 30 secunde la 48°C
- extensie 90 secunde la 68°C
- extensie finală: 7 minute la 68°C (după Coalo Maria Chiara, 1999).
Amplificarea s-a efectuat pe un număr de 69 probe, dezvoltate pe mediul Potato
Dextrose Broth (PDB-bulion cu cartof-dextroză), utilizând tehnica adaptată a lui Ristaino şi
col., 1998.
I.3.8.2. Tehnica PCR-RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism
Fragmentele amlificate au fost digerate de noi cu 3 enzime de restricŃie de la
Fermentas: RsaI, HindIII şi AluI. Protocolul de digestie a fost conform cu a
manufacturierului (http://www.fermentas.com).
Produşii PCR au fost incubaŃi peste noapte, la 37ºC, iar la final la 65ºC timp de 10
minute. Produşii de digestie au fost apoi supuşi electroforezei, într-un gel de agaroză de 3%
cu buffer TBE, la 60V, timp de 2 ore. ADN-ul a fost colorat cu Sybr Safe (Invitrogen),
pentru a vizualiza polimorfismele fragmentelor amplificate, la lumină ultravioletă (Biorad).
S-a utilizat un ladder ADN de 700 pb pentru compararea fragmentelor (Fermentas).
I.3.9. Metode utilizate în stabilirea diversităŃii şi
înrudirii filogenetice a speciilor de fungi din familia Saprolegniaceae
I.3.9.1. SecvenŃierea automată
Catena de ADN a fost secvenŃiată cu primerii universali ITS1 (sens) şi ITS4
(antisens) la Mycrosinth (ElveŃia). Rezultatele secvenŃierilor au fost interpretate utilizânduse
un software specific denumit Chromas Lite.
Pentru stabilirea diversităŃii genetice au mai fost utilizate softuri genetice specifice.
16