DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO FÃSICO ... - UFSM
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA<br />
CENTRO DE CIÊNCIAS RURAIS<br />
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA<br />
DOS ALIMENTOS<br />
<strong>DESENVOLVIMENTO</strong> E CARACTERIZAÇÃO<br />
FÍSICO-QUÍMICA E SENSORIAL DE FERMENTADOS<br />
DE BUTIÁ (Butia odorata)<br />
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO<br />
Gabrieli Bernardi<br />
Santa Maria, RS, Brasil.<br />
2013
<strong>DESENVOLVIMENTO</strong> E CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E<br />
SENSORIAL DE FERMENTADOS DE BUTIÁ (Butia odorata)<br />
Gabrieli Bernardi<br />
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado do Programa de<br />
Pós-graduação em Ciência e Tecnologia dos Alimentos,<br />
Área de Concentração em Qualidade de Alimentos, da<br />
Universidade Federal de Santa Maria (<strong>UFSM</strong>, RS), como requisito<br />
parcial para obtenção do grau de<br />
Mestre em Ciência e Tecnologia dos Alimentos<br />
Orientador: Prof. Dr. Roger Wagner<br />
Santa Maria, RS, Brasil.<br />
2013
Universidade Federal de Santa Maria<br />
Centro de Ciências Rurais<br />
Programa de Pós-graduação em Ciência<br />
e Tecnologia dos Alimentos<br />
A Comissão Examinadora, abaixo assinada,<br />
aprova a Dissertação de Mestrado<br />
Desenvolvimento e caracterização físico-química e<br />
sensorial de fermentados de butiá (Butia odorata)<br />
elaborada por<br />
Gabrieli Bernardi<br />
como requisito parcial para obtenção do grau de<br />
Mestre em Ciência e Tecnologia de Alimentos<br />
COMISÃO EXAMINADORA:<br />
__________________________________<br />
Roger Wagner, Dr.<br />
(Presidente/Orientador)<br />
___________________________________<br />
Aline Fogaça, Dr. (UNIFRA)<br />
___________________________________<br />
Renato Zanella, Dr. (<strong>UFSM</strong>)<br />
___________________________________<br />
Leila Queiroz Zepka, Dr. (<strong>UFSM</strong>)<br />
Santa Maria, 27 de fevereiro de 2013.
DEDICATÓRIA<br />
Dedico esse título aos meus pais e ao meu irmão.<br />
De vocês sempre tive amor, dedicação e paciência.<br />
Amo vocês.
AGRADECIMENTOS<br />
Aos meus pais, Raul e Ocrilde, pelo exemplo de dedicação que carrego comigo em todos os<br />
desafios da vida.<br />
Ao meu irmão Guilherme, pela amizade e carinho.<br />
Ao professor Roger, pela dedicação ao me orientar, pela paciência e compreensão presentes<br />
durante esses dois anos. Obrigada pelo exemplo de bom profissional e de ser humano.<br />
Ao Harry e Ivera, meu suporte mais próximo em todos os momentos, exemplos de carinho e<br />
dedicação, não teria conseguido sem vocês.<br />
Aos colegas do NTA, vocês todos foram presença constante na minha vida durante esses dois<br />
anos por isso, obrigada pela ajuda, pelos momentos de distração e pela torcida. Tassi, Bruna,<br />
Carol, Dani, Jossiê, Mari, Raquel, Laura, Duda e todos os que passaram pelo laboratório nesse<br />
período. Aos queridos Matheus e Carol (in memoriam). Muito obrigada, do fundo do coração.<br />
Aos meus amigos queridos, Fran, Everton, Luís e a Renata, pelos momentos de descontração e<br />
pela capacidade imensa que vocês têm de transformar qualquer assunto sério em brincadeiras.<br />
Vocês me fazem ver o mundo de uma maneira mais fácil.<br />
A Dona Arlete Wagner pelo fornecimento das amostras de butiá e a todos que, de alguma<br />
maneira, colaboraram para a realização deste trabalho, colegas do mestrado e professores e<br />
funcionários do PPGCTA.
RESUMO<br />
Dissertação de Mestrado<br />
Programa de Pós-graduação em Ciência e Tecnologia dos Alimentos<br />
Centro de Ciências Rurais<br />
Universidade Federal de Santa Maria<br />
<strong>DESENVOLVIMENTO</strong> E CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E<br />
SENSORIAL DE FERMENTADOS DE BUTIÁ (Butia odorata)<br />
AUTORA: GABRIELI BERNARDI<br />
ORIENTADOR: ROGER WAGNER<br />
Data e Local da Defesa: Santa Maria, 27 de fevereiro de 2013.<br />
As frutas nativas de diferentes biomas vêm sendo estudadas como uma nova alternativa para o<br />
desenvolvimento de fermentados alcoólicos, além do tradicional vinho de uva. O Butiá é um exemplo típico<br />
da região sul do Brasil. Esta fruta possui coloração amarela e polpa fibrosa, além de características sensoriais<br />
de sabor que misturam acidez e doçura acentuada. Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de<br />
um fermentado de butiá e o estudo dos compostos responsáveis pelo aroma da bebida. Microfermentações<br />
foram realizadas às temperaturas de 10 e 20 ºC com 7 e 2 dias de maceração. O fermentado apresentou<br />
graduação alcoólica média de 11 °GL, acidez total titulável variando entre 0,68% (M2T10) e 1,16% (M7T20)<br />
e acidez volátil entre 0,06% (D2T10) e 0,11% (M7T20). Com relação aos açucares redutores e ao pH os<br />
valores variaram de 0,93 a 1,29 g/l e de 3,83 a 3,95 respectivamente. Foi utilizada a técnica de microextração<br />
em fase sólida no headspace para a extração dos compostos voláteis minoritários do fermentado de butiá,<br />
empregando a fibra DVB/CAR/PDMS. Dez mililitros de amostra foram extraídos à 35 ºC por 45 minutos,<br />
sendo adicionados de 30% de NaCl e mantidos sob agitação. A fração volátil foi analisada em GC-FID e<br />
GC/MS, possibilitando a quantificação e identificação de 60 compostos entre ésteres (27), álcoois (15),<br />
ácidos (11), lactonas (2), aldeídos (1), cetonas (1), terpenos (1). Para os álcoois superiores e demais<br />
compostos, também majoritários, a extração foi realizada direto no headspace estático (HS) da amostra. O<br />
método foi validado de acordo com as seguintes figuras de mérito: linearidade (0,991-0,998), sensibilidade<br />
LD (0,01-0,5) e LQ (0,1-1), precisão, expressa como repetibilidade (6,5-10,9%) e precisão intermediária (7,2-<br />
10,3%) e exatidão (86-96%). O estudo do aroma da bebida, através da GC-O, mostrou que os compostos de<br />
maior contribuição positiva para o aroma foram os ésteres, (hexanoato de etila), seguido do álcool (3-metil-<br />
1-butanol). O ácido hexanóico foi identificado como um potencial off flavor, sendo que, nas fermentações a<br />
20 ºC esses compostos foram encontrados em maior concentração. O teste de aceitabilidade (escala hedônica<br />
estruturada de 9 pontos) mostrou que a aceitabilidade do fermentado foi maior para os tratamentos com<br />
menores concentração de ácido hexanóico, ou seja, os fermentado a temperatura de 10 ºC e com 2 dias de<br />
maceração.<br />
Palavras chave: Fermentados de frutas, butiá, off flavor, SPME, headspace estático.
ABSTRACT<br />
Master Dissertation<br />
Graduate Program in Food Science and Technology<br />
Federal University of Santa Maria<br />
DEVELOPMENT AND CHARACTERIZATION PHYSICOCHEMICAL<br />
AND SENSORY OF JELLY PALM WINE (Butia odorata).<br />
AUTHOR: GABRIELI BERNARDI<br />
ADVISOR: ROGER WAGNER<br />
Date and Presentation Place: Santa Maria, February 27, 2013<br />
Fruits from different biomes haven been studied as a new alternative to the development of alcoholic fermented<br />
beverages besides the traditional grape wine. Jelly palm (butia odorata) is a typical fruit from the southern region<br />
of Brazil. This fruit possess a yellow color, fibrous pulp and a sensorial characteristic that combines sweetness<br />
with acidity. The aim of this work was the development of a fermented beverage and the study of the compounds<br />
responsible for the aroma of the beverage. Microvinifications were conducted at temperatures and 10 and 20 ºC<br />
with 7 and 2 days of maceration time. The fermented beverage showed an average value of 11 GL for alcoholic<br />
graduation. Total acidity ranged between 0.68% (D2T10) and 1.16% (M7T20) and volatile acidity ranged between<br />
0.06% (D2T10) and 0.11% (M7T20). Residual sugar and pH ranged between 0.93 to 1.29 g/l and from 3.83 to<br />
3.95, respectively. The minor volatile compounds of jelly palm wine were extracted using solid-phase<br />
microextraction technique employing a DVB/CAR/PDMS fiber. Ten milliliters of the wine were extracted at 35<br />
°C for 45 minutes, added to 30% NaCl and kept under constant stirring. The volatile fraction was analyzed by GC-<br />
FID and GC-MS allowing the identification and quantification of compounds from esters 60 (27), alcohols (15),<br />
acids (11), lactones (2), aldehydes (1), ketones (1), terpenes (1). For the higher alcohols and other major volatile<br />
compounds, the extraction was performed directly in the static headspace (HS) of the sample. The method used<br />
was validated with respect to lineariry (0.991-0.998), sensitivity LOD (0.01-0.5) and LOQ (0.1-1), precision as<br />
repeatability (6.5-10.9%) and intermediate precision (7.2-10.3%) and accuracy (86-96%). The evaluation of the<br />
jelly palm wine aroma by GC-O showed that the volatile compounds that most contributing to the aroma are, esters<br />
(ethyl hexanoate) and alcohols (3-methyl-1-butanol). The acid, hexanoic acid was described as a potential off<br />
flavor having a higher concentration in the fermentations at 20 ºC. Sensory analysis showed that the acceptability<br />
of the beverages were higher for those fermented at 10 ºC that possess the lower concentrations of the hexanoic<br />
acid.<br />
Keywords: Wine fruits, jelly palm, off flavor, SPME, static headspace
MANUSCRITO 1<br />
LISTA DE TABELAS<br />
TABLE 1 - General composition of jelly palm wine ............................................................... 52<br />
TABLE 2 - Performance parameters of the HS-GC method for volatile compounds in model<br />
wine. ......................................................................................................................................... 52<br />
TABLE 3 - Parameters analyzed in the extraction of volatile compounds of jelly palm wine<br />
expressed as total area of the peaks and number of peaks of the chromatograms. .................. 53<br />
TABLE 4 - Odor active and non-active compounds in jelly palm wine detected by FID and<br />
Olfactometry with retention index, odor descriptors and mean of concentration. ................... 54<br />
MANUSCRITO 2<br />
TABLE 1 - Effect of maceration time and temperature on the general composition of jelly palm<br />
wine. ......................................................................................................................................... 74<br />
TABLE 2 - Mean concentrations (µ/l) of volatile compounds of jelly palm wine according to<br />
the applied treatments ............................................................................................................... 74<br />
TABLE 3 - Mean values assigned by consumers for the five samples of jelly palm wine, using<br />
a hedonic scale of nine points. .................................................................................................. 76
LISTA DE ILUSTRAÇÕES<br />
FIGURA 1 - Dispositivos empregados para extração por SPE, a) cartucho b) disco de extração.<br />
.................................................................................................................................................. 18<br />
FIGURA 2 - Principio do equilíbrio termodinâmico entre as fases para extração no headspace<br />
estático. ..................................................................................................................................... 19<br />
FIGURA 3 - Ilustração do processo de extração por microextração em fase sólida (SPME) e<br />
dessorção da fibra em cromatógrafo gasoso. ............................................................................ 20<br />
MANUSCRITO 1<br />
FIGURE 1 - Scheme of the gas chromatograph equipped with the olfactometric detector. ... 41<br />
FIGURE 2 - a) Chromatogram (FID) of the volatile compounds of jelly palm wine by HS-<br />
SPME extraction. b) Consensus aromagram of jelly palm wine. Peaks labeled with small letters<br />
were not identified by FID........................................................................................................ 53<br />
MANUSCRITO 2<br />
FIGURE 1 - a) Score plot of principal component analysis of the volatile composition of jelly<br />
palm wine submitted to different treatments. b) Loading plots of principal component analysis<br />
of the volatile composition of jelly palm wine. ........................................................................ 77<br />
FIGURE 2 - Consumer’s preference with respect to the flavor of jelly palm wine. 9, like<br />
extremely; 8, like very much; 7, like moderately; 6, like slightly; 5, neither like not dislike; 4,<br />
dislike slightly; 3, dislike moderately; 2, dislike very much; 1, dislike extremely. ................. 78<br />
FIGURE 3 - Consumer’s preference with respect to aroma of jelly palm wine. 9, like<br />
extremely; 8, like very much; 7, like moderately; 6, like slightly; 5, neither like / not dislike; 4,<br />
dislike slightly; 3, dislike moderately; 2, dislike very much; 1, dislike extremely. ................. 78<br />
FIGURE 4 - Consumer’s preference with respect to general acceptability of jelly palm wine.<br />
9, like extremely; 8, like very much; 7, like moderately; 6, like slightly; 5, neither like not<br />
dislike; 4, dislike slightly; 3, dislike moderately; 2, dislike very much; 1, dislike extremely. 79<br />
FIGURE 5 - Consumer purchasing intention for Jelly palm wine. 1 definitely would buy; 2<br />
probably would buy; ................................................................................................................. 79
LISTA DE ABREVIATURAS<br />
ATT – Acidez total titulável<br />
CAR - Carboxen<br />
CW - Carbowax<br />
DVB - Divinilbenzeno<br />
GC‐FID - Cromatografia a gás com detecção por ionização em chama do inglês Gas<br />
Chromatography equipped with a Flame Ionization Detection<br />
GC-MS - Cromatógrafia a gás acoplado a um espectrômetro de massas do inglês Gas<br />
Chromatography coupled to Mass Spectometry<br />
GC‐O - Cromatógrafia em fase gasosa hifenada à olfatometria do inglês Gas Chromatography<br />
olfactometry<br />
m/z - Razão massa/carga<br />
PDMS - Polidimetilsiloxano<br />
SDE - Extração e destilação simultânea do inglês, Simultaneous destillation extraction<br />
SPE - Extração em fase sólida do inglês, Solid phase extraction<br />
SPME - Microextração em fase sólida do inglês, Solid phase microextraction.<br />
pH - Potencial hidrogeniônico
SUMÁRIO<br />
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 12<br />
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................... 12<br />
2.1 Butiá ............................................................................................................................. 13<br />
2.2 Fermentados de frutas ............................................................................................... 13<br />
2.3 Análise dos Compostos Voláteis ................................................................................ 14<br />
2.4 Métodos de “Análise Total” ....................................................................................... 16<br />
2.4.1 Extração líquido-líquido ............................................................................................. 16<br />
2.4.2 Extração em fase sólida – SPE ................................................................................... 17<br />
2.5 Análises do Headspace ................................................................................................ 18<br />
2.5.1 Headspace Estático..................................................................................................... 19<br />
2.5.2 Headspace Dinâmico .................................................................................................. 19<br />
2.5.3 Microextração em fase sólida (SPME)....................................................................... 20<br />
2.6 Separação e Quantificação dos Compostos Voláteis ............................................... 21<br />
2.7 Análise do impacto odorífero dos compostos voláteis ............................................. 23<br />
2.8 Análise sensorial ......................................................................................................... 25<br />
2.9 Análise de Componentes Principais........... ................................................................... 25<br />
3 ARTIGOS CIENTÍFICOS……………… ................................................................... 27<br />
3.1 Manuscrito 1 - Analysis of volatile compounds of jelly palm wine ........................... 27<br />
3.2 Manuscrito 2 - Effect of temperature and maceration time on volatile composition and<br />
sensory acceptation of jelly palm wine................................................................................ 51<br />
4 DISCUSSÃO GERAL .................................................................................................. 75<br />
5 CONCLUSÕES ............................................................................................................. 77<br />
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................ 79
12<br />
1 INTRODUÇÃO<br />
O Brasil produz frutas tropicais, subtropicais e temperadas, graças a sua extensão<br />
territorial, posição geográfica, condições climáticas e de solo. É o 3º maior produtor de frutas<br />
com 42,6 milhões de toneladas produzidas em 2,2 milhões de hectares distribuídos pelo país.<br />
No primeiro semestre de 2009, a procura por frutas brasileiras cultivadas dentro das regras de<br />
sustentabilidade e preservação do meio ambiente, entre elas açaí e acerola, apresentou um<br />
crescimento de 59% nas exportações brasileiras destas frutas em relação ao ano anterior<br />
