TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover
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<strong>Tierärztliche</strong> <strong>Hochschule</strong> <strong>Hannover</strong><br />
Nachweis des Chemokins MIP-3β/CCL19 im Liquor cerebrospinalis und dessen<br />
Beteiligung bei der Einwanderung mononukleärer Zellen in den<br />
Subarachnoidalraum bei Hunden mit entzündlichen und nicht-entzündlichen<br />
neurologischen Erkrankungen<br />
INAUGURAL-DISSERTATION<br />
zur Erlangung des Grades einer<br />
Doktorin der Veterinärmedizin<br />
- Doctor medicinae veterinariae -<br />
(Dr. med. vet.)<br />
vorgelegt von<br />
Janina Bartels<br />
Celle<br />
<strong>Hannover</strong> 2013
Wissenschaftliche Betreuung:<br />
1. Univ.-Prof. Dr. med. vet. Andrea Tipold, Klinik für Kleintiere<br />
2. Dr. Scott Schatzberg, DVM, PhD, Veterinary Emergency and Specialty Center,<br />
Santa Fe, NM<br />
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Andrea Tipold<br />
2. Gutachter: Univ.- Prof. Dr. med. vet. Andreas Beineke<br />
Tag der mündlichen Prüfung: 29.4.2013
Meinen Eltern
Teile der vorliegenden Dissertation wurden auf folgenden Tagungen vorgestellt:<br />
Bartels, J., Schatzberg, S.J., Darrow, B.G., Bu, L., Carlson, R., Tipold, A.:<br />
MIP-3β/CCL19 ist verantwortlich für die Einwanderung mononukleärer Zellen in den<br />
Subarachnoidalraum bei Hunden.<br />
21. Jahrestagung der Fachgruppe „Innere Medizin und Klinische<br />
Laboratoriumsdiagnostik“, Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft, e.V.<br />
(DVG), München, 01.02.-02.02.2013 (Posterpreis).<br />
Bartels, J., Schatzberg, S.J., Darrow, B.G., Bu, L., Carlson, R., Tipold, A.:<br />
MIP-3β/CCL19 associated with the invasion of mononuclear cells in<br />
neuroinflammatory and non-neuroinflammatory diseases in dogs.<br />
2013 ACVIM Forum, American College of Veterinary Internal Medicine, Seattle,<br />
Washington, U.S.A., 12.6-15.6.2013, oral presentation accepted
Inhaltsverzeichnis<br />
INHALTSVERZEICHNIS<br />
Kapitel 1 EINLEITUNG...................................................................................……….7<br />
Kapitel 2 LITERATURÜBERSICHT............................................................………….9<br />
2.1. SRMA.............................................................……………………...…...9<br />
2.1.1. Allgemeiner Überblick...............................................................….....9<br />
2.1.2. Pathogenese............................................................................…....11<br />
2.2. MUO.......................................................…………..............................13<br />
2.2.1. Allgemeiner Überblick ….......................................................……...13<br />
2.2.2. Pathogenese ….........................................................................…..15<br />
2.3. Bandscheibenvorfall.....................................................................…16<br />
2.3.1. Allgemeiner Überblick …........................................................….….16<br />
2.3.2. Pathogenese ……………………….......................................………17<br />
2.4. Chemokin MIP-3β/CCL19..................................................…….……19<br />
Kapitel 3 MATERIAL UND METHODEN …......................................…………….....21<br />
3.1. Patientenmaterial...................................................................……....21<br />
3.2. Material ............................................................................…………...22<br />
3.2.1. Reagenzien und Chemikalien...................................................…...22<br />
3.2.2. Geräte.....................................................................………………...22<br />
3.2.3. Laborbedarf.......................................................................………....23<br />
3.2.4. Puffer und Lösungen ….......................................…….....……….....24<br />
3.2.5. Computer-Software..............................………………………...........24
Inhaltsverzeichnis<br />
3.3. Methode...................................……………………………..................25<br />
3.3.1. ELISA...............................................................…………………......25<br />
3.3.2. Chemotaxis Assay................................................................……....28<br />
3.4. Statistische Auswertung …............................................………......30<br />
Kapitel 4 UNTERSUCHUNG DES CHEMOKINS MIP-3β/CCL19 IN<br />
LIQUORPROBEN VON HUNDEN MIT ENTZÜNDLICHEN UND NICHT-<br />
ENTZÜNDLICHEN ZNS-ERKRANKUNGEN …................………………. 31<br />
Kapitel 5 FALLDARSTELLUNG EINES HUNDES MIT INFEKTIÖS BEDINGTER,<br />
ENTZÜNDLICHER ZNS-ERKRANKUNG …....…..................….......…....59<br />
Kapitel 6 ÜBERGREIFENDE DISKUSSION..........................................…………....86<br />
Kapitel 7 ZUSAMMENFASSUNG..................................................................….…..93<br />
Kapitel 8 SUMMARY......................................................................…………….……96<br />
Kapitel 9 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS..................................................………....99<br />
Kapitel 10 LITERATURVERZEICHNIS...........................................………............102<br />
Kapitel 11 ANHANG......................................................................……………...…127<br />
Kapitel 12 DANKSAGUNG..........................................................……………........141
Einleitung<br />
Kapitel 1 Einleitung<br />
Entzündliche, immun mediierte oder infektiöse Erkrankungen des zentralen Nervensystems<br />
(ZNS) werden häufig in der Kleintiermedizin diagnostiziert. Eine Vielzahl von<br />
neurologischen ZNS-Erkrankungen ist beim Hund beschrieben und vermutlich<br />
immun mediiert (DEWEY 2008; TALARICO u. SCHATZBERG 2010; TIPOLD u.<br />
SCHATZBERG 2010).<br />
Eine häufige entzündliche neurologische ZNS-Erkrankung bei Hunden ist die<br />
"Steroid-responsive Meningitis-Arteriitis" (SRMA) (TIPOLD u. JAGGY 1994). Sie ist<br />
auch unter dem Namen "canine juvenile polyarthritis syndrom" (FELSBURG et al.<br />
1992), "Beagle pain syndrom" (HAYES et al. 1989), “Necrotizing Vasculitis“ (SCOTT-<br />
MONCRIEFF et al. 1992), "Corticosteroid-responsive Meningomyelitis” "(IRVING u.<br />
CHRISMAN 1990) bekannt (TIPOLD 1997).<br />
Eine andere Gruppe von neuroinflammatorischen Erkrankungen mit unbekannter<br />
Ätiopathogenese wird als Meningoenzephalomyelitis unbekannten Ursprungs (MUO)<br />
bezeichnet. In dieser Gruppe sind die granulomatöse Meningoenzephalomyelitis,<br />
nekrotisierende Enzephalitiden und andere Enzephalitiden unbekannter Ätiologie<br />
enthalten (TIPOLD 1997; TALARICO u. SCHATZBERG 2010).<br />
Diese immun mediierten Erkrankungen unbekannter Ätiologie müssen von<br />
entzündlichen Erkrankungen unterschieden werden, die durch infektiöse Mikroorganismen<br />
verursacht werden. Diese Mikroorganismen können viralen, mykologischen,<br />
protozoären oder bakteriellen Ursprungs sein (TIPOLD 1997; DEWEY<br />
2008). Es ist wichtig, die entsprechende Ursache zu diagnostizieren, um geeignete<br />
Therapien wählen zu können (DEWEY 2008).<br />
Während immun mediierte Krankheiten immunsuppressive, entzündungshemmende<br />
Medikamente benötigen, würden sie bei Infektionskrankheiten in hohen Dosierungen<br />
kontraindiziert sein (DAY 2008).<br />
Entzündungshemmende Medikamente verändern die Zytokin- und Chemokinkonzentrationen,<br />
die für eine Entzündungsreaktion und deren Folgen verantwortlich<br />
sind. Glukokortikosteroide können zum Beispiel verwendet werden, um eine<br />
unkontrollierte Immunreaktion zu unterdrücken (TIPOLD 1997; DAY 2008).<br />
7
Einleitung<br />
Eine antimikrobielle Therapie ist bei bakteriellen Infektionskrankheiten essenziell, und<br />
angemessene, frühe Anwendungen dieser Therapie sind lebensrettend (TIPOLD<br />
1995; DEWEY 2008).<br />
In der folgenden Studie sollte die Hypothese bewiesen werden, dass das Protein<br />
MIP-3β/CCL19 zumindest teilweise an der Pathogenese der Invasion von mononukleären<br />
Zellen in den Subarachnoidalraum bei Hunden mit entzündlichen und<br />
nicht-entzündlichen ZNS-Erkrankungen beteiligt ist. Die untersuchten Krankheiten<br />
umfassen die Steroid-responsive Meningitis-Arteriitis (SRMA), die Meningoenzephalitis<br />
unbekannter Herkunft (MUO) und Bandscheibenvorfälle (IVDD).<br />
8
Literaturübersicht<br />
Kapitel 2 Literaturübersicht<br />
2.1. SRMA<br />
2.1.1. Allgemeiner Überblick<br />
Die Steroid-responsive Meningitis-Arteriitis (SRMA) des Hundes ist eine weltweit<br />
verbreitete, entzündliche neurologische Erkrankung, bei der Ätiologie und Pathogenese<br />
bislang noch unklar sind (TIPOLD et al. 1995).<br />
SRMA ist die häufigste Meningitis bei Hunden (TIPOLD u. STEIN 2011) und wird<br />
zusammen mit der Granulomatösen Meningoenzephalitis (GME), den protozoären<br />
Infektionen des ZNS und der Staupe am häufigsten als entzündliche Erkrankung des<br />
ZNS diagnostiziert (TIPOLD 1995).<br />
Die histopathologischen Merkmale von SRMA sind charakterisiert durch eine eitrige<br />
Meningitis, wobei die Halswirbelsäule überwiegend betroffen ist. Der entzündliche<br />
Prozess führt zu einer Einwanderung von neutrophilen Granulozyten, Makrophagen,<br />
Plasmazellen und Lymphozyten (TIPOLD u. SCHATZBERG 2010). Zusätzlich<br />
werden in den Meningen Immunglobuline (Ig) wie IgG, IgM und IgA produziert<br />
(TIPOLD et al. 1995).<br />
Außerdem kann eine Arteriitis in den meningealen Gefäßen, besonders in den<br />
zervikalen Rückenmarkshäuten auftreten (TIPOLD u. SCHATZBERG 2010).<br />
SRMA ist überrepräsentiert in Berner Sennenhunden (TIPOLD u. JAGGY 1994), in<br />
den Hunderassen Beagle (FELSBURG et al. 1992; SNYDER et al. 1995), Boxer<br />
(TIPOLD u. JAGGY 1994), Weimaraner und Nova Scotia Duck Tolling Retriever,<br />
welches die Möglichkeit einer genetischen Prädisposition impliziert (TIPOLD u.<br />
SCHATZBERG 2010). Es können jedoch auch andere junge, mittelgroße bis große<br />
Hunde betroffen sein.<br />
Der Beginn der Krankheit tritt in der Regel zwischen dem 6. und 18. Lebensmonat<br />
eines Hundes auf, jedoch ist die Spannbreite dieser Erkrankung größer und liegt<br />
9
Literaturübersicht<br />
zwischen dem 4. Lebensmonat und dem 7. Lebensjahr (CIZINAUSKAS et al. 2000;<br />
TIPOLD 2000; TIPOLD u. SCHATZBERG 2010).<br />
Bei Hunden treten zwei klinische Formen auf, die akute und die chronische Form<br />
(TIPOLD u. JAGGY 1994; TIPOLD u. SCHATZBERG 2010).<br />
Die häufigste Form ist die akute, klassische Präsentation mit Hyperästhesie, Fieber<br />
bis zu 42° C, Apathie und Nackenschmerzen (TIPOLD 1995; TIPOLD u. SCHATZ-<br />
BERG 2010). Die weitere neurologische Untersuchung ist in der Regel unauffällig,<br />
wobei allerdings teilweise Propriozeptionsdefizite vorhanden sein können (TIPOLD<br />
2000; TIPOLD u. SCHATZBERG 2010).<br />
Wenn die Krankheit nicht frühzeitig behandelt wird, kann ein chronisch protrahierter<br />
Krankheitsverlauf beobachtet werden (CIZINAUSKAS et al. 2000; TIPOLD u.<br />
SCHATZBERG 2010).<br />
Eine chronisch-protrahierte Form kann sich aufgrund mehrerer Rezidive der<br />
klassischen Form entwickeln (TIPOLD u. SCHATZBERG 2010). Charakteristisch für<br />
die chronische Manifestation sind neurologische Defizite, welche Gangstörungen wie<br />
Hypermetrie, Paresen, generalisierte Ataxie, Propriozeptionsdefizite und einen<br />
verminderten Drohreflex einschließen (TIPOLD u. JAGGY 1994).<br />
Die Diagnose wird durch die klinische Präsentation, durch ein Blutbild und durch<br />
Liquoruntersuchungen unterstützt (TIPOLD 1997). Bei akuten Erkrankungen ist im<br />
Blutbild eine deutliche neutrophile Leukozytose mit Linksverschiebung zu erwarten<br />
(TIPOLD u. SCHATZBERG 2010). Darüber hinaus kann eine erhöhte alpha2-<br />
Globulinfraktion im Blut gemessen werden (TIPOLD 2000; TIPOLD u. SCHATZ-<br />
BERG 2010). Die Liquoranalyse weist eine neutrophile Pleozytose auf mit bis zu<br />
mehreren tausend neutrophilen Granulozyten pro Mikroliter Liquor cerebrospinalis<br />
(CSF) und einer moderat erhöhten Proteinkonzentration (TIPOLD 1997; TIPOLD<br />
2000; TIPOLD u. SCHATZBERG 2010).<br />
In der chronischen Form ist die Pleozytose des Liquors nicht so ausgeprägt wie in<br />
der akuten Form (TIPOLD 1995). Die Zellen bei der chronischen Form bestehen<br />
vorwiegend aus mononukleären Zellen wie Lymphozyten, Makrophagen und<br />
Monozyten oder aus einer gemischten Pleozytose mit normalem oder leicht<br />
10
Literaturübersicht<br />
erhöhtem Gesamtproteingehalt (TIPOLD u. JAGGY 1994; TIPOLD 1995; TIPOLD<br />
2000; TIPOLD u. SCHATZBERG 2010).<br />
Bei beiden klinischen Formen sind die IgA-Konzentrationen im Serum und Liquor<br />
cerebrospinalis erhöht (FELSBURG et al. 1992; TIPOLD u. JAGGY 1994; TIPOLD<br />
1995).<br />
Die Messung von IgA ist ein wichtiges diagnostisches Hilfsmittel zur Differenzierung<br />
der SRMA von anderen entzündlichen kaninen Meningoenzephalitiden, wobei Werte<br />
auch unter Therapie erhöht bleiben (TIPOLD u. JAGGY 1994).<br />
Andere diagnostische Verfahren wie die Computertomographie oder Magnetresonanztomographie<br />
(MRT) können nützlich sein, in dem sie eine Kontrastverstärkung<br />
der Hirnhäute aufdecken (FUCHS et al. 2000; TIPOLD u. SCHATZBERG 2010) und<br />
andere Differentialdiagnosen ausschließen.<br />
2.1.2. Pathogenese<br />
Eine Fehlregulation des Immunsystems scheint bei der Pathogenese der SRMA eine<br />
entscheidende Rolle zu spielen (TIPOLD 2000; TIPOLD u. SCHATZBERG 2010).<br />
In verschiedenen Studien wurden mikrobiologische Untersuchungen des CSF von<br />
erkrankten Hunden vorgenommen, jedoch blieb auch hier die mikrobiologische<br />
Untersuchung bei allen SRMA Fällen negativ (TIPOLD 2000). Der Nachweis von<br />
aktivierten T-Lymphozyten deutet auf eine Antigenexposition hin, aber bisher konnte<br />
kein entsprechender Auslöser entdeckt werden (TIPOLD u SCHATZBERG 2010).<br />
Das Ansprechen auf eine Glukokortikosteroidtherapie kann ein Indiz für einen<br />
immunpathologischen Mechanismus sein (BURNS et al. 1991; TIPOLD 1997).<br />
Es war möglich, Autoantikörper bei SRMA-Fällen nachzuweisen, jedoch werden<br />
diese Antikörper nicht als die eigentliche Ursache der Krankheit angesehen, sondern<br />
werden als ein Epiphänomen bewertet (SCHULTE et al. 2006; TIPOLD u.<br />
SCHATZBERG 2010).<br />
11
Literaturübersicht<br />
TIPOLD et al. (1995) konnten eine intrathekale IgM- und IgG-Synthese in SRMA-<br />
Hunden nachweisen, welche auf eine spezifische Immunantwort gegen das ZNS<br />
hindeuten.<br />
Die immunologischen Veränderungen in der akuten Form der SRMA zeigen eine<br />
erhöhte Anzahl von zirkulierenden B-Zellen, sowie eine verringerte Anzahl von T-<br />
Zellen im peripheren Blut und Liquor (FELSBURG et al. 1992). Eine Th2-vermittelte<br />
Immunantwort konnte nachgewiesen werden (SCHWARTZ et al. 2008b;<br />
SCHWARTZ et al. 2011). So war zum Beispiel Interleukin 4 (IL-4) in Blut und Liquor<br />
bei Hunden mit der akuten Form der SRMA erhöht, während die auf eine<br />
Th1-Antwort-hinweisenden Zytokinkonzentrationen (IL-2, IFN-γ) niedrig blieben<br />
(SCHWARTZ et al. 2011). Die erhöhte humorale Immunantwort und IgA-Produktion<br />
erfolgt auf Grund der überschießenden Th2 mediierten- Antwort (TIPOLD u.<br />
SCHATZBERG 2010).<br />
BURGENER et al. (1998) konnten eine positive Korrelation zwischen der Interleukin-<br />
8 Konzentration (IL-8) und dem IgA-Gehalt im Liquor cerebrospinalis, sowie der<br />
chemotaktischen Aktivität für Neutrophile identifizieren (TIPOLD u. SCHATZBERG<br />
2010). Eine kontinuierliche Freisetzung von chemotaktischen Faktoren kann die<br />
Pathogenese von Rezidiven erklären (TIPOLD et al.1994).<br />
Die klassische Form der SRMA ist durch eine erhöhte Wanderung von Leukozyten,<br />
hauptsächlich von Neutrophilen, in den Subarachnoidalraum von Hunden<br />
charakterisiert (TIPOLD u. JAGGY 1994).<br />
Es wurde gezeigt, dass Integrine für die Leukozytenmigration in das ZNS relevant<br />
sind. Das Integrin CD11a ist bei Hunden mit SRMA hochreguliert und möglicher<br />
-weise für die Invasion neutrophiler Granulozyten in den Subarachnoidalraum bei<br />
Hunden verantwortlich (SCHWARTZ et al. 2008a; TIPOLD u. SCHATZBERG 2010).<br />
Darüber hinaus kann durch die Produktion von Matrixmetalloproteinasen 2 und 9 die<br />
Basalmembran bei Entzündungen des ZNS abgebaut und die Infiltration von<br />
Neutrophilen in die Hirnhäute unterstützt werden (SCHWARTZ et al. 2008a.;<br />
SCHWARTZ et al. 2010).<br />
MAIOLINI et al`s Studie (2012) unterstützt die Annahme, dass eine Beteiligung von<br />
drei Signalproteinen (IL-6, VEGF, TGF-β1) an der Pathogenese der SRMA und an<br />
12
Literaturübersicht<br />
der Entwicklung einer systemischen Arteriitis mit verantwortlich sind. TGF- β1 und IL-<br />
6 sind möglicherweise bei der Differenzierung von CD4 Vorläuferzellen zu Th17<br />
Lymphozyten beteiligt und führen dadurch zu einer Autoimmunreaktion (MAIOLINI et<br />
al. 2012). Der Mechanismus der Einwanderung dieser mononukleären Zellen in die<br />
Meningen ist bisher nicht bekannt.<br />
2.2. MUO<br />
2.2.1. Allgemeiner Überblick<br />
Es gibt eine weitere Gruppe von neuroinflammatorischen Erkrankungen mit<br />
unbekannter Ätiopathogenese. Diese Erkrankungen werden als Meningoenzephalomyelitiden<br />
unbekannten Ursprungs (MUO) bezeichnet.<br />
Diese Terminologie umfasst die Granulomatöse Meningoenzephalitis (GME),<br />
nekrotisierende Meningo-enzephalitis (NME), nekrotisierende Leukoenzephalitis<br />
(NLE) und andere Enzephalitiden unbekannter Ätiologie (ADAMO et al. 2007;<br />
TALARICO u. SCHATZBERG 2010), bei denen zwar eine Verdachtsdiagnose gestellt<br />
wird, aber histopathologische Untersuchungen ante mortem meist nicht durchgeführt<br />
werden.<br />
Die klinischen Symptome hängen von der Lokalisation der Entzündung und dem<br />
Ausmaß der Entzündung ab. Der Beginn ist in der Regel akut, progressiv im Verlauf<br />
und besitzt oft eine multifokale bis diffuse neuroanatomische Lokalisierung<br />
(TALARICO u. SCHATZBERG 2010). GME kann bei allen Hunderassen auftreten,<br />
wobei Toyrassen und Terrierrassen überrepräsentiert sind (TALARICO u. SCHATZ-<br />
BERG 2010). Das Auftreten klinischer Symptome erfolgt in der Regel im Alter von 6<br />
Monaten bis zu 12 Jahren (MUNANA 1996).<br />
Drei Formen werden unterschieden, und zwar eine disseminierte, okuläre oder fokale<br />
Form (TIPOLD 1997; TALARICO u. SCHATZBERG 2010).<br />
13
Literaturübersicht<br />
NME und NLE werden auch aufgrund ihrer Überschneidungen in der Neuropathologie<br />
zu der nekrotisierenden Enzephalitis (NE) zusammengefasst (TALARICO<br />
u. SCHATZBERG 2010).<br />
Die klinische Symptomatik von NE variiert mit Lage der Läsion und ist gewöhnlich mit<br />
cerebrothalamischen Anzeichen verbunden, obwohl NLE auch zu Hirnstammsymptomen<br />
führen kann (DE LAHUNTA und GLAS 2009, S. 411; TALARICO u.<br />
SCHATZBERG 2010).<br />
Die definitive Diagnose kann nur durch Gehirnbiopsien und histopathologische<br />
Untersuchungen erfolgen (DEWEY 2008; TALARICO u. SCHATZBERG 2010). Jede<br />
Krankheit hat histopathologische Merkmale. GME ist durch eine perivaskuläre nicht<br />
eitrige Granulombildung unter Beteiligung von Monozyten, Lymphozyten und<br />
Plasmazellen charakterisiert (CORDY 1979; TALARICO und SCHATZBERG 2010).<br />
Läsionen werden vor allem in der weißen Substanz gefunden (CORDY 1979;<br />
TALARICO u. SCHATZBERG 2010). Die graue Substanz, die Meningen und der<br />
Plexus chorioideus können ebenfalls betroffen sein (KIPAR et al. 1998).<br />
NME ist histologisch durch eine nicht-eitrige Meningoenzephalitis, vorherrschend im<br />
zerebralen Kortex, mit perivaskulären Infiltrationen von Lymphozyten, Plasmazellen<br />
und Makrophagen charakterisiert. Darüber hinaus treten Nekrose und fokale<br />
Malazien in der grauen Substanz auf (HINRICHS et al. 1996; TALARICO u.<br />
SCHATZBERG 2010).<br />
NLE betrifft überwiegend die periventrikuläre weiße Hirnsubstanz und zeigt große<br />
Nekrosen mit Hohlraumbildung (SUMMERS et al. 1995; TALARICO u.<br />
SCHATZBERG 2010).<br />
Eine ante mortem Diagnose besteht meistens nur aus einer Verdachtsdiagnose, die<br />
aufgrund des Signalements, der neurologischen Präsentation, der Liquoranalysen,<br />
der neuroanatomischen Lokalisierung, und bildgebenden Verfahren, sowie durch den<br />
Ausschluss von Infektionserregern gestellt wird (TIPOLD 1997).<br />
Liquorproben können sehr hilfreich bei der Unterstützung einer Verdachtsdiagnose<br />
sein und können eine erhöhte Anzahl von Entzündungszellen im Liquor aufdecken.<br />
14
Literaturübersicht<br />
Häufig wird eine mononukleäre oder gemischtzellige Pleozytose im Liquor von MUO<br />
Tieren gesehen (TIPOLD 1997; TALARICO u. SCHATZBERG 2010).<br />
Computertomographie (CT) oder die Magnetresonanz-Tomographie (MRT) sind<br />
wertvolle diagnostische Hilfsmittel, um eine Verdachtsdiagnose stellen zu können<br />
(TALARICO u. SCHATZBERG 2010). Abhängig von der jeweiligen Krankheit<br />
offenbart ein MRT Veränderungen in den Meningen, in der grauen und/oder weißen<br />
Substanz und deutet auf einen Entzündungsprozess hin.<br />
2.2.2. Pathogenese<br />
Die Ätiopathogenese ist nicht bekannt. Wie bei der SRMA, gibt es eine<br />
Prädisposition für bestimmte Rassen und ein genetischer Einfluss wird vermutet<br />
(TIPOLD 1997;<br />
BARBER et al. 2011). NME wurde zunächst als “pug dog encephalitis” bezeichnet,<br />
da sie erstmals bei Möpsen beschrieben wurde (KOBAYASHI 1994). Diese Krankheit<br />
ist auch beim Malteser dokumentiert (STALIS 1995). Die starke genetische<br />
Komponente wurde von BARBER et al. (2011) und GREER et al. demonstriert<br />
(GREER et al. 2009; GREER et al. 2010).<br />
Bei Yorkshire Terriern wurde eine nicht-eitrige, nekrotisierende Enzephalitis<br />
beschrieben, die der des Mopses ähnelt, sich jedoch in der Verteilung der Läsionen<br />
