外源性碱性成纤维细胞生长因子对大鼠肌源性干细胞增殖的影响*

第 13 卷 第 27 期 2009–07–02 出版
中国组织工程研究与临床康复
Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research July 2, 2009 Vol.13, No.27
外源性碱性成纤维细胞生长因子对大鼠肌源性干细胞增殖的影响*
吕 丹,姜殿君,张庭深
Effects of exogenous basic fibroblast growth factor on proliferation of rat muscle-derived stem
cells
Lü Dan, Jiang Dian-jun, Zhang Ting-shen
Abstract
BACKGROUND: Muscle-derived stem cells have some problems in purification, amplification and directional differentiation
during in vitro culture. Basic fibroblast growth factor as a membrane of bioactive factor has been paid great attention, due to its
biological activity.
OBJECTIVE: To explore effects of basic fibroblast growth factor on in vitro proliferation of rat muscle-derived stem cells.
DESIGN, TIME AND SETTING: The cytological in vitro study was performed at the Shenyang Medical College from April to July
2008.
MATERIALS: Five healthy male Wistar rats were supplied by Experimental Animal Center, Shenyang Medical College. Basic
fibroblast growth factor was produced by Zhuhai Biological Product Co., Ltd.
METHODS: Left anterior limb triceps brachii was sterilely obtained from rats. Muscle-derived stem cells were harvested by
isolation with enzyme digestion, purified by density gradient centrifugation and differential attachment. At the second passage,
muscle-derived stem cells were treated with basic fibroblast growth factor at final concentration of 6.25, 12.50, 25.00, 50.00,
100.00 μg/L. Cells received 200 μL growth medium as blank control group, and those treated with 200 μL growth medium +
muscle-derived stem cells as negative controls. MTT was added at 24, 48, 72 and 96 hours of culture.
MAIN OUTCOME MEASURES: Immunocytochemical method was used to determine rat muscle-derived stem cells. MTT assay
was utilized to detect cell proliferation.
RESULTS: Muscle-derived stem cells were mostly positive for Sca-1, but few was positive for Desmin. Compared with the
negative control group, various concentrations of basic fibroblast growth factor had significant proliferation effects on
muscle-derived cells (P < 0.05). At 6.25-50.00 μg/L, the proliferation effect became strong with the increased concentration (P <
0.01). At 50.00 μg/L, the proliferation promotion effect nearly reached a peak. Muscle-derived stem cells significantly proliferated
