Rezumatul tezei de doctorat - USAMV Cluj-Napoca

Echipament, materiale şi reactivi utilizate în experiment:
- Colonii fungice în fază staŃionară (aproximativ 1 x 10 9 ), în număr de 69 pe probe, pe
bazine de provenienŃă; Kitul de la Qiagen.
I.3.5.2. ExtracŃia ADN-ului din fungi utilizând soluŃii
La extracŃia rapidă a ADN utilizând soluŃie de PBS (fosfat tampon salin),
efectuată pe un număr de 69 probe, s-a procedat în felul următor: într-un tub Eppendorf se
cântăresc 120 mg Ńesut fungic, peste care se adaugă 200 µl soluŃie PBS. Probele se
centrifughează la 3000 rpm timp de 20 minute, apoi se elimină supernatantul. OperaŃiunea a
fost repetată de 5 ori, până la curăŃarea peletei de ADN fungic. Apoi probele s-au pus în baie
de apă, la 95°C pentru spargerea peretelui celular, timp de 15 minute. Se uscă probele la
etuvă 30 minute, după care se adaugă soluŃie TE (Tris-EDTA) de rehidratare a ADN-ului.
Pentru metoda rapidă de extracŃie a ADN cu soluŃie NE se folosesc anumite
materiale chimice, soluŃiile trebuind preparate în laborator. Materialele şi consumabilele au
fost următoarele: pipete Eppendorf, cu volume reglabile; tuburi (Eppendorf); vârfuri de
pipete de dimensiuni diferite (dimensiuni mari, medii şi mici); apă sterilă.
I.3.6. Cuantificarea ADN prin metoda directă de determinare a purităŃii şi
concentraŃiei ADN cu spectofotometrul Nanodrop ND-1000
Pentru determinarea purităŃii şi concentraŃiei ADN s-a utilizat spectofotometrul
Nanodrop ND – 1000. Pentru a se putea afla concentraŃia ADN extras din probele de fungi s-
a utilizat metoda directă de determinare, care presupune măsurarea densităŃii optice a probei
de ADN, la lungimea de undă 260/280 nm, pe un spectrofotometru, în domeniul UV/VIS.
I.3.7. Regiunea ITS de la fungi şi primerii utilizaŃi
La fungi şi alte eucariote, există două locaŃii pentru ADNr: genomul nuclear şi
genomul mitocondrial. Cel din urmă conŃine două gene care codifică genele mitocondriale
mici şi mari ale ARNr. ADNr nuclear la fungi este organizat, în general, într-o unitate
13