李琇瑋

生化科技學系微生物組專題討論
題目: An Analysis of the Solution Structure and Signaling Mechanism of LovK,
a Sensor Histidine Kinase Integrating Light and Redox Signals
作者:Erin B. Purcell, Claudia A. McDonald, Bruce A. Palfey, and Sean Crosson
文章來源:American Chemical Society: 2010, 49 (31), pp 6761–6770
演講人:Hsiou-Wei Lee 李琇瑋 B96608034
指導老師:Chii-Shen Yang, Ph.D. 楊啟伸 博士
演講日期:October 12, 2010
演講地點:The 6th Classroom
摘要
Flavin-binding LOV domain 在各式生物間有相當的保守性,其分布的範圍很廣;在
植物、真菌、古細菌、細菌中都可以找到。該 domain 是約有 100-residue 的光
感應模組,encoded 出的 multidomain 蛋白質可以調控藍光範圍的生理反應。以
Caulobacter crescentus 為例,其 encode 之可溶性 LOV-histidine kinase (LovK),可
以調控細胞附著的性質。完整的 LovK 分成兩個部分,包括 N-terminal 的 LOV
sensory domain,以及位在 LOV domain 兩端的 nonconserved sequence,是用來協
調 protein 的 signaling lifetime。Size exclusion chromatography 以及 small-angle
X-ray scattering (SAXS)已證明光刺激 LOV sensor domain 時,並沒有造成劇烈之構
形變化。然而,proteolysis 指出 LOV domain 的 C-terminal flanking seq. 接受光刺
激後構形會改變。基於 SAXS envelop reconstruction 及生物資訊的預測,推論結
構動態的部份為 extended C-terminal coiled coil,它會將 LOV domain 連接於
histidine kinase domain。另外為證實 LOV domain 之傳訊與細胞內的氧化還原態也
有關,作者測量 LovK FMN cofactor 的還原電位。In vitro 之實驗中,以化學方式
還原 LovK 的 cofactor FMN,會減弱蛋白質 light-dependent ATPase 的活性,證明
LovK 活性可同時受細胞氧化還原的環境的調控。
本研究之重要性
前言
LovK 在生物界分布範圍很廣,能感應外界環境變化,並進行一連串的訊息傳
遞,C. crescentus 的 LOV domain 與細胞的附著功能有關,對 Brucella abortus
而言,當藍光刺激,LOV domain 與 FMN 形成 thioester bond 時,會增強布魯氏
菌的致病力。
前人作過的研究
植物中的 LOV domain 常以 dimer 的形式存在,包括 LOV1 以及 LOV2。LOV1 的
1

C-terminal α-helix 會 packed 在 LOV2 的中心,作為 allosteric switch; 當被光刺激
後,α-helix 會離開 LOV2 的核心〔1〕。後來的研究也指出,LOV2 的 N-terminus
接受光刺激後也會有偏移的現象〔2〕。根據這些結果以及蛋白質結晶結構分
析,可建構 LOV domain 接受光刺激後,訊息傳遞的動態藍圖,進而設計 LOV-Trp
抑制劑,並利用光調控 DNA binding 的活性〔3〕。另外許多研究發現 Bacillus
subtilis σ B regulator (YtvA)的 LOV domain〔4-6〕訊息傳遞的模式與植物的 LOV2
不同,因為 YtrA 沒有 C-terminal Jα helix,其 α-helix 會與 STAS domain 的
C-terminus 連接〔7〕。
作者為何要作本研究
即使已經可以從很多種 protein 中純化出 LOV domain,大體而言,我們對 LOV
domain 在 multidomain 的蛋白質中傳遞訊息的機制,以及 protein 的結構變化
上仍然不是很清楚,近期在 YtvA 以及 phototropin 的研究上都提出了這樣的問
題。
本研究欲完成之項目
作者著重在細菌的 LOV-histidine kinase 此 multidomain 的研究,LovK 可以提供
LOV domain 在 histidine kinase 訊息傳遞上的 model。作者有系統地分析 LovK
的結構及其 oligomeric 的性質、訊息傳遞 lifetime、以及 LovK 的氧化還原性質。
Cloning 及表現 constructs:
材料與方法
C. crescentus 的 LovK gene( CC_0285) 經 PCR 放大後,clone 到 pET28a 的表現載體
中。為取得 Truncated LovK LOV domain,先 PCR “pET28a-LovK”後,再用限制酶 NdeI
及 XhoI 切下。LovK (1-138) construct ligated 到 pET28a; 其他 constructs 則 ligated
到 pET28 variant ,其 N-terminal His6-tag 之後是接著 TEV cleavage site。
蛋白質純化及表現:
pET28a 表現質體 transform 到 Rosetta (DE3) pLysS cells,expression strain 在 37 0 C
生長到 OD600 =0.1 後,將溫度降至 16 0 C,同時 expression strain 用 isopropyl
β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)誘導 16h。使用超音波破菌,buffer 含 20mM
Tris-HCl(pH 7.6), 500mM NaCl, 20mM imidazole, 1mM β-mercaptoethanol, and 5%
glycerol。Recombinant protein 用 Ni 2+ chelating resin 純化,並使用 20-500mM
imidazole 流洗。蛋白質純化過程要避光,避免 FMN cofactor 的 loss。
UV-Vis 吸收光譜:
使用 1cm 石英 cuvette,純化的 LOV protein 先置於黑暗中保存 24h,之後用白光
激發 5 min,紀錄 120 s 內的吸收光譜變化。將 447 nm 吸光值代到以下公式
2

