Εργαστηριακή άσκηση - ΤΕΙ Αθήνας

ΛΗΨΗ ΦΑΣΜΑΤΩΝ ΟΡΑΤΟΥ-ΥΠΕΡΙΩΔΟΥΣ (UV-VIS):
ΧΡΗΣΗ ΤΟΥ ΝΟΜΟΥ ΤΟΥ BEER ΣΤΗΝ ΕΝΟΡΓΑΝΗ ΠΟΣΟΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ
1. Σκοπός της Άσκησης
Στην παρούσα άσκηση, θα εξεταστούν οι ταινίες απορρόφησης σε ένα φάσμα ορατού-υπεριώδους μιας
κόκκινης χρωστικής. Θα γίνει εξοικείωση των σπουδαστών με την οργανολογία της τεχνικής.
Στη συνέχεια θα ληφθεί το φάσμα υπερύθρου διαλυμάτων μιας κόκκινης χρωστικής, θα γίνει αναγνώριση
των κορυφών (ή ταινιών απορρόφησης) και θα εξαχθούν συμπεράσματα για την ταυτότητα του υλικού.
2. Γενικά
Τα φάσματα UV-ορατού είναι διαγράμματα της έντασης της απορρόφησης της ακτινοβολίας (δηλ. του
φωτός) συναρτήσει του μήκους κύματος λ (δηλ. του χρώματος της ακτινοβολίας) που εκφράζεται σε nm.
Η ένταση της απορρόφησης εκφράζεται είτε ως απορροφητικότητα (Α), είτε ως % διαπερατότητα (%Τ) και
εμφανίζονται σαν κωδωνοειδείς καμπύλες που εμφανίζουν κάποια μέγιστα ή ελάχιστα αντίστοιχα.
Ένα σύγχρονο φασματοφωτόμετρο UV-ορατού περιλαμβάνει μια πηγή υπεριώδους-ορατού με λυχνία
βολφραμίου (ορατό) και λυχνία δευτερίου (υπεριώδες), οπτική σχεδίαση διπλής δέσμης, έναν ανιχνευτή
βασισμένο σε ένα φωτοπολλαπλασιαστή (PMT) και ελέγχεται τοπικά από Η/Υ.
ΤΕΙ Αθήνας
ΣΑΕΤ
1
Σχήμα 1: Διάγραμμα και
φωτογραφία τυπικού
φασματοφωτομέτρου UV-ορατού.

Σε ένα φάσμα UV-ορατού αποδίδεται πληροφορία που σχετίζεται με τις ηλεκτρονιακές μεταπτώσεις στις
χρωμοφόρες ομάδες των οργανικών μορίων, καθώς και με μεταπτώσεις μεταξύ των τροχιακών των
ανόργανων αλάτων. Όλα τα οργανικά και ανόργανα μόρια απορροφούν σε κάποια περιοχή, κυρίως μέσα
στο UV. Στην παρούσα άσκηση θα ασχοληθούμε με οργανικές χρωστικές και συνεπώς θα μας
απασχολήσουν οι μεταπτώσεις μεταξύ μοριακών τροχιακών στις χρωμοφόρες ομάδες.
Οι πιο συνήθεις ηλεκτρονιακές μεταπτώσεις είναι οι σσ* αφού αντιστοιχούν στους δεσμούς σ, οι οποίοι
είναι οι πιο συχνοί στα οργανικά μόρια.
Δεσμός παράδειγμα μετάπτωση λmax ε (ένταση) διαλύτης
C–H CH4 σσ* 122 ισχυρή αέρια φάση
C–C CH3–CH3 σσ* 135 ισχυρή αέρια φάση
C=C CH2=CH2 ππ* 162 15000 εξάνιο
(CH3)2C=C(CH3)2 ππ* 196 11500 εξάνιο
C–Cl CH3Cl nσ* 173 200 εξάνιο
C–Br n-C3H7Br nσ* 208 300 εξάνιο
C–I CH3I n σ* 259 400 εξάνιο
C–O CH3OH n σ* 177 200 εξάνιο
CH3OCH3 n σ* 184 2500 αέρια φάση
C–N (C2H5)2NH n σ* 193 2500 εξάνιο
C=O (CH3)2C=O n σ* 166 16000 αέρια φάση
π π* 189 900 εξάνιο
n π* 279 15 εξάνιο
CH3COOH n π* 200 50 αέρια φάση
CH3COONa n π* 210 150 νερό
CH3COOC2H5 n π* 210 50 αέρια φάση
CH3CONH2 n π* 220 63 νερό
Η λήψη των φασμάτων θα γίνει
σε κυψελίδες UV-ορατού από
ΤΕΙ Αθήνας
χαλαζία, σχήματος
τετραγωνικού πρίσματος (δηλ.