(FRANÇA, 2009). Avanços na economia e o aumento no poder aquisitivo dos brasileiros<br />
proporcionaram uma mudança de comportamento dos consumidores. Produtos diferenciados e<br />
que acrescentam qualidade de vida e bem estar são o principal foco desse público. Além dos<br />
avanços na economia, a agroindustrialização das frutas também ganha destaque como uma das<br />
causas para o aumento dessa demanda, sendo que, no Brasil existe uma abundância de frutas<br />
nativas com potencial para serem utilizadas na indústria alimentícia (DUARTE et al., 2010). O<br />
surgimento de produtos industrializados a partir destas frutas agrega valor à matéria–prima<br />
proporcionando a inserção e a popularização das mesmas no mercado. Adicionalmente, a<br />
agroindústria estimula a competitividade, sendo também uma maneira de expandir as<br />
exportações de produtos não perecíveis, atendendo demandas internacionais importantes. No<br />
Rio Grande do Sul, existem projetos de pesquisa e extensão, como é o caso da Embrapa com o<br />
“Projeto Sabor Nativo” o qual visa estimular o crescimento agroindustrial proporcionando o<br />
desenvolvimento de diversos produtos a partir de matérias-primas pouco exploradas como:<br />
araçá, pitanga, butiá, flor de feijoa e pequenas frutas de clima temperado como a amora e o<br />
mirtilo (EMBRAPA, 2011). Além disso, nota-se também a importância do cultivo de frutos<br />
nativos para o desenvolvimento socioeconômico regional, como pode ser caracterizado com o<br />
cultivo e processamento do Butiá na cidade de Giruá (região Noroeste do Rio Grande do Sul).<br />
A fruta inspira nessa cidade um evento típico “Festa do Butiá”, o qual conta com o incentivo<br />
municipal e beneficia pequenos agricultores familiares que buscam fontes econômicas<br />
alternativas (PORTAL MUNICIPAL, 2010).<br />
Dentro deste contexto, o desenvolvimento de novos produtos apresenta-se também<br />
como uma maneira de diminuir as perdas nos períodos de safra e, em alguns casos, valorizar<br />
comercialmente as porções da fruta de menor valor agregado. Um bom exemplo pode ser<br />
atribuído ao fermentado de caju, o qual é produzido a partir do pedúnculo (pseudofruto) do<br />
fruto, onde a castanha é o produto alvo do cultivo (NETO et al., 2006). Segundo a legislação
13<br />
brasileira, o fermentado de fruta é definido como uma bebida com graduação alcoólica que<br />
varia entre quatro e quatorze por cento em volume (20 °C) e deve ser obtido pela fermentação<br />
alcoólica do mosto da fruta sã, fresca e madura de uma única espécie, do respectivo suco<br />
integral ou concentrado, ou polpa, que poderá nestes casos, ser adicionado de água (BRASIL,<br />
2009). O aroma é, sem dúvida, um dos principais parâmetros de qualidade não apenas de<br />
vinhos, mas de bebidas fermentadas em geral.<br />
A fermentação alcoólica é um processo biológico no qual utiliza açúcares, como a<br />
glicose, frutose e sacarose, que são convertidos em energia celular com produção de etanol e<br />
dióxido de carbono como resíduos metabólicos. Durante esse processo, uma série de compostos<br />
com impacto odorífero é formada por diferentes vias metabólicas (OUGH, 1992). Em suma, o<br />
desenvolvimento de um novo produto, como o fermentado de butiá, envolve as etapas de<br />
otimização de processo de fabricação, e o produto obtido deve ser devidamente caracterizado<br />
em diversos parâmetros de qualidade entre eles, composição físico-química, bem como,<br />
composição de voláteis e a identificação dos voláteis de impacto odorífero. Neste sentido, o<br />
objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de um produto fermentado de butiá e o estudo de<br />
alguns parâmetros que possam influenciar na sua qualidade, principalmente no aroma.<br />
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA<br />
2.1 Butiá<br />
O Butiá, fruto da família arecaceae, é uma fruta de coloração amarela, polpa fibrosa e<br />
de composição interessante. A família arecaceae é uma das famílias de plantas mais utilizadas<br />
em todo o mundo, devido à notável importância econômica de suas espécies na produção de<br />
alimentos e produtos agroindustriais, destacando-se também a utilização do butiazeiro para<br />
ornamentação e artesanato (BÜTTOW et al., 2009). O gênero Butia apresenta diferentes<br />
espécies e subespécies que no Brasil ocorrem em Minas Gerais, Bahia, Paraná, Mato Grosso,<br />
São Paulo, Santa Catarina e Rio Grande do Sul (HENDERSON, et al., 1995; LORENZI et al.,<br />
2004). Especificamente no estado do Rio Grande Sul ocorre cinco dessas espécies, sendo: B.<br />
capitata Becc., B. eriospatha, Becc., B. odorata Becc., B. paraguayensis e B. yatay Becc.<br />
(ROSSATO et al., 2007).<br />
As palmeiras do gênero butia são plantas de altura moderada, com acaules de caule<br />
subterrâneo, curto e grosso. As folhas são arqueadas, com pecíolo e bainha indistintos. As<br />
inflorescências são interfoliares, ramificadas com bráctea peduncular, lisa ou estriada
14<br />
superficialmente (LORENZI et al., 2004). Os frutos do butiazeiro são providos de coloração<br />
que variam entre tons de amarelo e vermelho na maturidade, com diâmetro médio de 1,7 a 4,2<br />
cm, mesocarpo carnoso, endocarpo contendo 1 a 3 lóculos e 3 poros próximos à sua porção<br />
mediana, e semente com abundante endosperma (HENDERSON et al., 1995; LORENZI et al.,<br />
2004). A maturação de frutos geralmente ocorre de novembro a maio, tendo seu pico no verão,<br />
no mês de fevereiro (ROSA et al., 1998). Sensorialmente os frutos são descritos como globosos,<br />
doce-acidulados, suculentos e com sabor e aroma intensos. Tais características tornam os frutos<br />
de butiá atrativos para o consumo tanto in natura ou como matéria-prima na produção de sucos,<br />
licores, geléias, sorvetes, bolos, entre outros produtos (BÜTTOW, 2009).<br />
As características físico-químicas do butiá e a caracterização dos compostos voláteis<br />
presentes na fruta foram reportadas por Ferrão (2012). Os valores médios encontrados para<br />
sólidos solúveis totais (12,39 °Brix), acidez total (1,60 eq. g% de ác. cítrico) e pH (3,50)<br />
demostram a viabilidade da utilização do butiá para o desenvolvimento de um fermentado.<br />
Além disso, a composição volátil da fruta apresentou compostos comumente encontrados em<br />
matérias-primas já utilizadas para produção de vinhos de frutas, como por exemplo, hexanoato<br />
de etila e (E)3-hexenoato de etila, encontrados também na composição volátil de abacaxi (ELSS<br />
et al., 2005) e de goiaba (NISHIMURA et al., 1989).<br />
2.2 Fermentados de frutas<br />
Tradicionalmente, os vinhos são preparados pela fermentação de mostos de uvas, que<br />
produzem etanol e outros produtos metabólicos, entre eles alguns compostos voláteis<br />
responsáveis pela composição do aroma final da bebida. No entanto, nos últimos anos, muitos<br />
autores tem reportado a utilização de outras frutas, que não a uva, para a produção de bebidas<br />
fermentadas, popularmente chamadas de vinhos de frutas. Comercialmente todos os produtos<br />
que não tenham tido a uva como matéria prima, não podem receber o nome de vinho. Para que<br />
isso ocorra o rótulo deve conter a designação específica da matéria prima usada, usando-se<br />
assim o nome da fruta associada à palavra vinho, por exemplo, vinho de laranja ou vinho de<br />
maçã. Segundo a legislação brasileira, o fermentado de fruta é definido como uma bebida com<br />
graduação alcoólica que varia entre quatro e quatorze por cento em volume (20 °C) e deve ser<br />
obtido pela fermentação alcoólica do mosto da fruta sã, fresca e madura de uma única espécie,<br />
do respectivo suco integral ou concentrado, ou polpa, que poderá nestes casos, ser adicionado<br />
de água (BRASIL, 2009).
15<br />
A utilização de frutas para produção de vinhos de frutas já vem sendo estudada há<br />
bastante tempo, com Amerine, Berg e Cruess, em 1972, utilizando amora para produção de<br />
bebida fermentada e com With e Lodge, em 1982, na utilização de kiwi. Além do<br />
desenvolvimento das bebidas, normalmente costuma-se realizar a caracterização da bebida<br />
utilizando os parâmetros comumente associados à qualidade de vinhos. Sendo assim, na<br />
determinação dos parâmetros de qualidade dos fermentados de frutas, as análises físicoquímicas<br />
como, pH, teor alcoólico, açúcar redutor, acidez total titulável e acidez volátil são as<br />
mais utilizadas. Entretanto, nos últimos anos, alguns autores tem explorado de maneira intensa<br />
a utilização de frutas exóticas brasileiras, normalmente desconhecidas do público em geral, para<br />
produção de bebidas fermentadas e utilizam a caracterização da fração volátil como um dos<br />
principais parâmetros de qualidade. Alguns dos mais recentes trabalhos publicados utilizam<br />
guabiroba, cupuaçu, cacau e umbu (DUARTE et al., 2010), cajá (DIAS et al., 2003) e caju<br />
(GARRUTI et al., 2006). Mais recentemente Pino e Queris reportaram a composição volátil de<br />
fermentado de abacaxi, manga e goiaba (PINO & QUERIS, 2010; PINO & QUERIS, 2011a;<br />
PINO & QUERIS, 2011b).<br />
Dentre os principais compostos voláteis reportados nos trabalhos que utilizam as frutas<br />
para o desenvolvimento de fermentados estão os ésteres como, butirato de etila, hexanoato de<br />
etila e octanoato de etila seguidos pelos álcoois, álcool isoamílico, álcool feniletílico e 2,3-<br />
butanodiol e os ácidos, acético, ácido butanóico e octanóico. A origem destes compostos, assim<br />
como nos vinhos de uva, varia de acordo com a matéria prima, o tipo de levedura utilizada e as<br />
reações que ocorrem no meio durante a fermentação (TAT et al., 2004; UBEDA et al., 2002).<br />
Além de servir de fonte para o estudo de diferentes técnicas de extração, caminhos metabólicos<br />
para formação de compostos voláteis e caracterização de compostos de aroma, as bebidas<br />
fermentadas de frutas constituem produtos promissores devido à tendência de aceitação em<br />
pesquisas de consumo, além de contribuírem para a redução de perdas pós-colheita de frutos<br />
perecíveis (MUNIZ et al., 2002). Apesar de muitas frutas terem sido exploradas neste sentido,<br />
na literatura não foram encontrados trabalhos reportando o desenvolvimento de fermentado de<br />
butiá, sua caracterização físico-química e sensorial.<br />
2.3 Análise dos Compostos Voláteis<br />
A fermentação alcoólica leva a formação de uma série de produtos, além do etanol sendo<br />
que, a composição e a concentração desses compostos podem variar amplamente de maneira<br />
que alguns destes podem aparecer em altas concentrações, enquanto uma grande parte se
16<br />
apresenta em níveis muito baixos, até mesmo abaixo de ng/l. Estes compostos, apesar de<br />
minoritários podem influenciar no aroma da bebida de forma muito significativa<br />
(WARDENCKI & PLUTOWSKA, 2008). Uma maneira de explorar essas informações é<br />
através da avaliação ou análise da fração volátil do fermentado.<br />
A análise de compostos voláteis se inicia na etapa de isolamento da matriz de não<br />
voláteis, empregando técnicas que envolvem a análise total ou análise do headspace (espaço<br />
confinado sobre a amostra) a fim de eliminar interferentes e ajustar a concentração acima do<br />
limite detectável pelos instrumentos (FRANCO & JANZANTTI, 2004). Diversos trabalhos na<br />
literatura reportam o desenvolvimento de métodos para determinar a composição volátil de<br />
fermentados de frutas, juntamente com a identificação dos compostos relevantes para<br />
caracterização do aroma tais como: kiwi (SOUFLEROS et. al., 2001), cajá (DIAS, SCHWAN<br />
& LIMA, 2003), cacau (DIAS et al., 2007), laranja (SELLI et. al., 2008), cacau, cupuassu,<br />
gabiroba, jaboticaba e umbu (DUARTE et. al., 2010) e manga (PINO et. al., 2010).<br />
Independente do método utilizado, o extrato isolado deve ser representativo da amostra, sendo<br />
assim a escolha do método torna-se uma etapa determinante na análise. FRANCO &<br />
JANZANTTI (2004) reportaram a existência de duas abordagens para o isolamento dos<br />
compostos voláteis de um alimento. A primeira, denominada de Análise Total ou Métodos<br />
Tradicionais, compreende a análise de todos os componentes voláteis presentes na matriz<br />
alimentícia, enquanto a segunda, que é comumente conhecida como Análise do Headspace e<br />
envolve apenas a análise dos componentes voláteis presentes na fase gasosa em equilíbrio sobre<br />
a amostra (líquida ou sólida), assim representando mais fielmente o que é percebido pelo olfato.<br />
2.4 Métodos de “Análise Total”<br />
Pertencentes ao grupo das “análises totais” ou métodos tradicionais estão às técnicas de<br />
extração líquido-líquido, extração em fase sólida – SPE, destilação por vapor, destilação<br />
seguida pela SPE e o sistema de extração‐destilação simultânea (SDE) entre outras. Apesar de<br />
sua ampla aplicação, essas técnicas apresentam uma desvantagem em comum, que é a<br />
destruição potencial dos componentes de aroma e ou produção de artefatos (ROBARDS et al.,<br />
2000; MAMEDE & PASTORE, 2004). Abaixo são descritas algumas das técnicas tradicionais<br />
para extração de compostos voláteis.<br />
2.4.1 Extração líquido-líquido
17<br />
A extração líquido-liquido, também conhecida como extração por solvente, foi um dos<br />
primeiros métodos utilizados para recuperar compostos de aroma em alimentos, sendo usada<br />
também pelas indústrias de perfumaria e de cosméticos. A extração é feita pela adição e<br />
agitação de um solvente imiscível na matriz e a extração acontece pela passagem do analito<br />
para o solvente imiscível (QUEIROZ et al., 2001). Após a agitação são formadas duas fases<br />
líquidas que são então separadas. A fase contendo o analito pode ser evaporada, no caso de<br />
solventes orgânicos, ou ainda, ser analisada diretamente no sistema cromatográfico. Esta<br />
técnica utiliza tanto solventes puros, quanto misturas. Os solventes mais utilizados são<br />
diclorometano, éter etílico, éter de petróleo, pentano e o hexano (MARSILI, 1997). Diversos<br />
trabalhos reportam a utilização desta técnica para análise de compostos voláteis (PINO &<br />
VILLAREAL, 1994; LAMIKANRA et al, 1996; PINO et al., 2011a). A vantagem da técnica<br />
está no fato de que todos os compostos voláteis (baixa, média e alta volatilidade) podem ser<br />
analisados em uma única etapa de extração (MAMEDE & PASTORE, 2004). Entretanto, a<br />
técnica apresenta algumas limitações como a formação de emulsões, principalmente se<br />
compostos não voláteis estiverem presentes na amostra. Além disso, a técnica de extração<br />
líquido-líquido utiliza grande quantidade de solvente orgânico para a extração dos compostos<br />
voláteis dos alimentos, sendo necessária posterior concentração do extrato por calor, podendo<br />
acarretar mudanças na composição de voláteis, além da extração de compostos não voláteis.<br />
Apesar da sua simplicidade, a tendência moderna é substituir a extração líquido‐líquido por<br />
outras técnicas, devido à alta pureza dos solventes que são requeridos para análise de traços, a<br />
necessidade de redução, no ambiente, de solventes orgânicos e o risco a saúde associado a sua<br />
manipulação, além de, não ser aplicada para análise de compostos voláteis em amostras vivas<br />
(AUGUSTO et al., 2003).<br />
2.4.2 Extração em fase sólida – SPE<br />
A SPE consiste em uma técnica de separação líquido-sólido bastante empregada em<br />
matrizes complexas (QUEIROZ et al., 2001). A extração por meio desta técnica é baseada nos<br />
mecanismos de separação da cromatografia líquida de baixa pressão (POOLE et al., 2000;<br />
LANÇAS, 2004) e dependendo do adsorvente e do modo como é empregada, a SPE pode ser<br />
dividida em modo reverso, modo normal e troca iônica (ORLANDO et al., 2009). Vários são<br />
os dispositivos empregados para SPE, a instrumentação básica empregada é extremamente<br />
simples podendo, porém, ser sofisticada, dependendo do problema a ser resolvido e do grau de
18<br />
automação desejado (LANÇAS, 2004). Dentre os dispositivos os mais utilizados são os<br />
cartuchos e os discos de extração (Fig. 1).<br />
Figura 1 - Dispositivos empregados para extração por SPE, a) cartucho b) disco de extração (Fonte:<br />
ORLANDO et al., 2009)<br />
Em ambos os dispositivos, a amostra é forçada a passar pelo material extrator pela<br />
aplicação de pressão em uma das extremidades do cartucho ou disco. Para realizar a análise<br />
simultânea de várias amostras e extrações mais rápidas, geralmente são utilizados sistemas<br />
extratores com vácuo. As etapas da extração resumem-se na ativação do sorvente, percolação<br />
da amostra/sorção dos analitos no sorvente, eliminação dos interferentes da matriz (clean up),<br />
eluição dos analitos e posterior concentração do composto de interesse (LANÇAS, 2004;<br />
CALDAS et al., 2011). Apesar de bastante utilizada a SPE também agrega a maior desvantagem<br />
dentro das análises totais, que é o fato de as técnicas serem consideradas “sujas” para a análise<br />
de aroma. Os compostos não voláteis podem ser eluídos ou extraídos junto com os compostos<br />
voláteis, contaminando ou degradando-se no injetor do cromatógrafo gasoso, o que pode causar<br />
danos ao equipamento e originar artefatos (FRANCO & JANZANTTI, 2004)<br />
2.5 Análises do Headspace<br />
As técnicas de amostragem de voláteis mais recentes utilizam pouco ou nenhum<br />
solvente orgânico. As técnicas de análise do headspace podem ser divididas em análises do<br />
headspace estático e análise do headspace dinâmico (KOLB, 1999). Em ambos os casos, o<br />
princípio fundamental é o mesmo: analise da fase gasosa em equilíbrio com a fase líquida ou<br />
sólida da amostra.
