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JAEA-Review 2010-065
Fungicide Tolerant Mutation of Entomopathogenic
Fungi Induced by Carbon Ion Beams
T. Saito a) , K. Satoh b) and I. Narumi b)
a) Faculty of Agriculture, Shizuoka University, b) Radiation-Applied Biology Division, QuBS, JAEA
Entomopathogenic fungi, Isaria fumosorosea, Beauveria bassiana and Verticillium lecanii, are important agents to
control insect pests, but the fungi are highly susceptible to conventional fungicides for plant diseases such as powdery
mildew. The purpose of this study is to generate mutants tolerant to fungicides using carbon ion beams. In order to
determine a suitable dose of ion beam radiation to induce the fungi mutate efficiently, fungal conidia were irradiated with ion
beams in the 50 to 400 Gy range. The dose that gives 10% conidial survival was approximately 150 Gy in I. fumosorosea,
150 to 300 Gy in B. bassiana and 150 to 350 Gy in V. lecanii. Irradiated conidia were cultured on Sabouraud dextrose agar
supplemented by fungicides, benomyl (500 ppm) and triflumizole (150 ppm). Fungicide-tolerant mutants were obtained
from B. bassiana and V. lecanii, but not I. fumosorosea. The mutants were obtained in a dose-independent manner. The
results indicate that ion-beam irradiation is greatly useful for making fungicide-tolerant mutants of entomopathogenic fungi.
化学合成農薬は数多くの課題を抱えていることから、
IPM(総合的害虫管理技術)の普及が急務とされている。
この IPM の基幹技術と目されているのが天敵昆虫や天
敵微生物などを用いる生物的防除法である。天敵微生
物については昆虫病原糸状菌が商品化されているが、
殺菌剤と併用しにくいという難題を抱えている。たと
えば、農作物を栽培すれば「うどんこ病」などの病気
が発生するが、殺菌剤の散布は昆虫病原糸状菌に対し
て悪影響を与えてしまう。この抜本的な解決策として、
殺菌剤の影響を受けにくいという新機能を有する昆虫
病原糸状菌を創出することが考えられる。本研究の目
的は、イオンビームによる突然変異育種技術を用いて、
昆虫病原糸状菌の殺菌剤耐性変異体を創出することで
ある。
研究初年度は、炭素イオンビームの吸収線量を決定
するため、代表的な昆虫病原糸状菌 3 種(Isaria
fumosorosea、Beauveria bassiana 及び Verticillium lecanii)
を供試して、照射線量と分生子生存率の関係を調べた。
また、殺菌剤耐性変異体選抜の予備試験を行った。
各供試菌は、サブロー寒天培地で 20 日間(20 °C)培
養し、得られた分生子を 0.1% Tween 80 を含む蒸留水に
懸濁し、ろ過装置を用いてメンブレンフィルター(直
径 4.5 cm)上に分生子を集めた。このメンブレンフィ
ルターをプラスチックシャーレ(直径 6 cm)に入れ、
シャーレ上面をカプトン膜で覆ったのち、炭素イオン
ビームを照射した。吸収線量は、8 段階(50~400 Gy、
50 Gy 間隔)とした。
分生子生存率の調査方法は次の通りである。イオン
ビーム照射後のフィルターをサブロー液体培地が入っ
たサンプル瓶(10 mL 用)に投入し、撹拌棒を用いてフ
ィルターから分生子を離脱させた。フィルターを取り
除いた後、液体培地の分生子濃度を測定した。生存率
は、分生子を懸濁させた液体培地(100 µL)をサブロ
ー寒天培地上に塗布し、20 °C で培養した後のコロニー
数をもとに算出した。
殺菌剤耐性変異体の選抜方法は次の通りである。殺
菌剤は、市販のベンレート水和剤(50%ベノミル)とト
リフミン乳剤(15%トリフルミゾール)を供試した。各
殺菌剤を添加(1,000 倍)したサブロー寒天培地上にイ
オンビーム照射後の分生子懸濁液 200 µL を塗布し、
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20 °C で 3 週間程度培養後、発育良好なコロニーを殺菌
剤耐性変異体として分離した。この操作は、イオンビ
ームの照射区ごとに行った。
イオンビーム吸収線量と分生子生存率の関係を
Table 1 に示した。生存率が 10%程度となる吸収線量は、
I. fumosorosea が 150 Gy、B. bassiana が 150~300 Gy 及
び V. lecanii が 150~350 Gy であり、実験によってばら
ついた。
殺菌剤耐性変異体の獲得状況を Table 2 に示した。I.
fumosorosea ではベノミル耐性変異体は得られたが、著
しい奇形を呈したことから、期待される変異体とは認
められなかった。また、トリフルミゾール耐性変異体
も得られなかった。一方、B. bassiana ではベノミル耐
性変異体が得られ、トリフルミゾール耐性変異体も少
数ながら得られた。V. lecanii でも両剤に対する耐性変
異体が得られた。吸収線量と耐性変異体出現頻度に一
定の傾向はみられなかった。
以上のことから、イオンビームは昆虫病原糸状菌の
殺菌剤耐性変異体の作出に利用できると考えられる。
得られた殺菌剤耐性変異体の病原力については、今後、
検討する予定である。
Table 1 Percent survival of fungal conidia treated with
carbon ion beams.
Dose
(Gy)
I. fumosorosea B. bassiana V. lecanii
1 st 2 nd 3 rd 1 st 2 nd 1 st 2 nd
400 0 0 0 6.1
350 0 0 0 0.1 5.0 36.0
300 0 0 0.6 0.6 12.8 50.5 0.1
250 0.3 0.6 1.9 3.1 24.2 61.3 2.0
200 3.2 1.1 3.8 5.0 52.1 62.4 4.5
150 10.2 6.0 6.9 13.5 75.1 69.9 13.8
100 53.2 25.5 20.1 44.5 59.6 80.2 80.6
50 91.4 70.8 34.0 90.9 83.2 91.2
Table 2 Fungicide-tolerant mutation induced by
carbon ion beams.
Fungicide I. fumosorosea B. bassiana V. lecanii
Benomyl Deformed Obtained Obtained
Triflumizole None Obtained Obtained