傅煦媛 - 國立臺灣大學
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國立臺灣大學微生物與生化學研究所微生物學組專題討論<br />
題目:Ligand screening system using fusion proteins of G protein-coupled receptors with G<br />
protein α subunits.<br />
作者:Hinako Suga, Tatsuya Haga<br />
文章來源:Neurochemistry international 51(2-4):140-64, 2007<br />
演講人:Hsu-Yuan Fu <strong>傅煦媛</strong> D97B47403<br />
指導老師:Chii-Shen Yang 楊啓伸 助理教授<br />
演講日期:2009/09/28<br />
演講地點:The 6 th Classroom 三號館第六教室<br />
摘要<br />
膜蛋白質大量密集地佔據生物膜上大約一半的體積。而膜蛋白質家族中最大的組成<br />
- G protein-coupled receptors (GPCRs) 亦為構成人類基因組中最大的基因家庭,並且是目<br />
前藥物開發中最大的標的。雖然基因組的解析和生物資訊的發展,讓大量的 GPCR 基<br />
因被鑑定出來,但 ligand 的鑑定,卻仍有待實驗方法的發展。目前已發展許多檢測系<br />
統用於鑑定孤兒 GPCR 的 ligand,但這些方法都十分複雜。而進一步對於各種 GPCR<br />
藥物篩選平台,目前仍沒有簡單的方法,篩選它們的 ligand,特別是 Gαi 的 GPCR。<br />
作者過去研究融合蛋白 GPCR-Gα 是否可以用來進行篩選和鑑定孤兒 GPCR 的<br />
ligand。經過初步實驗證實,部份融合蛋白平台的確可以提供有效的篩選。並在此從<br />
GPCR 的研究,討論以下四項主題:(1) GPCR 基因和蛋白質特性,(2) 孤兒 GPCRs 的<br />
ligand 鑑定,(3) GPCRs 和 G protein α subunits 融合蛋白質之特性,(4) 利用 GPCRs 和<br />
G protein α subunits 融合蛋白質作為 ligand 篩選工具。<br />
Keywords: Membrane protein, GPCR, Fusion GPCR-Gα, Drug design<br />
簡介<br />
GPCR 是細胞表面最大一類的<br />
receptors,可以辨認細胞外幾乎各種刺激的<br />
傳遞。例如荷爾蒙、神經傳遞物質、化學小<br />
分子、光、激素等。Receptors 接受外界訊<br />
息後產生立體構型改變,傳遞訊息影響細胞<br />
內之 heterotrimeric G-protein。被活化的<br />
heterotrimeric G-protein 再啟動下游目標蛋<br />
白質,經由一連串訊息傳遞後,完成細胞對<br />
刺激的反應。而 GPCR 又根據不同分析有<br />
許多種不同分類方式。目前較多科學家習慣
以系統學上分析之結果,將 GPCR 分成五個主要的家族:rhodopsin, secretin, glutamate,<br />
adhesion, frizzled-taste-2。Rhodopsin 家族,又稱為 Class A family,是最大且目前被研<br />
究最為詳細之 GPCR 家族。<br />
GPCR 下游活化的 heterotrimeric G-protein 是由於其與 GTP 結合,而後進行 GTP<br />
之水解而稱之。G-protein signaling system 可視為兩個部份:(I) GPCR,為一膜蛋白。在<br />
圖中為 rhodopsin,其扮演的角色為接受細胞外之訊息;(II) heterotrimeric G-protein,包<br />
括 α、β、γ 三個次單元,其扮演的角色為接受 GPCR 活化後,傳遞訊息至下游蛋白質,<br />
調控細胞反應。<br />
Gα subunit 又可依其活化之下游蛋白質,分成 Gαi、Gαs、Gαq、Gα12/13 四大家族。<br />
其下游對應之訊息傳遞路徑如下:<br />
Gαs<br />
Gαi<br />
