JAEA-Review-2010-065.pdf:15.99MB - 日本原子力研究開発機構
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3-21<br />
<strong>JAEA</strong>-<strong>Review</strong> <strong>2010</strong>-065<br />
Improvement of Endophytic Bacteria Using Ion Beams<br />
M. Aino a) , K. Satoh b) and I. Narumi b)<br />
a) Hyogo Prefectural Center for Agriculture, Forestry and Fisheries,<br />
b) Radiation-Applied Biology Division, QuBS, <strong>JAEA</strong><br />
The endophytic bacteria produce various kinds of bioactive substances, by which the plants grow well and exhibit<br />
resistance to diseases and environmental stress. In this study, we investigated survival rate, mutation frequency for<br />
kanamycin resistance and antagonistic effect against tomato bacterial wilt of endophytic bacteria, Pseudomonas fluorescens<br />
FPH 9601, that was irradiated with ion beams. The absorbed dose range was 10 to 300 Gy. Irradiation over 100 Gy<br />
resulted in a significant decrease in cell survival, whereas irradiation below 10 Gy had no effect on cell survival. The<br />
kanamycin resistant bacteria appeared only in 300-Gy irradiated cells at a rate of 1.8%. We could successfully obtain<br />
mutants that have enhanced suppressiveness against the tomato bacterial wilt by ion-beam irradiation. These results suggest<br />
that ion-beam irradiation is a useful method to obtain mutants of Pseudomonads.<br />
内生細菌は種々の生理活性物質を産生し、これらの<br />
働きによって感染した植物の生育が促進されたり、病<br />
害に対して抵抗性になったり、環境ストレスに対して<br />
耐性になったりする。これらの現象は内生細菌の植物<br />
への親和性に依存すると考えられる。一方、<br />
Pseudomonas 属細菌の中には植物に内生能を示す菌株<br />
が多く存在し、現在、生物農薬として販売されている<br />
「セル苗元気」(トマト・ナス・ピーマンの青枯病に効<br />
果を示すバイオ農薬)の原体微生物として用いられて<br />
いる。本生物農薬に含まれる Pseudomonas 属細菌を用い、<br />
イオンビーム突然変異育種の技術を用いて植物への定<br />
着や抗菌活性能力の増強が可能かどうかを検討した。<br />
供試菌株は Pseudomonas fluorescens FPH9601 を用い、<br />
標準寒天培地上で 28 °C、24 時間培養後、滅菌蒸留水に<br />
懸濁した。懸濁液(約 10 8 cfu/ml)2 mL を直径 47 mm<br />
の酢酸セルロースメンブランフィルター(ADVANTEC<br />
社)でろ別した。ろ別後、直ちに直径 60 mm シャーレ<br />
にフィルターを入れ、凍結乾燥を行った。保護剤等は<br />
添加せず行った。凍結乾燥後、シャーレ上面をカプト<br />
ン膜で覆った。<br />
イオンビーム照射は TIARA の AVF サイクロトロン<br />
を用い、 12 C 5+ (220 MeV)で 10~300 Gy の範囲で凍結<br />
乾燥菌体を照射した。照射後、試料を滅菌蒸留水と共<br />
に試験管に入れ、30 分間振とう後、懸濁液を菌体原液<br />
とし、以下の試験に供試した。<br />
①吸収線量と生存率の関係:上記原液を基とし、希<br />
釈平板法を用いて生存菌数を計測した。供試培地は標<br />
準寒天培地を用いた。28 °C で 24 時間後に形成された<br />
コロニーを計測し、生存数とした。<br />
②吸収線量とカナマイシン耐性変異株の出現との関<br />
係:カナマイシンを 125、250 及び 500 ppm を含む標準<br />
寒天培地を流し込んだシャーレ(直径 90 mm)に上記<br />
原液 0.1 mL を塗布し、28 °C で 48 時間後にそれぞれの<br />
シャーレに生じたコロニーを計測した。<br />
③植物病害に対する発病抑制効果の増強株の検出:<br />
上記原液(吸収線量 300 Gy)を 100 倍に希釈し、標準<br />
寒天培地を流し込んだシャーレに塗布し、28 °C、48 時<br />
間後に生じたコロニーをかき取り、再度、標準寒天培<br />
地上で 28 °C、48 時間培養した。培養菌株を 15%グリセ<br />
ロール溶液に懸濁し、–80 °C で保存した。凍結保存菌<br />
株(100 菌株)を標準液体培地に植菌し、28 °C で 24<br />
時間培養し、シードリングバイオアッセイチャンバー<br />
法を用いて、トマト青枯病(Ralstonia solanacearum)に<br />
対する発病抑制効果を検定した。<br />
吸収線量と生存率の関係は、10 Gy では非照射と変わ<br />
らずコロニーが出現したが 25 Gy から急激に生存数が<br />
減少し 100~300 Gy の照射では、非常に高感受性を示<br />
した(Fig. 1)。カナマイシン耐性株の出現は、カナマイ<br />
シン 250 及び 500 ppm では各線量とも耐性株は出現し<br />
なかったが、125 ppm の場合、300 Gy 照射時のみに 1.8%<br />
の割合で耐性菌が出現した。イオンビーム照射による<br />
トマト青枯病に対する発病抑制効果の変化は、親株と<br />
比べ、59 株が効果低下し、41 株が効果増強した(Fig. 2)。<br />
これらの内 4 株は、親株よりも 5 倍以上の高い発病抑<br />
制効果を示した。これらの結果からイオンビームを用<br />
いた Pseudomonas 属細菌の突然変異育種は可能と推定<br />
された。<br />
Survival rate (%)<br />
Protection effect<br />
- 77 -<br />
1E+00<br />
1E-01<br />
1E-02<br />
1E-03<br />
1E-04<br />
0 10 25 50 75 100 200 300<br />
Absorbed dose (Gy)<br />
Fig. 1 Cell survival after irradiation with carbon ion<br />
beams in P. fluorescens FPH9601.<br />
Down: 59 strains UP: 41 strains<br />
Number of strains<br />
Fig. 2 Suppression of tomato bacterial wilt by ion beam<br />
irradiated P. fluorescens FPH.
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