傅煦媛 - 國立臺灣大學

孤兒 GPCRs 的 ligand 鑑定-GPCR ligand 篩選方法
Orphan GPCR 的 ligand 鑑定最大的瓶頸有三個:(1) GPCR 本身表現困難,表現
的 GPCR 不具有活性,可能和失去正常生理狀態下能交互作用的蛋白質存在與否有
關;(2) 不知 orphan GPCR 下游交互耦合之 Gα 為何;(3) 可能為絕大部分 GPCR 耦
合 Gαi 之篩選方式效率不佳。為了解決後兩個問題,目前設計出 Gαq/i chimera 平台和
Gα15 和 Gα16 平台。然而這兩個平台並不能完全解決問題。包括像是 chimera 後的
Gα,和被視為較無 GPCR 專一性之 Gα15 & Gα16 仍無法與 orphan GPCR 交互作用。
或是引起轉型細胞株中 cross-interaction 之反應。
GPCRs 和 G protein α subunits 融合蛋白質之特性
建構、表現具活性之 GPCR 和 Gα 蛋白質
共表現 GPCR 和 Gα 和表現 GPCR-Gα 融合蛋白質最大的不同,就是後者可以確
認其交互作用 1:1 的效率。其構築模式是在 GPCR 的 C-ter. 加上一 epitope tag 或是
GFP,然後再與 Gα 的 N-ter. 相接。利用 E. coli、昆蟲 Sf9 細胞、COS-7 細胞、HEK293
細胞、CHO-K1 細胞、Ra1 1 纖維組織母細胞和 Xenopus 卵母細胞轉型後進行蛋白質
表現。利用北方墨點法、免疫染色和 RT-PCR 確認蛋白質是否表現。活性測定則是利
用 agonist 刺激之 [ 35 S]GTPγS 結合能力或 GTP 水解能力進行分析。實際應用中,
β2-adrenoceptor-Gαs 融合蛋白質在 agonist 刺激下具有 [ 35 S]GTPγS 結合能力和 GTP
水解能力,但是在共表現中,卻無法觀察到結合能力或水解能力的訊號。然而,在 5-HT1A
受體與其 Cys351Gly Gαo 共表現於 COS-7 細胞中,卻比融合蛋白質具有較高的
agonist 刺激下具有 [ 35 S]GTPγS 結合能力。各種不同 GPCR 間的差異目前仍無法用序
列分析作為實驗設計的依據。
GPCR-Gα 融合蛋白質的下游訊息傳遞
無論是共表現或是融合蛋白質表現系統的篩選平台,除了 agonist 刺激下
[ 35 S]GTPγS 結合能力或 GTP 水解能力做為指標外,下游訊息傳遞也可以作為參考依
據。然而在 A1 receptor-GFP-Cys251Gly Gαi 融合蛋白質的實驗中,雖然具有 agonist 刺
激下 [ 35 S]GTPγS 結合能力,但卻無法傳遞訊息到 adenylyl cyclase 和 MAP kinase。目
前仍沒有合理的實驗結果可以推測原因。但很有可能與 G protein signaling system 的四
級結構有關。
Gβγ 的影響
Gβγ 的存在可以促進 GPCR 和 Gα 的耦合。Restored Gβγ 的 HEK 細胞表現 A1
receptor-Gαi 融合蛋白質時會對 agonist 具有較高親和力。可是在表現
β2-adrenoceptor-Gαs 之 Sf9 細胞中共表現 Gβγ 對於 agonist 親和力卻沒有顯著影響,而
對於基礎 GTPase 能力有些許改變。所以呼應上述的實驗結果,Gβγ 對於 G protein
signaling system 的四級結構影響仍有待研究。