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JAEA-Review 2010-065
Analysis of Molecular Mechanisms for
Radiation-induced Bystander Effects Using
Heavy Ion Microbeams
H. Matsumoto a) , M. Hatashita a) , M. Tomita b) , K. Otsuka b) , T. Funayama c) ,
T. Sakashita c) and Y. Kobayashi c)
a) Faculty of Medical Science, University of Fukui, b) Central Research Institute of Electric
Power Industry, c) Radiation-Applied Biology Division, QuBS, JAEA
The objective of this project is to elucidate molecular mechanisms of the bystander response using heavy ion microbeams
in JAEA. We found that the foci of γH2AX and pNBS1 were formed in the unirradiated cells in the target colony including
the irradiated cell 6 h after irradiation with 460 MeV 40 Ar beams and that this formation of the foci was almost completely
suppressed by the addition of DMSO or Lindane. Also we found that the foci of γH2AX and pNBS1 were formed in the
unirradiated cells in the untargeted colonies 6 h after irradiation and that this formation of the foci was almost completely
suppressed by the addition of aminoguanidine or c-PTIO. Our findings strongly suggested that ROS and NO are
initiators/mediators for evoking heavy ion microbeam-induced bystander responses.
低線量/低線量率放射線に対して生物が示す特異的
な応答様式の一つに放射線誘発バイスタンダー応答が
ある 1) 。我々は、細胞局部照射装置を用いて、この放
射線誘発バイスタンダー応答の分子メカニズム
を明らかにすることを計画した。
1. 実験方法
(1)細胞:ヒト正常線維芽細胞(AG1522 細胞)を用
いた。
(2)培養:開孔(径 12 mm)35 mm ディッシュの内
面中央に 20 mm 四方の collagen コートした
CR-39 をパラフィンで固定したものを使用し
た。2 × 10 5 cells/mL の細胞懸濁液 5 µL を CR-39
樹脂上に 5 箇所スポットし(1,000 cells/colony)、
15~20 時間培養したものを照射実験に供した。
(3)照射:Funayama ら 2) の方法に従って、中央にス
ポットしたコロニーの細胞 1 個に 5 粒子の
460 MeV 40 Ar 13+ を HZ1 ポートにおいて照射した。
(4)細胞の蛍光免疫染色:照射後、細胞を 37 °C で
培養し、6 時間後にメタノールで固定し、抗
γH2AX 抗体および抗 pNBS1 抗体を用いた蛍光
抗体染色法により染色し、蛍光顕微鏡下で観察
した 3) 。標的細胞を含む正方形枠(250 × 250 µm;
C)内、そこから右方向に設定した 3 個の正方
形枠(250 × 250 µm)の内部、および遠隔に存
在するサテライトコロニーの中心部の正方形
枠(250 × 250 µm)内のフォーカス形成頻度を
測定した。
2. 結果および考察(Fig. 1)
(1)Ar 線マイクロビームの照射により、照射された細胞
(標的細胞)において γH2AX および pNBS1 のフォー
カス形成が認められ、それらは同所局在していた。
(2) Ar 線マイクロビーム照射により、バイスタンダー細
胞においても γH2AX および pNBS1 のフォーカス
形成が認められ、それらは同所局在していた。従っ
て標的細胞から分泌されたバイスタンダー因子によ
りバイスタンダー細胞に DNA 二本鎖切断が誘発さ
れていることが示唆された。またバイスタンダー細
胞におけるこれらのフォーカス形成は標的細胞から
離れるに従ってその頻度は漸次減少した。
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(3) 距離に依存したバイスタンダー因子の変化:Ar 線マ
イクロビーム照射により、バイスタンダー細胞にお
ける γH2AX および pNBS1 のフォーカス形成が
DMSO(0.1%)、Lindane(40 µM)、Aminoguanidine
(AG, 10 µM)および c-PTIO(10 µM)によって抑
制された。DMSO による抑制は、標的細胞周辺にお
いて顕著であり、それ以外の部位では抑制効果は認
められなかった。Lindane による抑制効果は標的細胞
近傍においてのみ顕著であった。AG および c-PTIO
による抑制効果は、標的細胞から離れるに従って顕
著に認められた。
以上の結果より、ギャップ結合を移行しているバイ
スタンダー因子および標的細胞近隣の細胞に培地を介
して作用しているバイスタンダー因子は活性酸素種
(ROS)であることが示唆された。一方、遠隔的に作
用しているバイスタンダー因子は活性窒素種(RNS)、
特に NO ラジカルであることが示唆された。
Incidence of Bystander Cells
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
照射後6時間 6 h after irradiation
* *
*
*
*
Cen t er
~250 µm
~500 µm
~750 µm
Sat el l i t e
* *
Control DMSO Lindane AG c-PTIO
Fig. 1 Changes in bystander factors with depending on the
distance from the targeted cell.
References
1) H. Matsumoto et al., J. Radiat. Res. 50 Suppl. (2009)
A67.
2) T. Funayama et al., Radiat. Res. 163 (2005) 241.
3) A. Takahashi et al., Cancer Res. 64 (2004) 8839.