unterscheidet (TIPOLD et al. 1993b).<br />
NME betrifft vor allem die graue Substanz, während NLE hauptsächlich die weiße<br />
Substanz beeinflusst. In mehreren Studien wurden Autoantikörper gegen<br />
Hirngewebe bzw. Astrozyten gefunden (UCHIDA et al. 1999; MATSUKI et al. 2004;<br />
SHIBUYA et al. 2007; MATYASH u. KETTENMANN 2010; ZHANG u. BARRES<br />
2010). Allerdings ist auch zu erwähnen, dass ähnliche Antikörper im Liquor von<br />
anderen ZNS-Erkrankungen oder sogar von gesunden Tieren gefunden werden<br />
(SHIBUYA et al. 2007; TODA et al. 2007; TALARICO u. SCHATZBERG 2010).<br />
Derzeit wird vermutet, dass neben genetischen Einflüssen potenzielle infektiöse<br />
15
Literaturübersicht<br />
Auslöser zu einer Immundysregulation führen (TIPOLD 1997; TALARICO u.<br />
SCHATZBERG 2010).<br />
Spezifische Pathogene oder Antigene, die NME, NLE oder GME induzieren können,<br />
wurden untersucht. Aufgrund der neuropathologischen Gemeinsamkeiten wurde eine<br />
starke Virusbeteiligung vermutet, obwohl bisher kein Virus isoliert werden konnte<br />
(HINRICHS et al. 1996; TIPOLD 1997; SCHATZBERG et al. 2005; TALARICO und<br />
SCHATZBERG 2010).<br />
Allerdings werden diese Studien weitergeführt, um potenzielle Antigene zu<br />
identifizieren (SCHATZBERG 2007).<br />
2.3. Bandscheibenvorfälle<br />
2.3.1. Allgemeiner Überblick<br />
Bandscheibenvorfälle (IVDD) gehören zu den degenerativen neurologischen<br />
Erkrankungen und können in zervikale (C), thorakale (T), lumbale (L) oder sakrale<br />
(S) Bandscheibenvorfälle eingeteilt werden (PLATT u. OLBY 2004; LORENZ et al.<br />
2011). IVDD können entweder bei Protrusion des Anulus fibrosus Hansen-Typ 2 oder<br />
bei Extrusion des Nucleus pulposus in den Wirbelkanal Hansen-Typ 1 benannt<br />
werden (LORENZ et al. 2011).<br />
Die Inzidenz von thorakolumbalen IVDD ist höher als von zervikalen oder lumbalen<br />
IVDD (LORENZ et al. 2011).<br />
Basierend auf dem klinischen Schweregrad der Erkrankung können Hunde mit IVDD<br />
in fünf Symptomgruppen eingeteilt werden (SHARP u. WHEELER 2005). Der<br />
neurologische Grad 1 besteht aus Schmerzen ohne neurologische Dysfunktion. Grad<br />
2 wird als geringgradige Parese, Ataxie mit Propriozeptionsdefiziten und erhaltener<br />
Gehfähigkeit präsentiert.<br />
In Grad 3 werden hochgradige Paresen ohne Gehfähigkeit gesehen. Während der<br />
Grad 4 plegische Tiere beschreibt, bei denen Tiefenschmerz noch vorhanden ist,<br />
16
Literaturübersicht<br />
besitzen Patienten mit Grad 5 keinen Tiefenschmerz mehr (SHARP u. WHEELER<br />
2005).<br />
Klinische Symptome variieren nach der neuroanatomischen Lokalisation und dem<br />
Schweregrad des Bandscheibenvorfalls. Der Grad der neurologischen Dysfunktion<br />
beeinflusst die Prognose (PLATT u. OLBY 2004; LORENZ et al. 2011).<br />
Die Verdachtsdiagnose wird anhand des Signalements, der Vorgeschichte, der<br />
neurologischen Untersuchung gestellt und durch Übersichtsröntgenbilder und<br />
Myelographie unterstützt. Erweiterte Bildgebung, wie MRT oder CT, sind besser<br />
geeignet, um die Lage und das Ausmaß der Läsion zu identifizieren (COATES 2004).<br />
2.3.2. Pathogenese<br />
Ein Bandscheibenvorfall „Hansen-Typ 1“ ist eine chondroide Bandscheibendegeneration<br />
mit Herniation des Nucleus pulposus durch den Anulus fibrosus und<br />
Extrusion von Kernmaterial in den Wirbelkanal, welches zu einer<br />
Kompression des Rückenmarks führt (COATES 2004). Diese Form betrifft vor allem<br />
junge chondrodystrophe Hunde im thorakolumbalen Übergang (T12 - L2), wobei<br />
Dackel die größte Inzidenz haben (COATES 2004). Pudel, Beagle oder<br />
Cockerspaniel sind andere chrondrodystrophe Rassen, bei denen Hansen Typ 1<br />
Vorfälle gehäuft auftreten, allerdings kann diese Form auch in einigen großen<br />
Hunderassen wie Deutscher Schäferhund, Dobermann oder Labrador Retriever<br />
vorkommen (LORENZ et al. 2011).<br />
Hansen Typ 2-Vorfälle sind mit einer Protrusion des Anulus fibrosus verbunden.<br />
Dieser Typ ist häufiger bei älteren nicht chondrodystrophen Rassen wie Deutscher<br />
Schäferhund oder Labrador Retriever vorzufinden (LORENZ et al. 2011).<br />
Zusätzlich kann eine dritte Art von traumatischen Bandscheibenextrusionen ohne<br />
vorherige degenerative Veränderungen auftreten und zu Verletzungen des<br />
Rückenmarks ohne Kompression führen (DE LAHUNTA u. GLASS 2009, S. 258-<br />
259).<br />
17
Literaturübersicht<br />
Traumatische Ereignisse und Kompression verursachen direkte Schädigungen des<br />
Rückenmarks (OLBY 2010).<br />
Die anfängliche traumatische Schädigung führt zu Mechanismen, die eine<br />
Sekundärschädigung auslösen (COUGHLAN 1993; KRAUS 1996; JERRAM u.<br />
DEWEY 1999; WEIL et al. 2008), zum Beispiel können reaktive Sauerstoff-Moleküle<br />
zu einer neuronalen Schädigung führen (JERRAM u. DEWEY 1999; OLBY 2010).<br />
Demyelinisierung, Entzündungsreaktionen, fokale Blutungen und Ödem sind die<br />
Folge und resultieren in einer Schwellung des Rückenmarks (BRAUND 1993;<br />
JERRAM u. DEWEY 1999).<br />
Bei Rückenmarksverletzungen (SCI) aufgrund von Bandscheibenvorfällen kann eine<br />
lokale Entzündungsreaktion nachgewiesen werden (SPITZBARTH et al. 2012), wobei<br />
Leukozyteninfiltrate zu einer weiteren Schädigung des Rückenmarks führen.<br />
FLEMING et al. (2009) demonstrierten, dass eine reduzierte Leukozyteninfiltration<br />
nach SCI das Gewebe schützen kann.<br />
In SRUGO et al. `s Studie (2011) wurde nachgewiesen, dass eine Pleozytose des<br />
Liquor cerebrospinalis positiv mit dem Schweregrad der thorakolumbalen Schädigung<br />
des Rückenmarks bei Hunden mit IVDD verbunden ist. Sie fanden heraus,<br />
dass der Anteil der Liquormakrophagen bei den Hunden höher war, die keine Gehfähigkeit<br />
wiedererlangten und auch keinen Tiefenschmerz besaßen (SRUGO et al.<br />
2011). Mechanismen zur Einwanderung dieser mononukleären Zellen sind beim<br />
Hund nicht weiter untersucht.<br />
2.4. Chemokin MIP-3β /CCL19<br />
Chemokine sind wichtige Faktoren für die Zellwanderung und Pathogenese von<br />
Entzündungen im ZNS (DOGAN u. KARPUS 2004). Die meisten Chemokine sind im<br />
entzündeten Gewebe unter pathologischen Bedingungen hochreguliert und<br />
beeinflussen das Migrationsverhalten und die Aktivierung von Immunzellen<br />
(KARPUS u. RANSOHOFF 1998).<br />
18
Literaturübersicht<br />
Sie können Oberflächenmoleküle auf zirkulierenden peripheren Entzündungszellen<br />
hoch regulieren, welche daraufhin effizienter an den Endothelzellen der Blut-Hirn-<br />
Schranke (BBB) anhaften und auf die lokalen Chemokingradienten des ZNS<br />
reagieren können (CONSTANTIN 2008).<br />
Ist die Regulation der Chemokinproduktion gestört, können diese Moleküle Immunzellen<br />
dauerhaft aktivieren und eine chronische Entzündung verursachen<br />
(BAGGIOLINI 1998; LUSTER 1998).<br />
Ein Chemokin, das ebenfalls in die Pathogenese von Entzündungsreaktionen<br />
involviert ist, ist das MIP-3β (Macrophage Inflammatory Protein-3 beta), welches<br />
auch als (CC motif)-Ligand 19 (CCL19) bekannt ist.<br />
Es wird von verschiedenen Zellen, wie zum Beispiel dendritischen Zellen (DC),<br />
Makrophagen und einigen nicht-hematopoetischen Zellen hergestellt (CYSTER<br />
1999). Es bindet an den CCR7 Rezeptor, der auf myeloischen Zellen (KIVISÄKK et<br />
al. 2004), Gedächtnis-T-Zellen, aktivierten B-Zellen und reifen DC exprimiert wird<br />
(SALLUSTO u. LANZAVECCHIA 2000). In Studien von Nagetieren konnte die<br />
Produktion von CCL19 auch mit Astrozyten und Mikroglia in Verbindung gebracht<br />
werden (SERAFINI et al. 2001). Chemokinproduktion erfolgt entweder konstitutiv<br />
oder induziert (KRUMBHOLZ et al. 2007). Eine konstitutive CCL19 Bildung im ZNS<br />
ist möglicherweise für eine schnelle Immunüberwachung notwendig (KRUMBHOLZ<br />
et al. 2007). Bei der Entwicklung von chronischen Entzündungen im ZNS konnte eine<br />
Beteiligung von CCL19 nachgewiesen werden (PASHENKOV et al. 2003). Bei der<br />
Multiplen Sklerose (KRUMBHOLZ et al. 2007) oder der chronisch experimentellen<br />
autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) (SERAFINI et al. 2001) wird CCL19 de novo<br />
exprimiert.<br />
Mikroglia sind Effektorzellen des Immunsystems im ZNS (WILLIAMS et al. 2001), ihr<br />
„Homing“ könnte auch durch CCL19 geregelt sein (KIM et al. 1998). Mikroglia<br />
produziert möglicherweise auch CCL 19, sie ist bei Hunden mit MUO (STEIN 2004)<br />
und Verletzungen des Rückenmarks (BOEKHOFF et al. 2012) aktiviert.<br />
19
Literaturübersicht<br />
Die vorliegende Arbeit ist in zwei Abschnitte gegliedert:<br />
Die erste Studie (MIP-3β/CCL19 associated with the invasion of mononuclear cells in<br />
neuroinflammatory and non-neuroinflammatory diseases in dogs) untersucht, ob das<br />
Protein MIP-3β / CCL19 teilweise an der Pathogenese der Invasion von<br />
mononukleären Zellen in den Subarachnoidalraum von Hunden mit entzündlichen<br />
und nicht-entzündlichen ZNS-Erkrankungen beteiligt ist und ob CCL19 als wertvoller<br />
Biomarker für die Progression von Krankheiten beziehungsweise als prognostischer<br />
Indikator dienen kann.<br />
In der zweiten Studie (Successful medical management of an intra- and extracranial<br />
abscess of a dog secondary to a bite wound) wird der Erfolg einer medikamentellen<br />
Behandlungsstrategie für die Therapie eines Hirnabszesses dargestellt, welcher eine<br />
neuroinflammatorische Erkrankung mit infektiöser Ursache repräsentiert.<br />
20
Material und Methoden<br />
Kapitel 3 Material und Methoden<br />
3.1. Patientenmaterial<br />
In dieser retrospektiven Studie wurden insgesamt 141 Hunde untersucht, die zum<br />
einen in der Klinik für Kleintiere der Stiftung <strong>Tierärztliche</strong> <strong>Hochschule</strong> in <strong>Hannover</strong><br />
und zum andern im Veterinary Emergency and Specialty Center (VESC) Santa Fe,<br />
NM, USA vorstellig waren.<br />
Von diesen Hunden wurden gepaarte Serum- und Liquorproben entnommen und bei<br />
-20°C aufbewahrt.<br />
Die Patienten wurden insgesamt in vier Hauptgruppen aufgeteilt.<br />
Gruppe 1: 51 Hunde mit Steroid-Responsiver Meningitis-Arteriitis (SRMA)<br />
in der akuten Phase (n=25) und während der Behandlung (n=26)<br />
Gruppe 2: 27 Hunde mit Meningoenzephalomyelitis unbekannten Ursprungs (MUO)<br />
ohne Behandlung (n=16) und mit einer Prednisolonbehandlung (n=11)<br />
Gruppe 3: 36 Hunde mit Bandscheibenvorfällen (IVDD) unterschiedlichen<br />
Schweregrades Grad 2/3 (n=25 ) und Grad 4/5 (n=11)<br />
Gruppe 4: 27 Hunde als Kontrollgruppe mit idiopathischer Epilepsie (IE) (n=21) und<br />
gesunde Hunde (n=6)<br />
Für den Chemotaxis Assay wurden Liquorproben von insgesamt sieben Patienten<br />
untersucht. Drei Patienten mit SRMA, zwei Hunde mit MUO und zwei Liquorproben<br />
von Patienten mit diagnostiziertem Bandscheibenvorfall wurden ausgewertet. Die für<br />
diesen Test benötigten peripheren mononukleären Zellen (PMCs) wurden aus fünf ml<br />
frischem EDTA-Blut isoliert, das über Zephalicavenenpunktion eines gesunden<br />
Hundes entnommen wurde.<br />
21
Material und Methoden<br />
3.2. Material<br />
3.2.1. Reagenzien und Chemikalien<br />
- Histopaque 1,119, (Best.-Nr. 1119-1), Fa. Sigma-Aldrich<br />
- Pancoll human 1,077, (Best.- Nr. P04-060500), Fa. Biotech GmbH<br />
- Trypan- Blau-Lösung 0,4% in PBS, (Best.-Nr. T-6146), Fa. Sigma-Aldrich,<br />
Schnelldorf<br />
- AlamarBlue, Fa. Serotec, Düsseldorf, Deutschland<br />
- kanines MIP-3β/CCL19 ELISA Test-Kit (E90096Ca 96 Tests), USCN Life Science<br />
Inc., Wuhan, PR China<br />
3.2.2. Geräte<br />
- Lichtmikroskop, H 600, Fa. Helmut Hund GmbH, Wetzlar<br />
- Türk- Zählkammer, Fa. Brand, Wertheim<br />
- CO2-Brutschrank, MCO-18AIC (UV), Fa. SANYO Sales und Marketing Europe<br />
GmbH, München<br />
- Reagenzglasschüttler Reax control, Fa. Heidolph, Schwabach<br />
- Reinstwasser-Aufbereitungssystem GenPure, Fa. TKA Thermo Fisher Scientific,<br />
Niederelbert<br />
- Mikrobiologische Sicherheitswerkbank HERAsafeKS, Fa. Thermo Fisher Scientific,<br />
Niederelbert<br />
- Gefrierschrank Premium NoFrost, Fa. Liebherr, Ochsenhausen<br />
- Kühlschrank Comfort, Fa. Liebherr, Ochsenhausen<br />
- Ultraschallbad Ultrasound-7-neutral (Art. 5356), Fa. Roth, Karlsruhe<br />
- Laborwaage LabStyle204, Fa. Mettler Toledo, Giessen<br />
- Magnetrührer mit Heizplatte, Typ MR 3001,Fa. Heidolph, Schwabach<br />
- Magnetrührstäbchen, verschiedene Größen, 90 715, -730, -751, Fa. H+P<br />
Labortechnik, Oberschleißheim<br />
- Plattenrüttler Promax 1020, Fa. Heidolph, Schwabach<br />
22
Material und Methoden<br />
- Tischzentrifuge Rotina 35R, Fa. Hettich, Tuttlingen<br />
- Wasserbad mit Einhängethermostat, Fa. Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach<br />
- Synergy 2 Multi-Detektions-Reader für Mikroplatten, Fa. BioTek Instruments, Bad<br />
Friedrichshall<br />
- Vet-MR Grande 0.25 Tesla field, Fa. Esaote, Italy<br />
3.2.3. Laborbedarf<br />
- EDTA-Röhrchen, 5 mL , Fa. Sarstedt, Nümbrecht<br />
- 96-well Chemotaxis-Kammer (Polycarbonatfilter 5 µm Porengröße, 3.2 mm<br />
Durchmesser, 30 µl well-Größe), Chemo TX Disposable Chemotaxis system,<br />
NeuroProbe, Gaithersburg, MD<br />
- kanines MIP-3β/CCL19 ELISA Test-Kit (E90096Ca 96 Tests), USCN Life Science<br />
Inc., Wuhan, PR China<br />
- Pipettenspitzen: 10 µl (Kristall; Best.-Nr. 702504), Fa. Brand, Wertheim<br />
200 µl (gelb) (Best.-Nr. 613-0240), Fa. VWR, Darmstadt<br />
1000 µl (blau) (Best.-Nr. 2100610), Fa. Ratiolab, Dreieich<br />
- Pipetten Transferpette® einstellbar (0,1-1000 µl), Fa. Brand, Wertheim<br />
- Pipettierhelfer accu-jet® pro, Fa. Brand, Wertheim<br />
- Polystyrolröhrchen 3,5 ml und 5 ml (Art.-Nr. 55.1579 bzw. 55.484.001), Fa.<br />
Sarstedt, Nümbrecht<br />
- Einmalhandschuhe Novaglove® -Latex (Best.-Nr. 905451), Fa. NOBA<br />
Verbandsmittel, Wetter<br />
- Glas-Pasteurpipetten, 150 ml (Best.-Nr. 612-1798), Fa. VWR, Darmstadt<br />
- Mehrfachdispenser Handy-step® (Best.-Nr. 705100), Fa. Brand, Wertheim<br />
- Präzisionsdispenserspitzen 5 ml, 25 ml (Best.-Nr. 702376, 702380), Fa. Brand,<br />
Wertheim<br />
- Eppendorf Safelock-Tubes, 1,5 ml (Best.-Nr. 0030121694), Fa. Eppendorf,<br />
Hamburg<br />
- Bechergläser, Fa. VWR, Darmstadt<br />
23
Material und Methoden<br />
- Polypropylenröhrchen mit Deckel, 2 ml (Art.-Nr. 72.694), Fa. Sarstedt, Nümbrecht<br />
- Polypropylenröhrchen 4 ml (Best.- Nr. 55.532), Fa. Sarstedt, Nümbrecht<br />
- Reagenzröhrchen mit Verschluss, Polypropylen, 15 ml (Best.- Nr. 62.554.001),<br />
Fa. Sarstedt, Nümbrecht<br />
3.2.4. Puffer und Lösungen<br />
- HBSS, Hank`s balancierte Salzlösung (Best.- Nr. H4891), Fa. Sigma-Aldrich,<br />
Deisenhofen Deutschland<br />
- Zellwaschlösung (Best.- Nr. 349524), Fa. Becton Dickinson, Heidelberg<br />
- PBS, Phosphatgepufferte Salzlösung (pH 7,4):<br />
NaCl 137,0 mM<br />
KCl 2,7 mM<br />
Na2HPO4 8,1 mM<br />
KH2PO4 1,5 mM<br />
- Roswell Park Memorial Institute (RPMI)1640 Medium mit L-glutamine, Gibco<br />
Invitrogen GmbH, Karlsruhe<br />
- BSA, bovines Serumalbumin (Best.-Nr. A4503-50G), Fa. Sigma-Aldrich, Steinheim<br />
3.2.5. Computer-Software<br />
- Gen5 Reader Control and Data Analysis Software, Fa. BioTek Instruments, Bad<br />
Friedrichshall<br />
- Statistik Software- R® (R Foundation for Statistical Computing)<br />
24
Material und Methoden<br />
3.3. Methode<br />
3.3.1. ELISA<br />
Das Chemokin MIP-3β/CCL19 wurde mit Hilfe eines Sandwich-ELISAs (Enzyme<br />
linked immunoabsorbent assay) gemessen.<br />
In der Studie wurde ein speziell für das kanine MIP-3β/CCL19 entwickelter ELISA-Kit<br />
verwendet (E90096Ca 96 Tests), welcher nach den Richtlinien des Herstellers<br />
angewandt wurde (USCN Life Science Inc., Wuhan, PR China).<br />
In dem ELISA-Kit ist eine Mikrotiterplatte enthalten, die mit einem monoklonalen<br />
Antikörper spezifisch für das MIP-3β/CCL19 vorbeschichtet ist. Das Funktionsprinzip<br />
des SANDWICH-ELISAs beruht darauf, dass das im Patientenserum oder -liquor<br />
enthaltene MIP-3β/CCL19 an dem monoklonalen Antikörper der Mikrotiterplatte<br />
haftet. An das gebundene Protein kann in einem weiteren Schritt nun ein zweiter<br />
Antikörper binden. Nach Farbreaktion eines Substrates kann die Konzentration des<br />
Chemokins gemessen werden. Zwischen den einzelnen Schritten werden die<br />
überschüssigen Antikörper durch entsprechende Waschvorgänge entfernt.<br />
Liquorproben wurden entweder unverdünnt eingesetzt oder wurden je nach MIP-3β /<br />
CCL19 Ausgangskonzentration mit der Standardverdünnung bis zu einer Konzentration<br />
von 1:13 verdünnt. Die Serumproben wurden für die Untersuchungen des<br />
Proteins mit Hilfe des ELISAs unverdünnt eingesetzt.<br />
Auf jeder 96- well Mikrotiterplatte wurden sieben Kavitäten für die Verdünnungsreihe<br />
des Standards verwendet, eine Kavität wurde für den „Blank“ (Leerwert) und die<br />
restlichen Kavitäten wurden für die Liquor- und Serumproben benutzt (siehe<br />
Anhang).<br />
Vier Liquor- und Serumproben von Hunden mit idiopathischer Epilepsie dienten als<br />
Kontrolle. Eine dieser Proben wurde als Kontrolle auf jeder Mikrotiterplatte in jedem<br />
Experiment mitgeführt. Als positive Kontrolle dienten Liquor- und Serumproben von<br />
Hunden mit entzündlichen Erkrankungen und wurden ebenfalls bei jedem<br />
Experiment in gleicher Konzentration mit untersucht.<br />
25
Material und Methoden<br />
Nach einer zweistündigen Inkubationszeit (befeuchtete Luft, 37 °C, 5 % CO2<br />
Konzentration; SANYO Sales und Marketing Europe GmbH, München) wurden die<br />
Liquor- und Serumproben aus jeder Kavität entfernt. Ein für CCL19 spezifischer<br />
Biotin-konjugierter polyklonaler Antikörper (USCN, Life Science Inc., Wuhan, PR<br />
China) wurde zu jeder Kavität der Mikrotiterplatte hinzugegeben. Nach einer weiteren<br />
einstündigen Inkubationszeit wurden die Kavitäten dreimal mit einer<br />
Waschpufferlösung gewaschen (USCN Life Science Inc., Wuhan, PR China). Avidin,<br />
an welches eine Meerrettich-Peroxidase konjugiert ist (USCN, Life Science Inc.,<br />
Wuhan, PR China), wurde zu jeder Vertiefung hinzugegeben und für 30 Minuten bei<br />
37° C inkubiert. Der wie zuvor durchgeführte Waschvorgang wurde insgesamt<br />
fünfmal wiederholt. Bei dieser Untersuchung wird anschließend das TMB Substrat<br />
hinzugegeben und durch die Peroxidase umgesetzt, so dass eine blaue<br />
Farbveränderung entsteht.<br />
Durch die Zugabe von Schwefelsäure (USCN, Life Science Inc., Wuhan, PR China)<br />
wird die Enzym-Substrat-Reaktion beendet und eine gelbe Farbe entsteht. Die<br />
entstandene Farbänderung konnte spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge von<br />
450nm ± 10nm auf einem Mikroplatten-Reader, welcher mit der Analysesoftware Gen<br />
5 ausgestattet ist, gemessen werden (Synergy2 HT Multimode-Mikroplatten-Reader,<br />
BioTek Instruments Inc., Bad Friedrichshall Deutschland). CCL19 Konzentrationen<br />
zwischen 15.6 bis 1000 pg/ml können mit dieser Methode nachgewiesen werden.<br />
Die Standardkurve (Anhang) wurde mit Hilfe eines lyophilisierten Standard-Reagenz<br />
(USCN, Life Science Inc., Wuhan, PR China) des ELISA-Kits erstellt. Die<br />
Konzentrationen für die Standardkurve betrugen 1000 pg/ml, 500 pg/ml, 250 pg/ml,<br />
125 pg/ml, 62.5 pg/ml, 31.2 pg/ml und 15.6 pg/ml. Die minimale nachweisbare<br />
Menge des kaninen MIP-3β/CCL19 beträgt 6.5 pg/ml. Alle Messungen der Liquorund<br />
Serumuntersuchungen wurden in Duplikaten durchgeführt. Die gemessene OD<br />
(optische Dichte) konnte mit Hilfe der Standardkurve, die bei jedem Experiment<br />
erstellt wurde, in die Chemokinkonzentration (pg/ml) umgerechnet werden. Somit<br />
erlaubt der ELISA eine quantitative Bestimmung des Chemokins MIP-3β/CCL19.<br />
26
Material und Methoden<br />
Abb. 1: Prinzip der MIP-3β / CCL19 - Detektion mit Hilfe eines SANDWICH-ELISAs<br />
modifiziert nach: BURNS (2010)<br />
Testcharakteristika<br />
Präzision und Reproduzierbarkeit<br />
Die Präzision des MIP-3β/CCL19 ELISAs wird durch die Intra-assay-Varianz und<br />
durch die Inter-assay-Varianz dargestellt. Sie geben das Maß der analytischen<br />
Streuung an, den Variationskoeffizienten (CV% = SD/mean * 100) (HALWACHS-<br />
BAUMANN 2011).<br />
Die Intra-assay-Varianz beschreibt die Abweichungen innerhalb des gleichen<br />
Messdurchlaufes (HALWACHS-BAUMANN 2011). Die Inter-assay-Varianz gibt die<br />
Messabweichung auf unterschiedlichen Mikrotiterplatten derselben Proben an<br />
mehreren aufeinanderfolgenden Tagen an (HALWACHS-BAUMANN 2011).<br />
Drei Proben mit niedriger, mittlerer und hoher kaniner MIP-3β/CCL19- Konzentration<br />
wurden 20 Mal auf einer Mikrotiterplatte getestet, wobei der CV unter 10 % betrug.<br />
Drei Proben mit niedriger, mittlerer und hoher kaniner MIP-3β/CCL19 Konzentration<br />
wurden auf drei verschiedenen Platten getestet, wobei die Interassay-Varianz CV<br />
unter 12 % betrug (USCN LIFE SCIENCE INC. 2011).<br />
27
Material und Methoden<br />
3.3.2. Chemotaxis-Assay<br />
Um nachzuweisen, dass MIP-3β/CCL19 auch funktionell aktiv im Liquor<br />
cerebrospinalis vorliegt, wurde die chemotaktische Aktivität für mononukleäre Zellen<br />
mit Hilfe eines Migrationsassays unter Verwendung einer Einweg-96-Well-<br />
Chemotaxis Kammer (Chemo TX Disposable Chemotaxis system, NeuroProbe,<br />
Gaithersburg, MD) gemessen. Aus 5 ml peripherem Blut eines gesunden Hundes<br />
wurden mononukleäre Zellen durch Ficoll-Gradienten-Zentrifugation isoliert. Die<br />
Zellzahl wurde bestimmt und der Chemotaxis-Assay durchgeführt.<br />
Durchführungsprotokoll für die Separation mononukleärer Zellen<br />
Periphere mononukleäre Zellen (PMCs) wurden aus fünf Millilitern frischem EDTA-<br />
Blut über Punktion der Vena cephalica eines gesunden Hundes erhalten. Die PMCs<br />
wurden durch Ficoll-Gradienten-Zentrifugation nach einer modifizierten Technik nach<br />
