Zbornik - Društvo genetičara Srbije

II-Pos-2 ZBORNIK ABSTRAKATA III KONGRESA GENETIÈARA SRBIJE 57
Subotica, 30. novembar - 4. decembar 2004.
ULOGA OPŠTEG TRANSKRIPCIONOG FAKTORA NFY U REGULACIJI
EKSPRESIJE HUMANOG SOX3 GENA
A. Krstiæ, Marija Mojsin, Nataša Kovaèeviæ-Grujièiæ i Milena Stevanoviæ
Institut za molekularnu genetiku i genetièko inenjerstvo, Beograd
Rani stadijumi neurogeneze i neuronalne diferencijacije su precizno kontrolisani serijom
gena. Sox3 gen je eksprimiran u mozgu veæ u najranijim fazama razviæa. Smatra se da je
ovaj gen jedan od najranijih neuralnih markera kod kièmenjaka, odreðujuæi sudbinu
neurona.
Da bi se rasvetlili molekularni mehanizmi odgovorni za ekspresiju humanog SOX3 gena
korišæen je kompjuterski program ( MatInspector) koji pretrauje baze podataka vezivnih
matriksa, a sa ciljem identifikacije potencijalnih mesta vezivanja transkripcionih faktora u
promotoru humanog SOX3 gena. Niz potencijalnih vezivnih mesta za poznate transkripcione
faktore je identifikovan u 5’ nekodirajuæem regionu humanog SOX3 gena. Prisustvo
tri evolutivno konzervisana CCAAT boksa, koji predstavlja potencijalno vezivno
mesto za opšti transkripcioni faktor NFY, sugeriše moguæi znaèaj ovog faktora u regulaciji
ekspresije humanog SOX3 gena. Eksperimenti smanjene elktroforetske pokretljivosti i
modifikacija ove metode uz upotrebu specifiènih antitela dokazuju specifiènost vezivanja
transkripcionog faktora NFY za sva tri identifikovana CCAAT kontrolna elementa.
Da bi se ispitalo da li je potencijalni CCAAT boks funkcionalan, uraðena je poziciono
usmerena mutageneza. Sposobnost da utièe na ekspresiju cat gena u NT2/D1 æelijskoj
liniji, poreðena je izmeðu mutiranog i nemutiranog konstrukta. Pokazano je da je
mutageneza CCAAT boksa (-101 bp do -105 bp) umanjila ekspresiju reporter gena više
od 5 puta u poreðenju sa ekspresijom nemutiranog konstrukta. Ovaj rezultat ukazuje da
CCAAT boks vezivni domen prisutan u promotoru SOX3 gena ima funkcionalnu ulogu u
transkripciji ovog gena.
THE ROLE OF THE GENERAL TRANSCRIPTION FACTOR NFY IN THE
REGULATION OF THE EXPRESSION OF HUMAN SOX3 GENE
Early stadiums of the neurogenesis and neuronal differentiation are precisely controlled
by a series of genes. Sox3 is expressed in the brain from the earliest stages of development.
It is considered to be one of the earliest neural markers in vertebrates playing the
role in specifying neuronal fate.
In order to elucidate molecular mechanisms underlying the regulation of the human
SOX3 gene expression, computer prediction software (MatInspector) was used to search
the matrix family library database and to identify potential transcription binding sites in
the human SOX3 promoter. The number of putative consensus binding sites for known
transcription factors was identified in the 5’ noncoding region of the human SOX3 gene.
The presence of three evolutionary conserved CCAAT boxes, representing the putative
binding sites for the general transcription factor NFY, suggests the potential importance
of this factor in the regulation of the human SOX3 gene expression. EMSA and
«supershift» experiments are performed to prove the specificity of the NFY binding to all
three identified CCAAT control elements.
To examine whether the putative CCAAT box is functional, site directed mutagenesis
was done. The ability of the mutant and its wild-type counterpart to drive expression of
the cat reporter gene was compared in NT2/D1 cell line. We have shown that mutagenesis
of the CCAAT box (-101 bp to -105 bp) reduced the expression of the reporter gene
more than 5-fold when compared to the wild-type expression. This result indicates that
the CCAAT box motif present in the SOX3 promoter plays a functional role in the transcription
of this gene.