19<br />
2.5.1 Headspace Estático<br />
Na técnica que envolve a extração direta no headspace estático (direct headspace), a<br />
amostra é mantida em um recipiente fechado até que se atinja um equilíbrio termodinâmico dos<br />
compostos voláteis entre a fase líquida ou sólida e a fase gasosa, a uma determinada<br />
temperatura (KOLB, 1999). Uma alíquota da fase gasosa é recolhida e injetada no cromatógrafo<br />
gasoso. Devido às pressões parciais significativamente menores do que a pressão parcial do<br />
vapor de água, os analitos de interesse estão em concentrações geralmente baixas, obtendo-se<br />
cromatogramas pobres e limitados a poucos compostos voláteis (THOMAZINI & FRANCO,<br />
2000). No headspace estático podem ser realizadas as análises diretamente no headspace da<br />
matriz por injeção direta do ar confinado.<br />
Figura 2. Princípio do equilíbrio termodinâmico entre as fases para extração no headspace estático.<br />
Fonte: Adaptado de Technical Guide for Static Headspace Analysis Using GC, Restek Corp. (2000)<br />
2.5.2 Headspace Dinâmico<br />
O headspace dinâmico é um método muito empregado para a análise de compostos<br />
voláteis em alimentos. Neste método, há uma coleta contínua dos compostos voláteis, realizada<br />
por um sistema a vácuo ou pela passagem de um gás inerte (FRANCO & RODRIGUEZ-<br />
AMAYA, 1983). Os compostos voláteis retidos no polímero podem ser eluídos com solvente<br />
ou dessorvidos diretamente no injetor do cromatógrafo. A técnica de headspace dinâmico,<br />
desde que padronizadas as condições de isolamento, permite a realização de análise qualitativa,<br />
quantitativa e sensorial dos compostos voláteis responsáveis pelo aroma do alimento (BASTOS<br />
et al, 1998). Essa técnica foi bastante utilizada para a análise do aroma de alimentos como uva
20<br />
(SALINAS et al., 1999), suco de laranja (BYLAITE & MEYER, 2005) e mangaba<br />
(NOGUEIRA & SAMPAIO, 2006)<br />
2.5.2 Microextração em fase sólida (HS-SPME)<br />
A extração dos voláteis por SPME no headspace baseia-se na sorção dos analitos<br />
presentes no headspace da amostra, por uma fase extratora imobilizada na superfície de uma<br />
fibra de sílica fundida (PAWLISZYN, 1990). As fibras são recobertas com fase polimérica<br />
líquida ou com uma fase sólida porosa (mais exatamente, polímeros sólidos dispersos em uma<br />
matriz líquida). Para fases poliméricas líquidas, assim como polidimelsiloxano (PDMS) e o<br />
poliacrilato (PA), o mecanismo físico-químico responsável pela extração é a partição. Quando<br />
sólidos porosos recobrem a fase líquida, as fibras são chamadas mistas, assim como<br />
Divinilbenzeno-PDMS, Carboxen/PDMS, Carbowax-DVB e Carbowax-resina modelada (TR),<br />
e neste caso o processo também envolve, principalmente, a adsorção dos analitos (AUGUSTO<br />
& VALENTE, 2000). O processo de extração por SPME e posterior dessorção da fibra no<br />
cromatógrafo é ilustrado na Figura 2. Através da Figura 3, podemos visualizar que o processo<br />
de extração inicia-se quando a agulha do suporte de SPME (holder), com a fibra retraída,<br />
perfura o septo do frasco que contém a amostra. Posteriormente, a fibra é exposta no headspace<br />
da amostra para que ocorra a extração.<br />
Figura 3 – Ilustração do processo de extração por microextração em fase sólida (SPME) e dessorção da<br />
fibra em cromatógrafo gasoso. Fonte: Valente e Augusto (2000)
21<br />
Numa extração por SPME as moléculas do analito têm de se deslocar da matriz e<br />
penetrar no recobrimento e, para isto, resistências a transferências de massa devem ser<br />
vencidas, até que se estabeleça um equilíbrio de partição (ou de adsorção, para o caso de<br />
recobrimentos sólidos) do analito, entre a fibra e o meio que a envolve. A teoria da SPME<br />
baseia-se na cinética de transferência de massa entre as fases e na termodinâmica que descreve<br />
o equilíbrio de partição do analito entre elas (AUGUSTO & VALENTE, 2000).<br />
Em relação às outras técnicas apresentadas, a técnica que envolve a microextração em<br />
fase sólida apresenta algumas vantagens, como a facilidade de extração de compostos voláteis,<br />
rapidez, dispensa o uso de solventes, utiliza pequeno volume de amostra, além de apresentar<br />
alta sensibilidade e baixo custo (PAWLISZYN et al., 1992; KATAOKA et al., 2000). O<br />
isolamento ou extração dos compostos voláteis utilizando a técnica conhecida por SPME,<br />
seguido da análise em sistemas de cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de<br />
massas (GC/MS) tem sido empregadas para caracterizar adequadamente os compostos voláteis<br />
presentes em diversos alimentos, inclusive em fermentados de frutas (AUGUSTO et al., 2000;<br />
JUNQUEIRA et al., 2004; BRAGA, 2007; PINO et al., 2010).<br />
2.6 Separação e Quantificação dos Compostos Voláteis<br />
Independente do método de isolamento dos voláteis aplicado à matriz, a análise do<br />
isolado procede através da introdução do extrato em uma instrumentação analítica que realize<br />
a separação destes compostos, bem com a adequada detecção. O método analítico mais<br />
apropriado para a pesquisa de compostos voláteis é a cromatografia gasosa (GC), uma vez que,<br />
esta possui excelente capacidade de separação (resolução) e extrema sensibilidade<br />
(REINECCIUS, 2006). Na técnica cromatografia se faz necessário o ajuste criterioso das<br />
condições cromatográficas como a velocidade linear, rampa de temperatura e pressão e<br />
temperaturas do injetor e detector para que se tenha a seletividade apropriada no método. Além<br />
disso, o detector utilizado deve ser escolhido de acordo com a amostra a ser analisada e de<br />
acordo com o tipo de resultado (resposta) que se deseja obter (GARRUTI, 2001; WAGNER,<br />
2008; REID, 2003). O cromatógrafo a gás de alta resolução, com coluna capilar e injetor do<br />
tipo split-splitless, acoplado à espectrometria de massas (GC/MS) são os instrumentos mais<br />
requeridos para esta análise por possuir alta resolução e eficiência, possibilitando obter<br />
informações qualitativas e quantitativas (FRANCO & JANZANTTI, 2003). Além disto, o<br />
espectrômetro de massas possui a opção de escolha entre o modo operacional de varredura
22<br />
(SCAN) que coleta espectros para todos os compostos eluídos da coluna, e o sistema operacional<br />
em modo (SIM) com monitoramento de íon selecionado, que possibilita o aumento da<br />
sensibilidade e especificidade da análise quando o composto a ser determinado já é conhecido<br />
(REID, 2003). No caso de uma análise quantitativa dos compostos voláteis de uma matriz<br />
complexa, pode-se obter uma melhor resposta, para a maioria dos compostos orgânicos, através<br />
da utilização de detector FID (REID, 2003; REINECCIUS, 2006). Em ambos os casos, a<br />
identificação dos compostos pode ser feita com a utilização dos índices de retenção, para<br />
comparar a ordem de eluição experimental com a ordem de eluição descrita na literatura em<br />
uma mesma fase estacionária (ADAMS, 1995), além do uso de padrões analíticos, que auxiliam<br />
e eliminam possibilidades equivocadas, aumentando a confiabilidade da identificação<br />
(FRANCO & JANZANTTI, 2004). No caso da espectrometria de massa, as relações<br />
massa/carga (m/z) obtidas nos espectros de massas por ionização por elétrons (EI) a 70 eV, são<br />
utilizadas como informação estrutural na identificação e confirmação dos constituintes voláteis<br />
de uma amostra. Obtendo-se o espectro do composto de interesse, pode-se realizar uma busca<br />
através da similaridade espectral deste, com os espectros armazenados em uma biblioteca de<br />
referência. Com o resultado desta etapa, tem-se o analito tentativamente identificado e com<br />
elevado grau de incerteza sobre a identificação (McLAFFERTY, 1993).<br />
Definido o método, as condições cromatográficas e o detector ou detectores a serem<br />
utilizados é necessário estabelecer os critérios de quantificação que serão adotados. Na análise<br />
de compostos voláteis, muitas vezes se trabalha com um número muito grande de compostos,<br />
desta forma, validar um método de separação se torna uma alternativa que requer<br />
instrumentação adequada e disponibilidade de padrões analíticos de alta pureza para cada um<br />
dos compostos. Em alguns casos, a quantificação pode ser feita com a adição de um padrão<br />
interno de concentração conhecida à amostra. Assim, a quantificação se dá pela relação entra a<br />
área do padrão interno e a área do pico cromatográfico do composto de interesse e neste caso,<br />
assume-se o fator de resposta igual a um entre o padrão interno os analitos. Quando os padrões<br />
analíticos dos compostos de interesse estão disponíveis, a etapa de quantificação pode ser<br />
realizada através da validação externa individualmente a cada composto. Validação é uma<br />
avaliação a qual o método analítico é submetido para garantir que as informações geradas são<br />
confiáveis e reprodutíveis (RIBANI et al., 2004). Em um processo de validação alguns<br />
parâmetros, normalmente encontrados para validação de métodos de separação analíticos,<br />
devem ser considerados. Tais parâmetros são: seletividade; linearidade e faixa de aplicação;<br />
precisão; exatidão; limite de detecção; limite de quantificação e robustez (CHAN, 2008;<br />
RIBANI et al., 2004). A seletividade garante que o pico de resposta seja exclusivamente do
23<br />
composto de interesse. Se a seletividade não for assegurada, a linearidade, a exatidão e a<br />
precisão estarão comprometidas (RIBANI et al., 2004). A linearidade corresponde à capacidade<br />
do método em fornecer resultados diretamente proporcionais à concentração da substância em<br />
exame, dentro de uma determinada faixa de aplicação. A correlação entre o sinal medido (área<br />
ou altura do pico) e a massa ou concentração da espécie deve ser linear. Para verificar essa<br />
correlação, estabelece-se uma relação matemática que pode ser expressa como uma equação da<br />
reta, também chamada curva analítica (LANÇAS, 2009; RIBANI et al., 2004). A precisão<br />
representa a dispersão de resultados entre ensaios independentes, repetidos de uma mesma<br />
amostra, amostras semelhantes ou padrões, sob condições definidas. A precisão, em validação<br />
de métodos é considerada em três níveis diferentes: repetitividade; precisão intermediária e<br />
reprodutibilidade e os resultados podem ser expressos através da estimativa do desvio padrão<br />
relativo (RSD), também conhecido como coeficiente de variação (CV). Para avaliar o grau de<br />
concordância entre os resultados individuais encontrados em um ensaio e um valor de<br />
referência aceito como verdadeiro faz-se avaliação da exatidão do método. Os processos mais<br />
utilizados para avaliar a exatidão de um método são: materiais de referência; comparação de<br />
métodos; ensaios de recuperação e adição padrão. Os limites de quantificação (LQ) e detecção<br />
(LD) representam, respectivamente, a menor concentração da substancia que pode ser medida<br />
utilizando um determinado método experimental e a menor concentração da substância que<br />
pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada (CHAN, 2008). De maneira geral, a<br />
validação é específica e é influenciada pelo procedimento analítico utilizado, pela natureza e<br />
concentração do composto de interesse e pela matriz.<br />
2.7 Análise do impacto odorífero dos compostos voláteis<br />
É sabido que, na maioria dos alimentos, o aroma consiste na combinação de muitos<br />
compostos voláteis, sendo que, apenas umas pequenas parcelas destes compostos são<br />
sensorialmente relevantes (BLANK, 1996). Na pesquisa do sabor, a avaliação sensorial dos<br />
compostos voláteis, após a separação cromatográfica, é feita utilizando a técnica olfatométrica.<br />
A cromatografia gasosa hifenada a olfatometria (GC-O) é o termo usado para descrever as<br />
técnicas que utilizam julgadores para avaliar os compostos voláteis separados pela coluna<br />
cromatográfica. Na técnica cromatográfica é possível a detecção e a quantificação dos<br />
compostos presentes na amostra, entretanto, a quantificação, expressa em função da área do<br />
pico no cromatograma, não traduz a contribuição real da substância no aroma do produto<br />
(WARDENCKI & PLUTOWSKA, 2008). O ser humano tem a capacidade de detectar os
24<br />
compostos odoríferos que eluem do efluente cromatográfico, além de mensurar a duração<br />
(início ao fim) de cada odor, quantificar sua intensidade e descrever sua qualidade, uma vez<br />
que o nariz humano é muito mais sensível aos compostos odoríferos do que vários detectores<br />
instrumentais (DELAHUNTY et al, 2006). Dentre vários métodos existentes para quantificar o<br />
impacto sensorial dos efluentes, pode-se dividir os mesmo em três grupos baseados no método<br />
de determinação. Métodos por Diluições Sucessivas, Métodos por Freqüência de Detecção, e<br />
Métodos de Tempo-Intensidade. No grupo dos métodos por diluição destacam-se as técnicas<br />
denominadas CHARM desenvolvida por Acree et al. (1984) e a AEDA desenvolvida por<br />
Ullrich & Grosch (1987). As técnicas de tempo-intensidade podem ser representadas pela<br />
técnica OSME, desenvolvida por Mc Daniel et al. (1990), e a FSCM por Étievant et al. (1999).<br />
Os métodos que utilizam a frequência de detecção do odor como NIF/SNIF (Nasal impact<br />
Frequency/Surface of Nasal Impact Frequency) foram desenvolvidos por Pollien et al. (1997)<br />
e são métodos conhecidos pelo menor consumo de tempo e maior facilidade de aplicação uma<br />
vez que, os métodos de diluição são os que exigem mais tempo para aplicação enquanto os que<br />
utilizam tempo-intensidade apresentam maior dificuldade de aplicação (DELAHUNTY et al.,<br />
2006). É importante ressaltar que, para os métodos que utilizam a frequência de detecção os<br />
julgadores requerem menos treinamento (VAN RUTH & O’CONNOR, 2001). Da Silva et al<br />
(1994) desenvolveram um programa nomeado de Sistema de Coleta de Dados Tempo-<br />
Intensidade (SCDTI), no qual o julgador utiliza um mouse para registrar em uma escala de 9<br />
a 15 pontos, o tempo e a intensidade do odor percebido. As repetições de cada julgador são<br />
analisadas e integradas, formando um aromagrama individual médio para cada julgador, que<br />
são então analisados gerando um aromagrama consensual da equipe. Os compostos de maior<br />
importância odorífera são representados pelos picos mais altos (mais intensos) e/ou de maior<br />
área. O aromagrama consensual pode ser comparado ao cromatograma, permitindo assim,<br />
identificar os compostos importantes para a formação do aroma do alimento, mesmo que estes<br />
estejam em concentrações muito baixas no isolado (LOPEZ et al., 1992; GARRUTI, 2001).<br />
Muitos estudos vêm sendo desenvolvidos utilizando GC-O como uma ferramenta no auxílio da<br />
correlação existente entre dados instrumentais e atributos sensoriais (ZHANG et al., 2011,<br />
SEFTON et al., 2011, SANCHEZ-PALOMO et al., 2011) auxiliando na identificação dos<br />
compostos típicos de aroma em vinhos e fermentados de frutas.
25<br />
2.8 Análise sensorial<br />
A análise sensorial permite determinar diferenças, caracterizar e medir atributos<br />
sensoriais dos produtos ou até mesmo determinar se as diferenças nos produtos são detectadas<br />
e aceitas pelo consumidor. Os métodos sensoriais podem ser divididos em analíticos<br />
(discriminativos e descritivos) e afetivos. Os métodos discriminativos são aqueles que<br />
estabelecem diferenciação qualitativa e/ou quantitativa entre amostras. Nos testes<br />
discriminativos, os provadores de uma equipe atuam como instrumentos para detectar pequenas<br />
diferenças. Os métodos descritivos descrevem qualitativa e quantitativamente as amostras e<br />
utilizam escalas de intervalo ou de proporção. Os métodos descritivos envolvem a detecção e a<br />
descrição dos aspectos sensoriais qualitativos e quantitativos de um produto por painel (grupo<br />
de pessoas que avaliam produtos) treinado. Com relação aos métodos afetivos, os mesmos<br />
acessam diretamente a opinião (preferência e/ou aceitabilidade) do consumidor já estabelecido<br />
ou do consumidor potencial de um produto, a respeito de características específicas desse<br />
produto, ou ideias que o consumidor tenha do produto a ser avaliado; por isso, são também<br />
chamados de testes de consumidor (MEILGAARD et al., 1987; STONE & SIDEL, 1993;<br />
DUTCOSKY, 1996).<br />
Os testes afetivos têm demonstrado êxito no desenvolvimento, melhoria da qualidade e<br />
avaliação do mercado de produtos alimentícios (MEILGAARD et al., 1999). Dentro dos testes<br />
que buscam avaliar a satisfação do consumidor encontra-se a escala hedônica estruturada verbal<br />
de 9 pontos como um dos métodos mais utilizados (MEILGAARD et al., 1987) devido a<br />
simplicidade na sua aplicação. A importância dos dados obtidos na análise sensorial ganha<br />
maior proporção à medida que correlacionamos com outros provenientes de análises<br />
instrumentais (BASTOS et al., 2002; WAGNER, 2008,). As percepções sensoriais dos<br />
consumidores são critérios de relevância na definição da qualidade de um produto, não sendo<br />
o bastante apenas a excelente qualidade química, física e microbiológica deste (MININ, 2006).<br />
2.9 Análise de Componentes Principais<br />
A Análise de Componentes Principais (PCA) é uma técnica de estatística multivariada<br />
que consiste em reescrever o conjunto de variáveis originais da amostra em um sistema de eixo<br />
mais conveniente para a análise dos dados, sendo esse chamado de componente principal. Cada<br />
componente principal é independente entre si, sendo uma combinação linear de todas as<br />
variáveis originais que relêem o máximo de informação da variação total contida nos dados
26<br />
(NETO & MOITA, 1998; MINGOTI, 2005). A técnica de PCA foi introduzida por Karl Pearson<br />
em 1901 e está fundamentada no artigo de Hotelling (1933 apud MINGOTI, 2005). Por ser uma<br />
análise antiga, ela é amplamente utilizada nas mais diversas áreas pesquisa, sendo uma<br />
fundamental ferramenta na análise de dados com um número grande de variáveis, como é o<br />
caso da determinação de compostos voláteis (REINECCIUS, 2006; LOSEKAN, 2012).<br />
Em suma, a revisão da literatura mostrou a importância do aroma como parâmetro de<br />
qualidade de bebidas tais como o vinho de butiá. Consequentemente, a importância da<br />
caracterização físico-química e da determinação da fração volátil. Não existem, na literatura,<br />
trabalhos que reportem o desenvolvimento bem como, a caracterização do ponto de vista físico<br />
químico e sensorial desta bebida.