TOTH et al. (1992) getrennt (siehe Anhang).<br />
Durchführung des Chemotaxis-Assays<br />
Für den Chemotaxis-Assay wurden fünfundzwanzig Mikroliter (µl) der vorher auf die<br />
erwünschte Konzentration eingestellten Zellsuspension (50.000 Zellen / 25 µl) direkt<br />
auf die Filteroberfläche der Chemotaxis- Assay Kammer (Chemo TX Disposable<br />
Chemotaxis system, NeuroProbe, Gaithersburg, MD) pipettiert. Die Kammer ist mit<br />
einer hydrophoben Maske um jede Teststelle beschichtet, wodurch die<br />
Zellsuspension auf diese vorgegebenen Teststellen beschränkt bleibt und die<br />
Notwendigkeit für Vertiefungen auf der Filteroberfläche entfallen.<br />
Eine bekannte Verdünnungsreihe der Zellsuspension mit 50.000 Zellen, 25.000<br />
Zellen, 12.500 Zellen, 6.250 Zellen, 3.125 Zellen, 1.563 und 781 Zellen wurde<br />
hergestellt und in eine Reihe der Kavitäten der Chemotaxis-Kammer pipettiert. Diese<br />
Verdünnungsreihe dient als Standard des Chemotaxis-Assays, mit dem die zu<br />
messenden Liquorproben verglichen werden konnten. Der Rest der 96-Well Platte<br />
28
Material und Methoden<br />
wurde jeweils mit 29 µl der zu untersuchenden Liquorproben beladen, welche in<br />
Rosewell Park Memorial Institute (RPMI)1640 Medium mit L-glutamine (Gibco®<br />
RPMI Media 1640) und 1 % Bovinen Serum Albumin (BSA) verdünnt wurden. Die zu<br />
untersuchenden Liquorproben stammten von drei unbehandelten Hunden mit SRMA,<br />
zwei Hunden mit einem Bandscheibenvorfall und zwei unbehandelten Hunden mit<br />
vermutlicher MUO.<br />
In zwei Kavitäten der Platte wurde nur Medium pipettiert, um als negative Kontrolle<br />
des Versuches zu dienen.<br />
Die mit der Standardreihe, den Liquorproben, sowie der negativen Kontrolle<br />
beladenen Kammern und die auf der Filteroberfläche zugesetzte Zellsuspension<br />
wurde bei 37°C in befeuchteter Luft mit 5% CO2 in einem Inkubator (SANYO Sales &<br />
Marketing Europe GmbH, München) inkubiert. Die Migrationszeit der Zellsuspension<br />
erfolgte für 30 Minuten, 1 Stunde, 1,5 Stunden und 2 Stunden. Der Filter wurde<br />
entfernt und die Zellen, die durch den Filter in die unteren Kavitäten wanderten,<br />
wurden mit Hilfe des alamarBlue ®-Assays (Serotec, Düsseldorf, Deutschland)<br />
gezählt.<br />
AlamarBlue Reagenz® wurde als 10% des Probenvolumens hinzugegeben,<br />
woraufhin eine 1- bis 3-stündige Inkubation bei 37 °C erfolgte. Resazurin, der<br />
Wirkstoff des alamarBlue ® Reagenz, ist eine blaue nicht-toxische, zellpermeable<br />
Verbindung, die in dieser Form nicht-fluoreszierend ist. Durch Eintritt in das<br />
Zellinnere wird Resazurin durch lebensfähige Zellen zu Resorufin reduziert, welches<br />
eine rote Farbe aufweist und stark fluoreszierend ist. Die resultierende Fluoreszenz<br />
wurde mit Hilfe eines Mikroplatten-Reader mit der Analyse-Software Gen 5<br />
(Synergy2 HT Multimode-Mikroplatten-Reader, BioTek Instruments Inc., Bad<br />
Friedrichshall Deutschland) gemessen und die gewanderte Zellzahl bestimmt.<br />
29
Material und Methoden<br />
3.4. Statistische Auswertung<br />
Die statistische Auswertung der Messwerte und deren graphische Darstellung in<br />
Form von Box-and-Whisker-Plots erfolgte mit Hilfe des Statistikprogramms R-<br />
Software (R Foundation for Statistical Computing).<br />
Der Shapiro- Wilk Test wurde für die Prüfung der Normalverteilung verwendet und<br />
zeigte, dass nicht alle Daten normal verteilt waren.<br />
Daher wurden die nicht-parametrischen Tests, der Kruskal-Wallis-Test und der Mann-<br />
Whitney-Wilcoxon-Test für die Beurteilung statistischer Zusammenhänge verwendet.<br />
Die Korrelation zwischen zwei Variablen wurde mittels Spearman und Kendall<br />
Rangkorrelation getestet. Die statistische Signifikanz wurde bei 5% (p
Untersuchung des Chemokins MIP-3 β/CCL19<br />
Kapitel 4 Untersuchung des Chemokins MIP-3β/CCL19 in Liquorproben von<br />
Hunden mit entzündlichen und nicht-entzündlichen ZNS<br />
Erkrankungen<br />
MIP-3β/CCL19 associated with the invasion of mononuclear cells in<br />
neuroinflammatory and non-neuroinflammatory diseases in dogs<br />
Janina Bartels¹, Scott J. Schatzberg², Brett G. Darrow³, Lijing Bu 4 , Regina Carlson¹,<br />
Andrea Tipold¹*<br />
¹ Department of Small Animal Medicine and Surgery, University of Veterinary Medicine<br />
<strong>Hannover</strong>, Buenteweg 9, D-30559 <strong>Hannover</strong>, Germany<br />
² VESC Veterinary Emergency and Specialty Center, 2001 Vivigen Way, Santa Fe,<br />
NM 87505, USA<br />
³ Bremen, Germany<br />
4<br />
Biology Department, University of New Mexico, 1 University Boulevard,<br />
Northeast Albuquerque, NM 87131, USA<br />
* Corresponding author: email: andrea.tipold@tiho-hannover.de (A.Tipold)<br />
31
Untersuchung des Chemokins MIP-3 β/CCL19<br />
Abstract<br />
Background:<br />
Chemokines are important factors in the mechanism of cell migration and<br />
pathogenesis of central nervous system (CNS) inflammatory reactions. MIP-<br />
3β/CCL19 is one chemokine that may play a major role in this context.<br />
Objective: The aim of this study was to prove the hypothesis that MIP-3β/CCL19 is<br />
involved in the pathogenesis of mononuclear cell migration into the subarachnoid<br />
space of dogs with inflammatory and non-inflammatory CNS diseases such as<br />
steroid-responsive meningitis-arteritis (SRMA) and intervertebral disc disease (IVDD)<br />
and may serve as a valuable biomarker for the progression of the diseases.<br />
Material and methods: This retrospective study analyzed a total of 141 dogs.<br />
Experiments were performed on cerebrospinal fluid (CSF) and peripheral blood (PB)<br />
samples of dogs affected with SRMA during the acute phase (n = 25) as well as<br />
during treatment (n = 26). Dogs with SRMA were compared to dogs with presumed<br />
meningoencephalomyelitis of unknown origin (MUO) receiving no therapy (n = 16)<br />
and with patients receiving prednisolone therapy (n= 11).<br />
A control group with normal cell count consisted of dogs with Idiopathic Epilepsy (IE)<br />
(n= 21) and of healthy dogs (n= 6). Additionally, dogs with IVDD of varying severity<br />
(n= 36) were analyzed. Concentration of MIP-3β/CCL19 in the CSF and serum were<br />
determined by a sandwich ELISA. Migration assays were performed on seven<br />
selected CSF samples using a disposable 96-well chemotaxis chamber (untreated<br />
SRMA n = 3 ; untreated MUO n = 2 ; IVDD n = 2).<br />
Results: MIP-3β/CCL19 was detectable in CSF samples of all dogs. Dogs with<br />
untreated SRMA/MUO displayed pronounced MIP-3β/CCL19 elevations compared to<br />
the control group and patients receiving glucocorticosteroid treatment.<br />
CSF cell count of untreated SRMA/MUO patients was significantly positively<br />
correlated with the MIP-3β/CCL19 CSF concentration. IVDD patients also had<br />
elevated CSF MIP-3β/CCL19 concentration compared to controls, but values were<br />
considerably lower than in inflammatory CNS diseases. Selected CSF samples<br />
including inflammatory and non-inflammatory neurologic diseases displayed<br />
32
Untersuchung des Chemokins MIP-3 β/CCL19<br />
chemotactic activity for mononuclear cells in the migration assay, proving that the<br />
measured CSF protein is available in the active form.<br />
Conclusions: The hypothesis was confirmed that MIP-3β/CCL19 is involved in the<br />
pathogenesis of SRMA/MUO, possibly perpetuating an autoimmune reaction.<br />
The marked chemotactic activity for mononuclear cells leads to the assumption that<br />
this chemokine could be associated with the migration of mononuclear cells into the<br />
subarachnoid space of dogs. The elevation of CSF MIP-3β/CCL19 in IVDD suggests<br />
that it also plays a role in the secondary wave in spinal cord injuries (SCI). CSF MIP-<br />
3β/CCL19 concentration may serve as a prognostic indicator in SCI, be a precious<br />
biomarker for developing new treatment schemes and for verifying the success of<br />
treatment.<br />
1. Introduction<br />
In several neurologic diseases a pleocytosis is often detected in the cerebrospinal<br />
fluid (CSF). Lymphocytes and plasma cells have been shown to prevail in the cell<br />
count in viral infections (Wamsley and Alleman 2004), chronic steroid responsive<br />
meningitis-arteritis (SRMA) (Tipold and Jaggy 1994), granulomatous<br />
meningoencephalomyelitis (GME) and in necrotizing encephalitides (NE) (Wamsley<br />
and Alleman 2004; Talarico and Schatzberg 2010). A neutrophilic pleocytosis is<br />
characteristic for bacterial infections and the acute stage of SRMA (Tipold and Jaggy<br />
1994). A mixed cell population can be seen in protozoal diseases, chronic bacterial<br />
infections, necrotic lesions, and in GME (Wamsley and Alleman 2004). In addition to<br />
inflammatory lesions, mild mixed cell pleocytosis can also be seen with situations<br />
such as acute intervertebral disc herniation that results in central nervous system<br />
(CNS) myelomalacia or infarction (Chrisman 1992).<br />
Chemokines are important factors in the mechanism of cell migration and thus play a<br />
relevant role in the pathogenesis of inflammation in the CNS (Dogan and Karpus<br />
2004). They upregulate surface molecules on circulating inflammatory cells in the<br />
periphery which enable them to more efficiently adhere to the endothelial cells of the<br />
blood-brain barrier (BBB) and react to the CNS chemokine gradients (Constantin<br />
33
Untersuchung des Chemokins MIP-3 β/CCL19<br />
2008). One aim of therapeutic research would be to develop specific treatments to<br />
modulate the inflammatory response within the CNS (Bar- Or 2008) in diseases such<br />
as SRMA and meningoencephalitides of unknown origin (MUO), but also the<br />
inflammatory reaction in disc diseases possibly leading to secondary wave injury<br />
(Jeffery 2009; Jeffery et al. 2011; Boekhoff et al. 2012).<br />
One chemokine that could be involved in the pathogenesis of an inflammatory<br />
reaction and is a potent candidate for future modulation is MIP-3β (Macrophage<br />
Inflammatory Protein- 3 beta) also known as (C-C motif) ligand 19 (CCL19).<br />
This protein will be referred to as CCL19 for most of the text of this manuscript but,<br />
these terms may be used interchangeably. CCL19 is constitutively expressed in the<br />
CNS for fast immunosurveillance (Krumbholz et al. 2007) and is produced by<br />
different cells such as dendritic cells (DC), macrophages and some nonhematopoietic<br />
cells (Cyster 1999; Krumbholz et al. 2007). It binds to the CCR7 receptor which is<br />
expressed on myeloid cells (Kivisäkk et al. 2004), mature DC, T cells, as well as<br />
activated B cells (Sallusto and Lanzavecchia 2000; Sallusto et al. 2000; Pashenkov<br />
et al. 2003).<br />
CCL 19 was shown to be probably involved in the development of chronic<br />
inflammation and lymphoid neogenesis guiding B cells and T cells into the target<br />
organ, such as the brain (Pashenkov et al. 2003). It is also expressed de novo in<br />
various neuroinflammatory diseases, for example multiple sclerosis (Krumbholz et al.<br />
2007) or chronic experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) (Serafini et al.<br />
2001; Pashenkov et al. 2003).<br />
Bone- marrow derived microglia or macrophages connect the normal brain with the<br />
immune system (Williams et al. 2001; Krumbholz et al. 2007). Guiding these cells to<br />
the CNS might also be regulated by CCL19, due to its role in attracting macrophage<br />
progenitors (Kim et al. 1998; Krumbholz et al. 2007).<br />
Microglia itself may produce CCL 19 and was shown to be activated in canine<br />
diseases such as MUO (Stein 2004) and spinal cord injury (Boekhoff et al. 2012).<br />
In the current study the hypothesis should be proven that the protein MIP-3β/ CCL19<br />
is at least partly involved in the pathogenesis of the invasion of mononuclear cells<br />
34
Untersuchung des Chemokins MIP-3 β/CCL19<br />
into the subarachnoid space of dogs and could be used as a valuable biomarker for<br />
disease progression. Therefore, three diseases were chosen: steroid-responsive<br />
meningitis-arteritis (SRMA), meningoencephalitis of unknown origin (MUO), and<br />
intervertebral disc disease (IVDD). In SRMA Th2-mediated immune response was<br />
shown (Schwartz et al. 2008b; Schwartz et al. 2011) and a Th17 skewed immune<br />
response may be accountable for maintaining the inflammatory reaction (Maiolini<br />
2012; Waite and Skokos 2012). For comparison, MUO was chosen as a disease<br />
group with a predominantly mononuclear pleocytosis within the CSF (Wamsley and<br />
Alleman 2004; Dewey 2008, Granger et al. 2010) despite the heterogeneity of the<br />
group. Examples of these idiopathic inflammatory disorders of the CNS are NE and<br />
GME, in which a strong genetic component (Barber et al. 2011), occurrence of<br />
autoantibodies (Shibuya at al. 2007) and the distribution of lymphocytes and<br />
macrophages (Park et al. 2012) suggest a strong involvement of mononuclear cells<br />
in the pathogenesis. Therefore, CCL19 should be analyzed to prove its involvement<br />
in the migration of mononuclear cells into the CSF.<br />
A third group was analyzed. In spinal cord injury after intervertebral disc herniation a<br />
local inflammatory reaction was shown (Spitzbarth et al. 2012) and the macrophage<br />
count within the CSF is thought to be positively associated with the degree of spinal<br />
cord damage (Srugo et al. 2011).<br />
In the aforementioned diseases of dogs CCL19 was measured in CSF and serum<br />
samples. With this investigation we seek to understand the role of CCL19 in the<br />
mononuclear migration in CSF and to establish whether this chemokine is generally<br />
associated with CNS inflammation or specific to certain diseases.<br />
2. Materials and methods<br />
Samples from patients and controls<br />
A total of 141 patients were analyzed, which were referred to the Department of<br />
Small Animal Medicine and Surgery, University of Veterinary Medicine <strong>Hannover</strong>,<br />
35
Untersuchung des Chemokins MIP-3 β/CCL19<br />
Germany and the Veterinary Emergency and Specialty Center (VESC) Santa Fe,<br />
NM, USA (table 1). The studies were performed according to the ethical guidelines of<br />
the University of Veterinary Medicine <strong>Hannover</strong>.<br />
CSF and serum samples for CCL19 assays were obtained and stored at -20°C.<br />
Blood was collected via cephalic, saphenous or jugular venipuncture into serum<br />
tubes. CSF collection was performed under general anesthesia by cisternal or lumbar<br />
puncture.<br />
SRMA group: Fifty one patients were diagnosed with SRMA by clinical signs,<br />
complete blood and CSF examinations, normal cervical radiographs, elevated IgA<br />
levels in CSF and serum, response to glucocorticosteroid treatment and the absence<br />
of other conditions causing cervical pain.<br />
The SRMA untreated group consisted of 25 patients which received no medication at<br />
the time of sample collection. Nine of these dogs were evaluated separately, five<br />
patients having received onetime pre-treatment with steroids and four patients having<br />
relapsed after stopping previous therapy. CSF and blood findings are summarized in<br />
table 1.<br />
The SRMA treatment group consisted of 26 of the 51 patients receiving more than<br />
one steroid treatment prior to CSF acquisition.<br />
MUO group: CSF was also obtained from 27 patients with presumed MUO. Sixteen<br />
of these patients received no therapy, while 11 patients were already being treated<br />
with prednisolone. The suspected diagnosis was supported by clinical signs, CSF<br />
analysis (predominantly mononuclear pleocytosis) and magnetic resonance imaging<br />
(MRI) findings (T1W with and without contrast medium, T2W and flair sequence). In<br />
ten patients the diagnosis was confirmed by histopathological examination and<br />
included four cases with GME, two with NE and four cases with MUO with a<br />
histopathological pattern not related to GME or NE.<br />
IVDD group: The CSF of 36 patients with intervertebral disc disease were analyzed.<br />
The diagnosis of IVDD was made by clinical signs, CSF analysis, MRI and surgery<br />
36
Untersuchung des Chemokins MIP-3 β/CCL19<br />
findings. Based on the severity of clinical signs the patients were grouped into five<br />
grades (Sharp and Wheeler 2005).<br />
Twenty five patients were combined with the neurologic status grade 2/3 to one<br />
group. The dogs were mild to severely paretic, but capable of spontaneous<br />
movement.<br />
A second group contained 11 patients with the neurologic status grade 4/5, which<br />
were paralytic with or without deep pain sensation.<br />
Control group: CSF samples with normal reference values (less than 5 white blood<br />
cells/µl, cisternal protein less than 25 mg/dl) (Wamsley and Alleman 2004) from 27<br />
dogs were analyzed. Twenty one patients were diagnosed with idiopathic epilepsy<br />
based on clinical signs, blood work, MRI and CSF results and six samples were<br />
obtained from healthy dogs (Animal Experiment number: 33.42502/05-12.05).<br />
Number of patients and their laboratory findings are provided in table 1.<br />
SRMA untreated SRMA treated MUO untreated MUO treated IVDD 2/3 IVDD 4/5 IE/ healthy IE healthy<br />
No. patients 25 (5/4/16) 26 16 11 25 11 27 21 6<br />
CSF cellcount/3μL 528 (200-3800) 1 (0.25-2) 196 (25.8-731.8) 2 (1-3) 1 (1-3) 3 (2.5-4) 1 (0-1) 1 (0-1)<br />
CSF protein mg/dl 28 (20-55) 12 (11-14) 40 (25.3-97.3) 16 (14-20) 19 (15-22) 14 (10.5-16) 12 (10-14) 12 (10-14)<br />
CSF Ig A 1.6 (0.4-2.7) 0.2 (0.09-0.45)<br />
Serum Ig A 184 (106-282) 75.4 (47.9-98.7)<br />
blood leucocytes 20.7 (18-27) 10.9 (9.8-13.9) 10.6 (9.7-13.1) 10 (9.7-12) 8 (7.5-11) 13.2 (8.3-15.7) 10 (9-12) 10 (9-12) 10 (9-12)<br />
*1000 /μL<br />
CSF CCL19 pg/ml 1690 (671.5-3200) 80.5 (68-111.5) 373.5 (174.5-776.8) 91.8 (76.6-95) 108.2 (82-162) 149.2 (97.6-207) 60.7 (51.2-79) 66 (56-87.1) 51.2 (40.1-54.2)<br />
Serum CCL19 pg/ml129.3 (73-198) 84.5(35.5-131.9) 160.6 (79.7-467.9) 51.8 (32.4-190) 146.4 (73-191) 97.6 (47-129.3) 97.8 (64-143) 88.3 (55.8-127) 108.9 (90.4-192)<br />
Table 1. CSF and serum characteristics in patients with IE, neuroinflammatory<br />
disease, IVDD and clinically healthy patients<br />
Abbreviations: SRMA = steroid-responsive meningitis-arteritis; MUO =<br />
meningoencephalomyelitis of unknown origin; IVDD = intervertebral disc disease; IE<br />
= idiopathic epilepsy; No = number; CSF = cerebrospinal fluid; pg = picogram; ml =<br />
milliliter; SRMA untreated: n = 25 total; n = 5 onetime pre-treated; n = 4 relapse; n =<br />
16 untreated. Data are provided as medians (25th- 75th percentiles).<br />
37
Untersuchung des Chemokins MIP-3 β/CCL19<br />
Measurement of CCL19<br />
Concentrations of CCL19 in the CSF and serum were determined by sandwich<br />
ELISA (Enzyme linked immunoabsorbent assay). An ELISA Kit specific for canine<br />
MIP-3β/CCL19 (E90096Ca 96 Tests) was used according to manufacturer’s<br />
instructions (Uscn Life Science Inc., Wuhan, P.R. China). Briefly, the microtiter plate<br />
provided in the ELISA kit has been pre-coated with a monoclonal antibody specific to<br />
MIP-3β/CCL19. CSF samples were used undiluted or were tapered down to a dilution<br />
of 1:13 with the standard diluent depending on the CCL19 output concentration.<br />
Serum samples were used undiluted for the ELISA. Seven wells were prepared for<br />
the dilutions of standard, one well for blank and the rest of the 96 wells were used for<br />
the CSF and serum samples. Four CSF and serum samples of the IE group served<br />
as a control and one of these IE samples was pipetted to the plates in each<br />
experiment. As a positive control served CSF and serum samples of the neuroinflammatory<br />
group and the same sample was used in each experiment at same<br />
dilution.<br />
After a two hours incubation time at 37°C in humidified air with 5% CO2 in an<br />
incubator (SANYO Sales & Marketing Europe GmbH, Munich), the liquid of each well<br />
was removed. A biotin- conjugated polyclonal antibody preparation (Uscn Life<br />
Science Inc., Wuhan, P.R. China) specific for CCL19 was added to each well.<br />
Following a one hour incubation time the wells were washed three times with wash<br />
buffer solution (Uscn Life Science Inc., Wuhan, P.R. China). Avidin conjugated to<br />
horseradish peroxidase (Uscn Life Science Inc., Wuhan, P.R. China) was pipetted to<br />
each well and incubated for 30 minutes at 37° C. The wash process was repeated for<br />
total of five times as conducted before. Subsequently the TMB (3,3´,5,5´-<br />
Tetramethylbenzidine) substrate was pipetted to the plate.<br />
The enzyme-substrate reaction was terminated by the addition of sulphuric acid<br />
solution (Uscn Life Science Inc., Wuhan, P.R. China) and the color change measured<br />
spectrophotometrically at a wavelength of 450nm ± 10nm on a microplate reader<br />
equipped with the analysis software Gen 5 (Synergy2 HT multi-mode microplate<br />
reader, BioTek Instruments Inc., Bad Friedrichshall Germany).<br />
38
Untersuchung des Chemokins MIP-3 β/CCL19<br />
The detection range of this method was 15.6 - 1000 pg/ml. The standard curve was<br />
created by a lyophilized standard reagent (Uscn Life Science Inc., Wuhan, P.R.<br />
China) provided in the ELISA kit. Standard concentrations used for the ELISA were<br />
1000 pg/ml, 500pg/ml, 250 pg/ml, 125 pg/ml, 62.5 pg/ ml, 31.2 pg/ml, 15.6 pg/ml. The<br />
minimum detectable dose of canine CCL19 is 6.5 pg/ml. All measurements of the<br />
CSF and serum were performed in duplicates, and OD (optical density) were<br />
converted into chemokine concentration (pg/ml) using calibration curves generated in<br />
