Rezumatul tezei de doctorat - USAMV Cluj-Napoca

More documents

Recommendations

Info

nucleară care se repetă în tandem. O unitate ADNr, ilustrată în fig.2, include 3 gene ARNr: gena nucleară mică-small nuclear (18S) ARNr, 5,8S ARNr şi gena nucleară mare-large nuclear (28S) ARNr. Într-o unitate, genele sunt separate de două spaŃii transcrise interninternal transcribed spacers (ITS1 şi ITS2), şi două unităŃi ADNr separate de spaŃiul intergenic-intergenic spacer (IGS). Ultima genă ARNr (5S) poate fi sau nu în interiorul unităŃii repetate (Kamoun, 2003). Fig.2. Diagrama unităŃilor repetitive ale ADN ribozomal nuclear (Frisvad şi col., 1998) Cu excepŃia unor domenii variabile ale genelor ARNr, regiunile codificatoare sunt înalt conservate în cazul organismelor, acest lucru permiŃând comparaŃii între fungi înrudiŃi îndepărtat. În contrast, deoarece aceştia evoluează repede, regiunile necodificatoare au o variabilitate mai mare faŃă de regiunile codificatoare. SpaŃierile transcrise intern (ITS1 şi ITS2) necodificatoare pot fi utilizate în diferenŃierea speciilor înrudite strâns din interiorul unui gen fungic. Regiunea ITS, incluzând aici ITS1, gena 5,8S ARNr şi ITS2, este de aproximativ 600 până la 1000 perechi de baze şi poate fi amplificată atât total, cât şi parŃial folosind primerii “universali” descrişi de White şi col., în 1990. Regiunea ITS este acum poate cea mai secvenŃiată regiune a ADN la fungi. Aceasta este folosită în elaborarea studiilor de sistematică moleculară între specii şi chiar în interiorul speciilor (de exemplu, pentru a identifica geografic rasele). Din cauza gradului mare de variaŃie faŃă de alte regiuni genice ale ADNr (SSU şi LSU), variaŃia în interiorul unităŃilor repetitive individuale ale ADNr uneori poate fi observată atât în interiorul regiunii ITS, cât şi IGS. Pe lângă primerii standard utilizaŃi de majoritatea laboratoarelor (ITS1 şi ITS4), mai pot fi folosiŃi alŃi câŃiva primeri în amplificarea selectivă a secvenŃelor ITS a fungilor. 14
Primerii folosiŃi de către noi în reacŃia PCR au fost următorii (standardizaŃi de White şi col., 1990): - ITS1, cu secvenŃa 5’-3’: TCCGTAGGTGAACCTGCGG; - ITS4, cu secvenŃa 5’-3’: TCCTCCGCTTATTGATATGC; - ITS5, cu secvenŃa 5’-3’: GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG; Am folosit comparativ un amestec de perechi de primeri, în următoarea combinaŃie: ITS1 cu ITS4 şi ITS4 cu ITS5. Primerul ITS1 se ataşează la capătul 3’al genei 18S ADNr şi primerul ITS4 la capătul 5’ al genei 28S ADNr (după Paul B. şi col., 2004). Ultima combinaŃie de primeri se utilizează în amplificarea regiunii unităŃii repetitive a ADNr, care include două regiuni necodificatoare, denumite ITS1 şi ITS2, şi gena 5,8S ARNr (Llanos Frutos şi col., 2004). I.3.8. Tehnici moleculare utilizate în experiment I.3.8.1. Amplificarea PCR a probelor de Saprolegnia În experienŃa efectuată de noi am utilizat combinaŃiile de perechi de primeri ITS1 şi ITS4, ITS4 şi ITS5 (White şi col., 1990), care amplifică regiunea ITS1, gena 5,8S rRNA şi ITS2. ReacŃiile de amplificare au fost efectuate individual, într-un volum final de 25 µl, cu un termocycler Eppendorf. Parametrii ciclului de amplificare utilizat au fost următorii: denaturarea iniŃială la 95°C timp de 3 minute, urmată de 35 cicluri de denaturare la 94°C timp de 1 minut, annealing la 55°C timp de 1 minut şi extensia la 72°C timp de 1 minut, şi extensia finală la 72°C timp 7 minute. Produşii de amplificare au fost separaŃi prin electoforeză pe gel de agaroză 1,5%, cu buffer TBE 1x, timp de 60 minute la 70V. ADN a fost apoi colorat cu Sybr Safe (Invitrogen) şi vizualizat la lumină UV. Se fotografiază gelul şi se salvează imaginea pe aparat (Biorad). Lungimile produşilor de amplificare au fost estimate în comparaŃie cu un Ladder ADN Low Range (700 pb) sau de 50 pb (Fermentas) (adaptată după Ristaino şi col., 1998). 15
Page 1 and 2: UNIVERSITATEA DE ŞTIINłE AGRICOLE
Page 3 and 4: II.6. REZULTATELE RESTRICłIEI ENZI
Page 5 and 6: diverse specii piscicole. De aici s
Page 7 and 8: Fig.1. LocaŃiile în care s-au efe
Page 9 and 10: A fost constituit un număr de 207
Page 11 and 12: Sabouraud Dextrose Broth (SDB-bulio
Page 13: Echipament, materiale şi reactivi
Page 17 and 18: CAPITOLUL II REZULTATELE CERCETĂRI
Page 19 and 20: Mediile diametrului coloniilor de S
Page 21 and 22: laborator specifice metodologiei de
Page 23 and 24: Deoarece am utilizat în experiment
Page 25 and 26: fragmente: primul la aproximativ 45
Page 27 and 28: II.7. REZULTATE PRIVIND STUDIUL ÎN
Page 29 and 30: mai mare genetică, indivizii despr
Page 31 and 32: MenŃionăm faptul că în toate ba
Page 33 and 34: CAPITOLUL III CONCLUZII ŞI RECOMAN
Page 35 and 36: isexualis (761 pb, o identitate de
Page 37 and 38: BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ 1. Colao Ma
Page 39 and 40: 19. Oroian, T.E., 2006, SelecŃia a
Page 41 and 42: UNIVERSITY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Page 43 and 44: SPECIES FROM SAPROLEGNIACEAE FAMILY
Page 45 and 46: The specific literature presents up
Page 47 and 48: Fig.1. The locations where the rese
Page 49 and 50: estimation of the spawns infestatio
Page 51 and 52: pellets were filtred, washed with d
Page 53 and 54: The DNA rapid extraction using PBS
Page 55 and 56: We used a comparatively mixture of
Page 57 and 58: II.1. THE RESULTS OF SAPROLEGNIA CU
Page 59 and 60: Reading time 24 48 72 n Culture med
Page 61 and 62: asexual one. We can precisely concl
Page 63 and 64: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 700pb- Fig.3. Ele
Page 65 and 66:
pairs length. The sequencing result
Page 67 and 68:
II.7. RESULTS REGARDING THE GENETIC
Page 69 and 70:
higher genetic distance, the indivi
Page 71 and 72:
We mention the fact that in al the
Page 73 and 74:
extraction have values between 1,10
Page 75 and 76:
13. In researches on the aquatic fu
Page 77 and 78:
40. Frisvad, J.C., Bridge, P.D., Ar
Page 79:
61. *** http://www.sigmaaldrich.com
show all

Rezumatul tezei de doctorat - USAMV Cluj-Napoca

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?