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乌司他丁调控脓毒症大鼠
TNF-α 与 IL-6 及 IL-10 水平的研究
施 荣 熊旭东 李淑芳
*1
*2
, ,
上海中医药大学附属曙光医院 GICU, 上海 200021
【摘 要】 目的: 探讨乌司他丁对脓毒症大鼠血清 TNF-α、
IL-6、 IL-10 水平的调控作用。 方法: 将雄性 SD 大
鼠随机分为正常对照组、假手术组、模型组和乌司他丁组。采用盲肠结扎穿孔术 (CLP) 制备脓毒症模型 , 于造模后
2.0, 8.0, 12.0, 24.0 h 处死大鼠 , 双抗体夹心酶联免疫吸附法 (ELISA) 测定血清 TNF-α、 IL-6、 IL-10 水平 ; 留取完整左
肺组织行病理切片 , 评估肺脏损伤情 况。 结果: 模型组各时间点 TNF- α、
IL-6、 IL-10 水平均高于假手术组 ( P <
0.05); 乌司他丁组与模型组相比 , 除 24.0 h 外 TNF- α 水平明显降低 ( P < 0.01), IL-6 水平各时间点均明显下降 ( P < 0.01),
IL-10 水平各时间点均明显升高 ( P < 0.01), 病理切片显示乌司他丁组肺损伤轻于模型组。 结论: 乌司他丁能下调脓
毒症大鼠 TNF-α 、 IL-6 水平 , 对 IL-10 有上调作用 , 并能减轻脓毒症肺损伤。
【关键词】 乌司他丁 ; 脓毒症 ; 肿瘤坏死因子 -α; 白介素 -6; 白介素 -10
【中图分类号】 R 965 【文献标识码】 A 【文章编号】 1672-7878(200 9)01-0016-04 Study of Ulinastatin on Level of TNF-α, IL-6 and IL-10 in Rats with Sepsis
*1 *2
SHI Rong , XIONG Xu-dong , LI Shu-fang
【 ABS TRACT】 O bjective: To investigate the regulating effect of ulinastatin on the serumal level of TNF-α,
IL-6 and
IL-10 with sepsis in the rats. Methods: Male SD rats were randomly divided into four groups: normal control group, sham
group, cecal ligation and puncture (CLP) group and ulinastatin pretreated group. Cecal ligation and puncture (CLP) were
performed to make sepsis model. Rats were sacrificed at 2.0, 8.0, 12.0 and 24.0 h, the level of the TNF-α,
IL-6 and IL-10
were examined with ELSA and left lung tissue was obtained to observe the pathological changes under microscope. Results:
In com
parison with the sham group, the level of the TNF-α , IL-6 and IL-10 increased in CLP group ( P < 0.05). The leve l of
TNF-α in ulinastatin pr etreated group was much lower than that in CLP group ( P < 0.01) besides 24.0 h group. The leve l of
IL-6 in ulinastatin pretreated group was much lower than that in CLP group ( P < 0.01). The level of IL-10 in the CLP gr oup
showed significant difference from the ulinastatin pretreated group ( P < 0.01). HE-stain ed sections reve aled that ulinast atin
attenuated lung injury. Conclusion: The ulinastatin can downregulate the level of the TNF-α and IL-6 can upregulate the
level of the IL-10 obviously and attenuate lung injury in sepsis.