each experiment.<br />
Chemotaxis Assay<br />
To prove chemotactic activity of measured CSF samples for mononuclear cells and to<br />
give a hint that CSF CCL19 is available in the active form, migration assays were<br />
performed by using a disposable 96-well chemotaxis chamber (Chemo TX<br />
Disposable Chemotaxis system, NeuroProbe, Gaithersburg, MD) with polycarbonate<br />
filters (5 µm pore size, 3.2 mm diameter size, 30 µl well size).<br />
CSF samples of seven patients were examined, three untreated patients diagnosed<br />
with SRMA, two untreated patients with the suspected diagnosis of MUO and two<br />
patients with IVDD.<br />
Peripheral mononuclear cells (PMCs) were separated from five milliliters of fresh<br />
EDTA blood collected via cephalic venipuncture of a healthy dog. PMCs were<br />
separated by Ficoll gradient centrifugation according to the technique described by<br />
Toth et al. 1992. PMCs were washed twice with ten milliliters Hank’s balanced salt<br />
solution (HBSS) (Fa. Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany) and re-suspended in<br />
Cell-Wash fluid (Becton Dickinson, Heidelberg, Germany).<br />
The cell suspension was stained by trypanblue (0,4% in phosphate buffered saline<br />
(PBS) Fa. Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany) and counted in a TÜRK cell<br />
counting chamber (Fa. Brand, Wertheim, Germany). Twenty five µl of the cell<br />
suspension (50000 cells/ 25 µl) were pipetted directly on the top side of the filter,<br />
which is coated with a hydrophobic mask around each of the test sites. The<br />
39
Untersuchung des Chemokins MIP-3 β/CCL19<br />
hydrophobic mask restricts the cell suspension to these sites, eliminating the need<br />
for upper wells.<br />
A known serial dilution of the cell suspension with 50000 cells, 25000 cells, 12500<br />
cells, 6250 cells, 3125 cells, 1563 cells and 781 cells diluted in medium was pipetted<br />
in one row of wells to serve as a standard with which to compare the readings from<br />
the experimental wells. The rest of the 96 wells were loaded in duplicates with 29 µl<br />
of SRMA (untreated n = 3), IVDD (n = 2) and MUO (untreated n = 2) CSF samples<br />
diluted in Rosewell Park Memorial Institute (RPMI)1640 medium with L-glutamine<br />
(Gibco® RPMI Media 1640) containing 1 % bovine serum albumin (BSA) and a<br />
negative control of pure medium. The loaded chamber with added cell suspension on<br />
the top side of the filter was cultured at 37°C in humidified air with 5% CO2 in an<br />
incubator (SANYO Sales & Marketing Europe GmbH, Munich) while the migration<br />
time for the cell suspension was measured at 30 minutes, 1 hour, 1.5 hours and 2<br />
hours.<br />
The filter was removed and cells that had migrated through the filter to the lower<br />
wells were counted by alamarBlue® assay (Serotec, Düsseldorf, Germany).<br />
AlamarBlue® reagent was added as 10% of the sample volume, followed by 1 to 3<br />
hours incubation at 37ºC. Resazurin, the active ingredient of alamarBlue® reagent, is<br />
a non-toxic, cell permeable compound that is blue in color and virtually nonfluorescent.<br />
Upon entering cells, resazurin is reduced by viable cells to resorufin, a<br />
compound that is red in color and highly fluorescent.<br />
The resulting fluorescence was read on a microplate reader equipped with the<br />
analysis software Gen 5 (Synergy2 HT multi-mode microplate reader, BioTek<br />
Instruments Inc., Bad Friedrichshall Germany).<br />
Statistics<br />
For group comparison the Kruskal-Wallis test and the Mann–Whitney–Wilcoxon tests<br />
were used. Using the Shapiro-Wilk test data were shown to be not normally<br />
distributed. Correlation between two variables were tested by Spearman and Kendall<br />
rank correlation tests. Statistical significance was set at the 5% level (P
Untersuchung des Chemokins MIP-3 β/CCL19<br />
3. Results<br />
MIP-3β/ CCL19 concentration in CSF of the control group (idiopathic epilepsy/<br />
healthy dogs)<br />
CCL19 was measurable in all 21 samples of patients with idiopathic epilepsy and in<br />
the 6 samples from healthy donors (tab. 1). The comparison between IE and healthy<br />
animals showed significant difference (p = 0.0488) which is shown in figure 1.<br />
Although there were significant differences detected between samples from dogs with<br />
IE and from healthy animals, IE is still considered as a control group due to normal<br />
CSF examinations. The median CSF CCL19 content of the control group was 60.7<br />
pg/ml. IE alone had a median CSF CCL19 concentration of 66 pg/ml, while the<br />
healthy dogs had a median CSF CCL19 concentration of 51.2 pg/ml (see tab. 1).<br />
Fig. 1 MIP3β/ CCL19 CSF concentrations of patients with IE and healthy animals<br />
(control group).<br />
Boxes contain values from the 1st to the 3rd quartile, lines inside boxes indicate<br />
median values, endpoints of vertical lines display minimum and maximum values, o<br />
represents the outliers. Asterisks indicate statistically significant differences (* P <<br />
0.05; ** P < 0.01; *** P < 0.005)<br />
41
Untersuchung des Chemokins MIP-3 β/CCL19<br />
Abbreviations: IE = idiopathic epilepsy; CSF = cerebrospinal fluid; MIP3β =<br />
macrophage inflammatory protein-3β; pg = picogram; ml = milliliter<br />
MIP-3β/ CCL19 CSF concentration in inflammatory diseases<br />
Highly elevated CCL19 concentrations were observed in CSF samples of untreated<br />
SRMA and MUO patients compared to the control group (IE/ healthy)<br />
(p < 0.001; median SRMA: 1690 pg/ml; MUO: 373.5 pg/ml) as shown in figure 2,<br />
figure 3 and table 1. Dogs under therapy had significantly lower CCL19 values<br />
compared to the patients without therapy (p < 0.001). Treated SRMA dogs (p =<br />
0.026) differ significantly from the controls while treated MUO patients did not differ<br />
significantly (p = 0.059). Patients which received one injection with glucocorticosteroids<br />
before initial examination had significantly less CCL19 levels (p =<br />
0.0259) compared to entirely untreated animals. The subgroup of patients having a<br />
relapse did not differ statistically (p = 0.4864) from untreated patients (fig. 2 and fig.<br />
3).<br />
Fig. 2 MIP3β/ CCL19 CSF concentrations of patients with SRMA compared to the<br />
control group.<br />
42
Untersuchung des Chemokins MIP-3 β/CCL19<br />
y- axis: logarithm to base 10 of MIP-3β (pg/ml); x- axis: groups. Boxes contain values<br />
from the 1st to the 3rd quartile, lines inside boxes indicate median values, endpoints<br />
of vertical lines display minimum and maximum values, o represents the outliers.<br />
Asterisks indicate statistically significant differences (* P < 0.05; ** P < 0.01; *** P <<br />
0.005). Abbreviations: SRMA = steroid-responsive meningitis-arteritis; CSF =<br />
cerebrospinal fluid; MIP3β = macrophage inflammatory protein-3β; IE = idiopathic<br />
epilepsy<br />
Fig. 3 MIP3β/ CCL19 CSF concentrations of patients with MUO compared to the<br />
control group.<br />
y- axis: logarithm to base 10 of MIP3β (pg/ml); x- axis: groups<br />
Boxes contain values from the 1st to the 3rd quartile, lines inside boxes indicate<br />
median values, endpoints of vertical lines display minimum and maximum values, o<br />
represents the outliers. Asterisks indicate statistically significant differences (* P <<br />
0.05; ** P < 0.01; *** P < 0.005). Abbreviations: MUO = meningoencephalomyelitis of<br />
unknown origin; CSF = cerebrospinal fluid; MIP3β = macrophage inflammatory<br />
protein-3β; IE = idiopathic epilepsy<br />
43
Untersuchung des Chemokins MIP-3 β/CCL19<br />
Further evaluations of inflammatory diseases<br />
The CSF CCL19 concentrations of both untreated SRMA and untreated MUO<br />
patients were significantly correlated with the CSF cell count (SRMA r = 0.82, p <<br />
0.001; MUO r = 0.59, p = 0.018).<br />
SRMA and MUO patients under glucocorticosteroid treatment displayed no<br />
correlation between CSF cell count and CCL19 concentration as indicated by the<br />
results of Spearman and Kendall`s rank test (Spearman: SRMA r = 0.27, p = 0.19;<br />
MUO r = 0.53, p = 0.091).<br />
The CSF CCL19 and serum CCL19 concentrations did not correlate with each other<br />
showing that CSF elevation is not only due to BBB disruption (Spearman: SRMA<br />
untreated r = 0.099, p = 0.64; MUO untreated r = 0.33, p = 0.22).<br />
Total protein levels within the CSF from untreated SRMA dogs had a weak correlation<br />
with CSF CCL 19 concentrations using Spearman rank test (r = 0.39, p = 0.055), the<br />
Kendall rank test was additionally calculated because of the occurrence of outliers<br />
and revealed a significant correlation (tau = 0.33, p = 0.022).<br />
Dogs with MUO that did not receive therapy had no strong correlation between<br />
CCL19 CSF and CSF protein concentration (Spearman: r = 0.49, p = 0.057; Kendall:<br />
tau = 0.33, p = 0.079).<br />
MIP-3β/ CCL19 CSF concentration in intervertebral disc disease.<br />
CSF CCL19 concentrations of IVDD are significantly elevated compared to the<br />
control group (p < 0.005) as illustrated in the Box-and-Whisker Plots in figure 4. The<br />
median concentration of the protein in the IVDD grade 2/3 group was 108.2 pg/ml<br />
while grades 4/5 had a higher median of 149.2 pg/ml compared to the controls with a<br />
median concentration of 60 pg/ml (see tab. 1). The concentrations between the two<br />
IVDD groups did not differ significantly (p = 0.26). In comparison to the median<br />
CCL19 concentrations from untreated inflammatory neurologic diseases (SRMA:<br />
1690 pg/ml/ MUO: 373.5pg/ml) the elevations were mild (see fig.3 and fig. 4).<br />
44
Untersuchung des Chemokins MIP-3 β/CCL19<br />
Fig. 4 MIP3β/ CCL19 CSF concentration of IVDD compared to the control group.<br />
Boxes contain values from the 1st to the 3rd quartile, lines inside boxes indicate<br />
median values, endpoints of vertical lines display minimum and maximum values, o<br />
represents the outliers.<br />
Asterisks indicate statistically significant differences (* P < 0.05; ** P < 0.01; *** P <<br />
0.005). Abbreviations: IVDD = intervertebral disc disease; CSF = cerebrospinal fluid;<br />
MIP3b = macrophage inflammatory protein-3β, IE = idiopathic epilepsy.<br />
Further evaluations of IVDD<br />
Correlating CSF CCL19 concentrations to CSF cell count the data did not show<br />
significant correlation in the IVDD group (Spearman: IVDD group 2/3 r = 0.05, p =<br />
0.81; IVDD group 4/5 r 0.097, p = 0.78). CCL19 CSF concentration and CCL19<br />
serum concentration were significantly correlated within IVDD group 2/3 (r = 0.44, p =<br />
0.025) while IVDD group 4/5 had no significant correlation (r = 0.54, p = 0.094).<br />
45
Untersuchung des Chemokins MIP-3 β/CCL19<br />
Chemotactic activity of selected CSF samples for mononuclear cells<br />
Chemotactic activity of CSF samples could be proven for mononuclear cells. CSF of<br />
neuroinflammatory diseases including SRMA and MUO showed pronounced activity<br />
as illustrated in figure 5.<br />
The SRMA samples with a mean concentration of 3892.33 pg/ml CCL19 attracted<br />
24083 cells and the MUO samples with a mean concentration of 3622 pg/ml CCL19<br />
attracted 23876 cells after a two hours period, which was clearly stronger than the<br />
controls (medium 10785 cells).<br />
The CSF samples of dogs with IVDD with a much lower mean CCL19 concentration<br />
of 208.5 pg/ml compared to neuroinflammatory diseases also had a strong impact on<br />
migration and on average 17235 cells moved to the lower chamber after a 2 hour<br />
incubation time (see fig. 5).<br />
Fig. 5 Chemotaxis assay for mononuclear cells from CSF samples of SRMA, MUO,<br />
IVDD, medium as a negative control. Vertical lines indicate standard deviation<br />
Abbreviations: SRMA = steroid responsive meningitis-arteritis; MUO =<br />
meningoencephalomyelitis of unknown origin; IVDD = intervertebral disc disease;<br />
CSF = cerebrospinal fluid; pg = picogram; ml = milliliter.<br />
46
Untersuchung des Chemokins MIP-3 β/CCL19<br />
4. Discussion:<br />
The results of this study support the hypothesis that the protein MIP-3β/CCL19 is<br />
involved in the pathogenesis of the migration of mononuclear cells into the<br />
subarachnoid space of dogs with inflammatory CNS diseases and non-inflammatory<br />
diseases such as intervertebral disc disease (IVDD).<br />
CSF levels of the chemokine MIP-3β/CCL19 were analyzed in dogs afflicted with<br />
SRMA, an inflammatory CNS disease, and compared to other neuroinflammatory<br />
diseases (MUO), traumatic IVDD, non-inflammatory CNS disease, and normal<br />
unafflicted animals.<br />
CCL19 was detectable in healthy dogs and in patients with idiopathic epilepsy, a noninflammatory<br />
neurologic disease, which is in agreement with the results of other<br />
studies (Krumbholz et al. 2007; Pashenkov et al. 2003) in that CCL19 is constitutively<br />
expressed in the CNS and linked to the physiological immunosurveillance<br />
(Krumbholz et al. 2007). However, CCL19 was markedly upregulated in both neuroinflammatory<br />
diseases (NID) SRMA and MUO (fig. 1 and 2).<br />
Thus, CCL19 might be partly involved in the pathogenesis of CNS inflammation and<br />
in the migration of inflammatory cells into the subarachnoid space. Krumbholz at al.<br />
(2007) and Pashenkov at al. (2003) observed a CSF CCL19 elevation in NID of<br />
human patients. The higher concentration of the chemokine in SRMA is consistent<br />
with the fact that SRMA CSF has an increased neutrophilic inflammatory response.<br />
Earlier observations have shown that CCL19 is also produced by neutrophils (Scapini<br />
et al. 2001). The elevated chemokine concentration might maintain the inflammatory<br />
response and later transfer to an autoimmune reaction attracting certain lymphocyte<br />
subsets.<br />
Additionally, a disrupted blood brain barrier is consistent with a strong inflammatory<br />
response and could support the explanation for much higher CCL19 data. However,<br />
CCL19 levels were higher in CSF samples compared to serum concentrations in<br />
neuroinflammatory diseases suggesting intrathecal production rather than passive<br />
transfer through a disrupted blood brain barrier.<br />
47
Untersuchung des Chemokins MIP-3 β/CCL19<br />
Results of Pelletier et al.’s study (2010) revealed that a novel chemokine-dependent<br />
reciprocal cross-talk between neutrophils and Th17 cells exists. Activated neutrophils<br />
induced chemotaxis of Th17 cells and in turn activated Th17 cells could attract<br />
neutrophils (Pelletier et al. 2010).<br />
An uncontrolled IL-23–IL-17 pathway could maintain a chronic inflammatory<br />
response and lead to persistent immunopathology (Waite and Skokos 2012).<br />
Investigating this relationship and uncovering other similar pathways could be vital to<br />
our understanding of the pathogenesis of chronic inflammatory diseases.<br />
Observations from Maiolini (2012) give a strong hint, that the immunpathology of<br />
SRMA is maintained by a Th17 response (Maiolini 2012).<br />
Neutrophils can release a number of chemokines including CCL19, which can<br />
specifically induce chemotaxis of dendritic cells (DC) and trigger rapid integrindependent<br />
adhesion of CCR7-expressing lymphocytes (Scapini 2001). The<br />
neutrophil`s capability of CCL19 production might be important in guiding these cells<br />
to the inflamed sites and contributing to the regulation of the immune response .<br />
It has been shown previously that CCR7 ligands like CCL19 have a function in<br />
stimulating DCs for IL-23 production and generation of pathogenic Th17 cells in EAE<br />
induction (Kuwabara et al. 2009).<br />
The intrathecally produced CCL19 might not only play a role in inducing autoimmune<br />
diseases but also in maintaining chronic forms through recruitment of antigen<br />
presenting cells and lymphocytes, resulting in perpetual antigenic stimulation<br />
(Columba- Cabezas et al. 2003).<br />
The strong correlation between intrathecal CCL19 and the CSF cell count suggest an<br />
important role in recruiting immune cells to the CNS. Additionally, SRMA and MUO<br />
patients receiving glucocorticosteroids had significantly less CCL19 concentrations,<br />
showing that steroids have a strong impact in reducing the inflammatory pathway.<br />
Krumbholz et al.`s study did not reveal that MS patients receiving treatment differ<br />
from untreated patients (Krumbholz et al. 2007). The fact that the chemokine<br />
concentration in this study is altered in dogs with treatment suggests that treatments<br />
are directed at different pathways and that the pathogenesis of SRMA and MS are<br />
48
Untersuchung des Chemokins MIP-3 β/CCL19<br />
different. Glucocorticosteroids are shown to reduce the invasion of neutrophils<br />
(Cizinauskas et al. 2000) and may alter the production of chemokines in dogs.<br />
Relapsing SRMA also displayed elevated chemokine concentrations. This finding<br />
suggests the potential utility of this protein to serve as a valuable biomarker for the<br />
progression of the diseases, for developing new treatment schemes in inflammatory<br />
diseases and to indicate the success of treatment.<br />
The elevation of MIP-3β/CCL19 in IVDD CSF indicates a process of a secondary<br />
inflammatory response within the CNS (Stys 2004). Gray and white matter are<br />
affected by trauma, especially white matter damage is observed (Levine et al. 2006;<br />
Spitzbarth et al. 2011) caused by apoptosis, necrosis, and inflammation. Increased<br />
inflammatory cytokines in patients with chronic spinal cord injury after trauma<br />
suggest an altered immunological activation.<br />
A study by Srugo et al. (2011) suggested CSF pleocytosis is positively associated<br />
with the severity of thoracolumbar spinal cord damage in dogs with IVDD. They found<br />
that the percentage of CSF macrophages can be used as a prognostic indicator for<br />
regaining ambulation in dogs that have lost deep pain sensation (Srugo et al. 2011).<br />
In the current study the question was addressed, if CCL19 could also play an<br />
important role for the migration of mononuclear cells and the inflammatory<br />
pathogenesis in IVDD.<br />
A modest correlation of CSF to serum CCL19 in IVDD group 2/3 suggest that CSF<br />
CCL19 is derived by leakage via extracellular pathways from the circulation and not<br />
solely from intrathecal production in this group of patients. However, no correlation<br />
was found in IVDD group 4/5 and some samples showed much higher CSF values<br />
suggesting possible intrathecal production. A set of chemokines is intrathecally<br />
produced in CNS diseases leading to an inflammatory response.<br />
The fact that CCL19 is significantly elevated but, did not correlate with CSF cell count<br />
in either IVDD group suggests that CCL19 is not solely responsible for the<br />
recruitment of cells but, may play a part in the pathogenesis of IVDD inflammation.<br />
The performed chemotaxis assay from CSF samples attracted mononuclear cells.<br />
CSF of neuro-inflammatory diseases showed strong chemotactic activity in<br />
comparison to the controls. Even CSF samples of dogs with IVDD with a much lower<br />
49
Untersuchung des Chemokins MIP-3 β/CCL19<br />
mean CCL 19 concentration showed a pronounced impact on cell migration, which<br />
indicates the presents of a functional chemotactic protein. This function of CCL19<br />
might play an important role in secondary damages in spinal cord injuries (SCI).<br />
A study from Pineau and Lacroix (2007) on rodent models revealed that cytokine<br />
production is time dependent. CNS resident cells, including neurons, synthesized<br />
cytokines (IL-1, TNF, IL-6, and leukemia inhibitory factor) between 3 and 24 hours<br />
post SCI and some infiltrating leukocytes were responsible for the cytokine<br />
production 12 hours after the trauma. This would suggest that neural cells are<br />
responsible for the initial inflammatory response following SCI but, the recruitment of<br />
additional immune cells is responsible for the maintenance of inflammation (Pineau<br />
and Lacroix 2007). Additional studies would be necessary to determine the time at<br />
which CCL19 becomes a major inflammatory mediator.<br />
Kwon et al. observed in his study that IL-6, IL-8, MCP-1, tau, S100b and glial fibrillary<br />
acidic protein (GFAP) were elevated depending on severity of the initial injury.<br />
Evaluating this group of inflammatory cytokines a biochemical model was developed<br />
enabling to predict the ASIA (American Spinal Injury Association) grade in 89% of<br />
their subjects. It was found that the pattern of protein expression within the CSF over<br />
the first few days following injury were strong indicators of neurologic outcome and<br />
thus, are now a focus of therapeutic research for SCI (Kwon et al. 2010).<br />
Using CCL19 CSF concentration as a prognostic marker could be also a precious<br />
tool in the research of SCI in dogs, which should be followed up in further studies.<br />
In conclusion CCL19 may play an important role in the pathogenesis of SRMA/ MUO,<br />
possibly perpetuating an autoimmune reaction and may also be involved with the<br />
secondary wave of spinal cord injuries (SCI) in IVDD. The marked chemotactic<br />
activity for mononuclear cells leads to the assumption that this chemokine could be<br />
associated with the migration of mononuclear cells into the subarachnoid space of<br />
dogs. CCL19 concentration therefore, may serve as a prognostic indicator in SCI, be<br />
a precious biomarker for developing new treatment schemes and for verifying the<br />
success of treatment.<br />
50
Untersuchung des Chemokins MIP-3 β/CCL19<br />
