Rezumatul tezei de doctorat - USAMV Cluj-Napoca

Primerii folosiŃi de către noi în reacŃia PCR au fost următorii (standardizaŃi de White
şi col., 1990):
- ITS1, cu secvenŃa 5’-3’: TCCGTAGGTGAACCTGCGG;
- ITS4, cu secvenŃa 5’-3’: TCCTCCGCTTATTGATATGC;
- ITS5, cu secvenŃa 5’-3’: GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG;
Am folosit comparativ un amestec de perechi de primeri, în următoarea combinaŃie:
ITS1 cu ITS4 şi ITS4 cu ITS5. Primerul ITS1 se ataşează la capătul 3’al genei 18S ADNr şi
primerul ITS4 la capătul 5’ al genei 28S ADNr (după Paul B. şi col., 2004). Ultima
combinaŃie de primeri se utilizează în amplificarea regiunii unităŃii repetitive a ADNr, care
include două regiuni necodificatoare, denumite ITS1 şi ITS2, şi gena 5,8S ARNr (Llanos
Frutos şi col., 2004).
I.3.8. Tehnici moleculare utilizate în experiment
I.3.8.1. Amplificarea PCR a probelor de Saprolegnia
În experienŃa efectuată de noi am utilizat combinaŃiile de perechi de primeri ITS1 şi
ITS4, ITS4 şi ITS5 (White şi col., 1990), care amplifică regiunea ITS1, gena 5,8S rRNA şi
ITS2. ReacŃiile de amplificare au fost efectuate individual, într-un volum final de 25 µl, cu
un termocycler Eppendorf.
Parametrii ciclului de amplificare utilizat au fost următorii: denaturarea iniŃială la
95°C timp de 3 minute, urmată de 35 cicluri de denaturare la 94°C timp de 1 minut,
annealing la 55°C timp de 1 minut şi extensia la 72°C timp de 1 minut, şi extensia finală la
72°C timp 7 minute. Produşii de amplificare au fost separaŃi prin electoforeză pe gel de
agaroză 1,5%, cu buffer TBE 1x, timp de 60 minute la 70V. ADN a fost apoi colorat cu Sybr
Safe (Invitrogen) şi vizualizat la lumină UV. Se fotografiază gelul şi se salvează imaginea pe
aparat (Biorad). Lungimile produşilor de amplificare au fost estimate în comparaŃie cu un
Ladder ADN Low Range (700 pb) sau de 50 pb (Fermentas) (adaptată după Ristaino şi col.,
1998).
15