over time. Compared with the negative control group, significant proliferation promotion effect was detected in the basic fibroblast
growth factor groups at 96 hours (P < 0.01).
CONCLUSION: Basic fibroblast growth factor can promote proliferation of rat muscle-derived stem cells in vitro in a dose-time
dependent fashion. 50.00 μg/L and 96 hours are separately good concentration and time for in vitro culture.
Lü D, Jiang DJ, Zhang TS.Effects of exogenous basic fibroblast growth factor on proliferation of rat muscle-derived stem
cells.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2009;13(27): 5271-5275.
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摘要
背景:肌源性干细胞在体外培养过程中存在纯化、扩增、定向分化等难题,碱性成纤维细胞生长因子作为生物活性因子的
一员,因其生物活性的多效性而备受关注。
目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子对大鼠肌源性干细胞体外增殖的影响。
设计、时间及地点:细胞学体外观察,于 2008-04/07 在沈阳医学院完成。
材料:健康雄性 Wister 大鼠 5 只,由沈阳医学院实验动物中心提供。碱性成纤维细胞生长因子为珠海生物制品有限公司产品。
方法:无菌条件下取大鼠左前肢肱三头肌,采用酶消化法分离肌源性干细胞,应用密度梯度离心法和差速贴壁法进行纯化。
2 代肌源性干细胞,分别用终浓度为 6.25,12.50,25.00,50.00,100.00 μg/L 碱性成纤维细胞生长因子进行干预;
取第
200 μL 生长培养基作为空白对照组,以加入 200 μL 生长培养基+肌源性干细胞作为阴性对照组。分别于培养
以单纯加入
24,48,72,96 加入 h 溶液。
MTT
比色法检测细胞增殖情况。
主要观察指标:免疫细胞化学法鉴定大鼠肌源性干细胞,MTT
Sca-1 阳性反应,少数呈 Desmin 阳性反应。①不同浓度碱性成纤维细胞生长因子对肌源性干细
结果:肌源性干细胞多呈
胞的促增殖效应:与阴性对照组比较,各浓度碱性成纤维细胞生长因子组对肌源性干细胞均有明显的促增殖效应(P 0.05); <
6.25~50.00 μg/L 时促增殖作用随其质量浓度升高而显著增强(P < 0.01),至 50.00 μg/L 时其促增殖作用接近顶峰。
浓度为
②碱性成纤维细胞生长因子在不同培养时间点对肌源性干细胞的促增殖效应:随培养时间的延长肌源性干细胞明显增殖,
与阴性对照组比较,碱性成纤维细胞生长因子组出现显著促增殖效应(P 0.01)的时间为培养 < h。 96
结论:碱性成纤维细胞生长因子可促进体外培养的大鼠肌源性干细胞增殖,且呈浓度-时间依赖性增加,50.00 与 μg/L 96 h
为较佳的体外培养质量浓度和时间。
关键词:肌源性干细胞;碱性成纤维细胞生长因子;浓度;培养时间
doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2009.27.014
吕丹,姜殿君,张庭深.外源性碱性成纤维细胞生长因子对大鼠肌源性干细胞增殖的影响[J].中国组织工程研究与临床康复,
2009,13(27):5271-5275. [http://www.crter.org http://cn.zglckf.com]
ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH
基础医学
Department of Basic
Medicine, Shenyang
Medical College,
Shenyang 110034,
Liaoning Province,
China
Lü Dan,
Experimentalist,
Department of Basic
Medicine, Shenyang
Medical College,
Shenyang 110034,
Liaoning Province,
China
ludan1959@163.com
Correspondence to:
Zhang Ting-shen,
Professor,
Department of Basic
Medicine, Shenyang
Medical College,
Shenyang 110034,
Liaoning Province,
China
syzhangts@yahoo.
com.cn
Supported by: a grant
of Education
Committee of
Liaoning Province,
No. 2005L437*
Received: 2009-03-12
Accepted: 2009-05-05
沈阳医学院基础
医学教研室,辽宁
沈 阳 市
省
110034
丹,女,1959
吕
年生,辽宁省沈阳
市人,汉族,1995
年沈阳职工医学
院毕业,实验师,