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58
Falldarstellung<br />
Kapitel 5 Falldarstellung eines Hundes mit infektiös bedingter, entzündlicher<br />
ZNS Erkrankung<br />
Case report: Successful medical management of an intra- and extracranial<br />
abscess of a dog secondary to a bite wound<br />
Janina Bartels¹*, Brett Darrow², Shannon P. Holmes³, Scott J. Schatzberg 4 ,<br />
¹ Department of Small Animal Medicine and Surgery, University of Veterinary Medicine<br />
<strong>Hannover</strong>, Buenteweg 9, D-30559 <strong>Hannover</strong>, Germany<br />
² Bremen, Germany<br />
³ College of Veterinary Medicine University of Georgia<br />
4<br />
VESC Veterinary Emergency and Specialty Center, 2001 Vivigen Way, Santa Fe,<br />
NM 87505, USA<br />
Corresponding author: email: janina_bartels@hotmail.de; phone: +49-5143-6330;<br />
fax: +4951436330 (J. Bartels)<br />
59
Falldarstellung<br />
Abstract<br />
Companion animals are often presented to veterinary hospitals as emergencies<br />
following a traumatic event and, these patients are commonly associated with severe<br />
neurological signs.<br />
The following case report describes the clinical approach and successful medical<br />
management of a dog bite injury to the head that developed into a brain abscess<br />
(BA).<br />
A nine year and eight month old female spayed pug dog was presented on<br />
emergency after sustaining a dog bite to the head. Clinical signs consisted of a<br />
puncture wound on the left side of the head and a mandibular symphyseal fracture.<br />
The first neurological examination disclosed generalized ataxia, proprioception<br />
deficits of both left limbs, and a horizontal nystagmus. After initial improvement<br />
following empiric emergency treatment, the dog was re-presented and transferred to<br />
the Neurology Specialty Service due to worsening of clinical signs which included<br />
rotary nystagmus, a left head tilt and falling to the left. A central vestibular syndrome<br />
was diagnosed with neuroanatomical localization to the left brainstem and both intraand<br />
extracranial abscessation were disclosed on MRI imaging.<br />
The dog was successfully treated solely with medical management. With careful<br />
consideration of antibiotics and adjunctive medication selection, we were able to<br />
achieve a successful outcome in this BA case and no surgical intervention was<br />
needed.<br />
Introduction<br />
Traumatic events leading to neurological signs are a common finding in the<br />
emergency clinical setting as the result of bite wounds, car accidents and other<br />
traumatic injuries. As a result, one infrequent, though significant, sequela following<br />
these events is the formation of an intra- or extracranial abscess. In humans they are<br />
often polymicrobial in origin with the etiological agents depending on the entry point<br />
of infection (Mathisen and Johnson 1997). Brain abscesses (BA) are life- threatening<br />
infections which consist of localized areas of suppuration within an afflicted region of<br />
60
Falldarstellung<br />
the central nervous system (CNS). Therefore, early recognition, diagnosis, and<br />
management of this condition are critical.<br />
The most common sequela of brain abscesses documented in animals or humans<br />
are intracranial pressure elevation, aggressive headache, nausea, convulsions,<br />
behavior alterations and disorientation (King 2010; Lorenz et al. 2011). The clinical<br />
signs vary with location and distribution. They are reported to be associated with<br />
forebrain, brainstem or multifocal distribution (Constanzo et al. 2011). A definitive<br />
diagnosis is made using advanced imaging such as computed tomography (CT) or<br />
magnetic resonance imaging (MRI) in conjunction with fine needle aspiration and<br />
microbial culture. Historically, BA have presented major therapeutic challenges in<br />
which a combination of both surgical and medical intervention have yielded better<br />
outcomes and are considered to be the gold standard of treatment in humans (Kao et<br />
al. 2003; Hakan et al. 2006). There are few cases of BAs reported in veterinary<br />
medical literature. In some of these cases, a combination of surgery and antibiotics<br />
was successfully used in animals afflicted with a BA due to bite wounds (Bilderback<br />
and Faissler 2009; Constanzo et al. 2011).<br />
Case summary<br />
A nine year and eight month old female spayed pug dog was presented to her<br />
veterinarian following a dog attack where she sustained a bite wound to her head.<br />
The dog had a history of hypothyroidism and Addisons disease for which she<br />
received levothyroxin sodium 0.2 mg (0.017mg/kg, PO, q12 hrs), prednisolone 1.25<br />
mg (0.11mg/kg, PO) every other day, and desoxycorticosterone pivalate injection<br />
(DOCP) 25.5 mg (2.2 mg/kg, subcutanous SQ) every 28 days as treatment. The last<br />
DOCP injection was given seven days before presentation. At presentation, the<br />
referring veterinarian noted ataxia, proprioception deficits on the left side, horizontal<br />
nystagmus, and a puncture wound on the left side of the head. Additionally, oral<br />
hemorrhage was seen and palpation of the mandible was suggestive of a jaw<br />
fracture. The dog was then referred to the Veterinary Emergency and Specialty<br />
Center (VESC).<br />
61
Falldarstellung<br />
On presentation to the VESC Emergency Service the dog was quiet but, responsive<br />
with a body condition score of 7/9 weighing 11.6 kg. In addition to the aforementioned<br />
clinical signs noted by the referring veterinarian, a mandibular symphyseal fracture<br />
with no other palpable skull fractures was disclosed. Surgery to wire the intermandibular<br />
symphysis back to alignment was planned. Despite a mildly elevated<br />
heart rate of 150, vital parameters were within normal limits. Pre-operative blood<br />
work revealed hypophosphatemia 2.1 mg/dL (2.5-5.0 mg/dL), hyponatremia 140.7<br />
mmol/L (143.0-153.0 mmol/L), hypokalemia 3.57 mmol/L (3.7-5.9 mmol/L) and an<br />
elevated BUN 23 mg/dL (7-21 mg/dL). Prior to surgery the dog received a 50 ml<br />
bolus of lactated ringer‘s solution (LRS) with added potassium chloride over 10<br />
minutes, a fentanyl bolus 0.7 ml (0.06 ml/kg, intravenous IV) 35 mcg (3 mcg/kg),<br />
ampicillin sodium/sulbactam 346 mg (29.8mg/kg, IV, q 8 hrs), and cefazolin sodium<br />
260 mg (22.4 mg/kg, SQ, once). She was maintained on a 30 ml/h LRS and fentanyl<br />
constant rate infusion (CRI) with 15.5 ml/L fentanyl (2 mcg/kg/h). The pug was<br />
anesthetized with 4.6 ml (0.4 ml/kg, IV) propofol to effect and a 50 mcg fentanyl bolus<br />
(4.3 mcg/kg, IV). Anesthesia was maintained with isoflurane gas. The mandibular<br />
symphyseal separation was stabilized with a single 18 gauge intermandibular<br />
cerclage wire. Additionally, the dog received a cefovecin sodium injection (8 mg/kg,<br />
SQ, once) and a fentanyl patch 25 mcg post surgery. Prednisolone 5 mg (0.43 mg/kg,<br />
PO) was given once a day. The dog remained stable with no seizure activities and<br />
the vestibular signs seen at initial presentation resolved post-operatively.<br />
Four days following surgery the dog was re-presented to the VESC Neurology<br />
Service for an acute onset of vestibular signs. On examination severe vestibular<br />
ataxia, rotary nystagmus, left head tilt and falling to the left were seen. Proprioception<br />
could not be elicited due to severity of vestibular signs. The mentation was normal<br />
except for increased anxiety. The pug was hospitalized. An isotonic solution of<br />
balanced electrolytes (Normosol- R) at a rate of 60 ml/h (5.17 ml/kg/h), mannitol<br />
3000 mg (258.6 mg/kg, IV, once over 20 minutes), ondansetron 2.5 mg (0.22 mg/kg,<br />
IV, q 8 hrs), meclizine 25 mg (2.2 mg/kg, PO, q 12 hrs), tramadol hydrochloride 37.5<br />
mg (3.2 mg/kg, PO, q 8 hrs) and famotidine 6 mg (0.5 mg/kg, IV, q 12 hrs) were<br />
given. Metoclopramide HCL (2mg/kg/day) was later added to the fluids which were<br />
62
Falldarstellung<br />
set at a rate of 49 ml/h (4.2 ml/kg/hr). Prednisolone was increased to 5 mg (0.43<br />
mg/kg, PO, q 12 hrs) to better cope with the stress of illness in the face of<br />
hypoadrenocorticism. Clinical signs improved dramatically within three hours of<br />
presentation and the onset of treatment. The head tilt and nystagmus resolved.<br />
Proprioception was delayed to absent in the left hind limb. However, ataxia and wide<br />
circling to the left were still apparent. The clinical signs were considered to be caused<br />
by a left central vestibular system disease, although multifocal disease could not be<br />
excluded.<br />
Differential diagnoses included trauma with CNS damage subsequent to fracture<br />
and/or edema, secondary bacterial meningoencephalitis, intracranial abscess,<br />
hemorrhage, or neoplasia. Given the history that this dog was attacked and<br />
sustained head trauma caused by a bite wound, the most likely differential diagnosis<br />
was a brain abscess. MRI was strongly recommended and scheduled for the next<br />
day. Clinical signs worsened over night and a change in behavior was seen.<br />
The MRI was performed under general anesthesia with a Vet-MR Grande 0.25 Tesla<br />
field (Esaote, Italy). The animal was pre-oxygenated before receiving anesthesia and<br />
pre-medicated with glycopyrrolate 0.12 mg (0.01mg/kg, SQ) due to a heart rate of 72/<br />
min. The pug was also pre-medicated with fentanyl 33 mcg (2.8mcg/kg, IV) and<br />
midazolam 2.2 mg (0.18mg/kg, IV), induced with etomidate 22 mg (1.89mg/kg, IV)<br />
and maintained with isoflurane. The cerclage wire anchoring the mandibular fracture<br />
together was removed and the MRI sequences T1 weighted (W), T2W, T2 FLAIR<br />
(fluid attenuated inversion recovery), T2*W, T1W/+contrast performed. The dog<br />
received 110 ml/h (10ml/kg/h) of an isotonic solution of balanced electrolytes<br />
(Normosol R) which was reduced to 28 ml/h (2.5ml/kg/h) following the procedure.<br />
T2W and FLAIR MRI showed an intra- and extraaxial heterogeneously hyperintense<br />
lesion affecting the left cerebral hemisphere, extending through the frontal, temporoparietal<br />
and occipital lobes, and diffusely within the overlying temporal muscle.<br />
Multiple sequences disclosed a fracture of the temporal bone with extensive high<br />
signal lesion within and outside the calvaria. At the level of the skull fracture, the<br />
hyperintensity was located within the superficial left cerebrocortical grey matter as<br />
well as the corona radiata and deeper white matter including the left internal capsule<br />
63
Falldarstellung<br />
of the left temporo- parietal lobe. The images also showed that the lesion caused a<br />
moderate left to right mass affect with compression of the thalamus and left lateral<br />
ventricle at the level of the hippocampus and rostral midbrain. There was also mild<br />
compression of the left rostral colliculus of the midbrain consistent with herniation.<br />
The high signal within the temporal lobe extended rostrally and caudally into the<br />
white matter tracts into the frontal, parietal and occipital lobes consistent with<br />
vasogenic edema. The T2W high signal lesion was hypointense to the brain<br />
parenchyma on T1W imaging and had a faint intramedullary rim enhancement<br />
pattern after gadolinium (0.1mmol/kg, IV) administration. There was also diffuse<br />
enhancement of the deep planes of the temporal muscle. On T2* (GRE) imaging a<br />
hypointense triangular lesion within the brain consistent with hemorrhage was<br />
detected in the region of the skull fracture.<br />
Fig. 1<br />
Fig. 2<br />
64
Falldarstellung<br />
Fig. 3<br />
Fig. 1, Fig. 2 and Fig. 3: T2W weighted magnetic resonance imaging; intra- and<br />
extraaxial heterogeneous hyperintense lesion affecting the left cerebral hemisphere,<br />
extending through the frontal, temporo-parietal and occipital lobes, and diffusely<br />
within the overlying temporal muscle.<br />
Fig. 4 Fig. 5<br />
65
Falldarstellung<br />
Fig. 6<br />
Fig. 4, Fig. 5 and Fig. 6: MRI, T1W weighted after administration of contrastmedium,<br />
hypointense lesion to the brain parenchyma with a faint intramedullary rim<br />
enhancement pattern after gadolinium (0.1mmol/kg, IV) administration.<br />
In summary, MRI disclosed a large extra- and intracranial abscess affecting the left<br />
cerebral hemisphere and left rostral brainstem. A fracture of the left temporal bone at<br />
the level of the thalamus and rostral to the temporomandibular joint was identified.<br />
Abscessation was present within cerebral edema tracking rostrally and caudally<br />
through the brain in association with mild intraparenchymal hemorrhage at the level<br />
of the fracture.<br />
Following MRI, aspiration of the extracranial abscess was performed and samples<br />
were submitted for cytology, aerobic and anaerobic culture (Antech Diagnostics,<br />
Irvine, CA). No anaerobic or aerobic bacteria were isolated from the sample using<br />
direct plating media and broth culture. The cytological findings revealed a moderate<br />
granulomatous inflammation and necrosis, which were most consistent with a chronic<br />
inflammatory response or sterile tissue necrosis. Due to the cellular degeneration<br />
66
Falldarstellung<br />
present, the evaluation was interpreted with caution as the lack of a visible infectious<br />
agent does not rule out a low level of septic etiology.<br />
Despite negative bacterial cultures, an aggressive treatment of antibiotics was<br />
initiated including enrofloxacin 113 mg (10mg/kg, IV, q12 hrs), cefazolin sodium 250<br />
mg (21.6mg/kg, IV, q 8 hrs) and clindamycin phosphate 226 mg (19.5mg/kg, IV, q 12<br />
hrs). Due to the development of coughing, there was a concern for aspiration<br />
pneumonia and cefazolin was replaced by ampicillin sodium/sulbactam sodium<br />
250 mg (21.6mg/kg, IV, q 8 hrs). Additionally, famotidine 5.6 mg (0.5mg/kg, IV, q 12<br />
hrs) and dexamethason sodium phosphate 0.71 mg (0.06mg/kg, IV, once) were<br />
administered.<br />
To relieve potential nausea associated with vestibular disease, maropitant citrate 11<br />
mg (0.1mg/kg, SQ, q 24 hrs) and metoclopramide added to isotonic fluids with<br />
balanced electrolytes (Normosol-R) (1.5 mg/kg/day) were administered. The dog also<br />
continued to receive tramadol 25 mcg (2.2mg/kg, PO, q 12 hrs), prednisolone<br />
(5 mg PO, q 12 hrs), and levothyroxin sodium 0.2 mg (0.017mg/kg, PO, q 24 hrs).<br />
Five days following the diagnosis of intra- and extracranial abscessation,<br />
considerable improvement of neurological signs was noted. The dog continued to<br />
walk with a mild vestibular ataxia but, her head tilt had resolved and her postural<br />
reactions had normalized.<br />
With markedly improvement of the dog`s attitude and mentation, surgery to facilitate<br />
the drainage of the abscess was not performed. Twelve days after her initial<br />
presentation and hospitalization, the pug was sent home on enrofloxacin 90 mg<br />
(7.8mg/kg, PO) once a day, clindamycin 175 mg (15mg/kg, PO) twice a day and<br />
amoxicillin/clavulanic acid 250 mg (21.5mg/kg, PO) twice a day. Enrofloxacin and<br />
clindamycin were continued for four months while amoxicillin/clavulanic acid was<br />
discontinued after two weeks. Prednisolone (5 mg once daily for one month) was<br />
given to control the underlying Addisons disease. Levothyroxin sodium 0.2 mg<br />
(0.017mg/kg, PO, q12 hrs) medication was continued as previously prescribed.<br />
The dog had a control examination one week after discharge from the hospital. She<br />
was bright, alert and responsive and her neurologic exam disclosed only subtle<br />
67
Falldarstellung<br />
nondescript ataxia when running quickly. She continuously improved over the course<br />
of treatment without surgical intervention.<br />
Discussion<br />
Intracranial abscesses can arise as a result of local extension of contiguous infection<br />
such as otitis or maxillary tooth root abscess, from direct implantation through trauma<br />
such as bite wounds or foreign body penetration (Kastenbauer et al. 2004; Vite<br />
2005). They can also be the result of hematogenous spread from distant foci of<br />
infection (Kent 2006). In humans the route of the infection has a major influence on<br />
the specific organisms causing the formation of a BA allowing doctors to predict the<br />
microbial agents involved and help to guide empiric therapies (Mathisen and Johnson<br />
1997).<br />
The etiology of CNS abscesses are usually of bacterial origin. In general, aerobic<br />
bacteria such as Streptococcus spp and Staphylococcus spp may be more frequently<br />
identified than anaerobic bacteria as causes of CNS infections in dogs and cats (Kent<br />
2006; Vite 2005). S. aureus is a common pathogen recovered from post-traumatic<br />
brain abscesses in human medicine cases (Mathisen and Johnson 1997; Lu et al.<br />
2002). However, anaerobic bacteria such as Fusobacterium spp, Peptostreptococcus<br />
spp, Bacteroides spp, Actinomyces spp, and Eubacterium spp are also known to<br />
cause brain abscesses in animals (Vite 2005).<br />
The blood brain barrier (BBB) and absence of lymphatic system in the CNS normally<br />
prohibit microbial invasion and provide limited isolation of the CNS (Zachary 2006;<br />
Tipold 1997).<br />
Once the BBB is penetrated by an infectious agent, the immunologically privileged<br />
nature of the CNS is an advantage to the invading organism and is a disadvantage to<br />
the host (Dewey 2008). Immune privilege in the physiological microenvironment of<br />
the CNS is promoted by anatomical structures, as just described, and physiological<br />
protective mechanisms of lacking pro-inflammatory cytokines or production of antiinflammatory<br />
cytokines by resident CNS cells (Fabry et al. 2008). The CNS is poorly<br />
equipped with immunologically active cells which provides a good environment for<br />
68
Falldarstellung<br />
bacterial growth (Dewey 2008). Systemic immune cells are able to penetrate an<br />
intact BBB and enter the perivascular and subarachnoid spaces, and can serve as a<br />
protective immunologic surveillance of the CNS (Zachary 2006). A complex system<br />
of chemokine and cytokine gradients interact with leukocytes of the systemic immune<br />
system to direct physiologic and pathologic leukocyte trafficking and cellular<br />
migration of the CNS (Zachary 2006). However, as a result of the physiological and<br />
anatomic barriers, a response from the systemic immune system may occur well after<br />
an infection has been established (Dewey 2008). Additionally, in immune<br />
compromised dogs, BA may be more likely to develop (Smith et al. 2007). Once<br />
inflammation is underway, a disruption in the BBB resulting in hemorrhage and<br />
edema may occur (Zachary 2006).<br />
Life threatening neurologic dysfunction can be a sequela of bacterial brain infections.<br />
Clinical signs depend on the area of CNS involved and may be focal or multifocal<br />
with signs associated with meningitis (Lorenz et al. 2011). Neurological signs are<br />
usually acute, progressive in nature, and unilaterally localized (Tipold 1997). Cerebral<br />
abscesses are destructive, and cause progressive focal neurological deficits due to<br />
development of a mass effect and capsulated accumulation of purulent material<br />
within the CNS. In addition to focal signs, they may cause generalized neurological<br />
deterioration due to increased intracranial pressure or as the result of the<br />
involvement of bacterial toxins (Dewey 2008). Animals with a forebrain lesion may be<br />
presented with seizures, behavior changes and hyperesthesia (Tipold 1997).<br />
Brainstem abscesses can lead to severe neurologic complications due to their<br />
anatomic location and the interference with vital centers. In humans abscesses tend<br />
to elongate in the brainstem instead of expanding laterally. Therefore, the clinical<br />
findings may be confusing (Kastenbauer et al. 2004). With brainstem involvement,<br />
changes in mentation, gait abnormalities, proprioception deficits, and cranial nerve<br />
deficits may occur. Additionally, vestibular syndrome may be seen (Tipold 1997).<br />
Clinical signs of central vestibular syndrome consist of vestibular ataxia to rolling in<br />
one direction, nystagmus, abnormal head posture, nausea and vomiting, altered<br />
mental status, cerebellar signs, and evidence of ipsilateral hemiparesis and postural<br />
reaction deficits as seen in the case presented here (Munana 2004).<br />
69
Falldarstellung<br />
Antemortem diagnosis of brain abscesses is challenging. The clinical history may<br />
lead the clinician in the direction of abscessation but, due to focal or multifocal<br />
presentation with elevated ICP (intracranial pressure), clinical signs vary and the<br />
majority of signs are non-specific (King 2010). Blood cell count and clinical chemistry<br />
may also be non-specific and can demonstrate normal values, especially with<br />
encapsulated brain abscesses (Vite 2005). However, these diagnostics may disclose<br />
extraneural infections causing hematogenous spread. In cases of traumatic events,<br />
radiographs can verify bone fractures (Tipold 1997).<br />
Definitive diagnosis of BA can be supported by MRI or CT imaging (Runge et al.<br />
1996; Klopp et al. 2000). MRI is more sensitive than CT scans and may be<br />
advantageous in identifying early stages of BA (King 2010; Mathisen and Johnson<br />
1997). Differential diagnoses of BA include other infectious and non-infectious<br />
encephalitides, primary and metastatic brain tumors, infarction, hematoma and<br />
