GUÍA DE GENÉTICA 2009 - Facultad de Agronomía
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Objetivos Unidad II - Tema 9 2ª parte Ingeniería genética 1. Describir el proceso de ingeniería genética. 2. Analizar comparativamente este proceso con otras tecnología de manipulación genética y genómica. Principales conceptos 1. El diseño del transgen deberá ajustarse al objetivo buscado en cuanto a patrón de expresión (espacial, temporal), origen del transgen, entre otros criterios. 2. Un experimento de transformación genera varios eventos de transformación. 3. En general, numerosos eventos deben evaluarse para identificar el genotipo y fenotipo trasgénico buscado. Desarrollo de la soja Roundup Ready I. Resumen de información: La línea o evento de soja GTS 40-3-2 (Soja RR) fue desarrollada por Monsanto Canada Inc. para permitir el uso del glifosato como un sistema alternativo para control de malezas en la producción de soja (Glicine max). El desarrollo de la línea GTS 40-3-2 se basó en la tecnología del ADN recombinante, a través de la introducción del gen cp4 epsps aislado de la cepa CP4 de Agrobacterium tumefaciens en la variedad comercial de soja "A5403" (Asgrow Seed Company). Este gen bacteriano codifica una variante tolerante al glifosato de la enzima 5-enolpyruvulshikimate-3-fosfato synthasa (EPSPS). II. Descripción de la nueva característica 1. Tolerancia a Glifosato(ver Figura 10) El glifosato (N-fosfometilglicina), ingrediente activo del Roundup, es un herbicida sistémico, post emergente, usado en todo el mundo como un agente no selectivo para control de malezas. Se transloca simplásticamente hacia los meristemas de plantas en crecimiento. El glifosato actúa como un inhibidor competitivo de la enzima 5-enolpyruvylshikimate-3 fosfato synthase (EPSPS), enzima esencial en la ruta metabólica del shikimato encargada de la producción de los aminoácidos aromáticos: fenilalanina, tirosina y triptofano (Fig.10) y se localiza en el cloroplasto (Fig. 10). La inhibición de EPSPS resulta en la acumulación de shikimato y el bloqueo de la síntesis de los aminoácidos aromáticos necesarios tanto para su incorporación en proteínas como en la síntesis de metabolitos secundarios. En consecuencia, la presencia de glifosato determina supresión de crecimiento y muerte de la planta. La vía biosintética del shikimato solamente se encuentra en plantas y microorganismos. Se han clonado los genes correspondientes a las enzimas de la vía. Mutaciones en el gen que codifica EPSPS o su sobre-expresión determinan tolerancia al glifosato en cultivos celulares o plantas. 53
54 2. Ingeniería (Diseño) Genética a) El inserto El gen cp4 epsps derivado de la cepa CP4 de Agrobacterium tumefaciens codifica la enzima C4-EPSPS altamente insensible al glifosato. Esta enzima solamente difiere en un aminoácido de la versión EPSPS de las plantas (alanina por glicina). Las plantas que expresan C4-EPSPS continúan la síntesis de aminoácidos aromáticos en presencia de glifosato. b) Secuencias reguladoras y otras señales La región codificante del gen cp4 epsps se colocó bajo la regulación de un fuerte promotor constitutivo del Virus del Mosaico de Coliflor (P-CaMV E35S) y termina con la secuencia terminador (T-nos) del gen nos (nopalina sintetasa) derivado de Agrobacterium tumefaciens (Fig. 11). Una secuencia de ADN derivada de Petunia x hybrida que codifica para un péptido de tránsito cloroplástico (CTP4 chloroplast transit peptide) fue clonado en el extremo 5’ del gen. La secuencia que codifica CTP4 unido a la región codificante del gen cp4 epsps determinan la producción de una proteína de fusión que facilita la importación de la enzima recientemente traducida dentro del cloroplasto, donde tanto la ruta de la shikimato como de el sitio de acción de glifosato están localizado. Una vez importada al cloroplasto, el péptido de tránsito es eliminado y rápidamente degradado por una proteasa específica. La EPSPS es ubicua en la naturaleza y por lo tanto no se espera que sea tóxica o alérgena. Cuando se realizaron análisis comparativos con el banco de secuencias de polipéptidos tóxicos o alergénicos conocidos, la secuencia de aminoácidos de la enzima no mostró homologías significativas con ellos. c) Método desarrollado. La variedad de soja comercial A5403 (Asgrow Seed Co.) fue transformada por medio de bombardeo con partículas de oro, con el plasmido vector PV-GMGT04 amplificado en Escherichia coli (ver Fig. 12). El plásmido contiene el gen cp4 epsps (CP4 EPSPS en el esquema de la Fig. 11) que confiere tolerancia a glifosato, el genuidA (GUS en la Fig. 12) para la producción de beta-glucuronidasa como un marcador reportero y el gen nptII para resistencia a antibióticos (kanamicina) como marcador de selección. 3. Evaluación de las líneas transgénicas a) Caracterización de la integración y estabilidad en el genoma vegetal Se caracterizaron diferentes eventos de transformación en cuanto a: número de copias del casete insertado, presencia de rearreglos y la identificación de las diferentes secuencias insertadas. En el evento GTS 40-3-2 (Padgette et al., 1995) solo se detectó una copia del “ gen cassette CP4 EPSPS”, consistente en el promotor E35S del Virus del Mosaico de Coliflor (CaMV), el péptido de tránsito cloroplástico ct4, la secuencia codificadora cp4 epsps, y la señal de poliadenilación t-nos (Fig. 12).No se detectó incorporación de ninguna región codificadora externa a la fusión génica al vector plasmídico original. En posteriores generaciones se demostró que no hubo segregación de la fusión génica descripta anteriormente, mostrando que la línea GTS 40-3-2 seguía patrones clásicos de herencia, para la fusión génica. Análisis de ADN durante las seis generaciones siguientes mostraron que la inserción fue estable. Estudios de caracterización mas recientes, han mostrado que, durante la integración del inserto de ADN ocurrieron varios reordenamientos y que, además del inserto funcional primario, el evento 40-3-2 de soja Roundup Ready contiene dos segmentos pequeños no funcionales de ADN insertado de 250pb y 72pb respectivamente (Monsanto, 2000; Windels et al., 2001).