【 KEY WORDS】
抗 感 染 药 学
Shangh ai Shuguang Hospital, GI CU, Shanghai 200021, China
ulinastatin; sepsis; TNF-α;
IL-6; IL-10
Anti Infect Pharm
2009 March; 6(1)
施 荣 , 等 . 乌司他丁调控脓毒症大鼠 TNF-α 与 IL-6 及 IL-10 水平的研究
[ A nti Infect Pharm , 2009, 6(1):16~19]
*1
【作者简介】: 施荣 (198 1 - ), 男 , 博士研究生
【 联系电话 】 : 135121437 91
*2
【 通信作者 】 : 熊旭东 (1954- ), 男 , 博士生导师 【 研究方向 】 : 重症胰腺炎 , ARDS, 感染性疾病 E-mail: doctorshi@126.com

脓毒 症是具有感染 依据的全身炎症反应综合
征 , 是烧创伤、休克、感染等临床危急重症患者的
严重并发症之一 , 也是诱发脓毒性休克、多器官功
能障碍综 合征 (MODS) 的重要原因。近 年来 , 脓毒
症的发病率日渐升高 , 防治脓毒症的高昂费用是政
府和个人的沉重负担。全球约 1 800 万严重脓毒症
病例 , 且 患者数量每年以 1.50% 速度递增 , 美国每
[1]
年 75 万例脓毒症患者 , 约 21.50 万人死亡 。目前 ,
我国 尚缺乏相关统计资料 , 如按人口计算 , 患脓毒
症的人数 每年 可能超过 300 万。根据国内文献报
道 , 我国严重脓毒症和 MODS 的死亡人数高达每年
[2]
100 万人以上 。在脓毒症病理生理过程中 , 细胞因
子起决定 性作用。为探讨乌司他丁对脓毒症的防
治 作用 , 笔者观察了乌司他丁对脓毒症大鼠血清肿
瘤坏死因 子 -α ( TNF-α) 、白介素 -6(IL-6) 、白介素 -
10(IL-10) 水平的调控作用。
1
1.1
材料和方法
实验动物
ISSN 1672-7878 / CN 32-1726/R Anti Infect Pharm 抗感染药学 2009 March; 6(1)
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60 只雄性 SD 大鼠 ( 上海西普尔 -必
凯实验动
物有限公 司提供 ), 随机 分为正常对照 组、假手术
组、模型组和乌司他丁组。
1.2 分组及模型制作
60 只雄性 SD 大鼠随机分为 4 组 : ⑴正常对照
组 6 只 , 麻醉后腹主动脉采血致死 ; ⑵假手术组
6 只 , 麻醉后开腹翻动肠道 , 关腹 , 12.0 h 后麻醉并
腹主动脉采血致死 ; ⑶模型组 24 只 , 分别于 盲肠结
扎穿孔术 ( 以下简称 : CLP) 后 2.0, 8.0, 12.0, 24.0 h 麻
醉并腹主动脉采血致死 , 每个时间点 6 只 ; ⑷乌司
他丁组 24 只 , CLP 前 3 天腹腔注射乌司他丁 ( 广东
天普生化医药股份有限公司 , 批号 : 03070202), 按 体
4
重 5.0× 10 U/kg, q.d, 待 最后 1 次注射 2.0 h 后行
CLP 术 , 分别于 CLP 后 2.0, 8.0, 12.0, 24.0 h 麻醉并
腹主动脉采血致死 , 每个时间点 6 只。
[3]
盲肠结扎穿孔术 (CLP) 制备脓毒症模型 : 大鼠
经 20 mg/mL 戊巴比妥钠麻醉 ( 按鼠重 40 mg/kg 给
药 ) 后 , 以腹正中作一 1.50 cm 长的切口 , 找到盲肠 ,
在其根部结扎 , 用 18 号针穿通 3 次 , 轻挤出少量肠
内容物 , 留置 2 mm 皮瓣防止针孔闭合 , 还纳盲肠于
腹腔 , 逐层缝合腹壁切口 , 术毕皮下注射 9.0 mg/mL
1.3
氯化钠溶液 ( 按鼠重 30 mL/kg 给药 ) 抗休克。
经腹主动脉取血 , 静置 30 min 后 , 离心取血清 ,
- 70 ℃ 保存待测。严格按试 剂盒要求操作 , 检测
血清 TNF-α、
IL-6、 IL-10 浓 度 , ELISA 试剂盒 ( 为
R&D 公司原装产品 , 上海森雄科技实业有限公司 )
提供。
1.4
无菌留取 正常对照组、假手术组及模型组和
乌司他丁组各 时间点大鼠完 整左肺组织 , φB( 福尔
马林 )10% 固定 , 石蜡包埋 , 切片 , 苏木精 -伊红
(HE)
染色 , 光镜下观察比较肺组织损伤情况。
1.5
计量资料以均数 ± 标准差 ( x± s),
采用 SPSS