granuloma (Bilderback and Faissler 2009; Constanzo et al. 2011). In day one to three<br />
of BA formation (early cerebritis) BA appear hypointense on T1 weighted sequences<br />
and hyperintense on T2 weighted imaging as well as FLAIR images. After day three<br />
(late cerebritis) ring enhancement may be seen and present as a thin-walled rim of<br />
isointense to hyperintense signal on T1 weighted imaging and hypointense on T2<br />
weighted imaging and FLAIR precontrast images. Mature abscesses present on T1<br />
weighted imaging as hypointense with a round and well-demarcated appearance with<br />
hypointense edema in surrounding parenchyma. In T2 weighted and FLAIR images,<br />
the necrotic material appears hyperintense. In contrast enhancement imaging with IV<br />
gadolinium, BAs present with ring enhancement while they show restricted diffusion<br />
on diffusion-weighted imaging (DWI) (Mathisen and Johnson 1997; Constanzo et al.<br />
2011). Therefore neuroimaging such as MRI is superior in detecting early BA and<br />
differentiating it from other neurological diseases (Lu et al. 2006; Constanzo et al.,<br />
2011).<br />
A bacterial or fungal culture can give a definitive diagnosis and elucidate involved<br />
organisms, but due to the lack of positive results, it should be interpreted cautiously<br />
(Kao et al. 2003; Constanzo 2011). CSF evaluation is not always indicated due to the<br />
70
Falldarstellung<br />
high risk of brain herniation and may be of little value in excluding an abscess from<br />
the differential diagnosis (Vite 2005; Kent 2006; Bilderback and Faissler 2009).<br />
The management of BA is not well described and only limited information on<br />
treatment strategies is available in veterinary medicine. However, in human medicine,<br />
surgical intervention in combination with antimicrobial therapy has the highest rate of<br />
success (Kao et al 2003; Hakan et al. 2006; Lu et al. 2006). The decision to<br />
undertake surgical intervention in human medicine depends on the initial size of<br />
abscess. Abscesses smaller than 1.7 cm have been successfully treated with<br />
antibiotics alone, while surgical intervention is recommended when the size is larger<br />
than 4.2 cm (Rosenblum et al. 1980; Boom et al. 1985).<br />
There are a few cases reported in veterinary medical literature describing the<br />
success of surgical and antimicrobial combination therapy in animals afflicted with BA<br />
due to bite wounds (Bilderback and Faissler 2009; Constanzo et al. 2011). Surgical<br />
intervention can be done with either complete resection of the abscess or CT- guided<br />
aspiration via burr hole. It is strongly recommended to submit abscess samples for<br />
culture and antibiotic susceptibility. Based on these results an appropriate antibiotic<br />
therapy should be started.<br />
Antibiotic therapy for treatment of intracranial abscessation provides unique<br />
challenges that must be considered in selecting appropriate medications, timing, and<br />
route of administration. It is preferred to select medications that are able to penetrate<br />
the BBB and blood-cerebrospinal fluid-barrier (B-CSF-B), to attain adequate levels in<br />
the CNS and have a bactericidal effect given the limited host immune response in the<br />
CNS (Kent 2006). In patients with BA, treatment is further complicated due to the<br />
limited penetration of antimicrobials into the abscess capsule. Factors that become<br />
very important in deciding which medications to use in CNS disease include<br />
molecular size, polarity, lipid solubility and plasma protein binding fraction. These<br />
factors determine the bioavailability for antibiotics within the CNS (Maddison et al.<br />
2008).<br />
71
Falldarstellung<br />
In an intact B-CSF-B and BBB, large, complex molecules have limited penetrance<br />
while during inflammatory conditions entry may be enhanced. For example betalactam<br />
antibiotics are ionized at normal pH. An inflammatory process promotes an<br />
acidic enviroment which increases the plasma- CSF pH gradient and molecules can<br />
cross membrane barriers efficiently (Maddison et al 2008) to reach therapeutic levels<br />
within the CNS. Bypassing the B-CSF-B and BBB to deliver drugs directly to the CSF<br />
with an external ventricular drain has been considered in human medicine cases.<br />
Raza et al. (2005) reports that insertion of an external ventricular drain (EVD) solely<br />
for antibiotic therapy might be justified in cases where the organisms are sensitive<br />
only to antibiotics with poor CNS penetration, an increase in the antibiotic dose is<br />
precluded by its toxicity, or where IV therapy alone has not been clinically effective<br />
(Raza et al. 2005). However, this procedure is not commonly performed in veterinary<br />
medicine. Intraventricular injection of β-lactam antibiotics is not indicated in spite of<br />
their poor CSF penetration due to the pro-convulsive activity of this antibiotic class,<br />
but systemic dose of β-lactam antibiotics can be increased to ensure higher CSF<br />
concentrations (Nau et al. 2010).<br />
Several studies with animal meningitis models have demonstrated the effectiveness<br />
of using systemic ampicillin with the addition of sulbactam or other β-lactamase<br />
inhibitors (Jimenez-Mejias 1997; Cawley et al. 2002).<br />
In this case study, ampicillin with sulbactam was also used effectively in a<br />
concentration of 22 mg/kg IV every 6 hours. It was continued in the form of<br />
amoxicillin clavulanic acid (21.5mg/kg, PO, q 12 hrs) for two weeks. Third- and<br />
fourth-generation cephalosporins are better able to penetrate the BBB and can<br />
achieve good therapeutic concentration (Tessier et al. 2010). Their spectrum varies.<br />
Third generation cephalosporins such as cefovecin have a decreased gram positive<br />
and increased gram- negative activity (Maddison et al. 2008). Cefovecin is reported<br />
to be effective against Staphylococcus intermedius, β-hemolytic streptococci and<br />
Pasteurella multocida (Maddison et al. 2008). Additionally. cefovecin appears<br />
effective against anaerobes (Ramsey 2008).<br />
72
Falldarstellung<br />
However, at the initial presentation to the VESC, the animal received one injection of<br />
cefovecin sodium (8 mg/kg, SQ, once) but, clinically worsened over the next four<br />
days and needed subsequent therapies.<br />
Lipid solubility is also important for drug delivery to the CNS. Lipophilic drugs, such<br />
as enrofloxacin, are better able to penetrate the CNS (Maddison et al 2008) and can<br />
achieve higher concentrations. However, fluoroquinolones also have to be used with<br />
caution due to their central nervous system toxicity with higher doses (Brown 1996).<br />
Metronidazole is also highly lipophilic and achieves excellent penetration of tissues,<br />
including the CNS and abscesses (Maddison et al, 2008).<br />
Fluoroquinolones are of great value for the treatment of CNS infections caused by<br />
gram-negative aerobic bacilli but, depending on the agent chosen, they have limited<br />
value for treatment of gram positive bacteria. Because of their relatively high CNS<br />
toxicity and ability to penetrate the CNS in the absence of meningeal inflammation, a<br />
strong increase of their systemic dose as with β-lactam antibiotics is not<br />
recommended (Nau et al. 2010). The patient presented in this case was treated with<br />
enrofloxacin (10mg/kg, IV, q 12 hrs) and continued to receive oral enrofloxacin<br />
(8mg/kg, PO, q 24 hrs) for four months. The dog did not develop seizures.<br />
Another consideration in CSF bioavailability of antibiotics is the plasma protein<br />
binding. In the presence of an intact barrier, only the plasma fraction unbound can<br />
freely penetrate. The majority of fluoroquinolone molecules are unbound to plasma<br />
proteins. Conversely, macrolides and lincosamides such as clindamycin are highly<br />
bound to plasma proteins and therefore relative CNS concentrations are low (20% of<br />
plasma concentration) (Maddison et al 2008). However, these medications can still<br />
be clinically effective (Maddison et al 2008). Although the penetration of clindamycin<br />
into the CNS is considered poor, it can reach therapeutic CSF concentrations after a<br />
single injection of high-dose clindamycin even without meningeal inflammation (Gatti<br />
et al. 1998). Clindamycin is active against gram- positive cocci including penicillin<br />
resistant staphylococci, anaerobes and mycoplasma (Ramsey 2008). In this patient<br />
clindamycin phosphate was administered at (19.5mg/kg, IV, q 12 hrs) during the<br />
hospitalization period and continued at home (15mg/kg, PO, q 12 hrs) for four<br />
months.<br />
73
Falldarstellung<br />
Besides the previous considerations of molecular size, lipophilicity, and plasma<br />
protein binding in choosing an appropriate medication, the degree of inflammation<br />
should also be taken into account.<br />
The majority of drugs are removed from the CSF compartment by energydependent,<br />
active mechanisms and different medications have variable affinity to<br />
these transport systems. The specific transport systems may be inhibited during<br />
meningitis (Spector and Lorenzo 1974) and drugs reach a higher concentration within<br />
the CNS.<br />
Broad-spectrum antibiotic coverage should be implemented where cultures cannot<br />
be obtained or the culture remains negative despite strong suspicion of bacterial<br />
participation. Previous reports recommend IV broad-spectrum antibiotics such as<br />
ampicillin (5 - 22 mg/kg, IV, q 6 hrs) in combination with chloramphenicol (10 - 15<br />
mg/kg, PO, q 6 hrs) or metronidazole (10 - 15 mg/kg, PO, q 8 hrs) (Fenner 1998; Vite<br />
2005). Chloramphenicol was the BA standard therapy because of its broad<br />
antimicrobial spectrum and effective blood- brain- barrier (BBB) penetration.<br />
However, it`s lack of bactericidal activity and side effects, make it less attractive for<br />
first-line therapy. More recent recommendations incorporate third generation<br />
cephalosporins for gram- negative and gram- positive bacteria, metronidazole for<br />
anaerobes, and ampicillin for additional gram- positive coverage (Kent 2006;<br />
Bilderback and Faissler 2009).<br />
In addition to antimicrobials, medication for decreasing intracranial pressure (ICP)<br />
and edema should be included in the treatment plan. Mannitol is an important part in<br />
the medical management of elevated ICP (Plumb 1999). In this study, it was<br />
administered at a dosage of 258.6 mg/kg IV once. As an osmotic diuretic it shifts<br />
water from intracellular and interstitial spaces into the vasculature reducing the ICP<br />
and edema (Plumb 1999). Furthermore, it is considered a free radical scavenger<br />
which can reduce inflammatory by-products leading to a better recovery in ischemic<br />
brain conditions (Marcoux and Choi 2002).<br />
74
Falldarstellung<br />
Adjunctive glucocorticosteroid agents for the treatment of BA or meningitis are still<br />
controversial (Tipold 1997; Han et al. 2004). Their use may lead to a reduced<br />
permeability at the BBB for certain antimicrobials and immune cells leading to<br />
decreased clearance of bacteria from the CNS (Tessier and Scheld 2010).<br />
Corticosteroids may also reduce the penetration and decrease the bactericidal<br />
activity of some antimicrobials, such as vancomycin, in experimental meningitis<br />
(Andes and Craig 1999). Glucocorticosteroids have immunsuppressive effects that<br />
alter the immunological defense system which should be taken into consideration<br />
(Plumb 1999). However, glucocorticosteroids are indicated to reduce brain swelling<br />
and decrease the inflammation caused by proinflammatory bacterial products.<br />
These products induce the production of cytokines and chemokines by CNS cells<br />
inducing leukocyte chemotaxis to the infection focus and facilitate inflammation<br />
resulting in further edema and vasculitis (Sellner et al., 2010). Studies in humans<br />
have demonstrated a beneficial role for the early use of anti-inflammatory doses of<br />
glucocorticosteroids to reduce inflammation and brain edema during bacterial<br />
meningitis (Paris et al. 1994; de Gans and van de Beek 2002).<br />
Patients with raised intracranial pressure, neurological deterioration and lifethreatening<br />
complications, such as imminent cerebral herniation, generally had a<br />
significant improvement in outcome (Jafari and Cracken 1994; de Gans and van de<br />
Beek 2002). High dosage of IV glucocorticosteroids such as methylprednisolone<br />
should be avoided in patients with head trauma due to a higher mortality as Edwards<br />
et al`s study (2005) revealed. One dexamethasone sodium phosphate injection was<br />
given 0.71 mg (0.06mg/kg, IV) once to this patient. While hospitalized, she was<br />
administered prednisolone tablets 5 mg (0.43 mg/kg, PO) twice a day.<br />
Though not previously indicated in the treatment of BA, glucocorticosteroid therapy<br />
was continued at home once a day for one month to control the underlying Addisons<br />
disease. This raises the question, if this additional prednisolone therapy played a role<br />
in the successful outcome in the medical therapy of this brain abscess patient. This<br />
would be similar to the study of Sagmanli et al. (1991), which demonstrated a better<br />
outcome using an antimicrobial therapy combined with dexamethasone medication in<br />
experimentally induced anaerobic BA.<br />
75
Falldarstellung<br />
This case provides the report of a BA in a dog due to a bite wound that was<br />
successfully treated solely with medical management. It is invaluable to provide an<br />
early and accurate diagnosis and initiate an appropriate treatment plan. With a wellconsidered<br />
selection of antibiotics and adjunctive medications, we were able to<br />
achieve a successful outcome in this BA case.<br />
Medications<br />
Soloxin® 0.2mg; Virbac Corporation, P.O. Box 162059, Fort Worth, TX, 76161<br />
Delta-Cortef® prednisone tablets 2.5mg, Upjohn<br />
Percorten-V® 25mg/ml; Novartis<br />
Lactated Ringer`s solution®; Baxter Healthcare Corporation<br />
Innovar- vet®; Schering- Plough<br />
Unasyn®; Pfizer<br />
Cefazolin- sodium®; Apothecon<br />
PropoFlo®; Abbott Animal Health<br />
Isoflurane®; Abbott<br />
Convenia®; Pfizer Animal Health; New York, NY, 10017<br />
Duragesic®; Janssen Pharmaceutica<br />
Normosol- R® (Electrolytes per 1000 mL: Sodium 140 mEq; potassium 5 mEq;<br />
magnesium 3 mEq; chloride 98 mEq; acetate 27 mEq; gluconate 23 mEq.) Abbott<br />
Animal Health; Illinois, IL, 60064-6375<br />
Mannitol Injection 20% (200mg/ml); Hospira; Ilinois, IL<br />
Zofran®; GlaxoSmithKline<br />
Antivert®, Roerig<br />
Tramadol tablets 50mg; Amneal<br />
Pepcid®I.V; Merck<br />
Reglan®; Robins<br />
Robinul®; Robins<br />
Magnevist®; Bayer Health Care<br />
76
Falldarstellung<br />
Versed®; Roche<br />
Etomidate Injection®; Sagent Pharmaceuticals Schaumburg, IL 60195 (USA)<br />
Baytril Injection®; Bayer Health Care<br />
Zolicef®; Apothecon<br />
Clindamycin Injection®; Hospira, Inc., Lake Forest, IL 60045 USA<br />
Unasyn®; Pfizer<br />
Azium SP®; Schering- Plough Animal Health<br />
Cerenia®; Pfizer Animal Health<br />
BaytrilTablets® ; Bayer Health Care<br />
Antirobe Capsules®; Upjohn<br />
ClavamoxTablets®; Pfizer Animal Health<br />
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85
Übergreifende Diskussion<br />
Kapitel 6 Übergreifende Diskussion<br />
Entzündliche Erkrankungen des ZNS können entweder durch eine immun mediierte<br />
Reaktion oder durch ein infektiöses Agens entstehen, welches die Blut- Hirn-<br />
Schranke (BBB) überwinden und in das ZNS eindringen konnte.<br />
Unabhängig von der Ätiologie der entzündlichen ZNS-Erkrankungen, spielen<br />
Signalmoleküle für die Pathogenese der Entzündung im ZNS eine wichtige Rolle<br />
(DOGAN u. KARPUS 2004).<br />
Zu diesen Signalmolekülen gehören Chemokine, welche chemotaktische Zytokine<br />
sind, die bei dem Mechanismus der Zelleinwanderung in das ZNS als relevant gelten<br />
(DOGAN u. KARPUS 2004).<br />
Chemokine werden entweder konstitutiv exprimiert und regulieren die Zellwanderung<br />
unter physiologischen Bedingungen oder werden induziert exprimiert (MANTOVANI<br />
1999; KRUMBHOLZ et al. 2007) als Reaktion auf bestimmte Auslöser wie bakterielle,<br />
virale oder protozoäre Mikroorganismen und durch Signale, die zu einer Ausschüttung<br />
pro-inflammatorischer Zytokine und zu einer Hochregulierung von<br />
Chemokinen führen (BAUMGÄRTNER u. GRUBER 2010).<br />
Die meisten Chemokine sind im entzündeten Gewebe unter pathologischen<br />
Bedingungen aufreguliert und führen zu einer Aktivierung von zahlreichen Immunzellen<br />
(KARPUS u. RANSOHOFF 1998; DOGAN u. KARPUS 2004).<br />
Sie können wiederum Oberflächenmoleküle auf zirkulierenden peripheren<br />
Entzündungszellen aufregulieren, welche daraufhin effizienter an den Endothelzellen<br />
der BBB anhaften und auf die lokalen Chemokingradienten des ZNS reagieren<br />
können (CONSTANTIN 2008).<br />
Durch diesen Mechanismus wandern immer mehr Leukozyten in das ZNS ein, deren<br />
Zelltyp abhängig von dem vorhandenen Antigen ist (TIPOLD 1997).<br />
Ist die Regulation der Chemokinproduktion gestört, können diese Moleküle<br />
Immunzellen dauerhaft aktivieren und eine chronische Entzündung verursachen<br />
(BAGGIOLINI 1998; LUSTER 1998).<br />
Das Chemokin MIP-3β/CCL19 ist ein Protein, das ebenfalls an der Pathogenese von<br />
Entzündungsreaktionen beteiligt ist. Es wird von verschiedenen Zellen im<br />
86
Übergreifende Diskussion<br />
Organismus synthetisiert (SERAFINI et al. 2001).<br />
KRUMBHOLZ et al. (2007) konnten darstellen, dass bei Menschen eine konstitutive<br />
MIP-3β/CCL19 Bildung im ZNS erfolgt und diese möglicherweise für eine schnelle<br />
Immunüberwachung verantwortlich ist (KRUMBHOLZ et al. 2007).<br />
In der vorliegenden Arbeit wurde ebenfalls nachgewiesen, dass CCL19 in den<br />
negativen Kontrolltieren, die aus gesunden Patienten, sowie aus Patienten mit<br />
idiopathischer Epilepsie (IE) bestanden, konstitutiv synthetisiert wird.<br />
In Liquorproben erkrankter Hunde war die MIP-3β/CCL19 Konzentration deutlich<br />
erhöht. Wir vermuten daher, dass das Protein MIP-3β/CCL19 an der Pathogenese<br />
der Migration von mononukleären Zellen in das ZNS von Hunden mit entzündlichen<br />
und nicht- entzündlichen ZNS- Erkrankungen wie der SRMA, MUO und<br />
Bandscheibenvorfällen beteiligt ist.<br />
Es wurden signifikant erhöhte MIP-3β/CCL19 Liquorkonzentrationen bei Tieren mit<br />
entzündlichen ZNS-Erkrankungen (SRMA/MUO) im Vergleich zu der Kontrollgruppe<br />
(gesunde/IE) nachgewiesen (p < 0.001; median MIP-3β/CCL19 Konzentration<br />
SRMA: 1690 pg/ml; MUO: 373.5 pg/ml). Ebenfalls konnte dargestellt werden, dass<br />
die MIP-3β/CCL19 Liquorkonzentrationen der SRMA und MUO signifikant mit der<br />
Liquorzellzahl korrelierten (SRMA r = 0.82, p < 0.001; MUO r = 0.59, p = 0.018).<br />
Aufgrund der höheren MIP-3β/CCL19 Liquorkonzentrationen im Vergleich zur<br />
Serumkonzentration kann von einer intrathekalen Synthese aus- gegangen werden.<br />
Die erhöhte intrathekale Chemokinsynthese deutet somit darauf hin, dass MIP-<br />
3β/CCL19 bei der Pathogenese der untersuchten Erkrankungen relevant ist und zu<br />
einer Migration von Entzündungszellen in den Subarachnoidal- raum führt. Die etwas<br />
höheren MIP-3β/ CCL19 Liquorkonzentrationen von Hunden mit SRMA im Vergleich<br />
zu Humanpatienten mit neuroinflammatorischen Erkrankungen wie der Multiplen<br />
Sklerose (KRUMBHOLZ et al. 2007), lässt sich mit der aus überwiegend neutrophilen<br />
Granulozyten bestehenden Entzündungsreaktion der akuten SRMA-Form erklären.<br />
SCAPINI et al. (2001) konnte darstellen, dass MIP-3β/CCL19 ebenfalls von<br />
neutrophilen Granulozyten produziert wird. Diese erhöhte Chemokinkonzentration<br />
erhält möglicherweise die Entzündungsreaktion aufrecht und führt im Verlauf der<br />
Erkrankung zu einer Autoimmunreaktion, bei der bestimmte Lymphozyten angezogen<br />
87
Übergreifende Diskussion<br />
werden. MIP-3β/ CCL19 kann zu einer Chemotaxis von reifen und unreifen<br />
dendritischen Zellen, sowie auch zu einer Integrin-abhängigen Adhäsion von CCR7<br />
exprimierenden Lymphozyten führen (SCAPINI et al. 2001) und dadurch wichtig für<br />
die Regulation der Immunantwort sein.<br />
Ergebnisse von PELLETIER et al. (2010) zeigten, dass ein Chemokin-abhängiger,<br />
gegenseitiger Austausch zwischen Neutrophilen und Th17 Zellen existiert. Aktivierte<br />
Neutrophile induzieren chemotaktische Aktivität für Th17-Zellen und im Gegenzug<br />
ziehen aktivierte Th17 Zellen dann direkt Neutrophile an.<br />
Es konnte auch bereits gezeigt werden, dass MIP-3β/CCL19 DC stimuliert IL-23 zu<br />
produzieren und eine pathogene Th17 Zellproduktion in EAE induziert (KUWABARA<br />
et al. 2009).<br />
Ein unkontrollierter IL-23- IL-17 Pfad könnte für die Aufrechterhaltung von chronisch<br />
entzündlichen Erkrankungen verantwortlich sein (WAITE u. SKOKOS 2011).<br />
MAIOLINI et al`s Studie (2012) gibt einen starken Hinweis darauf, dass auch die<br />
Pathogenese der SRMA durch eine Th17 Antwort aufrecht erhalten wird.<br />
Die intrathekal- produzierte MIP-3β/CCL19 -Konzentration ist daher möglicherweise<br />
nicht nur bei der Induktion einer Autoimmunkrankheit relevant, sondern auch bei der<br />
Aufrechterhaltung chronischer Formen durch die Rekrutierung von Antigenpräsentierenden<br />
Zellen und Lymphozyten, was zu einer kontinuierlichen lokalen<br />
Antigenstimulation führt (COLUMBA- CABEZAS et al. 2003).<br />
Im durchgeführten Chemotaxis Assay konnte eine starke chemotaktische Aktivität für<br />