παραλληλεπιπέδου με δυο έδρες
τετράγωνες). Η διαδρομή του
φωτός αντιστοιχεί στο πάχος
της κυψελίδας που συνήθως
είναι 1 cm.
Ο νόμος των Beer-Lambert
Σχήμα 2: Είδη κυψελίδων ειδικών χρήσεων για φασματοφωτομετρία UV-vis:
Από αριστερά, κυψελίδα διαδρομής 0.1 cm, θερμοστατούμενη κυψελίδα και δυο
κυψελίδες-αντιδραστήρες (όπου παρατηρούνται οι απορροφήσεις των
αντιδρώντων και προϊόντων των αντιδράσεων)
ΣΑΕΤ
Μια συνήθης εφαρμογή της φασματοσκοπίας απορρόφησης UV-vis είναι ο ποσοτικός προσδιορισμός των
συγκεντρώσεων αγνώστων διαλυμάτων. Η μέθοδος στηρίζεται στη γραμμική σχέση που ισχύει μεταξύ των
2

τιμών της απορροφητικότητας και των συγκεντρώσεων διαφόρων διαλυμάτων της ίδιας ουσίας. Η σχέση
αυτή δίνεται από τον νόμο Beer-Lambert:
Α= εcl
Όπου
Α: απορροφητικότητα (καθαρός αριθμός)
ε: ο συντελεστής μοριακής απορρόφησης
c: η συγκέντρωση του διαλύματος
l: το μήκος διαδρομής της δέσμης μέσα στην κυψελίδα (ίση με το
πάχος της κυψελίδας)
Ο νόμος του Beer ισχύει γενικά για αραιά διαλύματα, τα οποία στις μετρήσεις τους δίνουν τιμές
απορροφητικότητας (Α) το πολύ μέχρι 2.5. Στα πυκνότερα διαλύματα, επειδή τα μόρια είναι πιο
συνωστισμένα στον δεδομένο όγκο υγρού, η απορρόφηση της ακτινοβολίας δεν γίνεται τόσο
αποτελεσματικά, οπότε οι τιμές των Α είναι μικρότερες των αναμενόμενων. Στο παρακάτω διάγραμμα
απεικονίζεται γραφικά η σχέση Beer-Lambert και η γραμμική περιοχή ισχύος της.
ΤΕΙ Αθήνας
Στην πράξη, μπορούμε να καταστρώσουμε μια καμπύλη βαθμονόμησης απορροφητικότηταςσυγκεντρώσεων
σε κάποιο επιλεγμένο μήκος κύματος (λ) του φάσματος απορρόφησης μιας χημικής
ένωσης. Στη συνέχεια, από αυτή μπορούμε να υπολογίσουμε την συγκέντρωση οποιουδήποτε άγνωστου
διαλύματος της ίδιας ένωσης, αφού μετρήσουμε την απορροφητικότητά της στο ίδιο λ. Αυτό αποτελεί και
αντικείμενο της παρούσας εργαστηριακής άσκησης.
ΣΑΕΤ
3

3. Πειραματική Διαδικασία
4.1. Οι φοιτητές θα χρησιμοποιήσουν το φασματοφωτόμετρο διπλής δέσμης του εργαστηρίου για να
ληφθούν τα φάσματα ορατού-υπεριώδους ενός δείγματος κόκκινης οργανικής χρωστικής (αλιζαρίνη,
πουρπουρίνη, ή κοχενίλλη) και εν συνεχεία, να κάνουν ποιοτική και ποσοτική αποτίμηση των φασμάτων.