Gαq<br />
Gα12/13<br />
Gαt<br />
(G-protein transducin)<br />
[屬於 Gαi]<br />
刺激 (stimulation) adenylyl cyclase,使 cAMP 量累積。<br />
cAMP 為一種二級訊息傳遞者 (secondary messanger),可<br />
活化 protein kinase A。<br />
抑制 (inhibition) adenylyl cyclase,使 cAMP 量降低。<br />
活化 phospholipase C,水解<br />
phosphoinositol-diphosphate,形成 IP3 及 diacylglycerol,<br />
前者作用於 IP3 受器,釋放細胞內的 Ca 2+ ;後者可活化<br />
protein kinase C。<br />
活化 rho GEF (一 small GTP-binding 蛋白質 rho 的<br />
guanine-nucleotide exchange factor)。和控制 cytoskeleton<br />
remodeling 有關,調控 cell migration。<br />
cGMP diesterase,可降低 cGMP 之含量,使原先與 Na +<br />
channel 結合之 cGMP 減少,結束 Na + channel 之開啟狀<br />
態,Na + channel 關閉,傳遞光之刺激。<br />
Gβγ subunit 亦有不同的訊息傳遞,如活化的鉀離子通道、抑制 adenylyl cyclase I、活<br />
化 adenylyl cyclase II,活化 phosphoinositol 專一之 phospholipase Cβ2/β3 等。因此,<br />
細胞外的訊息分子,通過 GPCR、G protein、effectors、protein kinases、kinase substrates、<br />
和其他分子,專一地在細胞中傳遞訊息反應。<br />
GPCRs 基因與蛋白質特性<br />
GPCR 基因特性<br />
GPCRs 是人類細胞中蛋白質 superfamily 最大的家族。利用 GPCR 的兩大特性:<br />
(1) 多數的 GPCR 基因沒有 introns;且 (2) 所有已知的 GPCR 蛋白質皆具有 7 個疏<br />
水性胺基酸區域,被視為是穿膜區。作者分析人類基因體定序結果,分析出 335570 個<br />
沒有 introns 的 ORF (open reading frame) 具有 200-1500 個胺基酸的序列。再利用生物<br />
資訊軟體 SOSUI 分析出獨特的 1714 個 ORF 具有 6-8 個穿膜區。進一步和已知的<br />
GPCR 比對,除去具有過短 loop 和高度同源性之 ORF,最後得到 581 個 GPCR 候<br />
選人。而過去的研究中指出,人類基因體定序分析的結果,估計約有 839-948 個基因
可能是 GPCR。其中包括 481 個是嗅覺受體、28 個苦味受體、330 個胞內源性 ligand<br />
受體,還有 0-109 個尚未以同源性分析可比對出之同源 GPCR 之未知新型 GPCR (或<br />
稱為孤兒 GPCR, orphan GPCR)。<br />
GPCR 蛋白質與結構特性<br />
GPCR 種類繁多。有趣的是其蛋白質序列同源性不高,但在結構上卻具有高度相似<br />
性:均為一條多肽鏈,形成七次穿膜之 α 螺旋結構 (seven transmembrane domain<br />
receptors, 7TM receptors)。從 2000 年開始,rhodopsin 的結構被解析出後,到目前為止,<br />
總共有 5 個重要的 GPCR 結構被解出。和同是 7TM receptor 的 bacteriorhodopsin (BR)<br />
相比,其七個穿膜區的 α 螺旋不互相平行也不垂直於膜面,且在 C-ter. 具有第八個 α<br />
螺旋和膜平行。<br />
Bovine<br />
Rhodopsin<br />
Squid<br />
Rhodopsin<br />
Turkey β1<br />
adrenergic<br />
receptor<br />
Human β2<br />
adrenergic<br />