27<br />
3 ARTIGOS CIENTÍFICOS<br />
3.1 Manuscrito 1 - Analysis of volatile compounds of jelly palm wine<br />
Analysis of volatile compounds of jelly palm wine<br />
(Manuscrito formatado segundo as normas da Revista Food Analytical Methods)
28<br />
ANALYSIS OF VOLATILE COMPOUNDS OF JELLY PALM<br />
WINE<br />
Gabrieli Bernardi; Raquel G. Vendruscolo; Tassiane S. Ferrão; Roger Wagner*<br />
Departamento de Tecnologia e Ciência dos Alimentos – Universidade Federal de Santa Maria<br />
(<strong>UFSM</strong>) - Av. Roraima, nº 1000 – Cidade Universitária, Cep 97105-900, Santa Maria, RS,<br />
Brazil.<br />
e-mail: rogerwag@gmail.com
29<br />
Analysis of volatile compounds of jelly palm wine<br />
Abstract<br />
Two analytical procedures based on headspace solid-phase microextraction (HS-SPME) and<br />
static headspace extraction (HS) were developed in this work for the characterization of minor<br />
and major volatile compounds of jelly palm wine. Volatile compounds were quantitatively<br />
evaluated with GC-FID and identified by GC/MS and GC-O. For the extraction of minor<br />
volatile compounds different sample preparation (SPME fiber type, addition of sodium<br />
chloride, extraction time and temperature) was evaluated to optimize the HS-SPME method.<br />
For the final method, 10 ml of jelly palm wine were placed in a 20 ml headspace vial with<br />
addition of 3 g of NaCl; a divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane SPME fiber was used<br />
for extraction at 35 ºC for 45 min with continuous stirring. A total of 57 volatiles compounds<br />
were identified; most esters, followed by alcohols and acids. The static headspace method, for<br />
major volatile compounds, was validated with respect to linearity (0.991-0.998), sensitivity<br />
LOQ (0.01-0.5) and LOD (0.1-1), precision, as repeatability (6.5-10.9%) and intermediate<br />
precision (7.2-10.3%) and for accuracy (86-96%). The method allows good determination for<br />
7 compounds, propanol, isobutyl alcohol, butyl alcohol, isoamyl alcohol, ethyl hexanoate, ethyl<br />
octanoate and hexanoic acid. GC-O analysis showed that esters were the main contributors for<br />
the positive aroma of the jelly palm wine. Ethyl hexanoate was described as the natural aroma<br />
of jelly palm fruit while hexanoic acid was described as a potential off-flavor to the aroma of<br />
the beverage.<br />
Keywords: Jelly palm, Static headspace, HS-SPME, GC-O
30<br />
Introduction<br />
Jelly palm (butia odorata) is a native fruit very appreciate in the southern region of<br />
Brazil, mainly because of its taste that combines sweetness with acidity. The fruits are mostly<br />
consumed fresh, even though jelly palm has been used in food industry for the production of<br />
ice-cream, jam, and concentrated juice 1,2 . Ferrão 3 has described the physicochemical<br />
characteristics of the jelly palm fruit which confirms the viability its use for wine production.<br />
In the past few years, different authors have reported the use of fruits for wine production 4-10 ,<br />
generally researching the general composition, sensory aspects and volatile compounds<br />
associated to the characteristic odour and flavour of these products. However, there is no<br />
information published to date on the composition and volatiles of jelly palm wine.<br />
Physicochemical characterizations of these beverages through classic methods are normally<br />
used for quality assessment and have a well-established methodology 11 . However, wine aroma<br />
is extremely complex due to the great number of compounds present which may have different<br />
polarities, volatilities and, moreover, may be found in a wide range of concentrations 12 .<br />
Therefore, a major task in flavour studies is to separate the strongly odour active compounds<br />
from the less odourous or odourless component present in wines 7 and furthermore, the<br />
compounds that influences the aroma in a negative way. Headspace analysis (both static and<br />
dynamic) has been widely used for volatile analysis in wine 13 . Static headspace (HS) is<br />
essentially a sampling method that permits analysts to take an aliquot of the gas phase in<br />
equilibrium with a liquid or solid phase 14 . However, static headspace analysis often shows poor<br />
sensitivity for analysis of minor and traces volatile compounds; it may be a powerful tool for<br />
major volatile compounds as the higher alcohols in wine matrices. Solid-phase microextraction<br />
(SPME) is a sample preparation technique using a fused-silica fiber that is coated on the outside<br />
with an appropriate stationary phase 15 . The method is solvent less, saves preparation time and<br />
shows good detection limits 16 . Solid-phase microextraction (SPME) is now widely used for<br />
analysis of aroma volatiles in many food and beverage matrices 17 . Though, besides the<br />
characterization of the volatile composition, in recent years, intensive studies have been carried<br />
out regarding the sensory activity of the individual components of food and alcoholic beverage<br />
odours 18,19 . The smell of an alcoholic beverage is the effect of a large number of chemical<br />
compounds. In this context, the combination of gas chromatography with olfactometric<br />
detection (GC-O) takes place. G-O is based on sensory evaluation of the eluate from the<br />
chromatographic column aimed at discovering the active odour compounds. Determination of<br />
the analyte’s odour is possible thanks to the presence of an olfactometric port, connected in
31<br />
parallel to conventional detectors, such as flame-ionization detector (FID) or mass spectrometer<br />
(MS) 20 .<br />
The existents methods for sensory impact evaluation are generally divided into three<br />
groups, dilution analysis, detection frequency methods and time-intensity methods 21,20 . Among<br />
the methods, detection frequency has a fundamental benefit, their simplicity, owing to which<br />
qualified evaluators are not required. Detection frequency method is based on recording<br />
detected odors from a number of sniffers. The method calculates the peak detection frequencies<br />
from the odors perceived to improve the reliability of aromagrams that show the repeatable and<br />
reproducible abilities 22 . Thus, the aim of this work was the development of a fermented<br />
beverage from jelly palm fruit and the characterization of the wine through classical methods.<br />
Further that, the volatile composition analysis using two headspace methods, HS (majority<br />
compounds) and SPME (minority compounds) and the determination of the volatile compounds<br />
that play a significant role in the aroma of the beverage were determined using a GC-O<br />
technique.<br />
Materials and Methods<br />
Reagents<br />
Chemical standards 1-propanol (99.5%), 2-methyl-1-propanol (99.0%), 1-butanol<br />
(99.4%), 3-methyl-1-butanol (98.5%), ethyl hexanoate (99.9%), ethyl octanoate (99.9%),<br />
hexanoic acid (99.9%) and internal standard 3-octanol (99.0%) were obtained from Sigma<br />
Aldrich (Saint Louis, EUA). Absolute ethanol (99.0%) and anhydrous citric acid were obtained<br />
from Merck (Darmstadt, Germany).<br />
Wine making<br />
Fresh, healthy and ripe fruits of jelly palm, var. Butia odorata (20 kg), were obtained<br />
from the Tuparendi city, northwest of the state of Rio Grande do Sul, Brazil<br />
(27° 45′ 21″ S, 54° 28′ 55″ W). The harvest was between March and April of 2011. The fruits<br />
were peeled manually, cut in pieces and passed through a domestic grinder in order to obtain<br />
the must. The must were diluted (1:1 v/v) with a sucrose solution to adjust the sugar content to<br />
24 ºBrix. An enzyme solution with pectolytic enzyme-Laffort (Petaluma, CA, USA) was added<br />
to a concentration of 3 g/hl and commercial Saccharomyces cerevisiae yeast Actiflore F33-<br />
Laffort (Petaluma, CA, USA) in a concentration of 20 g/hl. Sulfur dioxide, in the form of
32<br />
potassium metabisulfite, was added up to a concentration of 50 mg/l of free SO2 to inhibit<br />
bacterial growth. Vinifications were carried out, in duplicate, in 5 liters flasks in a room<br />
temperature (± 20 °C) and the fermentation was monitored by the daily measurement of Brix<br />
value, and temperature.<br />
The fermentation was considered complete when the Brix level was stable. For the<br />
clarification step was used bentonite (300 mg/l) prepared according to Daudt and Durante 23<br />
(1986), facilitating the sedimentation of non-fermentable solids. After the clarification step the<br />
wines were stored in glass bottles (237 ml) under the temperature of 6 °C until analysis.<br />
General composition of jelly palm pulp and wine<br />
Alcohol, pH, total acidity and volatile acid (such as acetic acid) were performed in the<br />
wine as described by Amerine and Ough 11 . Brix, total acidity and pH were determined in the<br />
jelly palm pulp according to standard methods AOAC 24 .<br />
Analysis of major volatile compounds<br />
For the determination of the major volatile compounds in jelly palm wine a static<br />
headspace extraction technique (HS-GC) was used 25 . Sample preparation was conducted using<br />
a 10 m/l aliquot of wine transferred to a 20 ml glass vial containing 3 g of NaCl; 30 µl of a 3-<br />
octanol internal standard solution (solution 822 mg/l in ethanol) were added to each vial. For<br />
the extraction headspace sampling temperature of 50 °C and headspace equilibrium time of 30<br />
min were used with continuous stirring (500 rpm). The headspace injected volume was 1 ml;<br />
sampling was conducted manually using a gas-tight syringe-Hamilton (Reno, Nevada, USA)<br />
The method was validated with respect to linearity, sensitivity (LOQ) and (LOD), precision<br />
(repeatability and intermediate precision) and accuracy. A model solution (hydroalcoholic<br />
solution) similar to the jelly palm wine was used, (2 g/l of anhydrous citric acid dissolved in<br />
11% ethanol solution) prepared with MilliQ water (Millipore, Bedford, USA) and pH value was<br />
adjusted to 3.8.<br />
Standard concentrations ranged from 0.1 to 50 mg/l (Table 3) were selected to bracket<br />
the concentrations of each individual compound in the wine. For linearity study, a calibration<br />
graph of five points was established for each compound using a pool of seven standard solutions<br />
(propanol, isobutyl alcohol, butyl alcohol, isoamyl alcohol, ethyl hexanoate, ethyl octanoate<br />
and hexanoic acid) in a model wine solution added to 30 µl of the internal standard (3-octanol).
33<br />
The limits of detections (LOD) were visually estimated as the concentration of the analyte that<br />
produce a signal 3 times the noise signal. The quantification limits (LOQ) were obtained<br />
injecting successive dilutions of standards and were calculated as the concentration which<br />
would result in a signal-to-noise ratio higher than or equal to 10. The spiked samples were<br />
injected six times in a single day for the repeatability assay and four times a day on three<br />
different days for the intermediate precision assay. The results were expressed as relative<br />
standard deviation (% RSD). The accuracy of the method was evaluated only in the case of<br />
wine since the calibration lines were built using hydroalcoholic solutions instead of a real<br />
matrix. For accuracy assay a sample of wine was spiked with standards at three levels of<br />
concentration and assessed through recovery studies defined as a percent recovered by the assay<br />
(using the proposed analytical procedure) of known added amount of analyte.<br />
The analysis of the major volatile compounds was conducted using a Varian 3400 Star<br />
gas chromatograph equipped with a Split/Splitless injector in split mode (1:5) and a flame<br />
ionization detector (GC-FID). A ZB-WAX plus capillary column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm<br />
film thickness) (Phenomenex, Palo Alto, CA, USA) was used. The temperature of the injector<br />
and detector was set to 230 and 250 °C respectively. The oven temperature was held at 35 °C<br />
for 2 min and raised from 35 °C to 80 °C at 4 °C/min, then programmed to run from 80 °C to<br />
200 °C at 30 °C/min remaining at 200 °C/min for 5 min. Carrier gas was hydrogen at an initial<br />
flow rate of 2 ml/min (constant pressure of 15 psi).<br />
Analysis of the minor volatile compounds<br />
Experimental parameters were evaluated to determinate the optimal condition for the<br />
extraction of the volatile compounds of jelly palm wine by HS-SPME. First of all, three types<br />
of fibers were tested: (1) polydimethylsiloxane-PDMS (100 µm × 10 mm), (2)<br />
carboxen/polydimethylsiloxane-CAR/PDMS (75 µm × 10 mm) and (3)<br />
divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane-DVB/Car/PDMS (50/30 µm × 20 mm) under<br />
the following conditions (35 °C for 45 min with 30% of salt, NaCl). Fibers were purchased<br />
from Supelco (Bellefonte, PA, USA) and were thermally conditioned in accordance with the<br />
manufacturer’s recommendations, before first use. Secondly, an univariate study was conducted<br />
to optimize the parameters time and temperature of extraction and salt addiction. Headspace<br />
temperatures of 35, 45 and 60 °C and extraction times of 25, 45 e 60 min were evaluated with<br />
continuous stirring (500 rpm). Finally, the influence of the ionic strength by the addition of<br />
NaCl in the sample was observed in the ratio of 0, 15 e 30%. In all experiments a 10 ml aliquot
34<br />
of wine was transferred to a 20 ml glass vial and extract under constant stirring. The mixture<br />
was carefully shaken to dissolve the salt and then left to equilibrate 5 min before each analysis.<br />
Fibers were desorbed in a split/splitless injector at 230 °C for 10 min. After each complete<br />
procedure the extracts were submitted to a chromatographic analysis.<br />
The analysis of the minor volatile compounds was conducted using a Varian 3400 Star<br />
gas chromatograph equipped with a split/splitless injector and a flame ionization detector (GC-<br />
FID). The injector operated in splitless mode for 2 min with a SPME liner (0.75 mm i.d.). The<br />
temperature of the injector and detector was set to 230 and 250 °C respectively. A ZB-WAX<br />
plus capillary column (60 m × 0.25 mm × 0.25 μm film thickness) (Phenomenex, CA, USA)<br />
was used. The oven temperature was held at 35 °C for 2 min and raised to 80 °C at 2 °C/min,<br />
then programmed for raise until 150 °C at 4 °C/min, and then to 230 °C at 8 °C/min and held<br />
in this temperature for 5 min. Carrier gas was hydrogen at an initial flow rate of 2 ml/min<br />
(constant pressure of 30 psi). For optimization study the parameters analyzed were evaluated<br />
according to the profile of volatile compounds, number of peaks and especially the sum of the<br />
total area of the peaks. All analyses were replicated three times. For sample characterization<br />
the relative concentrations of the investigated compounds were calculated by relating the area<br />
of the internal standard (82.2 mg/l) to the area of the compound of interest. Response factor<br />
between internal standard and analytes was assumed as one.<br />
Volatile compounds were identified in a Shimadzu QP2010Plus gas chromatography<br />
coupled to a mass spectrometer GC/MS. GC conditions were the same as those used for the<br />
GC-FID chromatographic analysis with polar column. A non-polar RTX5-ms capillary column<br />
(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) (Restek, Bellefonte, PA) was used for aid the identification.<br />
Helium was the carrier gas at a flow rate of 2 ml/min. MS was operated in electron ionization<br />
mode (EI) at 70 eV, scanning from m/z 35 to 350. The volatile compounds were identified by<br />
comparing their mass spectra to those of commercial spectra databases (NIST05, Wiley) and<br />
by comparing experimental retention index (RI) with the literature. Some compounds were<br />
positively identified by the comparison to authentic standards into the GC-FID and GC/MS<br />
systems.<br />
GC-Olfactometry analyses<br />
For the sensory evaluation of the GC effluents, the Varian 3400 Star chromatograph was<br />
modified similar as described by Garruti, Franco, Da Silva, Janzantti, and Alves et al. 26 (Fig 1.)<br />
Medicinal air (flow rate 3.5 l/min) was used to carry the analytes through the heated transfer
35<br />
line until the sniffing port. The air was previously humidified and kept at 28 °C. A detection<br />
frequency method was used for the evaluation of odours and their relative influence on the<br />
aroma of the sample.<br />
Eight judges responded to the sensory stimulus by using a time recorder, which was<br />
manipulated by the mouse of a personal computer. Time values were registered and stored in a<br />
data collection software system named SCDTI (Sistema de Coleta de Dados Tempo-<br />
Intensidade) developed at Unicamp, Campinas, Brazil. At the same time that stimulus was<br />
perceived a verbal qualitative description of each odorant was collected. The sniffing time for<br />
each run was 57 min; was used two judges each run, 28 min each one. Judges were selected<br />
among students from the Food Science Technology Departments at <strong>UFSM</strong>, on the basis of<br />
availability, interest and ability in discriminating the intensity of jelly palm wine aroma.<br />
Figure 1. Scheme of the gas chromatograph equipped with the olfactometric detector.<br />
Statistical analysis<br />
The experimental data were analyzed using analysis of variance (ANOVA) followed by<br />
the Tukey test (p ≤ 0.05) using the JMP (SAS) software.<br />
3. Results and Discussion<br />
Characterization of Jelly palm wine<br />
The values found for jelly palm wine characterization (Table 1) were considered normal<br />
in accordance to the values founds by others authors for fruit wines. Total acidity, however,
36<br />
was higher than in mango and pineapple wine 9,7 . The value for residual sugar shows that the<br />
fermentation was successful and classifies the wine as dry. Volatile acidity and pH attach to<br />
jelly pam wine durability based on Jackson 27 .<br />
Validation Parameters for major volatile compounds<br />
In general, the volatile compounds have shown a good linearity in the range of<br />
concentrations studied, as regression coefficients (R 2 ) varying between 0.991 (hexanoic acid)<br />
and 0.998 (propanol) (Table 2), with a linear range between 0.1 to 50 mg/l. The precision was<br />