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Objetivos<br />
Unidad II - Tema 9<br />
2ª parte<br />
Ingeniería genética<br />
1. Describir el proceso <strong>de</strong> ingeniería genética.<br />
2. Analizar comparativamente este proceso con otras tecnología <strong>de</strong> manipulación genética y<br />
genómica.<br />
Principales conceptos<br />
1. El diseño <strong>de</strong>l transgen <strong>de</strong>berá ajustarse al objetivo buscado en cuanto a patrón <strong>de</strong> expresión<br />
(espacial, temporal), origen <strong>de</strong>l transgen, entre otros criterios.<br />
2. Un experimento <strong>de</strong> transformación genera varios eventos <strong>de</strong> transformación.<br />
3. En general, numerosos eventos <strong>de</strong>ben evaluarse para i<strong>de</strong>ntificar el genotipo y fenotipo<br />
trasgénico buscado.<br />
Desarrollo <strong>de</strong> la soja Roundup Ready<br />
I. Resumen <strong>de</strong> información:<br />
La línea o evento <strong>de</strong> soja GTS 40-3-2 (Soja RR) fue <strong>de</strong>sarrollada por Monsanto Canada Inc.<br />
para permitir el uso <strong>de</strong>l glifosato como un sistema alternativo para control <strong>de</strong> malezas en la<br />
producción <strong>de</strong> soja (Glicine max).<br />
El <strong>de</strong>sarrollo <strong>de</strong> la línea GTS 40-3-2 se basó en la tecnología <strong>de</strong>l ADN recombinante, a<br />
través <strong>de</strong> la introducción <strong>de</strong>l gen cp4 epsps aislado <strong>de</strong> la cepa CP4 <strong>de</strong> Agrobacterium tumefaciens<br />
en la variedad comercial <strong>de</strong> soja "A5403" (Asgrow Seed Company). Este gen bacteriano codifica<br />
una variante tolerante al glifosato <strong>de</strong> la enzima 5-enolpyruvulshikimate-3-fosfato synthasa<br />
(EPSPS).<br />
II. Descripción <strong>de</strong> la nueva característica<br />
1. Tolerancia a Glifosato(ver Figura 10)<br />
El glifosato (N-fosfometilglicina), ingrediente activo <strong>de</strong>l Roundup, es un herbicida sistémico,<br />
post emergente, usado en todo el mundo como un agente no selectivo para control <strong>de</strong> malezas.<br />
Se transloca simplásticamente hacia los meristemas <strong>de</strong> plantas en crecimiento. El glifosato<br />
actúa como un inhibidor competitivo <strong>de</strong> la enzima 5-enolpyruvylshikimate-3 fosfato synthase<br />
(EPSPS), enzima esencial en la ruta metabólica <strong>de</strong>l shikimato encargada <strong>de</strong> la producción <strong>de</strong><br />
los aminoácidos aromáticos: fenilalanina, tirosina y triptofano (Fig.10) y se localiza en el<br />
cloroplasto (Fig. 10). La inhibición <strong>de</strong> EPSPS resulta en la acumulación <strong>de</strong> shikimato y el bloqueo<br />
<strong>de</strong> la síntesis <strong>de</strong> los aminoácidos aromáticos necesarios tanto para su incorporación en proteínas<br />
como en la síntesis <strong>de</strong> metabolitos secundarios. En consecuencia, la presencia <strong>de</strong> glifosato<br />
<strong>de</strong>termina supresión <strong>de</strong> crecimiento y muerte <strong>de</strong> la planta. La vía biosintética <strong>de</strong>l shikimato<br />
solamente se encuentra en plantas y microorganismos. Se han clonado los genes<br />
correspondientes a las enzimas <strong>de</strong> la vía. Mutaciones en el gen que codifica EPSPS o su<br />
sobre-expresión <strong>de</strong>terminan tolerancia al glifosato en cultivos celulares o plantas.<br />
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