mononukleäre Zellen durch Liquorproben von Hunden mit immun mediierten<br />
neuroinflammatorischen Erkrankungen (SRMA/MUO) dargestellt werden.<br />
Das Chemokin MIP-3β/CCL19 scheint ebenfalls bei der Immunantwort auf infektiöse<br />
Erreger eine wichtige Rolle zu spielen. AKAHOSHI et al. (2003) konnten nachweisen,<br />
dass MIP-3β/CCL19 von humanen peripheren neutrophilen Granulozyten gebildet<br />
wird als eine Antwort auf gram-negative oder gram-positive Bakterien (AKAHOSHI et<br />
al. 2003).<br />
Durchdringt ein Pathogen die BBB, wird die Kaskade einer Entzündung ausgelöst<br />
und es wandern immer mehr Leukozyten in das ZNS ein, wobei in bakteriellen<br />
Infektionen eine neutrophile Pleozytose vorherrschend ist (TIPOLD 1997).<br />
88
Übergreifende Diskussion<br />
Neutrophile können auf einen mikrobiellen Stimulus chemotaktische Proteine wie das<br />
MIP-3β/CCL19 synthetisieren und dadurch mit einer gewissen Zeitverzögerung auch<br />
zu einer Migration der T-Lymphozyten und DC zu dem Entzündungsherd führen<br />
(AKAOSHI et al. 2003).<br />
In seltenen Fällen kann es im ZNS auch zu einer lokalen Akkumulation von<br />
neutrophilen Granulozyten kommen, welche von einer Kapsel abgegrenzt werden<br />
und somit ein destruktiver Hirnabszess entsteht (LORENZ et al. 2011).<br />
Möglicherweise hat das Chemokin MIP-3β/CCL19 zum Teil auch eine Beteiligung an<br />
dieser Pathogenese und weitere Untersuchungen wären für die Darstellung dieses<br />
Zusammenhangs notwendig.<br />
Es ist wichtig, die entsprechende Ursache zu diagnostizieren und zwischen<br />
entzündlichen, infektiösen oder immun mediierten Erkrankungen zu unterscheiden,<br />
um geeignete Therapien wählen zu können, wie dies im zweiten Teil dieser Arbeit<br />
beschrieben wird.<br />
Während bei bakteriellen Infektionskrankheiten Antibiotika eingesetzt werden<br />
müssen, sind bei immun mediierten Krankheiten immunsuppressive, entzündungshemmende<br />
Medikamente wichtig (PLUMB 1999). Immunsuppressive Medikamente<br />
verändern die Zytokin- und Chemokinkonzentrationen, die für eine Entzündungsreaktion<br />
und deren Folgen verantwortlich sind. Glukokortikosteroide können zum<br />
Beispiel verwendet werden, um eine unkontrollierte Immunreaktion zu unterdrücken<br />
(PLUMB 1999).<br />
In der vorliegenden Studie besaßen Hunde mit SRMA und MUO, die<br />
Glukokortikosteroide als Behandlung erhielten, signifikant niedrigere MIP-3β/CCL19<br />
Liquorkonzentrationen im Vergleich zu unbehandelten Tieren (p < 0.001).<br />
Glukokortikosteroide können die Einwanderung neutrophiler Granulozyten bei<br />
Hunden mit SRMA reduzieren (CIZINAUSKAS et al. 2000) und beeinflussen<br />
wahrscheinlich die Chemokinproduktion und somit auch die Entzündungsreaktion bei<br />
Hunden.<br />
Bei infektiösen neuroinflammatorischen Erkrankungen wie dem Hirnabszess sind<br />
neben der Auswahl von Breitspektrumantibiotika mit einer hohen Bioverfügbarkeit im<br />
89
Übergreifende Diskussion<br />
ZNS, möglicherweise auch entzündungshemmende Medikamente für die Therapie<br />
relevant. Der Einsatz von Glukokortikosteroiden bei Hirnabszessen oder infektiösen<br />
Meningitiden wird kontrovers diskutiert (TIPOLD 1997). Jedoch besitzen Glukokortikosteroide<br />
in entzündungshemmender Konzentration auch einen positiven Effekt<br />
auf das ZNS. Durch Glukokortikosteroide werden Hirnödeme und die Ausschüttung<br />
von pro-inflammatorischen bakteriellen Produkten und somit auch die Zytokin- und<br />
Chemokinkonzentration vermindert, die normalerweise durch die Kaskade der<br />
Entzündungsreaktion zu weiteren Schäden im ZNS führen (PARIS et al. 1994;<br />
SELLNER et al. 2010).<br />
In den durchgeführten Untersuchungen konnten, wie bereits für die neuroinflammatorischen<br />
ZNS-Erkrankungen beschrieben, im Liquor cerebrospinalis von<br />
Hunden mit Bandscheibenvorfällen im Vergleich zu der negativen Kontrollgruppe<br />
ebenfalls signifikant erhöhte MIP-3β/CCL19 -Konzentrationen gefunden werden<br />
(p < 0.005).<br />
Diese Erhöhung des Chemokins induziert einen sekundären Entzündungsprozess im<br />
ZNS, welcher eine wichtige Rolle bei der Sekundärschädigung des Rückenmarks<br />
spielt. PINEAU und LACROIX (2007) konnten nach einem initalen Rückenmarkstrauma<br />
eine zeitabhängige Zytokinproduktion feststellen, wobei die Rekrutierung<br />
weiterer Immunzellen für eine Aufrechterhaltung des Entzündungsprozesses<br />
verantwortlich ist (PINEAU u. LACROIX 2007). KWON et al. (2010) stellten fest, dass<br />
bestimmte Zytokine abhängig vom Schweregrad der Rückenmarksschädigung<br />
exprimiert werden und als mögliche prognostische Indikatoren genutzt werden<br />
können.<br />
In Rückenmarksverletzungen ist die Pleozytose im CSF positiv assoziiert mit dem<br />
Schweregrad der Rückenmarksschädigung und der Anteil der Liquormakrophagen<br />
kann als Indikator für die Prognose des klinischen Verlaufes verwendet werden<br />
(SRUGO et al. 2011).<br />
In der vorliegenden Studie konnte nachgewiesen werden, dass Liquorproben mit<br />
erhöhten MIP-3β/CCL19 Konzentrationen im Chemotaxis Assay chemotaktische<br />
Aktivität für mononukleäre Zellen besaßen und daher möglicherweise auch bei<br />
90
Übergreifende Diskussion<br />
Rückenmarksschäden eine wichtige Rolle bei der Einwanderung mononukleärer<br />
Zellen in das ZNS und der Pathogenese der Entzündungsreaktion spielt. In der<br />
Gruppe der Bandscheibenvorfälle korrelierte die Liquorzellzahl nicht mit den MIP-<br />
3β/CCL19-Konzentrationen, was vermuten lässt, dass MIP-3β/CCL19 bei<br />
Bandscheibenvorfällen nicht alleine für die Einwanderung von Entzündungszellen in<br />
das ZNS verantwortlich ist.<br />
Es ist anzunehmen, dass MIP-3β/CCL19 möglicherweise als ein prognostischer<br />
Biomarker genutzt werden kann und eventuell für neue Therapieansätze von<br />
Bedeutung ist.<br />
In der vorliegenden zweiten Studie, welche eine infektiöse bakterielle ZNS-<br />
Erkrankung darstellt, ist neben der erwähnten anti-inflammatorischen Therapie eine<br />
entsprechende antimikrobielle Therapie unerlässlich (MADDISON et al. 2008).<br />
Antibiotikatherapien zur Behandlung von intrakraniellen Infektionen stellen eine<br />
besondere Herausforderung dar. Es sollten bevorzugt Medikamente angewandt<br />
werden, die in der Lage sind, die Blut-Hirn- Schranke (BBB) und Blut-Liquor-<br />
Schranke zu durchdringen, um angemessene Konzentrationen im ZNS zu erzielen.<br />
Angesichts der begrenzten Immunantwort im ZNS, sollten die Medikamente auch<br />
eine bakterizide Wirkung besitzen (KENT 2006).<br />
Bei dem vorliegenden Patienten mit einem Hirnabszess (BA) wurde die Behandlung<br />
noch weiter erschwert, aufgrund der begrenzten Penetration von antimikrobiellen<br />
Medikamenten in die Abszesskapsel. Zu den Faktoren für die Auswahl des<br />
geeigneten Medikaments für bakterielle ZNS-Erkrankungen, gehören Molekülgröße,<br />
Polarität, Lipidlöslichkeit und Plasmaproteinbindung. Diese Faktoren bestimmen die<br />
Bioverfügbarkeit für Antibiotika im ZNS (MADDISON et al. 2008).<br />
Es sollte immer von infektiösem Material eine kulturelle Untersuchung mit<br />
Antibiogramm durchgeführt und basierend auf diesen Ergebnissen eine<br />
entsprechende sensitive antibiotische Therapie begonnen werden (MADDISON et al.<br />
2008; VITE 2005).<br />
91
Übergreifende Diskussion<br />
In Fällen, in denen keine kulturelle Untersuchung durchgeführt werden kann oder die<br />
Kultur negativ verbleibt, obwohl ein starker Verdacht auf eine bakterielle Beteiligung<br />
besteht, sollten Breitspektrum-Antibiotika verabreicht werden (VITE 2005).<br />
Frühere Berichte empfehlen intravenöse (IV) Breitspektrum-Antibiotika wie Ampicillin<br />
(5 - 22 mg/kg, IV, q 6 hrs) in Kombination mit Chloramphenicol (10 - 15 mg/kg, per os<br />
(PO) q 6 hrs) oder Metronidazol (10 - 15 mg/kg, PO , q 8 hrs) (FENNER 1998; VITE<br />
2005).<br />
Neuere Empfehlungen beinhalten Cephalosporine der dritten Generation für gramnegative<br />
und gram-positive Bakterien, Metronidazol für Anaerobier und Ampicillin als<br />
zusätzliche grampositive Abdeckung (BILDERBACK u. FAISSLER 2009; KENT<br />
2006). Eine Kombination aus Enrofloxacin (10 mg/kg, IV, q 12 hrs), Clindamycin<br />
phosphate (19.5 mg/kg, IV, q 12 hrs) und Cefazolin sodium (21.6 mg / kg, IV, q 8 hrs),<br />
welches anschließend zu Ampicillin sodium/sulbactam sodium (21.6 mg/kg, IV, q 8<br />
hrs) gewechselt wurde, konnte in dieser Studie als erfolgreiche Therapie angewandt<br />
werden. Der Hund wurde zu Hause mit Enrofloxacin (7.8 mg/kg, PO, q 24 hrs) und<br />
Clindamycin (15 mg/kg, PO, q 12 hrs) für vier Monate und Amoxicillin/clavulansäure<br />
(21.5 mg/kg, PO, q 12 hrs) für zwei Wochen weiterbehandelt. Diese medikamentöse<br />
Behandlungsstrategie konnte zu einem erfolgreichen klinischen Verlauf ohne<br />
chirurgische Intervention führen.<br />
92
Zusammenfassung<br />
Kapitel 7 Zusammenfassung<br />
Janina Bartels: Nachweis des Chemokins MIP-3β/CCL19 im Liquor cerebrospinalis<br />
und dessen Beteiligung bei der Einwanderung mononukleärer Zellen<br />
in den Subarachnoidalraum bei Hunden mit entzündlichen und nichtentzündlichen<br />
neurologischen Erkrankungen.<br />
Chemokine sind wichtige Faktoren für die Zellwanderung und Pathogenese von Entzündungen<br />
im zentralen Nervensystem (ZNS). Sie können im Gewebe unter pathologischen<br />
Bedingungen hochreguliert sein und durch lokale Chemokin-gradienten<br />
das Migrationsverhalten, sowie die Aktivierung von Immunzellen beeinflussen.<br />
Die erste Studie dieser Arbeit befasste sich mit dem Nachweis des Chemokins<br />
MIP-3β (Macrophage Inflammatory Protein-3 beta)/ CCL19 in Liquor cerebrospinalis<br />
(CSF) und Serumproben von Hunden mit entzündlichen und nicht-entzündlichen<br />
Erkrankungen des Zentralnervensystems (ZNS). Die Hypothese sollte bestätigt<br />
werden, dass MIP-3ß/CCL19 im CSF bei ausgewählten neurologischen<br />
Erkrankungen erhöht ist und an der Pathogenese der Invasion von mononukleären<br />
Zellen in den Subarachnoidalraum beteiligt ist. Die Messung des Chemokins MIP-<br />
3β/CCL19 in 141 gepaarten Serum- und CSF Proben von Hunden erfolgte mit Hilfe<br />
eines ELISAs.<br />
Die Messergebnisse zeigten, dass in CSF Proben erkrankter Hunde die MIP-<br />
3β/CCL19 Konzentrationen deutlich höhere Werte aufwiesen. MIP-3β/CCL19 CSF-<br />
Konzentrationen waren bei Tieren mit Steroid-responsiver Meningitis-Arteriitis<br />
(SRMA) und Meningoenzephalomyelitis unbekannten Ursprungs (MUO) signifikant<br />
erhöht im Vergleich zur Kontrollgruppe, die aus gesunden Hunden und Patienten mit<br />
idiopathischer Epilepsie bestand (p < 0.001; median CCL19 Konzentration SRMA:<br />
1690 pg/ml; MUO: 373.5 pg/ml). Ebenfalls konnte dargestellt werden, dass die MIP-<br />
3β/CCL19 CSF-Konzentrationen bei Hunden mit SRMA und MUO signifikant mit der<br />
Liquorzellzahl korrelierten (SRMA r = 0.82, p < 0.001; MUO<br />
r = 0.59, p = 0.018). Aufgrund der höheren MIP-3β/CCL19 Liquorkonzentrationen im<br />
Vergleich zur Serumkonzentration kann von einer intrathekalen Synthese<br />
93
Zusammenfassung<br />
ausgegangen werden. Die erhöhte intrathekale Chemokinsynthese deutet darauf hin,<br />
dass MIP-3β/CCL19 bei der Pathogenese der untersuchten Erkrankungen relevant<br />
ist und möglicherweise eine Entzündungsreaktion aufrecht erhält. Eine Behandlung<br />
mit Glukokortikosteroiden reduzierte die MIP-3β/CCL19 Chemokinkonzentrationen im<br />
CSF bei Hunden mit SRMA und MUO im Vergleich zu unbehandelten Tieren<br />
signifikant (p < 0.001).<br />
Es konnte auch eine chemotaktische Aktivität für mononukleäre Zellen durch<br />
Liquorproben von Hunden mit immun mediierten neuroinflammatorischen<br />
Erkrankungen im durchgeführten Chemotaxis Assay dargestellt werden.<br />
Diese Ergebnisse führen zu der Annahme, dass das Chemokin MIP-3β/CCL19 in<br />
einer aktiven Form vorliegt und bei der Migration von Entzündungszellen in den<br />
Subarachnoidalraum eine Rolle spielt.<br />
Bei den untersuchten Hunden mit Bandscheibenvorfällen im Vergleich zur<br />
Kontrollgruppe konnten im CSF ebenfalls signifikant erhöhte MIP-3β/CCL19-<br />
Konzentrationen gefunden werden (p < 0.005). Diese Erhöhung des Chemokins kann<br />
für den sekundären Entzündungsprozess im ZNS verantwortlich sein, welcher eine<br />
wichtige Rolle bei der Sekundärschädigung des Rückenmarks spielt. Der<br />
Chemotaxis Assay konnte zeigen, dass CSF Proben von Hunden mit Bandscheibenvorfällen<br />
auch chemotaktische Aktivität für mononukleäre Zellen aufweisen. Da<br />
jedoch bei diesen CSF-Proben die Zellzahl nicht mit der MIP-3β/CCL19-<br />
Konzentrationen korrelierte, wird vermutet, dass MIP-3β/CCL19 bei Bandscheibenvorfällen<br />
nicht alleine für die Einwanderung von mononukleären Zellen in das ZNS<br />
verantwortlich ist.<br />
In der zweiten Studie konnte die erfolgreiche medikamentöse Behandlungsstrategie<br />
für die Therapie eines Hirnabszesses dargestellt werden, welcher eine neuroinflammatorische<br />
Erkrankung mit infektiöser Ursache repräsentiert.<br />
Es ist essentiell zwischen entzündlichen, infektiösen oder immun mediierten<br />
Erkrankungen zu unterscheiden, um die entsprechenden Therapien wählen zu<br />
können. Bei einem bakteriell bedingten Hirnabszess ohne eindeutige Identifizierung<br />
des mikrobiellen Agens müssen Antibiotika eingesetzt werden, die ein breites<br />
Spektrum und ebenfalls eine gute biologische Verfügbarkeit im ZNS besitzen.<br />
94
Zusammenfassung<br />
In dieser Studie konnte eine Kombination aus Enrofloxacin (10 mg/kg, IV, q 12 hrs),<br />
Clindamycin phosphate (19.5 mg/kg, IV, q 12 hrs) und Cefazolin sodium (21.6mg/kg,<br />
IV, q 8 hrs), welches während der Behandlung zu Ampicillin sodium/sulbactam<br />
sodium (21.6 mg/kg, IV, q 8 hrs) gewechselt wurde, zu einem erfolgreichen klinischen<br />
Verlauf ohne chirurgische Intervention führen. Der Hund wurde zu Hause mit<br />
Enrofloxacin (7.8 mg/kg, PO, q 24 hrs) und Clindamycin (15 mg/kg, PO, q 12 hrs) für<br />
vier Monate und Amoxicillin/clavulansäure (21.5 mg/kg, PO, q 12 hrs) für zwei<br />
Wochen weiterbehandelt. In dem vorliegenden Fall wurden zusätzlich zu den Breitspektrumantibiotika<br />
auch entzündungshemmende Medikamente eingesetzt.<br />
In der ersten Studie konnte die Hypothese bestätigt werden, dass das Chemokin<br />
MIP-3β/CCL19 eine Rolle in der Pathogenese der SRMA und MUO spielt und<br />
vermutlich bei der Sekundärschädigung von Rückenmarksverletzungen beteiligt ist.<br />
Das Chemokin MIP-3β/CCL19 kann vermutlich für die bessere Beurteilung der<br />
Prognose, sowie auch als wichtiger Biomarker für die Entwicklung neuer<br />
Behandlungsstrategien verwendet werden.<br />
95
Summary<br />
Kapitel 8 Summary<br />
Janina Bartels: Detection of the Chemokine MIP-3β/CCL19 in cerebrospinal fluid<br />
and its association with the invasion of mononuclear cells in<br />
neuroinflammatory and non-neuroinflammatory diseases in dogs.<br />
Chemokines are important factors for the cell migration and pathogenesis of<br />
inflammatory reactions in the central nervous system (CNS). They can be upregulated<br />
in tissues under pathologic conditions. Certain chemokine gradients can<br />
influence the cell migration and lead to the activation of immune cells. The first<br />
aspect of this study covered the quantification of chemokine MIP-3β (macrophage<br />
inflammatory protein-3 beta)/CCL19 concentrations in the cerebrospinal fluid (CSF)<br />
and serum samples in dogs with inflammatory and non-inflammatory diseases of the<br />
central nervous system (CNS).<br />
The second aspect of this study addressed the determination of the chemotactic<br />
activity of mononuclear cells induced by CSF containing elevated MIP-3β/CCL19<br />
concentrations. The hypothesis should be proven that MIP-3β/CCL19 concentrations<br />
are increased in CSF samples of selected neurological diseases and that higher<br />
concentrations of MIP-3β/CCL19 within the CNS induce mononuclear cell migration.<br />
MIP-3β/CCL19 concentration measurements were performed using a commercially<br />
available ELISA in 141 paired serum and CSF samples of dogs. Elevated MIP-<br />
3β/CCL19 values could be measured in CSF samples of dogs with inflammatory and<br />
non- inflammatory neurological diseases. MIP-3β/CCL19 CSF concentrations in dogs<br />
with steroid-responsive meningitis-arteritis (SRMA) and meningoencephalitides of<br />
unknown origin (MUO) were significantly higher compared to the control group<br />
consisting of healthy dogs and patients with idiopathic epilepsy (p < 0.001 ; median<br />
CCL19 concentration SRMA: 1690 pg / ml; MUO: 373.5 pg / ml).<br />
Additionally, a significant correlation between MIP-3β/CCL19 CSF concentrations<br />
and CSF cell count in dogs affected with SRMA and MUO (SRMA r = 0.82, p
Summary<br />
Increased intrathecal chemokine synthesis suggests that MIP-3β/CCL19 may play an<br />
important role in the pathogenesis and maintenance of an inflammatory reaction.<br />
Glucocorticosteroid administration significantly decreased the MIP-3β/CCL19<br />
chemokine concentrations in CSF samples of dogs affected with SRMA and MUO<br />
compared to untreated patients (p < 0.001).<br />
Chemotactic assay results revealed that chemotactic activity for mononuclear cells<br />
was induced by CSF samples with elevated levels of MIP-3β/CCL19 of dogs with<br />
immune mediated neuroinflammatory diseases suggesting that MIP-3β/CCL19 is<br />
present in an active form within the CSF and that increased MIP-3β/CCL19 CSF<br />
concentrations have an effect on the migration of inflammatory cells into the<br />
subarachnoid space.<br />
Patients with intervertebral disc disease (IVDD) showed significantly elevated MIP-<br />
3β/CCL19 CSF concentrations (p < 0.005) compared to controls. This chemokine<br />
elevation may be responsible for the secondary wave of inflammatory reactions in the<br />
CNS playing an important role in the secondary damage of spinal cord injuries (SCI).<br />
Furthermore, the chemotaxis assay also demonstrated that CSF samples of dogs<br />
with IVDD had chemotactic activity for mononuclear cells. However, in these CSF<br />
samples the total white blood cell count was not correlated with the MIP-3β/CCL19<br />
concentrations as shown previously with SRMA and MUO. Therefore, it is assumed<br />
that MIP-3β/CCL19 is not solely responsible for the migration of mononuclear cells<br />
into the subarachnoid space of dogs with IVDD.<br />
The second study presents a successful medical management of a brain abscess,<br />
which represents a neuroinflammatory disease caused by an infectious agent. It is<br />
essential to distinguish between inflammatory, infectious or immune-mediated<br />
diseases, in order to select appropriate therapies.<br />
In bacterial brain abscesses without clear identification of the microbial agent, broad<br />
spectrum antibiotics with high CSF bioavailability should be used. In this study, a<br />
combination of enrofloxacin (10 mg/kg, IV, q 12 hrs), clindamycin phosphate (19.5<br />
mg /kg, IV, q 12hrs) and cefazolin sodium (21.6 mg/kg, IV, q 8 hrs), which was later<br />
changed to ampicillin sodium / sulbactam sodium (21.6 mg/kg, IV, q 8 hrs), lead to a<br />
successful clinical outcome without surgical intervention.<br />
97
Summary<br />
The dog was maintained at home on enrofloxacin (7.8 mg/kg, PO q 24 hrs) and<br />
clindamycin (15 mg/kg, PO, q 12 hrs) for four months, and amoxicillin/clavulanic acid<br />
(21.5 mg/kg, PO, q 12 hrs) for two weeks. In the presented case, anti-inflammatory<br />
drugs were used in addition to the broad-spectrum antibiotics.<br />
The first study could confirm the hypothesis that the chemokine MIP-3β/CCL19 plays<br />
a role in the pathogenesis of SRMA and MUO and is involved in the secondary injury<br />
of SCI. Therefore, the chemokine MIP-3β/CCL19 may become a useful biomarker in<br />
detecting and determining the extent of disease, estimating prognosis and<br />
developing new treatment strategies.<br />
98
Abkürzungsverzeichnis<br />
Kapitel 9 Abkürzungsverzeichnis<br />
Abb. Abbildung<br />
Art.-Nr. Artikelnummer<br />
BA Hirnabszessen<br />
BBB Blut-Hirn-Schranke<br />
Best.-Nr. Bestellnummer<br />
BSA Bovines Serum Albumin<br />
bzw beziehungsweise<br />
C zervikal<br />
°C Grad Celsius<br />
CCL19 Chemokin Cysteine Ligand<br />
CCR7 C-C Chemokin Rezeptor<br />
CNS Central nervous system<br />
CSF Cerebrospinal fluid, Liquor cerebrospinalis<br />
CT Computertomographie<br />
CV Coefficient of variation, Variationskoeffizient (%)<br />
DC Dendritische Zellen<br />
EAE autoimmunen Enzephalomyelitis<br />
EDTA-Blut Blut in Ethylene-diamine-tetraacetic acid- beschichteten Röhrchen<br />
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay<br />
et al. und andere<br />
Fa. Firma<br />
FLAIR “fluid attenuated inversion recovery” Sequenz<br />
g Erdbeschleunigung, Gravitationsbeschleunigung (9,81 m/sek2)<br />
g Gramm<br />
GFAP Gliafaserproteine<br />
GME Granulomatöse Meningoenzephalitis<br />
HBSS Hanks balancierte Salzlösung<br />
hrs Stunde<br />
99
Abkürzungsverzeichnis<br />
IE idiopathische Epilepsie<br />
IFN Interferon<br />
Ig Immunglobulin<br />
IL Interleukin<br />
IV intravenös<br />
IVDD Intervertebral disk disease, Bandscheibenvorfall<br />
kg Kilogramm<br />
log Logarithmus<br />
µl Mikroliter<br />
mg Milligramm<br />
MIP-3β Makrophagen inflammatorisches Protein-3β<br />
ml Milliliter<br />
MRI Magnetic Resonance Imaging<br />
MRT Magnetresonanztomographie<br />
MUO Meningoenzephalomyelitiden unbekannten Ursprungs<br />
NME nekrotisierende Meningoenzephalitis<br />
NLE nekrotisierende Leukoenzephalitis<br />
ng Nanogramm<br />
n Nummer<br />
OD optische Dichte<br />
p Signifikanzwert<br />
PBS Phosphate-Buffered Saline, phosphatgepufferte Salzlösung<br />
PMC periphere mononukleäre Zellen<br />