HO
HO
O
O
O
HO
HO
HO
OH
O
HO
OH
ΤΕΙ Αθήνας
ΣΑΕΤ
4
OH
Κοχενίλλη (cochineal) ή καρμινικό οξύ
Natural Red 4, C.I. 75470
MB=492.38 g/mol
i. Παρασκευή διαλύματος χρωστικής (το στάδιο αυτό μπορεί να παραλειφθεί αφού τα διαλύματα είναι
προετοιμασμένα από την προηγούμενη): Ζυγίζεται ποσότητα 0.01231 g κοχενίλλης (0.25mmol,
MB=492.38 g/mol, βλ. σχήμα) στην οποία προστίθεται μικρή ποσότητα διαλύτη (νερό) εντός
ογκομετρικής φιάλης 50 ml, αναδεύεται καλά μέχρι να διαλυθεί όλη η ποσότητα του στερεού και στη
συνέχεια προστίθεται νέα ποσότητα διαλύτη μέχρι τη χαραγή. Με αυτό τον τρόπο έχει παρασκευαστεί
stock υδατικό διάλυμα συγκέντρωσης 5×10 -4 M. Από αυτό θα παρασκευαστούν πέντε αραιότερα
διαλύματα γνωστής συγκέντρωσης.
ii. Παρασκευή διαλυμάτων γνωστών συγκεντρώσεων : Από το έντονα ερυθρό διάλυμα που προκύπτει
γίνονται κατάλληλες διαδοχικές αραιώσεις σε ισάριθμες ογκομετρικές φιάλες των 10ml ώστε να
προκύψουν «γνωστά» διαλύματα συγκεντρώσεων 1.0x10 -5 M, 2.0x10 -5 M, 5.0x10 -5 M, 7.0x10 -5 M, και
1.0x10 -4 M.
iii. Στη συνέχεια, λαμβάνονται τα φάσματα UV-vis από όλα τα δείγματα ξεκινώντας από το αραιότερο
διάλυμα ως εξής: στην πρώτη κυψελίδα προστίθεται το αντίστοιχο διάλυμα της χρωστικής (διάλυμα
προς μέτρηση, τοποθετείται στην πρόσθια θέση του χώρου δειγμάτων όπου διέρχεται η δέσμη του
δείγματος) και στην δεύτερη κυψελίδα προστίθεται μόνο καθαρός διαλύτης (νερό, δείγμα αναφοράς,
τοποθετείται στην πίσω θέση του χώρου δειγμάτων όπου διέρχεται η δέσμη αναφοράς). Δεν χρειάζεται
να ληφθεί φάσμα του υποβάθρου (background) αφού χρησιμοποιείται φασματοφωτόμετρο διπλής
δέσμης κατά το οποίο γίνεται αυτόματη αφαίρεσή του δείγματος αναφοράς (αφαιρείται φάσμα του
υλικού της κυψελίδας-χαλαζίας και του διαλύτη).
iv. Εμφανίζονται στην οθόνη τα φάσματα των δειγμάτων σε μορφή απορροφητικότητας (Α, Absorbance
mode) και εντοπίζονται οι ταινίες (ή κορυφές) απορρόφησης με τα μήκη κύματός τους.

v. Επιλέγεται η ταινία απορρόφησης με μέγιστο στο λmax = 518nm και καταγράφονται τα ακριβείς τιμές
απορροφητικότητας A σε κάθε διάλυμα. Αυτές θα ονομαστούν Α1max, Α2max, Α3max … αντίστοιχα.
vi. Κατασκευάζεται πίνακας (στο Excel) με πρώτη στήλη τον αύξοντα αριθμό του δείγματος, δεύτερη
στήλη με τις συγκεντρώσεις των διαλυμάτων και τρίτη στήλη με τις τιμές των Α που μετρήθηκαν για
τo λmax στα 518nm. O πίνακας θα έχει τη μορφή:
Δείγμα C (M, mol/l)
1 1.0x10 -5 M
2 2.0x10 -5 M
3 5.0x10 -5 M
4 7.0x10 -5 M
5 1.0x10 -4 M
Amax
(λmax = 518nm)
vii. Από τα δεδομένα του πίνακα κατασκευάζεται γραφική παράσταση με την Πρότυπη Καμπύλη Αναφοράς
(ή βαθμονόμησης) συγκεντρώσεων-απορροφήσεων στο συγκεκριμένο λ, όπου τα πέντε σημεία θα
πρέπει να βρίσκονται σε ευθεία γραμμή. Ο οριζόντιος άξονας θα περιλαμβάνει τις τιμές των
συγκεντρώσεων [c] και ο κατακόρυφος τις τιμές των Α.