studied as repeatability (n = 6 intra-day) and intermediate precision (n = 4 inter-days) and<br />
expressed as relative standard deviation (%RSD) in the model wine. Percent RSD values range<br />
from 6.5% (propanol) to 10.9% (hexanoic acid) were found for repeatability and between 7.2<br />
and 10.3% for intermediate precision. The LOD and LOQ were visually calculated from the<br />
ratio of the peak areas to the average noise and are given in Table 2.<br />
The results for limit of quantitation and detection were dependent on the<br />
physicochemical characteristics of the volatile compounds, in this sense, ethyl hexanoate and<br />
possessed the lowest detection limit (0.01 mg/l) among the studied compounds. The slope of<br />
the calibration line is also sowed in Table 2; according to Ferreira 28 the slope is a measure of<br />
method sensitivity and depends on both extraction efficiency and detector response for each<br />
compound. In this sense, ethyl hexanoate followed by isoamyl alcohol presented the higher<br />
sensitivity for the method; both compounds show a good response detector and also reached<br />
the highest percent of recovery. The recovery percentages obtained assigned to the method an<br />
acceptable accuracy at the three tested levels. The percentage recovery ranged between 86 and<br />
96% for hexanoic acid and isoamyl alcohol, respectively.<br />
Optimization of solid-phase microextraction conditions for minor volatile compounds<br />
Typically SPME headspace sampling was selected for this study. HS-SPME is an<br />
equilibrium technique that requires a previous optimization step of the sampling conditions, in<br />
order to obtain high recoveries of volatiles compounds and a good precision of the method 29,30 .<br />
The main parameters for optimizing an extraction system were evaluated for jelly palm wine,<br />
fiber adsorbent phase, salt addition and extraction temperature and time. The results of the<br />
optimization performed in this study (Table 3) shows that, among the three fibers evaluated,<br />
under the same conditions (35 °C for 45 min with 30% of salt, NaCl), the highest values for
37<br />
sum of areas and sum of peaks were corresponding to the mixed-polymer coating fiber,<br />
DVB/CAR/PDMS (50/30 µm × 20 mm). CAR/PDMS fiber, which represents another mixedpolymer<br />
coating, extracted 123 volatile compounds and the sum of peak areas of these<br />
compounds was lower than DVB/CAR/PDMS value. Mixed-polymer coating fibers presented<br />
a high retention capacity due to the mutually potentiating effect of adsorption and distribution<br />
to the stationary phase 15,31 . The extraction with PDMS fiber, a non-polar coating, showed the<br />
lowest results for the evaluated parameters. Although DVB/Car/PDMS has the greatest surface<br />
area (fiber with 20 mm), which probably had an improvement in the extraction efficiency.<br />
Additionally, the affinity of the fiber coating for an analyte is the most important factor<br />
in SPME according to Kataoka 15 . As will be shown further, the predominant compounds in jelly<br />
palm wine are esters followed by alcohols. Furthermore, previous studies showed that the<br />
combination of the three stationary phases, DVB/CAR/PDMS, is the most appropriate due to<br />
its extraction ability over an expanded range of compounds, including analyses of volatile<br />
compounds from wine samples 32,33,34 . Based on these results, further optimization of the<br />
method, including the SPME sampling time, temperature and salt addiction were carried out<br />
with the DVB/CAR/PDMS fiber. The results of the effect of different sampling temperature<br />
and time (Table 3) showed that the optimal condition for these parameters were, 35 °C for<br />
extraction temperature and 45 min for extraction time, always preceded of 5 min of equilibrium.<br />
Raising the temperature from 25 °C to 35 °C a significant increase of total area was observed.<br />
However, when the temperature reach 45 ºC no significant difference was observed compared<br />
to 35 °C (p > 0.05), at this point, the total area showed a slight decrease, which means that, the<br />
compounds adsorbed on the fiber begun to perform the reverse process of desorption.<br />
According to Pellati 35 the increase in sampling temperature increased the headspace<br />
concentration of the volatile compounds, favoring the extraction. However, SPME involves an<br />
exothermic process and the extraction of compounds decreases as the temperature increases 33 .<br />
Though temperatures of 35 and 45 ºC were not statistically different, 35 °C was the chosen one<br />
since 45 ºC could lead to a sensory decharacterization of the jelly palm wine. Time extraction<br />
increases de total area with significant difference between 30 and 45 min (p > 0.05).<br />
However, between 45 and 60 min no significant difference was showed. These results<br />
are demonstrating that, extraction time influences the equilibrium between the analytes<br />
concentration in the aqueous phase and in the polymeric phase of the fiber 29 . Once the<br />
equilibrium has been reached, the analyte concentration in the fiber decreases. The same<br />
behavior has been observed in other samples such as, oregano and grape 36,16 . The results found<br />
for the salt addiction were the same found for other authors in similar matrices 7,37,38 and confirm
38<br />
that, the presence of an electrolyte in the adsorption process decrease the solubility of<br />
hydrophobic compounds in the aqueous phase increasing the sensitivity of the method 39 . In this<br />
way, the extraction of volatile compounds from jelly palm wine was conducted using a<br />
DVB/CAR/PDMS fiber, during 45 minutes at 35 °C with 3 g of NaCl.<br />
Volatile composition of jelly palm wine.<br />
Major volatile compounds<br />
The major volatile compounds present in jelly palm wine were determinate by static<br />
headspace method (described above) are showed in Table 4. Among the major volatile<br />
compounds, extracted by the HS procedure, isoamyl alcohol (28.5 mg/l) was the major volatile<br />
identified meanwhile; other higher alcohols n-propanol (10.2 mg/l), isobutyl (15.5 mg/l), and<br />
butyl alcohol (0.59 mg/l) were found in lower concentrations. The concentration found for<br />
isoamyl alcohol was similar to that found in cacao, cupuassu and gabiroba wine reported by<br />
Duarte 8 . Higher alcohols can be formed by the metabolism of yeast and bacteria by<br />
decarboxylation of ketoacids, which are intermediates of biochemical changes of leucine,<br />
isoleucine, valine and threonine 40 . In 1911, Neubauer and Fromherz 41 proposed a modified<br />
metabolic scheme that constitutes the Ehrlich pathway as it is still viewed today. They<br />
elucidated the conversion of leucine to isoamyl alcohol through intermediaries such as α-<br />
ketoisocaproic acid and isovaleraldeyde. Higher alcohols and their esters, have a significant<br />
impact on the flavor of alcoholic beverages in a mixture of these compounds, isoamyl<br />
alcohol has the largest share, and the smallest n-propanol 42 .<br />
Ethyl hexanoate (15.4 mg/l), a straight-chain ester, was the second major volatile<br />
compound present in the beverage and has been described as a pleasant fruit-like odor<br />
compound 5 . The content found for ethyl hexanoate in the jelly palm wine was higher than those<br />
found by other authors in different fruit wines like, pineapple 7 (0.006 mg/l), mango 9 (0.13 mg/l),<br />
cacao (0.032 mg/l), cupuassu (0.048 mg/l), gabiroba (0.073 mg/l), jaboticaba (0.010 mg/l),<br />
umbu 8 (0.024 mg/l) and guava 10 (0.273 mg/l) . Its superiority in the present work may be<br />
attributed to the raw material in accordance to the data reported by Ferrão 3 that described ethyl<br />
hexanoate as the major volatile compound present in jelly palm fruits. Ethyl octanoate (0.74<br />
mg/l) was found in higher concentration than found in gabiroba wine (0.13 mg/l) and pineapple<br />
(0.09 mg/l) wine 7,8 . Hexanoic acid (10.7 mg/l) was the third major volatile compound identified<br />
in the static headspace of jelly palm wine. Its formation in the jelly palm wine may be attributed
39<br />
to the hydrolysis of the main ester, ethyl hexanoate 43 . Although, in the same work cited above,<br />
Ferrão 3 also describe hexanoic acid in jelly palm pulp and made a correlation between its<br />
formation in the fruit and the β-oxidation of the linoleic acid. In this sense hexanoic acid may<br />
be originating from the raw material, as well. As will be showed further, hexanoic acid is also<br />
known as caproic acid and has an odor described as fatty, cheesy, waxy, and like that of goats<br />
(Merck, 1989). The unpleasant odor of this acid may cause a strong off flavor for the beverage.<br />
Minor volatile compounds<br />
The analytical method proposed allowed the identification of 56 compounds in the<br />
volatile fraction of jelly palm wine (Table 4). The volatile compounds were predominantly<br />
esters (27), followed by alcohols (15), acids (11), lactones (2), aldehyde, ketone and carbonyl<br />
compound (1). Aroma-active esters are formed intracellular by fermenting yeast cells. Since<br />
they are lipid soluble, ethyl esters can diffuse through the cellular membrane into the fermenting<br />
medium. Although, small quantities of esters may be originate from the raw material 12,44,45 prior<br />
to fermentation, the amounts are negligible compared to those introduced enzymatically by the<br />
yeast 46 . In jelly palm fruit the most volatile compounds were identified as esters Ferrão 3 . Among<br />
the esters identified in the headspace of jelly palm wine by HS-SPME procedure, 6 of them<br />
were identified as hexanoate esters; methyl hexanoate (0.140 mg/l), 3-(E)-ethyl-hexenoate,<br />
isobutyl hexanoate, butyl hexanoate, isoamyl hexanoate and 3-methylbut-2-enyl hexanoate.<br />
Hexanoate esters could be a product of hexanoic acid reaction with different alcohols; in a<br />
similar mechanism of ethyl ester formation (in which the alcohol group is ethanol and the acid<br />
group is a medium-chain fatty acid). As was showed above, hexanoic acid is the major acid in<br />
the wine and was found in a high concentration. However, despite hexanoate esters quantities<br />
were expressive, the main ester (highest concentration) identified by HS-SPME in jelly palm<br />
wine was an acetate, 3-Buten-1-ol-3-methyl-1-acetate (0.320 mg/l). The same compound was<br />
not reported in different genotypes of jelly palm according to Ferrão 3 , however has been<br />
reported in the volatile composition of acerola 47,48 . No data was found about the formation of<br />
this compound in wine; although acetate ester are generally found in fermented beverage by the<br />
reaction between an acid group (acetate) and the alcohol group (ethanol or a complex alcohol<br />
derived from amino acid metabolism) 49 . As will be shown further, esters are desirable<br />
compounds in wine and are known for a fruity like aroma, typically described for this fruit 3 .<br />
Among the alcohols, the major alcohols found in jelly palm wine were the higher<br />
alcohols, as already described above. However, a representative number of alcohols (11) were
40<br />
identified by HS-SPME extraction. Among then, phenylethyl alcohol (0.086 mg/l) and n-<br />
hexanol (0.032 mg/l) showed the highest concentration. Monoterpene alcohols like, L-linalool<br />
(0.006 mg/l), alpha-terpineol (0.002 mg/l) and citronellol (0.002 mg/l) were found in this work<br />
and also described in mango wine 9 and cupuassu wine 8 . The importance of monoterpenes on<br />
varietal flavour of wines was reviewed by Mateo et al., 50 . The mechanisms to liberate such<br />
compounds normally involve acidic and enzymatic hydrolysis of terpene glycosides. Among<br />
the acids (11), octanoic acid (0.112 mg/l), acetic acid (0.016 mg/l) and isobutyric acid (0.007<br />
mg/l) were the most representative acid with respect to concentration. Lactones are formed from<br />
the corresponding hydroxy acids, according to Fan et al. 51 . As with other esters, lactones exist<br />
in equilibrium with their reactant. In jelly palm wine two lactones were identified as γ-<br />
butyrolactone and γ-caprolactone also found in guava wine 10 and described as important<br />
compounds in terms of their contribution to the flavor aroma.<br />
Identification of the main odorants compounds by GC-Olfactometry<br />
Odor descriptor for major and minor (Table 4) volatile compounds was conducted with<br />
the aid of a GC-O. For identification, retention index was calculated for the odor descriptors<br />
and compared to the retention index of the previously identified compounds. Fig. 2a shows the<br />
consensus aromagram compared to the GC-FID chromatogram (Fig 2b) of the jelly palm wine<br />
obtained by SPME. A total of 34 odoriferous compounds were described by the judges and 25<br />
were identified in the GC-FID chromatogram (Fig 2b). Seven flavor compounds were perceived<br />
by the panel, but not detected by FID and were labeled with small letters. Among the 34<br />
compounds, the most frequently were ethyl acetate, isobutyl alcohol, 3-methyl-1-butanol, ethyl<br />
hexanoate, butyric acid, hexanoic acid and phenylethyl alcohol. These volatile compounds were<br />
described with a frequency detection higher or equal 4; among then ethyl hexanoate and<br />
hexanoic acid were the compounds with the higher frequency (8) representing the main<br />
contributors to the aroma. Among the acids, butyric acid and hexanoic acid were described as<br />
negative notes for the aroma being foot odor, cheese and rancidity, sheepskin, sour,<br />
respectively.<br />
The second largest share of compounds with higher contribution to jelly palm wine<br />
aroma obtained a frequency detection equal 3. Among them, isoamyl acetate, methyl hexanoate,<br />
ethyl (E)-3-hexenoate, butyl hexanoate and ethyl cinnamate were described as flowery and<br />
fruity like aromas, remembering jelly palm fruit in some cases. These compounds are playing<br />
an important role to the positively aroma of the wine. Ethyl hydrocinnamate was described as
41<br />
burnt sugar and coffee. Garruti et al. 5 have described the same compound in cashew apple wine<br />
as sweet, dried fruit, tea and tobacco. n- Hexanol, isobutyric acid and acetic acid were described<br />
as solvent, fermented fruit and vinegar; these volatiles are considered typical aromas of<br />
fermented beverage.<br />
The volatile compounds that obtained frequency of odor detection above 2 were<br />
considered the less important compounds to jelly palm wine aroma. Among them are<br />
valeraldehyde, 3-buten-1-ol-1-acetate, ethyl octanoate, cis-3-hexen-1-ol, alpha-terpineol,<br />
citronellol and octanoic acid.<br />
Conclusions<br />
This work reports for the first time the volatiles profile of jelly palm wine and also<br />
describes the most characteristic flavor in the beverage. The headspace procedures for major<br />
(GC-HS) and minor (SPME) volatile compounds were considered satisfactory. The principal<br />
volatile compounds identified in this work and that were responsible for the characteristic<br />
aroma of jelly palm wine are ethyl hexanoate and hexanoic acid. Sensory and instrumental data<br />
correlation significantly improved the knowledge of the role of several volatile compounds in<br />
the jelly palm wine, but further investigations are highly recommended, mainly to study the<br />
formation of the hexanoic acid that attributed a negative odor impact to the beverage.<br />
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46<br />
Table 1. General composition of jelly palm wine<br />
(mean ± standard deviation)<br />
Juice Composition<br />
Soluble solids (°Brix) 13 ± 0.31<br />
Total acidity (g% citric acid) 3.26 ± 0.01<br />
pH 3.45 ± 0.01<br />
Wine composition<br />
Alcohol (v/v)% 11 ± 0.17<br />
Total Acidity A (g% of tartaric acid) 0.11 ± 0.01<br />
Volatile Acidity B (g% of acetic acid) 0.09 ± 0.00<br />
Residual Sugar (g/L) 1.21 ± 0.04<br />
pH 3.45 ± 0.01<br />
Table 2. Performance parameters of the HS-GC method for volatile compounds in model wine.<br />
Compound Linear Range (mg/l) Slope Intercept R 2 LOD a LOQ b<br />
Propanol 0.1-10 0.1086 0.0026 0.998 0.05 0.1<br />
Isobutyl alcohol 0.5-20 0.1733 0.0611 0.997 0.05 0.5<br />
Butyl alcohol 0.1-10 0.1803 0.0137 0.996 0.01 0.1<br />
Isoamyl alcohol 1-50 1.0405 0.3339 0.991 0.05 1<br />
Ehtyl hexanoate 0.5-20 1.5966 0.0304 0.998 0.01 0.5<br />
Ethyl octanoate 0.1-5 0.3129 0.1544 0.992 0.01 0.1<br />
Hexanoic acid 0.1-10 0.0421 0.0256 0.991 0.5 0.1<br />
a Limit of detection (mg/l)<br />
b Limit of quantification (mg/l)
47<br />
Table 3. Parameters analyzed in the extraction of volatile compounds of jelly palm wine expressed as total area of the<br />
peaks and number of peaks of the chromatograms.<br />
Sum of peak area<br />
Mean of number of peaks<br />
Evaluated parameters<br />
(x10 6 )<br />
Fiber adsorbent phase<br />
PDMS 0.91b 62c<br />
CAR/PDMS 2.41a 123b<br />
DVB-CAR/PDMS 3.54a 180a<br />
Salt Addiction<br />
no salt 3.71c 152c<br />
15% of salt 5.78b 153b<br />
30% of salt 8.05a 170a<br />
Extraction Temperature<br />
25 °C 0.81b 91b<br />
35 °C 3.05a 231a<br />
45 °C 2.02a 223a<br />
Extraction Time<br />
30 min 2.68b 193b<br />
45 min 4.24a 231a<br />
60 min 3.85a 210a<br />
**<br />
Same letters in the same column in each parameter extraction indicates that the data are not statistically different from each other<br />
(Tukey test, p ≤ 0.05).<br />
Table 4. Odor active and non-active compounds in jelly palm wine detected by GC-FID and GC-O with retention<br />
index, odor descriptors and mean of concentration.<br />
KI-<br />
Peak KI-Wax a RTX5-<br />
ms b<br />
Compounds mg/l c IK-GC-O d Odor descritor e Frequency f<br />
a - - - -
48<br />
Peak<br />
IK-Wax a<br />
IK-<br />
RTX5-<br />
ms b<br />
(continua)<br />
Compounds mg.L c IK-GC-O d Odor descritor e Frequency f<br />
12 1198 932 Methyl hexanoate 0.140 ± 0.009 1190 Sweet, fruity 3<br />
c - - - - 1195 fruity 1<br />
13 1205 890<br />
3-Butenol-3-methyl-<br />
1acetate<br />
0.320 ± 0.003 1202 sweet, fruity 2<br />
d - - - - 1210 fruity 1<br />
14 1217 - 3-methyl-1-butanol* 28.5 ± 0.060 1223 Solvent, sweet 5<br />
15 1232 - Ethyl hexanoate* 15.4 ± 0.120 1235 Jelly palm, fruity 8<br />
e - - - - 1237 fruity 3<br />
16 1245 - 3-Butenol-3-methyl 0.020 ± 0.001 - - -<br />
17 1246 - Prenyl acetate 0.060 ± 0.003 1246 flower 2<br />
18 1255 - Isoamyl butyrate 0.002 ± 0.001 - - -<br />
19 1259 1015 Hexyl acetate 0.008 ± 0.001 - - -<br />
