傅煦媛 - 國立臺灣大學

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孤兒 GPCRs 的 ligand 鑑定-GPCR ligand 篩選方法 Orphan GPCR 的 ligand 鑑定最大的瓶頸有三個:(1) GPCR 本身表現困難,表現的 GPCR 不具有活性,可能和失去正常生理狀態下能交互作用的蛋白質存在與否有關;(2) 不知 orphan GPCR 下游交互耦合之 Gα 為何;(3) 可能為絕大部分 GPCR 耦合 Gαi 之篩選方式效率不佳。為了解決後兩個問題,目前設計出 Gαq/i chimera 平台和 Gα15 和 Gα16 平台。然而這兩個平台並不能完全解決問題。包括像是 chimera 後的 Gα,和被視為較無 GPCR 專一性之 Gα15 & Gα16 仍無法與 orphan GPCR 交互作用。或是引起轉型細胞株中 cross-interaction 之反應。 GPCRs 和 G protein α subunits 融合蛋白質之特性建構、表現具活性之 GPCR 和 Gα 蛋白質共表現 GPCR 和 Gα 和表現 GPCR-Gα 融合蛋白質最大的不同,就是後者可以確認其交互作用 1:1 的效率。其構築模式是在 GPCR 的 C-ter. 加上一 epitope tag 或是 GFP,然後再與 Gα 的 N-ter. 相接。利用 E. coli、昆蟲 Sf9 細胞、COS-7 細胞、HEK293 細胞、CHO-K1 細胞、Ra1 1 纖維組織母細胞和 Xenopus 卵母細胞轉型後進行蛋白質表現。利用北方墨點法、免疫染色和 RT-PCR 確認蛋白質是否表現。活性測定則是利用 agonist 刺激之 [ 35 S]GTPγS 結合能力或 GTP 水解能力進行分析。實際應用中, β2-adrenoceptor-Gαs 融合蛋白質在 agonist 刺激下具有 [ 35 S]GTPγS 結合能力和 GTP 水解能力,但是在共表現中,卻無法觀察到結合能力或水解能力的訊號。然而,在 5-HT1A 受體與其 Cys351Gly Gαo 共表現於 COS-7 細胞中,卻比融合蛋白質具有較高的 agonist 刺激下具有 [ 35 S]GTPγS 結合能力。各種不同 GPCR 間的差異目前仍無法用序列分析作為實驗設計的依據。 GPCR-Gα 融合蛋白質的下游訊息傳遞無論是共表現或是融合蛋白質表現系統的篩選平台,除了 agonist 刺激下 [ 35 S]GTPγS 結合能力或 GTP 水解能力做為指標外,下游訊息傳遞也可以作為參考依據。然而在 A1 receptor-GFP-Cys251Gly Gαi 融合蛋白質的實驗中,雖然具有 agonist 刺激下 [ 35 S]GTPγS 結合能力,但卻無法傳遞訊息到 adenylyl cyclase 和 MAP kinase。目前仍沒有合理的實驗結果可以推測原因。但很有可能與 G protein signaling system 的四級結構有關。 Gβγ 的影響 Gβγ 的存在可以促進 GPCR 和 Gα 的耦合。Restored Gβγ 的 HEK 細胞表現 A1 receptor-Gαi 融合蛋白質時會對 agonist 具有較高親和力。可是在表現 β2-adrenoceptor-Gαs 之 Sf9 細胞中共表現 Gβγ 對於 agonist 親和力卻沒有顯著影響,而對於基礎 GTPase 能力有些許改變。所以呼應上述的實驗結果,Gβγ 對於 G protein signaling system 的四級結構影響仍有待研究。
利用 GPCRs 和 G protein α subunits 融合蛋白質作為 ligand 篩選工具將融合蛋白質表現於 Sf9 細胞膜上,成功的以 ligand 活化融合蛋白質的有幾個例子,包括做為模式的 nociceptin receptor- Gαi2 可以反應出組織萃取物中的 ligand,再利用液相層析鑑定其身分;原本是 orphan GPCR 的 hGPCR48 和 Gαi1 融合後,在化學小分子、脂質資料庫中篩選出 5-oxo-ETE 為其化學小分子 ligand,而後解釋嗜中性和嗜酸性球的化學趨性。結論本文中所描述的 GPCR -Gα 融合蛋白質是一項利於 ligand 篩選的工具。大約 50% 已知的 GPCR 是與 Gαi 耦合。如果將這個比例推廣到目前的 orphan GPCR 中,將有半數的 orphan GPCR 可望篩選出 ligand。在後基因體時代裡,deorphaning 將繼續是一個最令人興奮的研究領域;此外,這個平台在藥物篩選的應用上,亦是未來過半數製藥產業上的一大福音。然而,不能否認的是,在細胞內真實 GPCR 所交互作用的網路, 遠比科學家想像的更有空間。更謹慎的研究了解 signaling transduction 亦是後基因體時代不能被忽視的關鍵。參考文獻 1. Heterotrimeric G protein activation by G-protein-coupled receptors. Nature Reviews Molecular Cell Biolog. 9(1), 60-71 (2008). 2. G-protein-coupled receptor-focused drug discovery using a target class platform approach. Drug Discovery Today 14(5-6):231-40 (2009) 3. Cellular assays as portals to seven-transmembrane receptor-based drug discovery. Nature reviews Drug Discovery 8(8):617-26. (2009) 4. RCSB Protein Data Bank: http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do
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