主要从事组织学
方面的研究。
ludan1959@163.
com
通讯作者:张庭
深,教授,沈阳医
学院基础医学教
研室,辽宁省沈阳
110034
市
syzhangts@
yahoo.com.cn
辽宁省教委资助
课题(2005L437)*
中图分类号:R394.2
文献标识码:B
文章编号:1673-8225
(2009)27-05271-05
收稿日期:2009-03-12
修回日期:2009-05-05
(20090227009/ZS·Q)
5271

0 引言
5272
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肌源性干细胞是一种具有增殖分化潜能的成体干
细胞,有证据表明肌源性干细胞是一群与卫星细胞完全
不同的细胞群,可能是一群未向任何方向定型的原始干
细胞 [1-2] 。由于其具有取材方便、免疫原性低、移植后存
活时间长等优点,广泛用于基因治疗的载体和组织工程
的种子细胞,在基因治疗和组织工程领域内有着广阔的
应用前景 [3-4] 。
现阶段在探讨适宜的干细胞培养条件同时,特别关
注生物活性因子对干细胞增殖的影响 [5-8] 。碱性成纤维细
胞生长因子是由146个氨基酸组成的活性肽,广泛存在
于生物体内,对起源于中胚层、神经外胚层组织和细胞
的存活、生长及促增殖分化具有明显的生物效应 [9-17] 。
研究表明,碱性成纤维细胞生长因子是一种以极微的含
量存在于正常人体(特别是神经组织)内,对中胚层与神
经外胚层源的细胞具有广泛的促进增殖和分化作用;
并作为一种形态发生和分化的诱导因子,存在于机体
的胚胎发育、血管形成、创伤愈合及神经系统发育的
过程中 [7,18] 。目前报道多关注于对神经系统发育和再生
作用,有关碱性成纤维细胞生长因子对肌细胞生长发育
作用的研究报道很少,为此实验进一步探讨碱性成纤维
细胞生长因子对大鼠肌源性干细胞体外增殖的影响。
1 材料和方法
设计:细胞学体外观察。
时间及地点:于2008-04/07在沈阳医学院完成。
材料:健康雄性Wistar大鼠5只,体质量(250±10)g,
由沈阳医学院实验动物中心提供,动物质量合格证号:沈
医动字-2008-015,实验过程中对动物的处置符合2006年
科技部《关于善待实验动物的指导性意见》的规定 [19] 。
主要试剂与仪器:
试剂与仪器 来源
分层液、 北京华美生物试剂公司
Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶、Percoll
培养基、胎牛血清
DMEM/F12
及 Sca-1 免疫组化试剂盒
Desmin
碱性成纤维细胞生长因子
CO2培养箱
倒置显微镜
Olympus
超净台
酶标仪
MTT
武汉博士德生物试剂公司
珠海生物制品有限公司
上海
日本
苏州净化仪器厂
南京
实验方法:
取材:大鼠250 g/L乌拉坦(4 mg/kg)腹腔麻醉后,备
皮,无菌条件下取出左前肢肱三头肌2.0~3.0 g;尽可能
吕丹,等.外源性碱性成纤维细胞生长因子对大鼠肌源性干细胞增殖的影响
剔除脂肪、肌腱,称质量后用D’Hanks液冲洗3次,将
肌组织剪成碎块(以不大于1 mm×1 mm为宜),移
mm×1
min,弃去上层液
入离心管中,加D’Hanks液静置1
D’Hanks液反复吹打2遍,每次静
及漂浮组织。再用
min,均将上层液及其中的漂浮组织去掉。
置1
消化:按1∶10体积比加入1 ℃
g/L透明质酸酶,37
消化,800 r/min离心3 min,弃去上清液。然后按1∶10
体积比加入2.5 g/L胰蛋白酶,37 h(期间吹打数
℃消化1
mL中
次),加入含体积分数为10%胎牛血清的培养基5
止,反复吹打后,上清液依次滤过200目、400目不锈钢
筛网。滤液收集后,1 200 min去上清,细
r/min离心10
胞团块用含体积分数为10%血清的DMEM培养基重悬。
纯化:
PercoⅡ
密度梯度离心法:在离心管中加入60%
2 PercoⅡ 2mL,最后缓慢加入消化
mL、再加入20%
后的细胞悬液2 mL,800 r/min离心20 min,收集60%
Percoll界面处的细胞。
与20%
preplate差速贴壁法 [20-24] :将细胞悬液置入经鼠尾胶
h,贴壁细胞为PP1;未贴壁的
原包被的培养瓶中培养1
h,贴壁细胞为PP2;
细胞悬液转入另一培养瓶中培养2
h转瓶培养至PP6。
同法制备PP3、PP4,以后间隔24
d后换液,以后每天换液1次,
细胞培养:将PP6培养3
倒置显微镜下观察,待细胞长满培养瓶瓶底70%~80%
后,按1∶2比例进行传代培养。
免疫细胞化学染色:将培养的细胞贴片取出,于体积
min,再经甲醇-H2O2混合液
分数为10%甲醛中固定30
(体积分数30% H2O2 min,
1份:甲醇50份)室温孵育30
min×3次;滴加
以阻断内源性过氧化物酶。PBS冲洗5
min,倾余液不洗;分
正常羊血清工作液封闭,室温20
℃
别滴加一抗Sca-1、desmin(兔抗大鼠单克隆抗体),4
min×3次(用PBS缓冲液代替一抗
孵育过夜,PBS冲洗2
℃
作阴性对照);滴加生物素标记二抗(羊抗兔IgG),37
孵育30 min,PBS冲洗2 ℃
min×3次;滴加SABC液,37
孵育20 min×4次;DAB显色,蒸馏水
min,PBS冲洗5
充分冲洗后,苏木精复染,常规脱水,透明,干燥,中
性树胶封固。
苏木精-伊红染色:固定方法同上,0.01 mol/L PBS
min/次,将长有细胞的盖玻片浸入苏木精染液,
洗3次,5