20 1270 - 4-ethyl-hexanoate 0.003 ± 0.001 - - -<br />
21 1303 - Ethyl (E)-3-hexenoate 0.014 ± 0.012 1304 Fruity, jelly palm 3<br />
22 1318 788 Prenol 0.005 ± 0.001 1315 Solvent,sweet 2<br />
23 1324 - Ethyl heptanoate 0.004 ± 0.003 - -<br />
24 1328 - 4-pentenyl butyrate 0.007 ± 0.003 - -<br />
25 1336 - Isobutyl hexanoate 0.002 ± 0.001 - -<br />
26 1338 874 n-Hexanol 0.032 ± 0.002 1340 solvent, laboratory 3<br />
27 1357 866 cis-3-Hexene-1-ol 0.004 ± 0.002 1351 Parsley, green grass 2<br />
28 1359 - Methyl lavender ketone 0.012 ± 0.013 - -<br />
29 1404 1193 Butyl hexanoate 0.028 ± 0.003 1407 fruity, jelly palm 3<br />
30 1427- 1195 Ethyl octanoate* 0.71 ± 0.060 1421 melon, ripe pineapple 3<br />
31 1435 - Acetic acid 0.016 ± 0.012 1438 vinegar, solvent ,sour 3<br />
f - - - - - -<br />
32 1439 - Isoamyl hexanoate 0.007 ± 0.012 - fruity 2<br />
33 1462 - 2-Ethylhexanol 0.004 ± 0.002 - - -<br />
34 1520 - 2-nonanol 0.002 ± 0.001 - - -<br />
35 1521 - Ethyl-3-Hidroxy butyrate 0.004 ± 0.001 - - -<br />
36 1540 - Linalool 0.006 ± 0.001 - flower 2<br />
37 1552 - 1-Octanol 0.006 ± 0.003 - -<br />
38 1558 - Isobutyric acid 0.015 ± 0.003 1559 Fermented fruity 3<br />
g - - nd - 1590 Flower, fruity 2<br />
39 1572 - 2,3-Butanediol 0.003 ± 0.002 - - -<br />
40 1575 -<br />
3-methylbut-2-enyl<br />
hexanoate<br />
0.001 ± 0.002 - - -<br />
41 1625 - Butyric acid 0.001 ± 0.001 1625 Foot odor, cheese 5<br />
42 1636 1588 Ethyl decanoate 0.002 ± 0.001 - - -
49<br />
43 1651 - γ-butyrolactone 0.061 ± 0.013 - - -<br />
44 1654 - 1-nonanol 0.002 ± 0.001 - - -<br />
-<br />
45 1658 - Isovaleric acid 0.012 ± 0.003 - -<br />
Peak<br />
IK-Wax a<br />
IK-<br />
RTX5-<br />
ms b<br />
(conclusão)<br />
Compounds mg.Lc IK-GC-O d Odor descritor e Frequency f<br />
46 1707 1188 Diethyl Succinate 0.004 ± 0.001 - - -<br />
47 1723 - alpha-Terpineol 0.002 ± 0.001 1722 Flower 1<br />
48 1728 - γ-caprolactone 0.008 ± 0.003 - - -<br />
49 1756 - Prenyl isobutyrate 0.008 ± 0.001 - - -<br />
50 1763 - Citronellol 0.002 ± 0.001 - Citronella 1<br />
51 1802 - 3-Methyl-2-butenoic acid 0.004 ± 0.003 - - -<br />
52 1813 - 3-Methyl-3-butenoic acid 0.001 ± 0.001 - - -<br />
53 1819 - Ethyl 4-hydroxybutyrate 0.008 ± 0.002 - - -<br />
54 1825 1258 2-Phenylethyl acetate 0.008 ± 0.011 - - -<br />
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57 1900 1120 Phenylethyl alcohol 0.086 ± 0.039 1940 Rose, strawberry gum 5<br />
58 1918 1123 2-Ethyl-hexanoic acid 0.009 ± 0.001 - - -<br />
59 1972 1193 Octanoic acid 0.113 ± 0.060 1996 Sweet 1<br />
60 >2000 1443 Ethyl cinnamate 0.009 ± 0.001 >2000 Floral, sweet 3<br />
a<br />
Experimental linear retention index on capillary column DB-Wax<br />
b<br />
Experimental linear retention index on capillary column RTX5-ms.<br />
c<br />
Mean ± standard deviation of three repetitions of each two production batches.<br />
d<br />
Experimental linear retention index on capillary column DB-Wax by GC-O<br />
e<br />
Aroma descriptor of the consensual aromagram<br />
f<br />
Detection frequency of the judges in GC-O analysis of jelly palm wine<br />
* Volatile compounds quantified by GC-HS
50<br />
a)<br />
b)<br />
Figure 2. a) GC-FID Chromatogram of the volatile compounds of jelly palm wine by HS-SPME extraction.<br />
b) Consensus aromagram of jelly palm wine. Peaks labeled with small letters were not identified by GC-<br />
FID
51<br />
3.2 Manuscrito 2 - Effect of temperature and maceration time on volatile composition and<br />
sensory acceptation of jelly palm wine<br />
Effect of temperature and maceration time on volatile composition and sensory acceptation<br />
of jelly palm wine<br />
(Revista para publicação não definida)
52<br />
EFFECT OF TEMPERATURE AND MACERATION TIME ON VOLATILE<br />
COMPOSITION AND SENSORY ACCEPTATION OF JELLY PALM WINE<br />
Gabrieli Bernardi a ; Raquel G. Vendruscolo; Tassiane S. Ferrão; Roger Wagner*<br />
Departamento de Tecnologia e Ciência dos Alimentos – Universidade Federal de Santa Maria<br />
(<strong>UFSM</strong>) - Av. Roraima, nº 1000 – Cidade Universitária, Cep 97105-900, Santa Maria, RS, Brazil.<br />
e-mail: rogerwag@gmail.com
53<br />
ABSTRACT<br />
In this work, five fermentations were conducted to analyze the influence of the temperature of<br />
fermentation and maceration time in the sensorial acceptability and volatile composition of jelly<br />
palm wine. Fermentations were conducted at 10 and 20 °C and with different days of contact with<br />
the fibrous pulp of jelly palm fruit (2 and 7 days). The dilution of the must (40%) was also evaluated<br />
at 10 °C. Fermentation conducted at 10 °C were longer (20 days) than those fermented at 20 °C (7<br />
days). The effects of the treatments were evaluated analyzing total acidity, volatile acidity, pH and<br />
reducing sugars in the jelly palm wines. The mean value for total acidity was higher in fermentation<br />
at 20 °C than at 10 °C, 1.13 and 0.91 g%, respectively. Volatile acidity also resulted in higher<br />
values for the wines fermented at higher temperature (0.59 g%). Residual sugar content was high<br />
in the fermentations at 10 °C. The volatile composition of the wines was also assessed in order to<br />
evaluate the effect of the treatments in the concentrations of the compounds with odour impact in<br />
the wine. The volatile compounds analyses were conducted by static headspace (major) and HS-<br />
SPME extraction (minor) by gas chromatography analysis. Volatile compounds showed different<br />
concentration among the treatments, fermentations at 20 °C and with prolonged maceration time<br />
had the higher concentration for all classes of volatile compounds. Main volatile compounds were<br />
identified as, ethyl hexanoate, 3-methyl-1-butanol, phenylethyl alcohol and octanoic acid. Sensory<br />
analysis was conducted in order to obtain the acceptability of the jelly palm wines according to the<br />
treatments applied. The results showed that wines with the high concentration of volatile<br />
compounds had lower acceptability. This information was attributed to the high concentration of<br />
some acids that were previously described as negative odors compounds to the wine such as,<br />
hexanoic acid, isobutyric acid and butyric acid.<br />
Keywords: Fermentation temperature, aroma compounds, off flavor, Jelly palm
54<br />
1 INTRODUCTION<br />
In the past a few years, many authors have been largely used different fruits for the<br />
production of wine. Its volatile composition has been used as a source for the study of the most<br />
variety extraction techniques, pathways involved into volatile formation and aroma potential.<br />
(SOUFLEROS et al., 2001; GARRUTI et al., 2006; DUARTE et al., 2009; PINO & QUERIS,<br />
2010; PINO & QUERIS, 2011a; DUARTE et al., 2010a; DUARTE et al., 2010b; PINO &<br />
QUERIS, 2011b; BERNARDI et al., 2013). The development of fruit wines emerges as one<br />
possible use for the abundance of native and tropical fruits existent in many parts of the world,<br />
such as, Brazil. Fermented beverages fruit products are a promising trend due acceptance in<br />
consumer research and contribution to the reduction of post-harvest losses of perishable fruits<br />
(DUARTE et al., 2010a).<br />
Further that, fruits are known to possess a complex volatile composition (FERRÃO, 2012;<br />
BICAS et al., 2011), which may give origin to beverages with different aromas than those that<br />
already exist on the market. As well known, the wine aroma is formed by hundreds of volatile<br />
compounds including higher alcohols, aldehydes, ketones, esters, acids, monoterpenes and C13-<br />
norisoprenoids (SANCHEZ-PALOMO et al., 2007). The origin of these compounds in wine may<br />
differ and can vary in accordance with many factors like, the composition of the raw material, the<br />
fermentative process applied and also from different chemical reactions that occur in wine during<br />
fermentation (PEREZ-PIETRO et al., 2003; MOLINA, SWIEGERS & VARELA, 2007). The<br />
compounds that define wine aroma are related to acceptance or rejection of wines by the consumers,<br />
that’s why the fermentation parameters that may influence the aroma have been extensively<br />
researched by many authors (CABAROGLU et al., 1997; DARIAS-MARTÍN et al., 2003; SELLI<br />
et al., 2006; SANCHEZ-PALOMO et al., 2007; RADEKA et al., 2007). However, for fruit wines<br />
most the existing studies are focused in yeast selection and different fruit cultivars as quality<br />
parameters to the wine aroma. Le et al., (2012) analyzed the behavior and fermentation<br />
performance of mixed yeasts in mango juices of three varieties and Duarte et al., (2010) reported<br />
the yeast selection for raspberry wine and Dias et al., (2007) for cocoa wine. Although the yeast<br />
strain is one of the most important parameters of fermentation, the time that wine will remain in<br />
contact with the skins or the pulp and furthermore, the temperature that will be employed for<br />
fermentation also interfere significantly in the aroma of the final beverage. Jelly palm fruit has been
55<br />
used for the production of wine and showed a good aroma potential (BERNARDI et al., 2013).<br />
Among the volatile compounds identified in the wine, ethyl hexanoate and hexanoic acid were the<br />
most frequently described by GC-O. Ethyl hexanoate was described as positively aroma compound<br />
attributing to the wine a characteristic jelly palm fruit aroma. However, hexanoic acid was<br />
described as a potential off flavor. The origin of hexanoic acid in the jelly palm wine may be a<br />
hydrolysis reaction of the main ester, ethyl hexanoate or it could come directly from the fruit that<br />
was characterized by Ferrão (2012). Therefore, since the existing methodologies for fruit wine<br />
production do not take into account the fermentation temperature and maceration time; the aim of<br />
this work was the development of different wines from jelly palm fruit and evaluates the influence<br />
of maceration time and temperature of fermentation in volatile composition and acceptability of<br />
the beverage.<br />
2 MATERIALS AND METHODS<br />
2.1 Wine making<br />
Fresh, healthy and ripe fruits of jelly palm (Butia odorata) were obtained from the city of<br />
Tuparendi, northwest of the state of Rio Grande do Sul, Brazil. The harvest was between March<br />
and April of 2011. For the wine production, methodology was similar to that use for Bernardi et<br />
al., (2013); the fruits were peeled manually, cut in pieces and passed through a domestic grinder in<br />
order to obtain the must. The must were added to a sucrose solution to adjust the sugar content to<br />
24 ºBrix. An enzyme solution with pectolytic enzyme-Laffort (Petaluma, CA, USA) was added to<br />
a concentration of 3g.hl and commercial Saccharomyces cerevisiae yeast Actiflore F33-Laffort<br />
(Petaluma, CA, USA) in a concentration of 20 g/hl. Sulfur dioxide, in the form of potassium<br />
metabisulfite, was added up to a concentration of 50 mg/l of free SO2 to inhibit bacterial growth.<br />
The following parameters were evaluated during fermentation process: different fermentation<br />
temperature (10 and 20 ºC), different maceration time (2 and 7 days) and a diluted treatment added<br />
of 40% of water to the must and fermented at 10 ºC. So, the vinifications were designated as M7T20<br />
(7 days of maceration time at 20 ºC), M2T20 (2 days maceration time at 20 ºC), M7T10 (7 days<br />
maceration time at 10 ºC), and M2T10 (2 days maceration time at 10 ºC) and D2T10 (diluted -<br />
40%. 2 days maceration at 10 ºC).
56<br />
Vinifications were carried out, in duplicate, in 5 liters flasks and the fermentation was<br />
monitored by the daily measurement of Brix value and temperature. The fermentation was<br />
considered complete when the Brix level was stable. For the clarification step was used bentonite<br />
(300 mg/l) prepared according to Daudt and Durante (1986), facilitating the sedimentation of nonfermentable<br />
solids. After the clarification step the wines were stored in glass bottles (237 ml) under<br />
the temperature of 6 °C until analysis.<br />
2.2 General composition of jelly palm pulp and wine<br />
Alcohol, pH, total acidity (as tartaric acid), volatile acid (such as acetic acid) were<br />
performed in wines (Amerine and Ough, 1988). The Brix value, total acidity, pH and reducing<br />
sugar were determined in the jelly palm pulp (AOAC, 2005).<br />
2.3 Analisys of the major volatile compounds<br />
The major volatile compounds were extracted by a static headspace procedure according to<br />
Bernardi et al., (2013). For the extraction, 10 ml of jelly palm wine were transferred to a 20 ml<br />
glass vial added to 3 g of NaCl and 30 µl of 3-octanol (822.2 mg/l internal standard). Headspace<br />
sampling temperature of 50 °C and equilibrium time of 30 min were applied under continuous<br />
stirring (500 rpm).<br />
The analysis of the volatile compounds was conducted using a Varian 3400 Star gas<br />
chromatograph (Palo Alto, CA, USA) equipped with a split/splitless injector and a flame ionization<br />
detector (GC-FID). A ZB-WAX capillary column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm film thickness)<br />
(Phenomenex, CA, USA) was used. The temperature of the injector and detector was set to 230<br />
and 250 °C respectively. The oven temperature was held at 35 °C for 2 min and raised to 80 °C at<br />
2 °C/min, then programmed to run to 150 °C at 4 °C/min and raised to 200 °C at 30 °C/min<br />
remaining for 5 min. Carrier gas was hydrogen at an initial flow rate of 2 ml/min (constant pressure<br />
of 15 psi). Quantification was conducted with an external calibration curve constructed using the<br />
internal standard to correct analyte losses, as described by Bernardi et al., (2013).<br />
2.4 Analysis of the minor volatile compounds
57<br />
The extraction of minor volatile compounds of jelly palm wine was conducted using a solid<br />
phase microextraction technique according to Bernardi et al., (2013). The volatile compounds were<br />
extracted using a DVB/CAR/PDMS fiber; 10 mL of jelly palm wine was transferred to a 20 ml<br />
glass vial added to 3g of NaCl and 10 µl of 3-octanol (82.2 mg/l internal standard solution). Time<br />
of extraction was 45 minutes preceded for 5 min of equilibrium at 35 °C under constant stirring<br />
(500 rpm).<br />
The analysis of the volatile compounds was conducted using a Varian 3400 Star gas<br />
chromatograph equipped with a Split/Splitless injector and a flame ionization detector (GC-FID).<br />
A ZB-WAX plus capillary column (60 m × 0.25 mm × 0.25 μm film thickness) (Phenomenex, CA,<br />
USA) was used. The temperature of the injector and detector was set to 230 and 250 °C<br />
respectively. The oven temperature was held at 35 °C for 2 min and raised from 35 °C to 80 °C at<br />
4 °C/min, then programmed to run from 80 °C to 200 °C at 30 °C/min remaining at 200 °C/min for<br />
5 min. Carrier gas was hydrogen at an initial flow rate of 2 ml/min (constant pressure of 30 psi).<br />
The relative concentrations of the investigated compounds were calculated by relating the area of<br />
the internal standard to the area of the compound of interest. Response factor between internal<br />
standard and analytes was assumed as one.<br />
Volatile compounds were identified in a Shimadzu QP2010 gas chromatograph coupled to a<br />
mass spectrometer GC/MS. GC conditions were the same as those used for the GC-FID<br />
chromatographic analysis. Helium was the carrier gas at a flow rate of 2 ml/min. MS was operated<br />
in electron ionization mode (EI) at 70 eV, scanning from 35 to 350 m/z. The volatile compounds<br />
were identified by comparing their mass spectra to those of commercial spectra databases (Wiley,<br />
NIST05) and by comparing experimental retention index (RI) with the literature. Some compounds<br />
were positively identified by injecting the authentic standards into the GC-FID and GC/MS<br />
systems.<br />
2.5 Sensory Analysis<br />
The final beverages were evaluated by 40 panelists, males and females, (staff and students<br />
of the Federal University of Santa Maria - <strong>UFSM</strong>). The panelists were selected for participation on<br />
the basis of their preference for wines, interest, and availability. Refrigerated (10 °C) samples of<br />
20 ml were served in clear glasses with a volume of 50 ml; these were marked with three digit
58<br />
random numbers and covered with plastic Petri dishes. The samples presentation order was<br />
conducted in accordance to Wakeling and MacFie (1995) experimental design for five samples,<br />
designed to avoid carry over effects. Distilled water was provided for rinsing of the palate during<br />
the testing. Evaluations took place in the afternoons between 14:00 and 17:00 p.m. and were<br />
conducted at room temperature 20 e 22 °C under white light. Jelly palm wines were evaluated for<br />
flavor, aroma and general acceptability according to a nine-point structured hedonic scale<br />
(1 = disliked extremely and 9 = liked extremely) and purchase intention using a five-point<br />
structured scale, (1 = certainly would not buy and 5 = certainly would buy) according to Stone and<br />
Sidel (1993).<br />
2.6 Statistical Analysis<br />
The experimental data were analyzed using analysis of variance (ANOVA) followed by the<br />
Tukey test (p ≤ 0.05) using the JMP software (SAS, Cary, NC). A Principal Component Analysis<br />
(PCA) was performed by using Pirouette (Infometrix, Inc., Bothell, WA). The data were auto<br />
scaled so that each variable contributes with the same weight in the analysis (VILANOVA et al.,<br />
2010).<br />
3. Results and discussion<br />
3.1 Influence of treatments on general composition of jelly palm wine<br />
Fermentation progress was affected by the applied treatments. The time to end fermentative<br />
process was higher for fermentations conducted at 10 ºC requiring 20 days, while fermentations<br />
conducted at 20 ºC reached the final point in 7 days. The general composition of jelly palm wines<br />
was also affected by the applied treatments (Table 1). Wines made from maceration time of 7 days<br />
and fermentation temperature of 20 ºC generally displayed higher levels of volatile acidity and total<br />
acidity than did those fermented at 10 ºC and 2 days of maceration. The values found for pH were<br />
statistically different for the treatment M7T20 and D2T10. The relation between pH and total<br />
acidity was confirmed as the higher values for total acidity were found in agreement with lower<br />
values for pH.
