GUÍA DE GENÉTICA 2009 - Facultad de Agronomía

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2. Ingeniería (Diseño) Genética
a) El inserto
El gen cp4 epsps derivado de la cepa CP4 de Agrobacterium tumefaciens codifica la enzima
C4-EPSPS altamente insensible al glifosato. Esta enzima solamente difiere en un aminoácido
de la versión EPSPS de las plantas (alanina por glicina). Las plantas que expresan C4-EPSPS
continúan la síntesis de aminoácidos aromáticos en presencia de glifosato.
b) Secuencias reguladoras y otras señales
La región codificante del gen cp4 epsps se colocó bajo la regulación de un fuerte promotor
constitutivo del Virus del Mosaico de Coliflor (P-CaMV E35S) y termina con la secuencia
terminador (T-nos) del gen nos (nopalina sintetasa) derivado de Agrobacterium tumefaciens
(Fig. 11). Una secuencia de ADN derivada de Petunia x hybrida que codifica para un péptido de
tránsito cloroplástico (CTP4 chloroplast transit peptide) fue clonado en el extremo 5’ del gen.
La secuencia que codifica CTP4 unido a la región codificante del gen cp4 epsps determinan la
producción de una proteína de fusión que facilita la importación de la enzima recientemente
traducida dentro del cloroplasto, donde tanto la ruta de la shikimato como de el sitio de acción
de glifosato están localizado. Una vez importada al cloroplasto, el péptido de tránsito es eliminado
y rápidamente degradado por una proteasa específica.
La EPSPS es ubicua en la naturaleza y por lo tanto no se espera que sea tóxica o alérgena.
Cuando se realizaron análisis comparativos con el banco de secuencias de polipéptidos tóxicos
o alergénicos conocidos, la secuencia de aminoácidos de la enzima no mostró homologías
significativas con ellos.
c) Método desarrollado.
La variedad de soja comercial A5403 (Asgrow Seed Co.) fue transformada por medio de
bombardeo con partículas de oro, con el plasmido vector PV-GMGT04 amplificado en Escherichia
coli (ver Fig. 12). El plásmido contiene el gen cp4 epsps (CP4 EPSPS en el esquema de la
Fig. 11) que confiere tolerancia a glifosato, el genuidA (GUS en la Fig. 12) para la producción de
beta-glucuronidasa como un marcador reportero y el gen nptII para resistencia a antibióticos
(kanamicina) como marcador de selección.
3. Evaluación de las líneas transgénicas
a) Caracterización de la integración y estabilidad en el genoma vegetal
Se caracterizaron diferentes eventos de transformación en cuanto a: número de copias
del casete insertado, presencia de rearreglos y la identificación de las diferentes secuencias
insertadas. En el evento GTS 40-3-2 (Padgette et al., 1995) solo se detectó una copia del “
gen cassette CP4 EPSPS”, consistente en el promotor E35S del Virus del Mosaico de Coliflor
(CaMV), el péptido de tránsito cloroplástico ct4, la secuencia codificadora cp4 epsps, y la señal
de poliadenilación t-nos (Fig. 12).No se detectó incorporación de ninguna región codificadora
externa a la fusión génica al vector plasmídico original.
En posteriores generaciones se demostró que no hubo segregación de la fusión génica
descripta anteriormente, mostrando que la línea GTS 40-3-2 seguía patrones clásicos de herencia,
para la fusión génica. Análisis de ADN durante las seis generaciones siguientes mostraron
que la inserción fue estable.
Estudios de caracterización mas recientes, han mostrado que, durante la integración del
inserto de ADN ocurrieron varios reordenamientos y que, además del inserto funcional primario,
el evento 40-3-2 de soja Roundup Ready contiene dos segmentos pequeños no funcionales
de ADN insertado de 250pb y 72pb respectivamente (Monsanto, 2000; Windels et al., 2001).