A(t) = A + (A − A )(1 − e ),並求出 recovery 的半生期。
膠體過濾及層析:
以 Hi Pre 26/60 Sephacryl S-200 column 進行 LovK 的 gel filtration,LOV domain 則
使用 10/300 Superdex-75 column 進行 gel filtration。Dark-state 的實驗要用鋁箔紙
包在 injection loop 外面,實驗過程都要保持避光。Light-state 的實驗先用白光激
發 5 min,再 loading 到 injection loop,全程都要用白光激發。以雙重波長 280nm
及 447nm 測 column elutant,確認 light-state 的 FMN cofactor 被 eluted out 仍受
光激發。
Small- angle X-ray Scattering (SAXS) :
準備不同濃度的 purified protein 0.4, 1.0, 2.0, 4.0 mg/mL,protein sample 以 2μL/s
流過 1.5 mm flow capillary,用 BioCAT beamline 打在 protein sample 上,data 用 Igor
Pro 還原,P(r) plots 由 SAXS data 經傅立葉轉換後得到,而 scattering envelop 則使
用 DAMMIF 得到。測量 light-state 的 SAXS,protein sample 在 flow capillary 中用 blue
AlGaInP LED 激發。
Proteolystic Digest:
LOV protein 稀釋成 20 μM,以不同 conc.的 trypsin digest (0.1 μg/mL-10 μg/mL)。
Dark digest 先讓 protein photorecover 24h;Light state 的 protein,在加入 trypsin
前要先光激發 5 min,反應過程中也要照光。終止反應: 加入等量的 solution (100
mM Tris-HCl, 200 mM dithiothreitol, 4% SDS, 0.2% bromophenol blue, and 20%
glycerol 並且煮沸 5 min),Sample 跑 5-12% SDS-PAGE,再用 silver staining。
Redox Potential Measurements:
濃縮 protein sampe 以如下的 solution 稀釋( 20μM in 100 mM 硫酸鉀 buffer(pH7.0);
200 μM xanthine; 1 μM benzyl viologen),用 xanthine/xanthine oxidase system 緩慢
還原電位,以 Shimadzu UV-2501 PC spectrophotometer 測吸光,還原電位再經由
Nernst equation 計算出來。
ATPase Activity Assays:
純化後的 LovK(1-368)先在黑暗中放置 24h,接著用 kinase reaction buffer (50 mM
Tris-HCl (pH7.6); 40 mM KCl; 10 mM MgCl2; 1 mM β-mercaptoethanol; 10% glycerol)
稀釋成 25 μM,加入 degassed 48h 的 sodium dithionite,黑暗中放置 30 min(dark
state 而言);Light-state 則光激發 2 min。加入 20 μM ATP 及 5 μM〔γ- 32 -P〕ATP,
反應 2 min 後 quenched 去除 4 μL aliquots,並加入 2 μL 12N formic acid。之後將
aliquots chilled 後,用 50 μM ATP 點在 PEI Cellulose F plates TLC,使用 runnig buffe
含 1 M formic acid 及 1 M LiCl。Radioactive TLC plates 使用 Typhoon Trio Variable
3