59<br />
Total acidity average value (1.1 g/l) was higher than for the treatments fermented at 20 ºC<br />
and higher that those found in other wine fruits like, like guava wine (0.13 g/l), mango wine (5.4<br />
g/l) and pineapple wine (4.12 g/l) (PINO & QUERIS, 2011a; PINO & QUERIS, 2011b, PINO &<br />
QUERIS, 2010). Results found for maceration time at 20 ºC in a traditional fermentation (grapes)<br />
also reported an increase in total acidity comparing control wine with skin contact wine (RADEKA<br />
et al., 2007). Reducing sugar was higher in fermentations at 10 ºC than at 20 ºC; temperature has<br />
an important effect on yeast growth and consequently on the fermentation process with lower<br />
temperatures may slow the rate of sugars consumption by the yeast to produce ethanol (REDY &<br />
REDY, 2011). According to Molina et al., (2007) temperature of fermentation affects fermentative<br />
parameters as the fermentation rate and final wine composition.<br />
3.2 Influence of treatments on volatile composition of jelly palm wine<br />
A total of 60 volatile compounds were identified in the headspace of jelly palm wine; among<br />
them (27) esters, (15) alcohols, (11) acids, (2) lactones and terpenes, aldehydes and ketones (1). In<br />
a general way, the concentration of the volatile products found in the wines fermented under<br />
maceration time of 7 days and fermentation temperature of 20 ºC (M7T20) was higher; differing<br />
statistically from the values found for the treatment (M2T10) (Table 2). The volatile compounds<br />
that reached the highest concentrations at 20 ºC and the lower at 10 ºC are mainly alcohols,<br />
propanol (9208.43 µg/l to 6790.30 µg/l) , isobutyl alcohol (12050.03 to 9033.63 µg/l), butyl<br />
alcohols (600.85 to 4021.10 µg/l), isoamyl alcohol (28564.02 to 2349.71 µg/l), (phenylethyl<br />
alcohol 91.05 to 31.77 µg/l) and (hexanol 36.28 to 8.39 µg/l), esters, ethyl hexanoate (15420.02 to<br />
6790.30 µg/l), 3-Buten-1-ol-3-methyl-1-acetate (332.45 to 86.77µg/l), ethyl acetate (141.03 to<br />
37.10 µg/l), methyl hexanoate (142.10 to 31.36 µg/l) and prenyl acetate (80.55 to 67.30 µg/l) and<br />
acids, hexanoic acid (10701.03 to 9532.07 µg/l), octanoic acid (117.34 to 36.72 µg/l), acetic acid<br />
(15.36 to 11.20 µg/l) and isobutyric acid (15.63 to 4.22 µg/l) . To obtain more simplified view of<br />
the relationship among the volatile compounds and the treatments a principal component analysis<br />
were conducted. Applying PCA to the normalized relative amounts of the 60 analytical variables<br />
(volatile compounds) and 30 objects (treatments), two factors were extracted explaining 75.9% of<br />
the total variance of initial data set.
60<br />
The first principal component (PC1) explains 69.0% of the variance in the initial data set<br />
and the second principal component (PC2) explain 6.9%. The projections of the samples along the<br />
directions identified by the first two PC’s, is reported in Fig. 1. First principal component (PC1)<br />
of wine treatments (scores) is plotted against the second principal component (PC2) in Fig.1.a. The<br />
separation of the different treatments applied to the wine is showed clearly through the scatter point<br />
plot. This figure shows that wines from the treatments fermented at 10 ºC were separeted by the<br />
first component analysis from those fermented at 20 ºC. Apparently treatments M7T10 and M2T20<br />
were not separated, however the completely separation were visualized with the aid of the third<br />
component (PC3) that explains 4.9% of the variance (data no showed). Fig. 1b shows the<br />
corresponding loadings plot that establishes the relative importance of each variable to discriminate<br />
the treatments. This figure shows that most of volatile compounds may be seen in the upper part of<br />
the plot, where PC1 and PC2 are positive and are strongly correlated to treatment (M7T20). The<br />
first component (PC1) was characterized by major concentration of the volatile compounds,<br />
including, ethyl hexanoate, methyl hexanoate, hexanoic acid and butyric acid. The esters and their<br />
corresponding acids, ethyl hexanoate and hexanoic acid and ethyl butyrate and butyric acid, are<br />
showing a positively correlation with the increases of temperature indicating a possible equilibrium<br />
hydrolyses reaction among these compounds (RAMEY & OUGH, 1980). The volatile compounds<br />
located in the negative PC2 are highly correlated to treatment (D2T10) that presented the lowers<br />
concentrations for the compounds. The upper part of the PC2 (positive) shows some volatile<br />
compounds that did not followed the same behavior of the most volatiles. 2-nonanol and methyl<br />
lavander ketone had its concentration not differing statistically to the treatments at 10 and 20 ºC,<br />
the same was observed for isoamyl acetate and 1-octanol. Therefore, it’s possible to conclude that,<br />
different temperatures had influenced the concentration of the volatile compounds in jelly palm<br />
wine and that a high fermentation temperature increases the volatile concentration. In general, the<br />
dilution of the must may be cause a dilution of the volatile compounds reducing its concentrations<br />
in the headspace of the wine. The influence of the treatments will be discussed for each chemical<br />
class of compounds in separate.<br />
3.3 Esters<br />
Most esters found in wine are produced by yeast, after cell division has essentially ceased.<br />
Straight-chain forms are synthetized from alcoholysis of the corresponding acids, which have been
61<br />
activated by acyl-S-CoA (RAAP & GUNTERT, 1986). The main ester of in jelly palm wine is a<br />
straight-chain ethyl hexanoate. It was described as the major volatile compound in jelly palm fruit<br />
by Ferrão (2012) and had its aroma described by Bernardi et al., (2013) as the same aroma as jelly<br />
palm fruit. Under the applied treatments the concentration of ethyl hexanoate was lower in the<br />
fermentations at 10 ºC and less days of maceration differing statistically from the treatments at 20<br />
ºC. Besides ethyl hexanoate, the effect of maceration time and temperature were similar for the<br />
others esters present in the wine. According to Killian and Ough, (1979), low fermentation<br />
temperatures (10 ºC) favor the synthesis if fruit esters such as those cited above while high<br />
temperature of fermentation (20 ºC) promotes the production of high molecular height esters. The<br />
treatment M7T20 showed the highest concentration for the esters differing statistically from the<br />
treatment D2T10.<br />
Ethyl acetate was reported in lower concentration in pineapple wine (38.3 µg/l), raspberry<br />
wine (7.9 µg/l) and cacao wine (0.19 µg/l) and the fermentation temperature for those wines ranged<br />
between 22 to 26 ºC (DUARTE et al., 2010a; PINO & QUERIS, 2010). However ethyl acetate<br />
formation is a common microbial fault produced by wine spoilage yeasts and it may be also formed<br />
in wine by a chemical interaction between ethanol and acetic acid (JACKSON, 2000). Therefore<br />
wines with high acetic acid levels are more likely to see ethyl acetate formation. According to<br />
Suomaleinen, (1981), an increase in the fermentation temperature releases higher levels of esters<br />
through more efficient excretion and/or enhanced autolysis of the yeast. An effect of the<br />
temperature on the thermodynamic equilibrium of ester solubility in cellular lipids and the aqueous<br />
medium is another possibly more likely explanation. Selli et al., (2006) has showed that, increasing<br />
the maceration time the concentrations of several esters increased significantly while Torija et al.,<br />
(2003) has reported that at lower temperatures (10-15 ºC) the concentration of volatile compounds,<br />
such as, esters increase. In jelly palm wine, esters were found in high concentration for the<br />
treatments fermented at 20 ºC and with 7 days of maceration.<br />
3.4 Acids<br />
Maceration time and fermentation temperature have a straight relation with acids<br />
concentration in wine. In general, in a traditional fermentation fatty acid concentrations increase<br />
in prolonged maceration time and high temperatures (RODRÍGUEZ-BENCOMO et al., 2008;
62<br />
SANCHEZ-PALOMO et al., 2007; SELLI et al., 2006). In the present work, 9 acids were<br />
identified in the headspace of jelly palm wine (Table 2). Hexanoic acid was identified as the major<br />
acid compounds followed by octanoic acid and acetic acid. Fatty acids are commonly present in<br />
wine and its origin may arise from autoxidation of saturated lipids constituents of fruits<br />
(JACKSON, 2000). Acids were found with the same comportment observed for esters among the<br />
applied treatments. Prolonged maceration time with high temperature showed the highest<br />
concentration. For all treatments, except for the diluted, the concentration of hexanoic acid was<br />
considered high in comparison to the results found in cashew apple wine (GARRUTI et al., 2006),<br />
grape wine (MOLINA et al., 2007) and mango wine (PINO & QUERIS, 2011). Sanchez-Palomo<br />
et al., (2007) also reported this acid in high concentration in treatments with skin contact.<br />
The presence of hexanoic acid in such concentration in jelly palm wine should be associated<br />
with the hydrolysis of the major esters, ethyl hexanoate, and possible of the others hexanoic acid<br />
esters. Ramey and Ough (1980) showed that, at the end of fermentation, fruit esters are generally<br />
in excess of their equilibrium constants. As a result, many esters begin to hydrolyze back to their<br />
component alcohol and acid. Furthermore, the hydrolysis is favored at high temperatures and low<br />
pH values. In the present work acetic acid was found a range of concentration between 15.3 to 11.2<br />
µg/l. This results were higher than those founds by Pino and Queris (2010) in pineapple wine (1.4<br />
µg/l) and lower than those found by Duarte et al., (2010a) in cupuassu wine (0.14 g/l). Small<br />
amounts of acetic acid are produced by yeast during fermentation, depending on the concentration<br />
in wine; acetic acid can be an undesirable flavorant to the complexity of flavor and odor. However,<br />
it plays an important role in the production of acetate esters that can give wine a fruity character.<br />
Amerine and Ough describe ‘normal’ fermentations as not exceeding 300 mg/L of acetic acid.<br />
Isobutyric acid was found in a range of concentration between 9.63 to 2.22 µg/l and according to<br />
Bernardi et al., (2013) this compound had an aroma description of fermented fruit in jelly palm<br />
wine GC-Olfactometric analysis. Other important acid found in the samples was the butyric acid<br />
that present a range of concentration between 9.25 and 0.62 µg/l and had the aroma described as<br />
foot odor, cheese (BERNARDI et al., 2013). In this sense, the presence of those acids indicates a<br />
negative contribution to the jelly palm wine aroma.<br />
3.5 Alcohols
63<br />
Seventeen alcohols were identified in jelly palm wine samples. The average of total<br />
concentration of higher alcohols was 45.70 mg/l. The total concentration for higher alcohols was<br />
higher in the treatments fermented at 20 ºC. Rankine (1967) reports an increase in isoamyl and<br />
isobutyl alcohols with the increase of temperature. Gutierrez, (1993) demonstrated that the<br />
optimum temperature for higher alcohols production is 30 ºC using Saccharomyces cerevisiae as<br />
yeast strain. According to Rapp & Versini (1991), concentrations of higher alcohols below 300<br />
mg/l add desirable complexity to wine aroma, whereas higher concentrations (400 mg/l) can be<br />
detrimental to wine quality by disguising fruity aromas given by esters. In jelly palm wine isoamyl<br />
alcohol was the major alcohol and its concentration ranged between (28564.0 to 23549.7 µ/l). This<br />
alcohol and isobutyl alcohol presented important contribution for jelly palm aroma and were<br />
described as solvent, sweet and solvent, fruity, respectively in Bernardi et al., (2013) work.<br />
Phenylethyl alcohol was found in a range of concentration between (91.0 to 31.77 µg/l), Molina et<br />
al., (2007) has also described high concentration of this alcohol at 28 ºC than at 15 ºC fermentation<br />
temperature. Terpenic alcohols like, alfa-Terpineol (1.45 to 0.51 µg/l) and linalool (3.40 to 1.08<br />
µg/l) had their aroma described by Bernardi et al., (2013) as flowery and can be positively<br />
correlated with the acceptability of guava wine (PINO & QUERIS, 2011). These alcohols can be<br />
found in jelly palm fruit in a free form as reported by Ferrão (2012) or by being degradation<br />
products of terpenyl glycosides hydrolysis during fermentation process (MAICAS & MATEO,<br />
2005, CARPINTERO et al., 2011). The concentration of the alcohols were higher in the treatments<br />
fermented at 20 ºC with 7 days of maceration and the results were significantly different from those<br />
found in must dilution treatment.<br />
3.6 Other Compounds<br />
Besides the compounds already discussed, other volatile compounds such as, terpenes,<br />
ketones, aldehydes and lactones were also identified in jelly palm wine. Among these compounds<br />
γ-butyrolactone, γ-caprolactone, myrcene, valeraldehyde and methyl lavender ketone. Ferrão,<br />
(2012) reported terpenes (2) lactones (3) aldehydes (9) and ketones (12) in jelly palm fruit, however<br />
during fermentation; aldehydes are generally reduced to alcohols according to Jacson (2000).<br />
3.7 Sensory Analysis
64<br />
The sensory analysis of jelly palm wine assessed the acceptability of the beverage by the<br />
consumers with respect to the aroma, flavor, general acceptability and also the purchasing<br />
intention. The results showed significant differences (p ≤ 0.05) in the acceptance of the five samples<br />
of jelly palm wine for the evaluated attributes (flavor and general acceptability) as showed in table<br />
3. The treatment D2T10 showed the high mean value for the aroma assessment followed by the<br />
treatment M2T10. Besides the different values, the treatments were not statistically different which<br />
shows that jelly palm wine aroma was not the main parameter for differentiation among the applied<br />
treatments. For the flavor assessment the treatment D2T10 was statistically different to the<br />
treatment M7T20 that possessed the lower mean value being considered the worst wine for the<br />
consumers with respect to this parameter. General acceptability was also high for the treatment<br />
D2T10 differing statistically from the treatment M7T20. Consumers answered the subjective<br />
question of "most liked" and "least liked" for each sample of wine. In general consumers answered<br />
the natural aroma of jelly palm fruit as the most liked attribute for the for all treatments and the<br />
high acidity as the least liked for the treatments fermented at 20 ºC. The attributes aroma, flavor<br />
and general acceptability were analyzed by graphs of frequency distribution of the hedonic values<br />
assigned to each sample (Figures. 2, 3, and 4). The same was done for purchase intention (Figure<br />
5). The higher acceptability for the treatment D2T10 with respect to flavor can be evidenced in<br />
Fig. 2. This sample accumulated 40% of the opinion of consumers between 7 (like moderately)<br />
and 9 (like extremely) on the hedonic scale for flavor. The treatment (M2T10) had a value close<br />
(35%), while the treatment M7T20 possessed 10%. To the aroma, the treatment D2T10 had 35%<br />
of the preference by consumers between 7 and 9 on the hedonic scale. The treatment M7T20 that<br />
did not differ statistically had 27% (Fig 3). The general acceptability had a similar behavior that<br />
for flavor assessment. Treatment D2T10 had 39%. For the purchase intention the results show a<br />
higher percentage to the item 3 of the questionnaire (maybe/maybe not) for the treatment D2T10<br />
with 31% of the purchasing intention (figure 4).<br />
The results found for the sensory evaluation will in agreement with those obtained for the<br />
volatile composition of the jelly palm wine. As reported by Bernardi et al., (2013), hexanoic acid<br />
assigns to the beverage a strong taste of rancid which may not be pleasant for the major of<br />
consumers. As showed in Table 2, the treatments fermented at 20 ºC possessed the high values for<br />
hexanoic acid while the wine fermented with must dilution at 10 ºC showed the lower value. Also,
65<br />
isobutyric acid, butyric acid and acetic acid show high concentration at 20 ºC than at 10 ºC.<br />
Bernardi et al., (2013) described the impact odors of those acids as undesirable to jelly palm wine<br />
aroma. So, this study showed that the presence of these compounds was negatively related with the<br />
desirable flavor acceptability of the product in spite of high concentration of esters.<br />
4 Conclusion<br />
In summary, this study revealed that maceration time and fermentation temperature<br />
influences the volatile composition of jelly palm wine. Using a dilution of the must was possible<br />
to reduce the undesirable odour effect of hexanoic acid and butyric acid, the main negative<br />
contributors for the jelly palm wine aroma. This study made possible to elaborate a new beverage<br />
with good sensory proprieties and that reached a good acceptability by the consumers.<br />
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69<br />
Table 1. Effect of maceration time and temperature on the general composition of jelly palm wine.<br />
20 °C 10 °C Diluted 10 °C<br />
Parameters/Treatments 7 days 2 days 7 days 2 days 2 days<br />
pH 3.83b 3.90ab 3.94ab 3.91ab 3.95a<br />
Total Acidity A (g%) 1.16a 1.11ab 1.10ab 0.96ab 0.68b<br />
Volatile Acidity B (g%) 0.11a 0.09b 0.07cd 0.07c 0.06d<br />
Reducing Sugar (g/l) 1.29b 1.30b 1.78a 1.81a 0.93d<br />
**<br />
Same letters in the same line in each parameter extraction indicates that the data are not statistically different from<br />
each other (Tukey test, p ≤ 0.05)<br />
A<br />
expressed as tartaric acid<br />
B<br />
expressed as acetic acid<br />
Table 2. Mean concentrations (µ/l) of volatile compounds of jelly palm wine according to the applied<br />
treatments<br />
Compounds/Treatments<br />
Esters<br />
a LRI<br />
20 °C 10 °C Diluted 10 °C<br />
7 days 2 days 7 days 2 days 2 days<br />
Ethyl Acetate 885 141.03a 124.12a 119.15a 84.07b 37.10c<br />
Isobutyl acetate 1023 5.01a 3,20b 3,10b 3,04b 3,02b<br />
Ethyl butyrate 1047 11.00a 7.65b 7.19b 8.95b 5.03c<br />
Butyl acetate 1086 44.02a 39.29a 29.14b 21.02c 9.95d<br />
Isoamyl acetate 1134 72.01a 55. 69b 47.99c 51.23bc 54.10bc<br />
Ethyl valerate 1146 3.03a 2.11b 0.42c 0.45c 0.45d<br />
Methyl hexanoate 1198 142.10a 133.28a 93.24b 85.45b 31.36c<br />
3-Buten1ol-3-methyl-1 acetate 1205 332.45a 287.14b 246.38c 154.44d 86.77e<br />
Ethyl hexanoate * 1242 15420.02a 13742.03a 9190.21b 9012.01b 6790.30c<br />
Prenyl acetate 1246 80.55a 67.30ab 43.86c 44.51c 25.34d<br />
Isoamyl butyrate 1255 2.38a 1.82a 2.13a 1.28b 0.49b<br />
Hexyl acetate 1259 5.01a 5.95a 5.24a 5.17a 3.75b<br />
Ethyl hex-4-enoate 1270 3.28a 2.61b 2.39b 1.76b 0.59c<br />
Ethyl (E)-3-hexenoate 1303 9.92a 6.66ab 5.93ab 6.19ab 2.64b<br />
Ethyl heptanoate 1324 4.80a 3.10a 3.01a 0.89b 0.78b<br />
4-pentenyl butyrate 1328 5.36a 3.48ab 3.53ab 1.89bc 1.20c<br />
Isobutyl hexanoate 1336 0.96ab 0.97a 0.86ab 0.35b 0.44ab<br />
Butyl hexanoate 1404 5.10a 3.27b 3.68a 2.39c 1.38d<br />
Ethyl octanoate * 1423 3.56a 2.93b 2.69b 1.86c 1.10c<br />
(continua)
70<br />
Compounds/Treatments<br />
Esters<br />
a LRI<br />
20 °C 10 °C Diluted 10 °C<br />
7 days 2 days 7 days 2 days 2 days<br />
Isoamyl hexanoate 1439 7.36a 6.54a 4.97b 4.77b 1.65c<br />
Ethyl-3-hidroxy butyrate 1521 1.17a 0.83b 0.77c 0.44c 1.09d<br />
3-methylbut-2-enyl hexanoate 1575 9.10a 8.30b 2.83c 1.48d 0.16e<br />
Ethyl decanoate 1636 7.92a 5.70ab 5.25b 5.09c 2.90c<br />
Diethyl succinate 1723 4.03a 3.90a 3.87a 2.60ab 1.00b<br />
Prenyl isobutyrate 1756 2.47a 1.00b 1.02c 1.57d 0.34e<br />
Ethyl 4-hydroxybuyrate 1819 15.23a 10.51b 10.47b 8.85b 4.72c<br />
2-Phenylethyl acetate 1825 0.21a 0.16ab 0.15ab 0.15ab 0.1b<br />
Ethyl hydrocinnamate 1870 16.67a 12.37b 8.78c 5.77d 4.69d<br />
Ehtyl cinnamate
71<br />
Compounds/Treatments<br />
a LRI<br />
20 °C 10 °C Diluted 10 °C<br />
7 days 2 days 7 days 2 days 2 days<br />
2-Ehtyl-hexanoic acid 1918 0.87a 0.38b 0.36b 0.25b 0.13c<br />
Octanoic Acid 1972 117.34a 113.51a 96.57a 68.92b 36.72c<br />
Total 10865.56 10472.83 9895.39 9738.8 9585.77<br />
Lactones<br />
γ-butyrolactone<br />
1651 0.63a 0.63a 0.55a 0.53a 0.46a<br />
γ-caprolactone 1728 1.66b 2.66a 1.35b 0.95c 0.51d<br />
Total 2.29 2.78 1.90 1.48 0.97<br />
Terpenes<br />
Myrcene 1168 0.41b 0.55ab 0.50b 0.65a 0.22c<br />
Aldehydes<br />
Valeraldehyde 1192 7.31ab 5.21b 8.35a 7.40b 3.30c<br />
Ketones<br />
Methyl lavender ketone 1359 1.15a 0.83b 0.76b 1.08a 0.43c<br />
**<br />
Same letters in the same line in each parameter extraction indicates that the data are not statistically different from each<br />
other (Tukey test, p ≤ 0.05)<br />
* Volatile compounds quantified by HS (Bernardi et al., 2013)<br />
a LRI - linear retention index calculated on DB-WAX capillary column.<br />
Table 3. Mean values assigned by consumers for the five samples of jelly palm wine, using<br />
a hedonic scale of nine points.<br />
20 °C 10 °C Diluted 10 °C<br />
Attribute/Treatment 7 days 2 days 7days 2 days 2 days<br />
Flavor 5.32b 5.62ab 5.50ab 6.17ab 6.55a<br />
Aroma 6.60a 6.37a 6.55a 7.00a 7.40a<br />
General Acceptability 5.37b 5.90ab 6.42ab 6.65ab 6.70a<br />
**<br />
Same letters in the same line in each parameter extraction indicates that the data are not statistically different<br />
from each other (Tukey test, p ≤ 0.05)
72<br />
a)<br />
b)<br />
Figure 1. a) Score plot of principal component analysis of the volatile composition of jelly palm wine submitted to<br />
different treatments. b) Loading plots of principal component analysis of the volatile composition of jelly palm wine.