min,自来水浸洗后用稀盐酸乙醇溶液分色数秒,
染色8
min蓝化细胞核,
再用自来水浸洗,然后浸入淡氨水中5
min,自来水洗后脱水透
自来水再次浸洗后伊红染色8
明封固。
MTT比色实验:
加样:第2代肌源性干细胞以0.1%胰酶消化后,用
生长培养基重新悬浮,以5×10 6 L -1 浓度接种于96孔板,
μL/孔。共5块板用于实验,每12孔为1组。A板的
200
P.O. Box 1200, Shenyang 110004 cn.zglckf.com
实验组加入终质量浓度分别为6.25,12.50,25.00,

吕丹,等.外源性碱性成纤维细胞生长因子对大鼠肌源性干细胞增殖的影响
μg/L碱性成纤维细胞生长因子;B,C,
50.00,100.00
D,E板的实验组碱性成纤维细胞生长因子终浓度均为
100.00 μg/L。每块板均设立空白对照组(每孔加200 μL
生长培养基)、阴性对照组(每孔加200 μL生长培养基+
℃、体积分数为5%的CO2孵箱
肌源性干细胞)。置于37
h后换液,生长因子浓度
中培养。A,D,E板均培养60
与初始浓度相同。
h呈色,B,C,D,E、板分
呈色:A板于培养96
别于培养24,48,72,96 h呈色。每孔加入5 g/L MTT
溶液20 μL,37 h后终止培养。吸弃上清液
℃继续孵育4
后每孔加入150 DMSO, μL min,使结晶物充
振荡10
分溶解。用酶联免疫检测仪在490 处测定吸光度值
nm
(A)。
设计、实施、评估者:设计为通讯作者,实施与评
估为全体作者,均经过系统培训,未使用盲法评估。
13.0软件包进
统计学分析:由第一作者通过SPSS
行统计处理,数据以x _
±s表示,组间比较采用方差分析,
两两比较采用Tukey法,P 0.05为差异有显著性意义。
<
2 结果
2.1 体外培养大鼠肌源性干细胞的形态观察
形态学观察:
刚分离、纯化后的PP6细胞呈球形,体积较小,有一定折光性,见图1。
将细胞悬液置入培养瓶中培养,贴壁缓慢,原代培养3 d后PP6中多
数细胞死亡。
贴壁后的肌源性干细胞开始扩增,并逐渐伸展呈细长梭形或纺锤
形,见图2。
随培养时间的延长,相距较近的2个或2个以上的肌源性干细胞趋于
融合,可向对方伸出小的突起,细胞呈网状并逐渐规律性地沿一个
方向平行排列,见图3。
培养至第4天,可在显微镜下见到肌干细胞融合形成的多核肌管,
在适当条件下可见肌管收缩。
Figure 1 After separation and purification, muscle-derived stem
cells presented spherical or elliptical shaped, and with
refraction, and could suspend in medium (×100)
1 刚分离的肌源性干细胞呈圆或椭圆形,有折光性,悬浮于
图
培养液中(×100)
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Figure 2 Muscle-derived stem cells gradually extended, with
spindle-shape at 3 days following adherence (×100)
2 培养 3 d 贴壁后的肌源性干细胞逐渐伸展呈长梭形或纺
图
锤形(×100)
Figure 3 At day 4 after primary culture, adjacent muscle-derived
stem cells began to merge, and sent small processes,
connected each other, and arranged parallelly in a
direction (×200)
3 培养 4 d,相距较近的肌源性干细胞趋于融合,可向对方
图
伸出小的突起,细胞呈网状并逐渐规律性地沿一个方向
平行排列(×200)
苏木精-伊红染色:可见肌源性干细胞平行排列,见
图4。
Figure 4 At day 4 after primary culture, spindle-shaped
muscle-derived stem cells arranged parallelly
(Hematoxylin-eosin staining, ×200)
4 培养 4 d 后呈梭形的肌源性干细胞平行排列(苏木精-伊
图
红染色,×200)
免疫细胞化学染色:肌源性干细胞多呈Sca-1阳性反
应,少数呈Desmin阳性反应,见图5。
ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH 5273

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a: Most of muscle-derived stem cells showed positive reaction containing
brown granules marked by Sca-1
b: Muscle-derived stem cells showed positive reaction containing brown
granules marked by Desmin, but the quantity is less
Figure 5 Immunocytochemical staining of muscle-derived stem
cells at 24 hours of in vitro culture (×200)
