Zbornik - Društvo genetičara Srbije

II-Usm-4 ZBORNIK ABSTRAKATA III KONGRESA GENETIÈARA SRBIJE 51
Subotica, 30. novembar - 4. decembar 2004.
TIAZOFURIN NE DOVODI DO OŠTEÆENJA DNK U KOMET TESTU
N. Ðeliæ 1 , Biljana Spremo-Potpareviæ 2 , Lada ivkoviæ 2 iV.Bajiæ 3
1 Katedra za biologiju, Fakultet veterinarske medicine, Univerzitet u Beogradu, Beograd
2 Institut za fiziologiju, Farmaceutski fakultet, Univerzitet u Beogradu, Beograd
3 Institut za biomedicinska istraivanja, «Galenka», Beograd
Tiazofurin predstavlja nukleozid sa izraenim antitumorskim dejstvom. Intracelularno,
tiazofurin se metabolièki konvertuje do tiazol-4-karboksamid adenin dinukleotida (TAD),
analoga nikotinamid adenin dinukleotida (NAD), koji snano inhibira IMP dehidrogenazu.
Usled inhibicije IMP dehidrogenaze kao kljuènog enzima u de novo sintezi purinskih
nukleotida, dolazi do pada guanilata i na taj naèin se postie inhibicija rasta tumora kako in
vitro,takoiin vivo.
Cilj ovog rada bio je da se utvrdi da li tiazofurin moe da dovede do ošteæenja molekula
DNK u humanim limfocitima, detektabilnih Komet testom (elektroforeza DNK pojedinaènih
æelija, engl. single cell gel electrophoresis). Cela krv je izlagana eksperimentalnim koncentracijama
(0.001, 0.002, 0.004 i 0.006 M) u trajanju od 30 min ili 2 sata na 37°C. Nakon
tretmana i provere citotoksiènosti pomoæu tripan plavog, uzorci su centrifugirani, a zatim su
æelije su resuspendovane u agarozi niske taèke topljenja, nanete na prethodno pripremljena
predemetna stakla i ostavljena u rastvoru za liziranje na +4°C preko noæi. Sutradan je posle
denaturacije DNK u puferu sa pH>13, izvršena elektroforeza u istom puferu na 0,7 V/cm.
Nakon neutralizacije alkalija, predmetna stakla su odmah bojena etidijum bromidom i obavljena
je analiza dobijenih kometa. Analizirano je taèno po 200 kometa za svaku
eksperimentalnu koncentraciju. Statistièka analiza uraðena je neparametrijskim
Wilcoxon-ovim testom.
Tiazofurin u ispitanim koncentracijama nije ispoljio znaèajnu citotoksiènost (u svim
uzorcima bilo je preko 90% vijabilnih limfocita). Pored toga, ne postoji statistièki znaèajno
odstupanje u stepenu ošteæenja DNK u odnosu na kontrolne (netretirane) uzorke,
kako pri tretmanu od 30 min, tako i pri tretmanu od 2 h. Na osnovu toga, moe se
zakljuèiti da je rezultat testiranja tiazofurina u in vitro Komet testu negativan.
TIAZOFURIN DO NOT INDUCE DNA DAMAGE IN THE COMET ASSAY
Tiazofurin is a nucleoside with a profound antitumor effects. Tiazofurin is metabolically
converted intracellularly to an analogue of nicotin amide adenin dinucelodide (NAD),
tiazole-4-carboxamide adenine dinucleotide (TAD), a potent inhibitor of IMP dehydrogenase.
Inhibition of this rate-limiting enyzme for de novo purine synthesis results in reduced
levels of guanylates, inhibiting tumor growth in vitro and in vivo.
The objective of the present investigation was to examine whether tiazofurin induces
DNA damage in human lymphocytes detectable by single cell gel electrophoresis
(Comet) assay. The whole peripheral venous blood was exposed to four experimental
concentrations of tiazofurin (0.001, 0.002, 0.004 i 0.006 M) for either 30 min or 2 h at
37°C. After the treatment, we checked cytotoxicity using trypan blue dye exclusion. The
samples were centrifugated, the cell pellet was resuspended in pre-heated low melting
point agarose and layed on the precoated slides. Afterwards, the slides were left in lysing
solution at +4°C overnight. Tomorrow, we performed DNA unwinding and electrophoresis
in alkaline buffer (pH>13) at 0,7 V/cm. After the neutralisation of alkali, slides were
stained with ethidium bromide and the comets were immediately scored. For each experimental
concentration and exposure time we analysed exactly 200 comets. Statistical
analyisis was performed by non-parametric Wilcoxon rank-sum test.
Tiazofurin has not expressed significant cytotoxicity at any experimental point (lymphocyte
viability was over 90%). Moreover, there is no significant departure in DNA damage