pg Picogramm<br />
PO per os<br />
q 8 hours alle 8 Stunden<br />
RPMI Rosewell Park Memorial Institute<br />
S sakral<br />
SCI Spinal cord injury<br />
SD Standard deviation<br />
sek. Sekunde<br />
100
Abkürzungsverzeichnis<br />
SRMA<br />
Std.<br />
T<br />
T2W<br />
Tab.<br />
TMB<br />
TGF<br />
VESC<br />
z.B.<br />
ZNS<br />
Steroid-responsive Meningitis-Arteriitis bzw. steril-eitrige Meningitis-<br />
Arteriitis<br />
Standard<br />
thorakal<br />
T2-weighted, T2-gewichtete MRT Sequenz<br />
Tabelle<br />
Substrat (3,3´,5,5´-Tetramethylbenzidine)<br />
Transforming growth factor<br />
Veterinary Emergency and Specialty Center<br />
zum Beispiel<br />
Zentrales Nervensystem<br />
101
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126
Anhang<br />
Kapitel 12 Anhang<br />
Materialvorbereitung des ELISA Kits<br />
Das Chemokin MIP3-b/CCL19 wurde mit Hilfe eines Sandwich-ELISAs (Enzyme<br />
linked immunoabsorbent assay) untersucht. Die Messungen wurden mit einem<br />
speziell für das kanine MIP3b/CCL19 entwickeltem ELISA-Kit (E90096Ca 96 Tests,<br />
USCN Life Science Inc., Wuhan, PR China) nach Herstellerangaben durchgeführt<br />
(USCN Life Science Inc. 2011).<br />
A: Vorbereitung Standard:<br />
Der Standard muss 15 Minuten vor dem Assay nach folgenden Schritten vorbereitet<br />
werden:<br />
1. Materialien auf Raumtemperatur bringen bis höchstens auf 18-25°C.<br />
2. Der lyophilisierte Standard wird mit 1ml Standardverdünnung vorbereitet, wobei<br />
nur leicht geschüttelt werden darf, um ein Schäumen zu vermeiden. Anschließend<br />
wird die Lösung 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen.<br />
3. Der Standard besitzt eine CCL19 Konzentration von 2000 pg/ml, welche für die<br />
Standardverdünnungsreihe weiter verdünnt wird. Die höchste verwendete<br />
Standardkonzentration im Assay beträgt 1000 pg/ml.<br />
4. Sieben Röhrchen werden mit 0,5 ml Standardverdünnungsmittel und 500 µl<br />
der Standardausgangskonzentration vorbereitet, die dann schrittweise weiter<br />
verdünnt wird. Die Konzentrationen des CCL19 in den 7 Röhrchen entsprechen<br />
1000 pg/ml, 500pg/ ml, 250pg/ ml, 125pg/ ml, 62.5 pg/ml, 31,2 pg/ ml und die<br />
niedrigste Konzentration entspricht 15.6pg/ ml.<br />
127
Anhang<br />
5. Das 8. Röhrchen enthält nur die Standardverdünnung 0 pg/ml und wird als<br />
„Blank“ (Leerwert) bezeichnet.<br />
B: Vorbereitung Verdünnungsmittel A und Verdünnungsmittel B:<br />
Das Verdünnungsmittel A wird für die Herstellung des Nachweisreagenz A,<br />
welches ein biotylierter anti- CCL19-Antikörper ist, benötigt. Das<br />
Verdünnungsmittel B wird für die Herstellung des Nachweisreagenz B<br />
vorbereitet, welches eine an Avidin konjugierte Meerrettich- Peroxidase ist.<br />
6 ml Assay Verdünnungsmittel A beziehungsweise Verdünnungsmittel B<br />
(2faches Konzentrat) werden mit 6 ml destilliertem Wasser verdünnt, wodurch<br />
das für den Reagenten A und den Reagenten B zu verwendende<br />
Verdünnungsmittel A und Verdünnungsmittel B entsteht. Dieses darf nicht<br />
wieder eingefroren werden.<br />
C: Vorbereitung Nachweisreagenz A und Nachweisreagenz B:<br />
Der biotylierter anti- CCL19-Antikörper (Nachweisreagenz A) und die an Avidin<br />
konjugierte Meerrettich- Peroxidase (Nachweisreagenz B) werden nach<br />
Herstellerangaben vorbereitet. Die Reagenzien müssen vor der Benutzung<br />
kurz zentrifugiert werden.<br />
Anschließend wird der jeweilige Reagent A oder B mit dem entsprechenden<br />
Verdünnungsmittel 1:100 verdünnt.<br />
D: Vorbereitung Waschlösung:<br />
<br />
Die im ELISA Kit vorhandene 20 ml Waschlösung (30faches Konzentrat) wird<br />
mit 580 ml destilliertem Wasser verdünnt, um 600 ml Waschlösung zu<br />
erhalten.<br />
128
Anhang<br />
E: TMB Substrat:<br />
<br />
Das benötigte TMB (3,3´,5,5´-Tetramethylbenzidine) Substrat wird mit einer<br />
sterilen Pipette in ein vorgegebenes Gefäß gefüllt.<br />
F: Vorbereitung Mikrotiterplatte:<br />
1.standard 1.standard<br />
2.standard 2.standard<br />
3.standard 3.standard<br />
4.standard 4.standard<br />
5.standard 5.standard<br />
6.standard 6.standard<br />
7.standard 7.standard<br />
8. blank 8. blank<br />
<br />
7 Vertiefungen werden in Duplikaten für die Standardverdünnungsreihe mit<br />
jeweils 100 µl verwendet, welche CCL19 Konzentrationen von 1000 pg/ml,<br />
500 pg/ml, 250 pg/ml, 125 pg/ml, 62.5 pg/ml, 31.2 pg/ml und 15.6 pg/ml<br />
aufweisen.<br />
In die 8. Vertiefung wird die reine Standardverdünnung pipettiert, welches als<br />
„Blank“ (Leerwert) bezeichnet wird.<br />
In die restlichen Vertiefungen werden jeweils 100 µl der zu untersuchenden<br />
Serum- und Liquorproben pipettiert, wobei die Liquorproben je nach CCL19<br />
Ausgangskonzentration mit der Standardverdünnung bis zu einer<br />
Konzentration von 1:13 verdünnt und Serumproben unverdünnt eingesetzt<br />
werden.<br />
129
Anhang<br />
Durchführungsprotokoll des ELISAs<br />
1. Die Mikrotiterplatte , welche mit einem monoklonalen Antikörper speziell für<br />
CCL19 vorbeschichtet ist, wird wie vorher beschrieben, mit der<br />
Standardverdünnungsreihe, dem „Blank“ und den zu untersuchenden Serumund<br />
Liquorproben beschickt und anschließend mit einer Abklebefolie bedeckt.<br />
2. Die Mikrotiterplatte wird mit den entsprechenden Reagenzien, welche die<br />
Standardverdünnungsreihe, de „Blank“ und den zu untersuchenden Serum-<br />
und Liquorproben umfasst, für zwei Stunden bei 37°C im Inkubator inkubiert.<br />
3. Anschließend werden die Reagenzien entfernt.<br />
4. 100 µl des biotylierten polyklonalen anti- CCL19- Antikörper (Nachweisreagent<br />
A) werden in alle Kavitäten der Mikrotiterplatte pipettiert und abgedeckt.<br />
5. Die Mikrotiterplatte wird mit dem polyklonalen anti- CCL19- Antikörper<br />
(Nachweisreagent A) für eine Stunde bei 37°C im Inkubator inkubiert.<br />
6. Die Flüssigkeit wird anschließend entfernt und dreimal mit 350 µl der<br />
Waschlösung gewaschen, wobei die Waschlösung jeweils ein bis zwei<br />
Minuten einwirken kann.<br />
7. 100 µl, der an Avidin konjugierten Meerrettich-Peroxidase (Nachweisreagent<br />
B), werden in alle Kavitäten der Mikrotiterplatte pipettiert und abgedeckt.<br />
8. Die Mikrotiterplatte wird mit dem bereits gebundenen polyklonalen anti-<br />
CCL19- Antikörper (Nachweisreagent A) und der an Avidin konjugierten<br />
Meerrettich- Peroxidase (Nachweisreagent B) für 30 Minuten bei 37°C im<br />
Inkubator inkubiert.<br />
130
Anhang<br />
9. Die Flüssigkeit, welche aus der übergebliebenen Avidin konjugierten<br />
Meerrettich- Peroxidase (Nachweisreagent B) besteht, wird anschließend<br />
entfernt und fünfmal mit 350 µl der Waschlösung gewaschen.<br />
10. Es wird in jede Kavität 90 µl Substratlösung (TMB-Substrat) hinzugefügt und<br />
die Mikrotiterplatte erneut mit einer Abklebefolie bedeckt. Die Platte mit dem<br />
Substrat wird für 15-25 Minuten bei 37°C inkubiert bis durch die<br />
Substratreaktion eine konzentrationsabhängige blaue Verfärbung eintritt.<br />
Dabei darf die Reaktion nicht länger als 30 Minuten erfolgen und muss<br />
lichtgeschützt sein.<br />
11. Von der Stopplösung (Schwefelsäure) werden 50 µl in alle Kavitäten pipettiert,<br />
wobei sich, die durch das TMB- Substrat entstandene blaue<br />
Farbveränderung, nun durch die Schwefelsäure gelb verfärbt wird und die<br />
Enzym- Substrat Reaktion beendet wird.<br />
12. Die CCL19 konzentrationsabhängige Verfärbung der Flüssigkeit in der<br />
Mikrotiterplatte wird bei 450nm ± 10nm im Mikroplatten- Reader gemessen.<br />
131
Anhang<br />
Curve<br />
4,000<br />
3,500<br />
3,000<br />
2,500<br />
450<br />
2,000<br />
1,500<br />
1,000<br />
0,500<br />
0,000<br />
1 10 100 1000 10000<br />
<br />
Abb. 2: Standardkurve mit sigmoidalem Verlauf (CCL19-Konzentrationen zwischen<br />
15.6 -1000 pg/ml auf der x-Achse; Optische Dichte auf der y-Achse, welche<br />
mit Hilfe des Synergy 2 Multi-Detektions-Reader Fa. BioTek Instruments,<br />
Bad Friedrichshall und der Gen5 Reader Control and Data Analysis<br />
Software Fa. BioTek Instruments, Bad Friedrichshall in die MIP3b/CCL19<br />
Konzentration umgerechnet wurde).<br />
Chemotaxis Assay<br />
Durchführungsprotokoll für die Separation mononukleärer Zellen<br />
1. Alle Reagenzien werden auf Raumtemperatur gebracht.<br />
2. Die 5 ml EDTA- Blut werden mit demselben Volumen Phosphat-gepufferte-<br />
Salzlösung (PBS) in einem 15 ml Röhrchen verdünnt.<br />
3. In einem weiteren 15 ml Röhrchen wird 2 ml Histopaque 1,119 pipettiert und<br />
darüber vorsichtig 2 ml Pancoll 1,077 geschichtet.<br />
132
Anhang<br />
4. Anschließend wird das verdünnte Blut vorsichtig auf den Dichtegradienten<br />
pipettiert, wobei die Oberflächen stabil bleiben müssen.<br />
5. Das Röhrchen wird nun bei 400 g für 30 Minuten bei Raumtemperatur<br />
zentrifugiert, so dass durch den Dichtegradienten verschiedene Schichten im<br />
Röhrchen zu sehen sind. Die erste transparente Schicht enthält Plasma und<br />
Thrombozyten und kann verworfen werden. Die Interphase zwischen der<br />
Plasmaschicht und Pancollschicht 1,077 enthält die mononukleären Zellen und wird<br />
für die weitere Durchführung verwendet.<br />
6. Die mononukleäre Zellsuspension wird mit 10 ml HBSS verdünnt und bei 170 g<br />
für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert.<br />
7. Der Überstand wird abdekantiert und das Pellet in der verbliebenen Flüssigkeit<br />
resuspendiert.<br />
8. In einem zweiten Waschschritt wird die mononukleäre Zellsuspension erneut mit<br />
10 ml HBSS verdünnt und diesmal bei 250 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur<br />
zentrifugiert.<br />
9. In einem dritten Waschschritt wird die mononukleäre Zellsuspension noch einmal<br />
mit 10 ml HBSS verdünnt und bei 170 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur<br />
zentrifugiert.<br />
10. Der Überstand wird abpipettiert und das Pellet in 500 µl Zellwaschlösung (Becton<br />
Dickinson, Heidelberg, Deutschland) resuspendiert.<br />
133
Anhang<br />
Bestimmung der Zellzahl<br />
10 µl der mononukleären Zellsuspension werden mit 90 µl Trypanblau (0,4% in<br />
phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (Fa. Sigma-Aldrich, Schnelldorf,<br />
Deutschland) vermischt, um die ungefärbten vitalen Zellen in einer TÜRK-<br />
Zählkammer (Fa. Brand, Wertheim, Deutschland) zählen und auf die benötigte<br />
Zellkonzentration einstellen zu können. Dabei wird 10 µl der gefärbten<br />
Zellsuspension in die TÜRK- Zählkammer pipettiert. Die ungefärbten, vitalen<br />
mononukleären Zellen werden in drei Feldern gezählt, die jeweils 0,1 mm³ groß sind.<br />
Die durchschnittliche Zellzahl wird mit 100.000 multipliziert, um die Zellzahl in 1<br />
Milliliter Suspension zu erhalten.<br />
Abb. 3: TÜRK-Zählkammer (Urban u. Fischer Verlag 2003, Roche Lexikon Medizin,<br />
5. Auflage [internet: URL: http://www.tk.de/rochelexikon/pics/p39580.002-1.html],<br />
übernommen von N. HENNING 1966: Klinische Laboratoriumsdiagnostik, 3.Auflage,<br />
Verlag Urban und Schwarzenberg, München).<br />
134
Anhang<br />
1. Anzahl der Hunde, Diagnose, Liquor- und Blutwerte und MIP-3β/CCL19-<br />
Messwerte der 51 Hunde mit SRMA aus der Studie „Untersuchung des<br />
Chemokins MIP-3β/CCL19 in Liquorproben von Hunden mit entzündlichen und<br />
nicht-entzündlichen ZNS Erkrankungen“.<br />
Lfd.<br />
Nr.<br />
Vorstellung<br />
Therapie CSF Neutrophile Lymphozyten Monozyten CSF IgA CSF IgA serum Blut CSF Serum<br />
Leukozyten CSF CSF CSF Protein<br />
Leukozyten CCL19 CCL19<br />
Diagnose<br />
/3µl % % % mg/dl µg/ml µg/ml 10³/µl pg/ml pg/ml<br />
1 SRMA C einmalig 140 90 3 17 25 4.7 129 8.9 144 155.7<br />
2 SRMA C einmalig 14 91 0 9 13 0.15 306 21.03 132 54.9<br />
3 SRMA C einmalig 20 93 1 6 10 1.8 163 15 340 114.8<br />
4 SRMA C einmalig 88 92 0 8 21 0.69 146 18 271.45 19.1<br />
5 SRMA C einmalig 900 75 1 24 28 0.9 30 36 1010.25 0<br />
6 SRMA C 6560 62 3 35 110 2.7 272 18.79 4600 856.78<br />
7 SRMA R 416 64 22 14 40 3.8 326 20.4 1881.303 474.57<br />
8 SRMA C 14500 91 2 6 137 2.55 409 32.54 3200 521.7<br />
9 SRMA C 200 84 8 8 23.9 0.2 93 30.3 290.38 129.3<br />
10 SRMA C 3216 95 1 4 0 0.4 82 13.85 3761.17 131.34<br />
11 SRMA C 275 80 5 15 30 0.5 143 20.5 1601.27 151.39<br />
12 SRMA C 9000 81 0 19 107 1.5 106 24.4 3404.5 197.4<br />
13 SRMA C 1370 79 1 20 43 1.65 511.7 25 2284.55 823.9<br />
14 SRMA C 5300 77 22 1 186 1.7 200 26 2712.7 53.817<br />
15 SRMA C 32 90 0 10 14 0.16 282 28 671.5 84.7<br />
16 SRMA C 540 70 2 28 32 1.1 210 27 3683.66 73<br />
17 SRMA C 528 78 5 17 54 1.6 106 16 703 77.7<br />
18 SRMA C 13 50 34 16 19 3.2 144.6 19 112 198<br />
19 SRMA C 475 92 5 3 22.13 0.3 102 17 999 531<br />
20 SRMA R 336 65 0 35 23 0.2 82.6 16.5 3397.7 64.5<br />
21 SRMA R 4680 66 0 34 55 2.87 549 19.5 2706 75<br />
22 SRMA C 3800 94 6 0 13 2.7 205 20.7 5745 60.9<br />
23 SRMA C 6848 91 1 9 131 3.1 184 30 2850 138<br />
24 SRMA R 1800 88 1 11 65 1.9 204 29 1690 73<br />
25 SRMA C 230 70 20 10 20 0.32 560 27 1233.65 235.1<br />
SRMA: Steroid-responsive meningitis-arteritis, CSF: Liquor cerebrospinalis, C:<br />
Erstvorstellung, R: Rezidiv, T: Therapie mit Glukokortikosteroiden, Lfd. Nr.: laufende<br />
Nummer; CCL19: Marophagen inflammatorisches Protein-3β<br />
135
Anhang<br />
Lfd.<br />
Vorstellung<br />
Leukozyten CSF CSF CSF Protein<br />
Leukozyten CCL19 CCL19<br />
Nr. Diagnose<br />
Therapie CSF Neutrophile Lymphozyten Monozyten CSF IgA CSF IgA serum Blut CSF Serum<br />
/3µl % % % mg/dl µg/ml µg/ml 10³/µl pg/ml pg/ml<br />
26 SRMA T Therapie 0 14 23 159 10 135.5 112<br />
27 SRMA T Therapie 2 12 0.35 67.8 12 131.1 116.6<br />
28 SRMA T Therapie 1 16 3.9 308 12 187 0<br />
29 SRMA T Therapie 2 14 2.6 85 7 0 115.6<br />
30 SRMA T Therapie 1 10 0.42 175 14 74.6 537.7<br />
31 SRMA T Therapie 2 11 0.32 306 10 55 35<br />
32 SRMA T Therapie 1 12 0.09 56.8 16 289.8 137<br />
33 SRMA T Therapie 1 15.8 0.122 45 10 99.7 182.1<br />
34 SRMA T Therapie 1 12 0.26 37 10 79.6 54.9<br />
35 SRMA T Therapie 0 11 0.2 29 11 66.3 90.1<br />
36 SRMA T Therapie 2 12 0.1 130 11 40.1 19.4<br />
37 SRMA T Therapie 4 14 0.57 87 10 75 145.6<br />
38 SRMA T Therapie 0 12 0.2 70 10 49.4 13.8<br />
39 SRMA T Therapie 2 17 0.97 67 12 121.7 97<br />
40 SRMA T Therapie 16 16 0.46 75 17 137.5 78.8<br />
41 SRMA T Therapie 2 15.5 0.09 170 16 81.6 32.5<br />
42 SRMA T Therapie 2 13 0.056 62 19 115.4 55.3<br />
43 SRMA T Therapie 2 7 0.033 31 8 97.6 41.2<br />
44 SRMA T Therapie 0 9.95 0.4 102 14 73.9 33.4<br />
45 SRMA T Therapie 1 11 0.48 43.4 10 67.2 37<br />
46 SRMA T Therapie 0 11 0.2 82.6 8 70.4 58<br />
47 SRMA T Therapie 2 9 0.06 88.9 12 81.4 177<br />
48 SRMA T Therapie 1 10 0.09 75.7 17 88.1 111.4<br />
49 SRMA T Therapie 3 13 0.05 45.05 11 84.5 251<br />
50 SRMA T Therapie 0 13 0.05 81 10 28.7 16.8<br />
51 SRMA T Therapie 0 10 0.06 30 19 72.6 379.8<br />
SRMA: Steroid-responsive meningitis-arteritis, CSF: Liquor cerebrospinalis, C:<br />
Erstvorstellung, R: rezidiv, T: Therapie mit Glukokortikosteroiden, Lfd. Nr.: laufende<br />
Nummer; CCL19: Marophagen inflammatorisches Protein-3β<br />
136
Anhang<br />
2. Anzahl der Hunde, Diagnose, Liquor- und Blutwerte und MIP-3β/CCL19-<br />
Messwerte der 27 Hunde mit MUO aus der Studie „Untersuchung des<br />
Chemokins MIP-3β/CCL19 in Liquorproben von Hunden mit<br />
entzündlichen und nicht-entzündlichen ZNS Erkrankungen“<br />
Lfd.<br />
Nr.<br />
Vorstellung<br />
Therapie CSF Neutrophile Lymphozyten Monozyten CSF IgA CSF IgA Serum Blut CSF Serum<br />
Leukozyten CSF CSF CSF Protein<br />
Leukozyten CCL19 CCL19<br />
Diagnose<br />
/3µl % % % mg/dl µg/ml µg/ml 10³/µl pg/ml pg/ml<br />
1 MUO C 0 15 12 170 577<br />
2 MUO C 29 33 11 771 121<br />
3 MUO C 16 26 10 126 854.9<br />
4 MUO C 4 30 13.58 107.3 551.4<br />
5 MUO C 1 16 7.47 227.8 44.6<br />
6 MUO C 721 193 10 400 80<br />
7 MUO C 764 110 14 1298 125<br />
8 MUO C 156 52 11 110.22 132.6<br />
9 MUO C 1520 390 7.4 2372 371.5<br />
10 MUO C 152 80 7 545 757<br />
11 MUO C 224 23 9.99 794 45.5<br />
12 MUO C 1136 398 13.3 519 0<br />
13 MUO C 600 36 13 206 188.6<br />
14 MUO C 908 93 10.2 347 78.9<br />
15 MUO C 416 44 6.61 1142 232<br />
16 MUO C 168 21 18.95 176 440<br />
17 MUO T Therapie 2 16 12 1 51.8<br />
18 MUO T Therapie 0 14 11.8 18.6 38.4<br />
19 MUO T Therapie 3 43 8.5 140.4 17.4<br />
20 MUO T Therapie 2 16 13 91.8 50.4<br />
21 MUO T Therapie 8 12.4 9.5 92.5 199.7<br />
22 MUO T Therapie 0 14 10 76.9 26.4<br />
23 MUO T Therapie 0 13 10 76.3 7.6<br />
24 MUO T Therapie 4 22 14 86 197.6<br />
25 MUO T Therapie 2 20 9.2 261 148.2<br />
26 MUO T Therapie 3 30 10 185 190<br />
27 MUO T Therapie 16 20 16 95 274<br />
MUO: Meningoenzephalomyelitiden unbekannten Ursprungs, CSF: Liquor<br />
cerebrospinalis, T: Therapie mit Glukokortikosteroiden, Lfd.Nr.: laufende Nummer,<br />
CCL19: Makrophagen inflammatorisches Protein-3β<br />
137
Anhang<br />
3. Anzahl der Hunde, Diagnose, Liquor- und Blutwerte und MIP-3β/CCL19-<br />
Messwerte der 36 Hunde mit IVDD aus der Studie „Untersuchung des<br />
Chemokins MIP-3β/CCL19 in Liquorproben von Hunden mit<br />
entzündlichen und nicht-entzündlichen ZNS Erkrankungen“<br />
Lfd.<br />
Nr.<br />
Diagnose Grad Vorstellung<br />
Leukozyten<br />
CSF<br />
/3µl<br />
Protein Leukozyten<br />
CCL19<br />
CSF Blut CCL19 CSF Serum<br />
mg/dl 10³/µl pg/ml pg/ml<br />
1 IVDD 2 chronisch 4 16 7 108.2 68.1<br />
2 IVDD 2 chronisch 2 15 21 121.1 0<br />
3 IVDD 2 chronisch 4 22 15 166.5 1457.22<br />
4 IVDD 3 akut 0 36 7 214.8 72<br />
5 IVDD 2 subakut 0 23 8 52.9 0<br />
6 IVDD 2 chronisch 1 14 10 130.1 162.7<br />
7 IVDD 2 akut 4 17 8 90.2 148<br />
8 IVDD 3 akut 1 10 8 197.3 304.8<br />
9 IVDD 2 akut 1 21 10 162.1 146.4<br />
10 IVDD 2 subakut 2 17 7 36.8 64.8<br />
11 IVDD 2 chronisch 1 15 11 52.2 84.5<br />
12 IVDD 3 subakut 1 12 9 163.4 922.9<br />
13 IVDD 2 chronisch 2 23 8 74.2 556<br />
14 IVDD 2 chronisch 3 15 8 87.97 75.6<br />
15 IVDD 2 chronisch 1 21 8 89.6 162.1<br />
16 IVDD 2 chronisch 0 22 15 164.7 191<br />
17 IVDD 2 chronisch 0 20 10 115.4 886.2<br />
18 IVDD 2 chronisch 0 13 5 82 77.4<br />
19 IVDD 2 akut 1 26 12 129.5 113.4<br />
20 IVDD 2 subakut 3 25 6 56.3 93.4<br />
21 IVDD 3 akut 8 19 14 158 162<br />
22 IVDD 2 akut 1 21 7 88.9 73.2<br />
23 IVDD 3 subakut 0 16 10 82 201<br />
24 IVDD 2 subakut 3 19 7 350 157<br />
25 IVDD 2 chronisch 1 16 12 72 63.3<br />
IVDD: Intervertebral disc disease, CSF: Liquor cerebrospinalis, Lfd. Nr.: laufende<br />
Nummer, CCL19: Marophagen inflammatorisches Protein-3β<br />
138
Anhang<br />
Lfd.<br />
Nr.<br />
Diagnose<br />
Grad<br />
Vorstellung<br />
Leukozyten<br />
CSF<br />
/3µl<br />
Protein Leukozyten CCL19 CCL19<br />
CSF Blut CSF Serum<br />
mg/dl 10³/µl pg/ml pg/ml<br />
26 IVDD 4 akut 4 14 7 347.4 129.7<br />
27 IVDD 4 akut 20 16 14 210.6 111.4<br />
28 IVDD 4 akut 3 19 16 102 679.6<br />
29 IVDD 4 akut 0 16 8 149.2 128.9<br />
30 IVDD 4 akut 3 13 13 93.1 64.1<br />
31 IVDD 5 akut 3 16 10 203.6 157.7<br />
32 IVDD 5 subakut 4 19 29 45 30<br />
33 IVDD 4 akut 6 10 16 40 0<br />
34 IVDD 4 akut 4 10 9 149.3 90<br />
35 IVDD 4 akut 2 11 17 491.79 97.6<br />
36 IVDD 4 chronisch 0 9 7 125 10.8<br />
IVDD: Intervertebral disc disease, CSF: Liquor cerebrospinalis, Lfd. Nr.: laufende<br />
Nummer, CCL19: Marophagen inflammatorisches Protein-3β<br />
139
Anhang<br />
4. Anzahl der Hunde, Diagnose, Liquor- und Blutwerte und MIP-3β/CCL19-<br />
Messwerte der 21 Hunde mit idiopathischer Epilepsie (IE) und 6 gesunde aus<br />
der Studie „Untersuchung des Chemokins MIP-3β/CCL19 in Liquorproben von<br />
Hunden mit entzündlichen und nicht-entzündlichen ZNS Erkrankungen“<br />
Lfd.<br />
Nr.<br />
Vorstellung<br />
Therapie CSF Neutrophile Lymphozyten Monozyten CSF IgA CSF IgA Serum Blut CSF Serum<br />
Leukozyten CSF CSF CSF Protein<br />
Leukozyten CCL19 CCL19<br />
Diagnose<br />
/3µl % % % mg/dl µg/ml µg/ml 10³/µl pg/ml pg/ml<br />
1 IE 1 11 9 52.7 22.9<br />
2 IE 0 9 12 56.5 93.6<br />
3 IE 1 7 23 125 103.5<br />
4 IE 1 14 11 73.7 873.9<br />
5 IE 0 10 10 138.7 197.3<br />
6 IE 0 14 14 62.4 102<br />
7 IE 2 12 10 126 316<br />
8 IE 1 13 10 77 313<br />
9 IE 2 10 7 68 83<br />
10 IE 1 15 10 80.9 32.6<br />
11 IE 0 14 9 60.7 43.2<br />
12 IE 3 14 8 23.2 72.4<br />
13 IE 1 23 10 22.9 118.4<br />
14 IE 2 15 16 56.8 69.8<br />
15 IE 0 11 8 11.8 33.9<br />
16 IE 0 6 9 66 108.6<br />
17 IE 0 12 9 108.4 150.9<br />
18 IE 3 9 12 45 37.4<br />
19 IE 1 19 23 87.1 24.6<br />
20 IE 0 10 11 56 60<br />
21 IE 0 14 10 135.5 63.5<br />
22 Gesund 68.2 115.7<br />
23 Gesund 52.4 286.2<br />
24 Gesund 50 218<br />
25 Gesund 54.8 86.5<br />
26 Gesund 21.5 102.2<br />
27 Gesund 36.8 65.9<br />
IE: idiopathische Epilepsie, CSF: Liquor cerebrospinalis, CCL19: Makrophagen<br />
inflammatorisches Protein-3β, Lfd. Nr.: laufende Nummer<br />
140
Danksagung<br />
Kapitel 13 Danksagung<br />
Mein besonderer Dank gilt Frau Prof. Dr. Tipold für die Möglichkeit, diese<br />
interessante Studie durchführen zu dürfen. Es war eine wunderschöne Zeit und ich<br />
danke Frau Prof. Tipold herzlichst für die ausgezeichnete Unterstützung. Es ist<br />
bewundernswert, mit welcher freundlichen, liebenswürdigen und unermüdlichen<br />
Hilfe Prof. Dr. Tipold mich betreute.<br />
Der <strong>Tierärztliche</strong>n <strong>Hochschule</strong> danke ich sehr für Bereitstellung der Forschungs-<br />
möglichkeiten und der guten Ausbildung.<br />
Für die einmalige und schöne Zeit im Labor und in der Kleintierklinik möchte ich mich<br />
bei Regina Carlson und der Arbeitsgruppe Neurologie bedanken.<br />
Ein ganz besonderer Dank geht auch an meine Mutter Christiane von Maske-Bartels,<br />
die mich in jeder Situation tatkräftig und liebevoll unterstützte.<br />
Auch möchte ich meinem Vater Klaus- Dieter Bartels und Dietmar Mückstein danken.<br />
Zuletzt möchte ich mich bei Brett G. Darrow bedanken für die außergewöhnliche und<br />
unvergessliche Hilfe!<br />
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