图 5 体外培养 24 h 后肌源性干细胞免疫细胞化学染色(×200)
MTT比色实验结果
2.2
不同质量浓度碱性成纤维细胞生长因子对肌源性干细胞
的促增殖效应:与阴性对照组比较,6.25,12.50,25.00,
μg/L碱性成纤维细胞生长因子组对肌源
50.00,100.00
性干细胞均有明显的促增殖效应(P 0.05);碱性成纤维
<
μg/L时促增殖作用
细胞生长因子质量浓度为6.25~50.00
随其质量浓度升高而显著增强(P < 0.01);至50.00 μg/L
μg/L比较差异无显
时其促增殖作用接近顶峰,与100.00
著性意义 (P > 0.05),见表1。
表1 培养96 h时MTT法检测肌源性干细胞增殖Tukey’s
HSD法组间两两比较结果
Table 1 Proliferation of muscle-derived stem cells detected by
MTT assay, results of pairwise comparison by
Tukey’s HSD method at 96 hours (n=12)
Group
Subset for alpha =0.05
1 2 3 4 5
Negative
control
0.337 700
6.25 μg/L 0.360 417
12.50 μg/L 0.372 133
25.00 μg/L 0.449 900
50.00 μg/L 0.515 308
100.00 μg/L 0.522 183
Sig. 1.000 1.000 1.000 1.000 0.245
吕丹,等.外源性碱性成纤维细胞生长因子对大鼠肌源性干细胞增殖的影响
碱性成纤维细胞生长因子在不同培养时间点对肌源性干
细胞的促增殖效应:肌源性干细胞增殖随培养时间的延长
而逐渐明显,与阴性对照组比较,碱性成纤维细胞生
长因子组出现显著促增殖效应(P 0.01)的时间为培养
<
96 h内尽管碱性成纤维细胞生长因子组肌源
h。培养72
性干细胞数量增多,但差异无显著性意义(P 0.05), >
见图6。
Mean
3 讨论
0.60
0.50
0.40
0.30
0.20
0.10
0.00
24 h
48 h
Negative control
Figure 6 Growth curve of muscle-derived stem cells after 96
hours of cell culture
图 6 培养 96 h 内肌源性干细胞的生长曲线
Basic fibroblast growth factor
72 h
96 h
现已证实骨骼肌细胞中不仅存在有碱性成纤维细
胞生长因子特异性受体,而且本身也合成和分泌碱性成
纤维细胞生长因子 [10-13] 。在哺乳类动物体内同时是形态
发生原、促有丝分裂原及分化因子,抗碱性成纤维细胞
生长因子抗体能封锁肌源性干细胞的有丝分裂及分化。
因此,在调控肌卫星细胞活性和肌源性干细胞增殖与分
化方面,碱性成纤维细胞生长因子应具有重要影响。
实验结果表明:①碱性成纤维细胞生长因子具有促
进体外培养的大鼠肌源性干细胞增殖的作用,而且其促
增殖效应随培养时间的延长而逐渐明显。②碱性成纤维
细胞生长因子促增殖效应与其质量浓度关系密切:
12.50~50.00 μg/L其
μg/L效应不明显;在12.50~50.00
促肌源性干细胞增殖效应随其质量浓度增大而提高;大
μg/L其促肌源性干细胞增殖效应则不再明显增
于50.00
加。
尽管碱性成纤维细胞生长因子可促进体外培养的
大鼠肌源性干细胞增殖,而且其效应与其质量浓度关系
密切,但具体作用机制至今还不清楚。是通过与骨骼肌
细胞上碱性成纤维细胞生长因子受体结合启动肌细胞
内信号转导来实现的、还是与可溶性的碱性成纤维细胞
P.O. Box 1200, Shenyang 110004 cn.zglckf.com

吕丹,等.外源性碱性成纤维细胞生长因子对大鼠肌源性干细胞增殖的影响
生长因子受体结合,然后作用于其他具有碱性成纤维细
胞生长因子受体或类似受体的非神经元和非骨骼肌细
胞,改变肌源性干细胞生存的微环境而发挥作用尚需进
一步探讨 [23-30] 。
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来自本文课题的更多信息--
课题价值:课题受辽宁省教委立项资助,项目编号
2005L437,属于提高高位缺损神经的再生效果、促进其再生
神经恢复功能的综合研究的一部分,旨在进一步探讨成体干
细胞的培养条件,为成体骨骼肌干细胞移植、延缓失神经支
配骨骼肌的萎缩速度,提高周围神经损伤的疗效奠定实验基
础,目前已结题。
方法创新: 实验采用近年来提出的 preplate 差速贴壁
方法,成功分离出高纯度的肌源性干细胞。虽然该法步骤繁
琐,细胞污染概率较大,细胞纯化耗时较长,但对细胞的损
伤小,且细胞的纯度可达 90%以上。在实验中注意到预贴壁
的时间长短直接影响肌源性干细胞的纯度,必须基于实验观
察进行调整,而不能直接引用文献。
偏倚或不足: 有关研究表明,碱性成纤维细胞生长因子
在哺乳类动物体内是形态发生原、促有丝分裂原及分化因子,
抗碱性成纤维细胞生长因子抗体能封锁肌源性干细胞的有丝
分裂及分化,因此在调控肌源性干细胞的增殖与分化方面,
碱性成纤维细胞生长因子具有重要影响。实验仅从细胞水平
探讨了碱性成纤维细胞生长因子对肌源性干细胞增殖影响,
有关调控机制及调节信号传导途径尚需深入分析。
ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH 5275