10.0 软件包进行单因素方差分析检验 , 根据方差分
析结果选择 t 检验 , 具有显著性 差异 ( P < 0.05) 。
2
2.1
各组血清 TNF-α、
IL-6、 IL-10 水平 , 模型组
各时间点 TNF- α、
IL-6、 IL-10 水平均高于假手术
组 ( P

· 18
·
组别
表 1 各组 大鼠 脓毒症血清 TNF-α、 IL-6 、 IL-10 水平比较
正常对照组
假手术组
模型组
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采血间隔 TNF- α IL-6 IL-10
-1 -1 -1
时间 (/h) t ( φB/pg· mL) ( φB/pg· mL) ( φB/pg·
mL)
16.31± 1.47 22.36 ± 1.04 30.00 ± 2.80
17.68± 3.27 23.36 ± 3.69 35.67 ± 2.26
2.0 47.92± 3.15 52.04 ± 4.06 78.42 ± 2.26
*2 *2 *2
8.0 67.59± 4.65 71.15 ± 4.10 78.86 ± 9.73
12.0 48.69± 3.58 85.89 ± 4.38 63.59 ± 4.83
24.0 26.43± 3.50 65.46 ± 6.24 54.12 ± 2.15
*2 *2 *2
*2 *2 *2
*1 *2 *1
*4 * 4 *4
2.0 26.41± 6.34 34.43 ± 5.84 119.20 ± 10.37
*4 *4 *4
8.0 34.33± 9.95 58.97 ± 7.98 101.31 ± 6.35
乌司他丁组
*4 *4 *4
12.0 32.08± 3.58 61.47 ± 7.36 88.10 ± 7.08
*3 *4 *4
24.0 23.84± 2.15 36.48 ± 5.26 83.39 ± 4.98
*1 *2 *3 * 4
注 : 与假手术组比较 ( P < 0.05, P < 0.01); 乌司他丁组与模型组比较 ( P < 0.05, P < 0.01)
CLP 术后 2.0 h, 模型组 1 只大鼠肺组织出现
局灶性肺泡壁充血 , 轻度肺间质水肿 , 其余 5 只及
乌司他丁组均未见明显组织病理学损伤性变化 , 见
图 2。
2-1 模型组 2.0 h 2- 2 乌司他 丁组 2.0 h
图 2 模型组与乌司他丁组的病理变化 (HE× 40)
CLP
术后 8.0 h, 模型组肺组织病变较 2.0 h 加
重 , 6 只大鼠均可见肺泡壁充血、增 厚及肺间质水
肿范围扩大 , 并出现毛细血管瘀血 , 少量炎性细胞
浸润 , 与模型组相比 , 乌司他丁组较模型组病变明
显减轻 , 6 只大鼠肺组织仅见局灶性 轻度肺泡壁充
血未见 , 明显肺间质水肿、炎性细胞浸润及毛细血
管瘀血 , 图 3。
3 -1 模型组 8.0 h 3-2 乌 司他丁组 8.0 h
图 3 模型组与乌司他丁组的病理学变化 (HE× 40)
CLP 术后 12.0 h, 与 8.0 h 相 比 , 模 型组 6 只 大
鼠肺组织病损范围进一步扩大 , 并出现广泛肺泡出
血 , 肺泡腔内可见较多的炎性细胞浸润 , 肺组织明
显实变 , 乌司他丁组与模型组相比 , 仅见少量肺泡
出血和炎性细胞浸润 , 轻度肺实变 , 图 4。
CLP 术后 24.0 h, 模型组 6 只大鼠肺组织病变
与 12.0 h 相比病变更严重 , 病变范围更广 , 出现广
泛的大量肺泡出血 , 肺泡腔内可见大量的炎性细胞
浸润 , 毛细血管瘀血与微血栓形成明显 , 肺组织实
变较 12.0 h 严重 , 乌司他丁组与模型组相比,病变
范围较小 ,可见肺泡壁充血,大量肺泡出血和炎
性细胞浸润,肺实变较轻 , 图 5。
3 讨论
4-1 模型 组 12.0 h 4-2 乌 司他丁组 12.0 h
图 4 模型组与乌司他丁组的病理学变化 (HE× 40)
5-1 模型组 12 .0 h 5-2 乌 司他 丁组 12.0 h
图 5 模型组与乌司他丁组的病理学变化 (HE× 40)
在脓 毒症的病理过程中 , 促炎 / 抗炎反应、凝
血纤 溶反应、免疫 系统的 激活和 抑制等形成 1 个
复杂的网络系统 , 彼此相 互联系、相互影响 , 使病
变的范围逐渐扩大 , 病变程度逐步加重。其中, 炎
症介质是触发、增强和放大脓毒症病理变化的核
心之一。细胞因子通常可分为促炎细胞因子和抗
炎细胞因子, 脓毒症的发生多由炎症级联反应启动,
在促炎和抗炎反应相持和交替制衡中, TNF-α
