Zbornik - Društvo genetičara Srbije
Zbornik - Društvo genetičara Srbije
Zbornik - Društvo genetičara Srbije
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
II-Pos-2 ZBORNIK ABSTRAKATA III KONGRESA GENETIÈARA SRBIJE 57<br />
Subotica, 30. novembar - 4. decembar 2004.<br />
ULOGA OPŠTEG TRANSKRIPCIONOG FAKTORA NFY U REGULACIJI<br />
EKSPRESIJE HUMANOG SOX3 GENA<br />
A. Krstiæ, Marija Mojsin, Nataša Kovaèeviæ-Grujièiæ i Milena Stevanoviæ<br />
Institut za molekularnu genetiku i genetièko inenjerstvo, Beograd<br />
Rani stadijumi neurogeneze i neuronalne diferencijacije su precizno kontrolisani serijom<br />
gena. Sox3 gen je eksprimiran u mozgu veæ u najranijim fazama razviæa. Smatra se da je<br />
ovaj gen jedan od najranijih neuralnih markera kod kièmenjaka, odreðujuæi sudbinu<br />
neurona.<br />
Da bi se rasvetlili molekularni mehanizmi odgovorni za ekspresiju humanog SOX3 gena<br />
korišæen je kompjuterski program ( MatInspector) koji pretrauje baze podataka vezivnih<br />
matriksa, a sa ciljem identifikacije potencijalnih mesta vezivanja transkripcionih faktora u<br />
promotoru humanog SOX3 gena. Niz potencijalnih vezivnih mesta za poznate transkripcione<br />
faktore je identifikovan u 5’ nekodirajuæem regionu humanog SOX3 gena. Prisustvo<br />
tri evolutivno konzervisana CCAAT boksa, koji predstavlja potencijalno vezivno<br />
mesto za opšti transkripcioni faktor NFY, sugeriše moguæi znaèaj ovog faktora u regulaciji<br />
ekspresije humanog SOX3 gena. Eksperimenti smanjene elktroforetske pokretljivosti i<br />
modifikacija ove metode uz upotrebu specifiènih antitela dokazuju specifiènost vezivanja<br />
transkripcionog faktora NFY za sva tri identifikovana CCAAT kontrolna elementa.<br />
Da bi se ispitalo da li je potencijalni CCAAT boks funkcionalan, uraðena je poziciono<br />
usmerena mutageneza. Sposobnost da utièe na ekspresiju cat gena u NT2/D1 æelijskoj<br />
liniji, poreðena je izmeðu mutiranog i nemutiranog konstrukta. Pokazano je da je<br />
mutageneza CCAAT boksa (-101 bp do -105 bp) umanjila ekspresiju reporter gena više<br />
od 5 puta u poreðenju sa ekspresijom nemutiranog konstrukta. Ovaj rezultat ukazuje da<br />
CCAAT boks vezivni domen prisutan u promotoru SOX3 gena ima funkcionalnu ulogu u<br />
transkripciji ovog gena.<br />
THE ROLE OF THE GENERAL TRANSCRIPTION FACTOR NFY IN THE<br />
REGULATION OF THE EXPRESSION OF HUMAN SOX3 GENE<br />
Early stadiums of the neurogenesis and neuronal differentiation are precisely controlled<br />
by a series of genes. Sox3 is expressed in the brain from the earliest stages of development.<br />
It is considered to be one of the earliest neural markers in vertebrates playing the<br />
role in specifying neuronal fate.<br />
In order to elucidate molecular mechanisms underlying the regulation of the human<br />
SOX3 gene expression, computer prediction software (MatInspector) was used to search<br />
the matrix family library database and to identify potential transcription binding sites in<br />
the human SOX3 promoter. The number of putative consensus binding sites for known<br />
transcription factors was identified in the 5’ noncoding region of the human SOX3 gene.<br />
The presence of three evolutionary conserved CCAAT boxes, representing the putative<br />
binding sites for the general transcription factor NFY, suggests the potential importance<br />
of this factor in the regulation of the human SOX3 gene expression. EMSA and<br />
«supershift» experiments are performed to prove the specificity of the NFY binding to all<br />
three identified CCAAT control elements.<br />
To examine whether the putative CCAAT box is functional, site directed mutagenesis<br />
was done. The ability of the mutant and its wild-type counterpart to drive expression of<br />
the cat reporter gene was compared in NT2/D1 cell line. We have shown that mutagenesis<br />
of the CCAAT box (-101 bp to -105 bp) reduced the expression of the reporter gene<br />
more than 5-fold when compared to the wild-type expression. This result indicates that<br />
the CCAAT box motif present in the SOX3 promoter plays a functional role in the transcription<br />
of this gene.