% of consumers<br />
% of consumers<br />
73<br />
30<br />
25<br />
20<br />
15<br />
M7T20 ⁰C<br />
M2T20 ⁰C<br />
M7T10 ⁰C<br />
M2T10 ⁰C<br />
D2T10 ⁰C<br />
10<br />
5<br />
0<br />
1 2 3 4 5 6 7 8 9<br />
Hedonic scale<br />
Figure 2. Consumer’s preference with respect to the flavor of jelly palm wine. 9, like extremely; 8, like very much; 7,<br />
like moderately; 6, like slightly; 5, neither like not dislike; 4, dislike slightly; 3, dislike moderately; 2, dislike very<br />
much; 1, dislike extremely.<br />
30<br />
25<br />
20<br />
15<br />
M7T20 ⁰C<br />
M2T20 ⁰C<br />
M7T10 ⁰C<br />
M2T10 ⁰C<br />
D2T10 ⁰C<br />
10<br />
5<br />
0<br />
1 2 3 4 5 6 7 8 9<br />
Hedonic scale<br />
Figure 3. Consumer’s preference with respect to aroma of jelly palm wine. 9, like extremely; 8, like very much; 7, like<br />
moderately; 6, like slightly; 5, neither like / not dislike; 4, dislike slightly; 3, dislike moderately; 2, dislike very much;<br />
1, dislike extremely.
% of consumers<br />
% of consumers<br />
74<br />
30<br />
25<br />
20<br />
15<br />
M7T20 ⁰C<br />
M2T20 ⁰C<br />
M7T10 ⁰C<br />
M2T10 ⁰C<br />
D2T10 ⁰C<br />
10<br />
5<br />
0<br />
1 2 3 4 5 6 7 8 9<br />
Hedonic scale<br />
Figure 4. Consumer’s preference with respect to general acceptability of jelly palm wine. 9, like extremely; 8, like<br />
very much; 7, like moderately; 6, like slightly; 5, neither like not dislike; 4, dislike slightly; 3, dislike moderately; 2,<br />
dislike very much; 1, dislike extremely.<br />
50<br />
40<br />
M7T20 ⁰C<br />
M2T20 ⁰C<br />
30<br />
20<br />
M7T10 ⁰C<br />
M2T10 ⁰C<br />
D2T10 ⁰C<br />
10<br />
0<br />
1 2 3 4 5<br />
purchasing intention<br />
Figure 5. Consumer purchasing intention for Jelly palm wine. 1 definitely would buy; 2 probably would buy;<br />
3, maybe/maybe not; 4, probably would not buy; 5, definitely would not buy.
75<br />
4 DISCUSSÃO<br />
Tradicionalmente, os vinhos são preparados pela fermentação de mostos de uvas, no<br />
entanto, nos últimos anos, muitos autores tem reportado a utilização de outras frutas, que não a<br />
uva, para a produção de bebidas fermentadas, popularmente chamadas de vinhos de frutas. Alguns<br />
dos mais recentes trabalhos publicados utilizam guabiroba (DUARTE et al., 2009; DUARTE et al.,<br />
2010), cupuaçu, cacau e umbu (DUARTE et al., 2010), cajá (DIAS et al., 2003) e caju (GARRUTI<br />
et al., 2006). Mais recentemente Pino e Queris reportaram a composição volátil de fermentado de<br />
abacaxi, manga e goiaba (PINO & QUERIS, 2010; PINO & QUERIS, 2011).<br />
A presente pesquisa buscou explorar o potencial de aproveitamento da fruta butiá (B.<br />
odorata) através do desenvolvimento de uma bebida fermentada. Além do desenvolvimento,<br />
buscou-se caracterizar a bebida dentro dos parâmetros comumente analisados em vinhos como,<br />
pH, teor alcoólico, acidez total titulável e acidez volátil (AMERINE e OUGH, 1976). Além disso,<br />
realizou-se o estudo da composição volátil da bebida utilizando dois métodos de extração no<br />
headspace da amostra. Os compostos majoritários foram extraídos pela técnica de extração no<br />
headspace estático da amostra e os compostos minoritários foram extraídos pela técnica de<br />
microextração em fase sólida (SPME). O potencial odorífero da bebida foi avaliado através da<br />
análise GC-olfatométrica utilizando a técnica de frequência de detecção de odores. Além da<br />
caracterização da bebida, foram estudados alguns parâmetros que possivelmente viessem a afetar<br />
a qualidade sensorial da mesma. Para isso, foram realizadas fermentações a diferentes<br />
temperaturas, diferentes tempos de maceração e com diluição do mosto de butiá. A fim de avaliar<br />
o efeito dos tratamentos aplicados aos fermentados realizou-se o estudo da fração volátil dos<br />
mesmos buscando identificar, entre os tratamentos, os compostos que obtiveram variação na<br />
concentração. Além disso, um teste de aceitação sensorial foi aplicado para correlacionar os dados<br />
obtidos com a preferência dos consumidores pelos fermentados e também a intenção de compra<br />
(manuscrito 1 e 2).<br />
A caracterização físico-química dos fermentado mostrou que os resultados obtidos foram<br />
semelhantes aos encontrados por outros autores em vinhos de frutas (NETO et al., 2006; DIAS et<br />
al., 2006; ASQUIERI et al., 2008). O resultado para a acidez total titulável (10.1 g/l) pode ser<br />
atribuída ao ácido cítrico, ácido minoritário nas uvas, mas majoritário em muitas frutas atribuindo<br />
ao fermentado um aumento na acidez (Moreno e Peinado, 2012). O resultado foi considerado alto
76<br />
em comparação a outro vinhos de frutas como, goiaba (0,13 g/l), manga (5,4 g/l) e abacaxi (4,12<br />
g/l) (PINO & QUERIS, 2011; aPINO &, QUERIS, 2011; bPINO & QUERIS, 2011).<br />
No que se refere aos compostos voláteis, o método de extração no headspace estático foi<br />
validado de acordo com as figuras de mérito, linearidade, precisão (repetitividade e precisão<br />
intermediária), limites de detecção e quantificação e exatidão (recuperação). O método permitiu a<br />
quantificação de sete compostos voláteis dos quais, propanol, isobutanol, butanol, hexanoato de<br />
etila, octanoato de etila e ácido hexanóico com boa recuperação. Para extração dos compostos<br />
minoritários, foram definidas as melhores condições de extração utilizando a SPME. Os parâmetros<br />
testados no preparo de amostra apresentaram influência no perfil de compostos voláteis. Como<br />
resultado final obteve-se um método que emprega a fibra DVB/CAR/PDMS para a extração da<br />
fração volátil do fermentado, adicionada de 30% de NaCl, a uma temperatura de 35 ºC por 45<br />
minutos e sob agitação. Foram quantificados e identificados 60 compostos voláteis na amostra de<br />
fermentados butiás analisadas, sendo 27 ésteres, 15 álcoois, 11 ácidos, 2 lactonas, aldeídos, cetonas,<br />
e terpenos (1). Muitos ésteres identificados no fermentados de butiá foram encontrados também<br />
por Ferrão (2012) na fração volátil da fruta de butiá, entre eles, o hexanoato de etila. Entre os<br />
álcoois destacam-se pela maior concentração os álcoois superiores como o isoamílico e o<br />
isubutanol. Na classe dos ácidos o ácido hexanóico, butírico e acético. Os compostos pertencentes<br />
a classe química éster são reportados por apresentarem notas frutais de aroma (GARRUTI et al.,<br />
2006). Entretanto, entre a classe dos álcoois e dos ácidos existem alguns compostos que podem<br />
atribuir aromas indesejados em bebidas como o fermentado de butiá. Tendo em vista a importância<br />
destes compostos no aroma do fermentado, a análise dos compostos voláteis aliada a análise GColfatométrica<br />
foi de grande importância. Através destas análises foi possível atribuir aos principais<br />
compostos descritores de odor apontando assim, os compostos responsáveis pelo aroma<br />
característico de fermentado de butiá e também, compostos que atribuíram aromas indesejáveis.<br />
Entre os principais compostos identificados pela técnica citam-se o hexanoato de etila, hexanoato<br />
de metila, ácido hexanóico, ácido butírico, ácido isobutírico, ácido acético, álcool isoamílico e o<br />
álcool feniletílico. O éster hexanoato de etila merece destaque uma vez que foi descrito como o<br />
aroma natural da fruta butiá e obteve nota máxima para frequência de detecção, sendo essa igual a<br />
oito. O éster hexanoato de metila foi descrito como aroma frutal. Os ácidos hexanóico, butírico,<br />
isobutírico e ácido acético obtiveram descritores negativos para o aroma do fermentado sendo<br />
esses, ranço, chulé, queijo e vinagre, respectivamente. Uma vez que esses compostos atribuíram
77<br />
notas negativas de odor para o aroma do fermentado, estudos foram desenvolvidos com o intuito<br />
de atenuar o impacto odorífero destes compostos.<br />
O estudo dos parâmetros fermentativos mostrou que o tempo de maceração a temperatura<br />
de fermentação e a diluição do mosto influenciam na composição geral do fermentado. As<br />
fermentações a 20 ºC obtiveram valores elevados para acidez total titulável e acidez volátil. Os<br />
valores para açucares redutores, entretanto, foram menores do que os encontrados nas fermentações<br />
a 10 ºC. As fermentações conduzidas a 20 ºC obtiveram maiores concentrações para todas as classes<br />
química de compostos voláteis, entre eles, os anteriormente descritos como positivos para o aroma<br />
e também os descritos como off flavors. O mesmo resultado foi reportado por MAMEDE &<br />
PASTORE, (2004) em fermentações de mosto de uva a 15 e 20 ºC. Na análise sensorial, as<br />
fermentações conduzidas a 10 ºC obtiveram as maiores médias para aroma, sabor e apreciação<br />
global. O tratamento D2MT10 obteve boa aceitabilidade por parte dos consumidores demostrando<br />
que o tratamento aplicado propiciou o desenvolvimento de um fermentado com boa aceitação.<br />
Neste sentido, o presente trabalho pode contribuir significativamente para o entendimento<br />
da transformação da matéria-prima em um produto fermentado de butiá. Adicionalmente, são ainda<br />
escassos os estudos que relatam o desenvolvimento de fermentado de Butiá, bem como a suas<br />
implicações nos parâmetros tecnológicos aplicados ao processo fermentativo.<br />
5 CONCLUSÕES<br />
Os fermentados de butiá apresentaram valores médios de graduação alcoólica (11ºGL), acidez<br />
total titulável (0,11 g%) e acidez volátil (0,08 g%), aceitáveis aos parâmetros exigidos pela<br />
legislação brasileira referente a bebidas fermentadas, sendo um indicativo que a fruta atende as<br />
características necessárias ao processamento. (Lei nº 10970 de 12/11/2004)<br />
Os métodos desenvolvidos empregando as técnicas de headspace estático e HS-SPME<br />
mostraram-se eficientes para a análise dos compostos voláteis majoritários e minoritários de<br />
fermentado de butiá, quando associados às técnicas de separação GC-FID e GC/MS para<br />
quantificação e identificação dos voláteis, respectivamente.<br />
Nos fermentados desenvolvidos foram identificados compostos voláteis importantes para a<br />
formação do aroma característico da fruta de butiá, ou seja, compostos que podem ter permanecido
78<br />
na fração volátil da bebida como, por exemplo, o hexanoato de etila e o acetato de isobutila, álcoois<br />
como o linalol e 1-octanol e ácidos como o ácido hexanóico e butanóico. Além destes compostos<br />
foram identificados também voláteis característicos de fermentação alcoólica e importantes para o<br />
aroma do vinho, como o álcool feniletilico, cinamato de etila, hidroxicinamato de etila, álcool<br />
isoamílico e ácido acético.<br />
Os vinhos fermentados a temperatura de 20 ºC apresentaram maior concentração dos compostos<br />
voláteis em geral. Este fato atribuiu à bebida um odor/sabor mais intenso, em comparação aos<br />
vinhos fermentados a 10 ºC, e também menor aceitação sensorial por parte dos provadores.<br />
Pela análise GC-olfatométrica ficou evidenciada a contribuição negativa dos ácidos hexanóico,<br />
butanóico e isobutanóico ao aroma do fermentado. Tornando-se assim, um desafio tecnológico a<br />
redução dos mesmos para o desenvolvimento da bebida. A origem destes ácidos foi atribuída em<br />
parte a sua presença na matriz, mas também, a hidrólise de seus ésteres correspondentes.<br />
Entre os tratamentos aplicados, a diluição do mosto propiciou o desenvolvimento de uma bebida<br />
de sabor e impressão global de boa aceitação por parte dos consumidores, lembrando descritores<br />
sensoriais característicos do fruto butiá.<br />
Desta forma foi possível contribuir para o entendimento da transformação da matéria-prima,<br />
polpa de butiá, em um produto fermentado, mostrando a viabilidade de aproveitamento da fruta<br />
que apresenta uma vida curta pós-colheita.
79<br />
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