viii. Από το Excel επιλέγουμε να εμφανιστεί η γραμμή τάσης (trendline) η οποία αποτελεί την ευθεία
ελαχίστων τετραγώνων για τα πέντε αυτά σημεία.
ix. Από το Excel επιλέγουμε να εμφανιστεί και η τιμή του συντελεστή συσχέτισης (R 2 ). Τώρα έχουμε μια
εκτίμηση για την ποιότητα των μετρήσεων του Α στα πέντε διαλύματα. Η κάθε μια από τις τρεις
γραφικές παραστάσεις θα πρέπει να φαίνονται περίπου όπως στο Σχήμα:
x. Στη συνέχεια υπολογίζεται η κλίση της ευθείας: εφφ=Α / [c].
xi. Με τη βοήθεια του νόμου του Beer, από την κλίση υπολογίζουμε την τιμή του συντελεστή μοριακής
απορρόφησης ε= εφφ/l, όπου l θα τεθεί το πάχος της κυψελίδας (1cm). Μονάδες του ε: l.mol -1 .cm -1 .
Θα υπολογιστεί η τιμή του ε στο λmax = 518nm.
ΤΕΙ Αθήνας
Εύρεση της συγκέντρωσης αγνώστου διαλύματος.
xii. Στη συνέχεια λαμβάνεται το φάσμα απορρόφησης UV-ορατού από διάλυμα άγνωστης συγκέντρωσης,
από το οποίο καταγράφεται η τιμή των Α για το μήκος κύματος λmax = 518nm.
xiii. Η τιμή της απορροφητικότητας Α κάθε αγνώστου διαλύματος τοποθετείται την Πρότυπη Καμπύλη
Αναφοράς και από τη θέση του υπολογίζεται η αντίστοιχη συγκέντρωση κάθε διαλύματος.
ΣΑΕΤ
5

4. Έκθεση και ερμηνεία των αποτελεσμάτων
Στην εργασία, θα πρέπει να εμφανίζεται ο πίνακας με τις τιμές Α των τριών μηκών κύματος όλων των
δειγμάτων, τα τρία αντίστοιχα διαγράμματα απορροφητικότητας (Α) – συγκεντρώσεων και οι υπολογισμοί
των συντ. μοριακής απορρόφησης (ε). Τέλος να εμφανίζεται ο τρόπος εύρεσης της συγκέντρωσης του
αγνώστου διαλύματος.
5. Ερωτήσεις
i. Πώς θα ήταν η Πρότυπη Καμπύλη Αναφοράς εάν στον κατακόρυφο άξονα υπήρχε η διαπερατότητα
Τ, αντί της απορροφητικότητας Α;
ii. Στο χημικό τύπο της κοχενίλλης, εντοπίστε τις χρωμοφόρες και τις αυξόχρωμες ομάδες.
iii. Ποιο τμήμα του μορίου πιστεύετε ότι δεν απορροφά καθόλου στο ορατό;
6. Βιβλιογραφία
1. SKOOG, HOLLER, NIEMAN, Αρχές Ενόργανης Ανάλυσης, εκδόσεις Κωσταράκη, Αθήνα 2010.
2. D. C. HARRIS, Exploring Chemical Analysis, W. H. Freeman, 1997
3. Ρ. Μ. SILVERSTEIN, F. X. WEBSTER and D. J. KIEMLE, Spectroscopic Identification of Organic
Compounds, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ, 2004
4. LAMBERT, SHURVEL, LIGHTNER and COOKS, Introduction to Organic Spectroscopy,
MacMillan, 1986
ΤΕΙ Αθήνας
ΣΑΕΤ
6