是最
主要的炎性细胞因子, 也是炎症反应的最初启动者 ;

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IL-6 为二 级炎性反应介质的主要成分, 循环中 IL-6
的清除率远低于其他细胞因子, 其水 平能反映脓毒
症的严重程度及预后情况。
TNF- α 能激活细胞因子级联反应, 诱发 IL-
1β、 IL -6、 IL-8 以及次 级炎症介质合成 ( 血小板激
活因子、前列腺素、一氧化氮和白三烯等 ) , 导致炎
症反应失控、急性肺损伤、循环衰竭 , 最终发展为
脓毒症 休克。当细菌或脂多糖进入机 体后, TNF-α
在早期即显著增高。本实验显示,大鼠在 CLP 后 2 h
TNF- α 便开始升高, 8 h 达高峰。实验结果表明, 乌
司他丁能明显下调 TNF- α 水平, 这可能与乌司他丁
通过抑制蛋白水解酶活 性, 减轻组织损伤, 减少组
织细胞破坏产生的炎症 刺激物对巨噬细胞的进一
步激活有关。 IL-6 能抑制内毒素 (LPS) 诱导的
TNF-α 合成及 TNF-α
诱导的 IL-1 合 成, 后者反过
来又促 进 IL-6 的转录与合成。由于循环中 IL-6 的
清除率远低于其他细胞因子, 因此其水平能反映疾
病的严 重程度及预后 情况, 检测其水平如果发现
IL-6 持 续升高, 往往预后不良。从表 1 中看出, 乌
司他丁 组及模型组中各时间点 IL-6 水平均明显高
于假手术组, 与模型组 相比, 乌司他丁 能明显下调
IL-6 水平,这 可能与乌司他丁抑制了各种蛋白水解
酶对组织细胞的损伤 , 以及降低 TNF-α
浓度有关。
IL-10 主要由 Th2 细胞产生, 并能受 LPS 诱导表
达。 IL-10 对免疫应答 主要起到抑制 作用, 能抑制
巨噬细胞抗原呈递, 抑制巨噬细胞活化及继发的细
胞免疫反应, 抑制 NF-kB、 PI-3K 和 p70S6 激酶活
化, 从而抑制多种基因转录, 减少 TNF-α
、 IL-6、
[4]
IL-8 等促炎症细胞因 子的分泌 。实验结果显示,
在模型 组及乌司他丁组中,各时间点 IL-10 水平均
较假手术和正常对照组 显著升高。乌司他丁促使
IL-10 水平升高的机制可能是通过影响细胞内信号
转导通路来促进 IL-10 的合成与分泌。
中性粒细胞、单核巨噬细胞以及失控的炎症
因子等在肺聚集, 可直 接或间接损伤肺组织, 导致
肺泡毛细血管膜损伤, 通透性增加和 肺泡上皮细胞
损害, 造成渗透性肺水肿和肺泡壁充血、肺泡出
血、肺泡壁增厚、毛细血管瘀血与微血栓形成, 最
终发展 为急性肺损伤 (ALI) 甚或急性呼吸窘迫综合
征 (ARDS) 。实验肺组织病理切片显示,随着时间
延长, 模型组肺组织病 损程度逐渐加重, 由局灶性
肺泡壁充血, 肺间质水肿逐步发展为 广泛的大量肺
泡出血, 肺泡腔内大量 的炎性细胞浸润, 毛细血管
瘀血与微血栓等病理改变, 而乌司他 丁组各时间点
肺组织病理变化均较模型组轻, 表明乌司他丁
能缓解肺损伤, 保护肺组织。
乌司他丁是由肝脏分 泌的 1 种具有 广谱蛋白
[5]
酶抑制作用的糖蛋白 ,属于人体内源性抑炎物质,
由 143 个氨基酸组成,代谢后进入尿液。在人体遭
受炎症物质的刺激时 ( 如感 染、创伤等 ) , 血中乌司
他丁的浓度就会升高, 并在炎症过程被消耗代谢。
实验证实乌司他丁能抑制中性粒细胞弹 性蛋白酶
的释放, 通过抑制 TNF-α
的释放, 减少肺组织缺血
[6-7]
再灌注损伤 、保护肺功能 。 示, 与模
型组相比, 乌司他丁能明显下调 TNF-α、
IL-6 水平,
上调 IL-10 水平, 并对肺脏有保护作用。乌司他丁
对细胞因子的调控及保护肺组织的作用 可能与乌
司他丁能抑制巨噬细胞内信号传导通路 如蛋白激
8
酶 C(PKC) 及核因子 - B(NF- B) 有关 。 临床观察
也证实, 乌司他丁能有效阻断或抵制脓毒症患者过
度的 ( 或失控的 ) 炎症反应, 降低脓毒症患 者的病死
[9]
率, 提高脓毒症的抢救成功 率 。因此,对脓毒症的
治疗除应用 有效抗感染外, 及时合用抗休克、抗炎
症药物如乌司他丁对缩短病程和改善预 后有相当
重要的作用。
[]
实验结果显
k k
参考 文献
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·
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( 收稿日期: 2008-08-16 修回日期: 2008-08-25 )