Model Image 掃描,尚未水解的〔γ- 32 -P〕ATP 及 free 的 32 P 用 ImageQuant version
5.2 定量。
C. crescentus LovK 的 cofactor 是 FMN
結果與討論
利用 Thin-layer chromatography 從 C. crescentus 純化出變性的 LovK,證明它的
cofactor 是 FMN (Table.2)
LovK 具有 photochemistry 的性質
FMN 的 4a carbon 會與 LovK conserved residue Cys70 形成共價鍵,未照光之前
吸收峰在 447nm,當照光形成共價鍵後,吸收峰移到 390 nm (Fig. 2C) 。 另外,
觀察 447 nm 吸收峰再次出現與否,可推知 covalent adduct 是否已回到 ground
state。(Fig.3)
不同半生期與 FMN 和 LovK covalently addut 的穩定性有關
由 Fig.3 可看出不同 flanking region 有不同的 lifetime,其中以 LovK(1-138)的半
生期最短,只有 2 min,而 LovK(1-1368)的半生期最長,121 分鐘。
Covalently adduct 與 surrounding enviriment 易接觸與否會影響其穩定性,進而
影響 adduct 的半生期。在 Table. 3 可以看到 LovK (1-138)的 accessibility constant
a 最大 0.1636。根據前人研究已知加入 imidazole 會加速 adduct state 回到
nonbonded state,paper 中嘗試以不同濃度的 imidazole 測試 decay 效率
(Fig.4B)。
根據 Table.3 及 Fig.4B 的資料顯示,LovK (1-138)對 solvent 的 acessibility constant
相當高,由於缺少了 C-terminal 的 flanking region,該部分的 amino acid 可穩定
N-terminal 的 24 amino acid,當少了 C-terminal region,N-terminus 的
photorecovery 會增快。
LovK is dimeric 且受光激發 LovK 的構形不會有大幅的改變
根據 Fig.5,dark-state 或 light-state 所 elut 出來的 protein 都為 dimer form,而
最前面的 peak,可能是 isoform,較 dimer form elongated 且較少 globular。因
此根據 size exclusion data 證明 LovK 的傳訊不需形成 oligomeric state,其 protein
構造上也不會有大幅改變。
用 SAXS 證明:控制 LovK kinase 的活性,只需在 N-terminal sensory domain 有些
微結構變化
根據 Fig.6A. 6B ;Table.4 ,觀察 LovK(1-163),其 Rg 值或 I0 值都沒有太大變化,根
據 SAXS 結果可以說明調控 LovK kinase 的活性,只需要 N-terminal sensory
domain 結構上些微的改變。
光刺激會造成 LOV-HK linker sequence 不穩定
利用 proteolysis 技術補足 SAXS 技術及 size exclusion chromatography 的不足,
用限量的 trypsin 處理 dark-state LovK (1-368),產生兩個主要的 cleavage product
4

約 29kDa、15kDa。(Fig.7)當光照之後,很快形成許多 cleavage product,proteolysis
的結果證明 protein 在 light-state 下,結構較為彈性且容易被水解。
胞內氧化還原性質,可以調控 LovK 的光活性
在 In vitro 環境, Full length LovK domain 的 ATPase assay 指出,降低胞內的還原
電位,也會降低 LovK 受光調控的性質(Fig. 8B)。混雜 Oxidized 及 reduced LovK
並不會影響 LovK dark-state 的 ATPase activity,但會影響 light state ATP 水解的程
度(Fig. 8C)。
參考文獻
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in the dimeric LOV domain of the photosensor YtvA.J. Mol. Biol. 373, 112–126.
Table2
圖表
5
Table2.根據親和層析法確認
LovK 的 cofactor 是 FMN( flavin
mononucleotide)。

Fig.2B.2C
Fig.3
Table.3
Fig.4B
6
Fig.2C 縱軸代表吸光值
的變化,可以看到原本
447nm 的吸光 shift 到
390nm,代表結構有了
改變。
Fig 3.不同
truncate adduct
decay 時間不同,
其中以
LovK(1-138)的
recovery time 最
短,約四分鐘
Table 3.比較不同 truncate 的
solvent accessibility,其中以
LovK(1-138)的 accessibility
constant 最大,0.0163。
Fig.4B 以不同濃度的
imidazole 分別測試不同
truncate 的 adduct decay
constant,發現當 imidazole 的
濃度上升,adduct 的 decay
常數都有上升的傾向。

Table.4
Fig.5
7
Table 4.用 SAXS 測 protein
的 conformation 變化,發
現 LovK(1-163)的 Rg 值在
光照或黑暗下,並沒有太
大的改變。
Fig.5 此圖為膠體過濾法,左半邊
為 280 nm 吸光,右半邊為 447 nm
吸光,可以發現 protein 以 dimer
form 存在,且光照後其結構並不會
有太大的變化。
圖 5A.由於 Protein 的量太少了,所
以測不到 447nm 的吸光。
Fig. 6B
Fig.6B 以 SAXS 測試 LovK(1-163),
發現 Rg 值在光照下或黑暗中並不
會有太大的變化,如圖所示黑色線
和灰色線重疊度高。

Fig.7
Fig.8B. 8C
8
Fig7.測試不同 truncate
的 proteolysis 的程度,
Histidine kinase 約 29
kDa,而 LOV domain 約
15kDa。為達相似水解
的程度所加的 trypsin
濃度也不同,根據圖中
可以看到含有
N-terminus 的 truncate
較不易被水解(B.C)。
而 LovK(1-138)相對上
較穩定,加入 trypsin
後 proteolytic band 沒
有很明顯分散。
Fig.8B 以化學還原方式,還原 oxidized LovK FMN(blue)造成吸光大幅下降,如圖中
所示 blue→gray(LovK OX →LovK RED ); 當加入相同體積的 LovK RED 以及 FMN OX (purple)
發現吸收峰恢復了 gay→purple,因為 electron 可以快速由 Lovk RED 傳給 FMN OX ,
幫助 adduct 形成。
Fig.8C 化學還原方式還原 LovK FMN cofactor,其 LovK ATPase 的 activity 在光照或
黑暗中並沒有顯著的差別; 然而,其氧化態被光激發以後,ATPase hydrolysis 明
顯上升許多。