receptor<br />
Human A2A<br />
adenosine receptor<br />
2000 2008 2008 2007 2008<br />
而在真實生理狀態的細胞中,GPCR 除了和訊息傳遞 heterotrimeric G-protein 形成<br />
complex 外,在膜上形成的四級結構也是 GPCR 正常生理作用的關鍵。有些 GPCR 是<br />
已知與其他蛋白質形成 hetero-oligomers。像是 RAMPs (receptor-activity-modifying<br />
proteins) 和用於運輸降鈣素受體類受體之相互作用是其功能必須的。RAMPs 是一新的<br />
家族,為一具有單跨膜區的蛋白質。目前已經發現許多 GPCR 需要這樣的輔助蛋白質<br />
來執行功能。<br />
GPCR 的去敏化 (desensitization)<br />
GPCR 在長時間接觸 ligand 後,會降低其對於此刺激物的反應,稱為去敏化<br />
(desensitization)。Desensitization 可以分成三個階段:首先,和 G proteins 去耦合,接<br />
著發生 internalization (sequestration),此時,這些 GPCR 仍處於可以再度回到細胞膜上<br />
進行下一次接受訊息;而最後一步不可逆的是進行 down-regulation,這時,這些 GPCR<br />
會被不可逆的降解。目前 GPCR 的 desensitization 機制仍未完全釐清。且在各 subtype<br />
的 GPCR 中 desensitization 的機制和閥值皆不同。為一生理中受到高度調控的現象。
孤兒 GPCRs 的 ligand 鑑定-GPCR ligand 篩選方法<br />
Orphan GPCR 的 ligand 鑑定最大的瓶頸有三個:(1) GPCR 本身表現困難,表現<br />
的 GPCR 不具有活性,可能和失去正常生理狀態下能交互作用的蛋白質存在與否有<br />
關;(2) 不知 orphan GPCR 下游交互耦合之 Gα 為何;(3) 可能為絕大部分 GPCR 耦<br />
合 Gαi 之篩選方式效率不佳。為了解決後兩個問題,目前設計出 Gαq/i chimera 平台和<br />
Gα15 和 Gα16 平台。然而這兩個平台並不能完全解決問題。包括像是 chimera 後的<br />
Gα,和被視為較無 GPCR 專一性之 Gα15 & Gα16 仍無法與 orphan GPCR 交互作用。<br />
或是引起轉型細胞株中 cross-interaction 之反應。<br />
GPCRs 和 G protein α subunits 融合蛋白質之特性<br />
建構、表現具活性之 GPCR 和 Gα 蛋白質<br />
共表現 GPCR 和 Gα 和表現 GPCR-Gα 融合蛋白質最大的不同,就是後者可以確<br />
認其交互作用 1:1 的效率。其構築模式是在 GPCR 的 C-ter. 加上一 epitope tag 或是<br />
GFP,然後再與 Gα 的 N-ter. 相接。利用 E. coli、昆蟲 Sf9 細胞、COS-7 細胞、HEK293<br />
細胞、CHO-K1 細胞、Ra1 1 纖維組織母細胞和 Xenopus 卵母細胞轉型後進行蛋白質<br />
表現。利用北方墨點法、免疫染色和 RT-PCR 確認蛋白質是否表現。活性測定則是利<br />
用 agonist 刺激之 [ 35 S]GTPγS 結合能力或 GTP 水解能力進行分析。實際應用中,<br />
β2-adrenoceptor-Gαs 融合蛋白質在 agonist 刺激下具有 [ 35 S]GTPγS 結合能力和 GTP<br />
水解能力,但是在共表現中,卻無法觀察到結合能力或水解能力的訊號。然而,在 5-HT1A<br />
受體與其 Cys351Gly Gαo 共表現於 COS-7 細胞中,卻比融合蛋白質具有較高的<br />
agonist 刺激下具有 [ 35 S]GTPγS 結合能力。各種不同 GPCR 間的差異目前仍無法用序<br />
列分析作為實驗設計的依據。<br />
GPCR-Gα 融合蛋白質的下游訊息傳遞<br />
無論是共表現或是融合蛋白質表現系統的篩選平台,除了 agonist 刺激下<br />
[ 35 S]GTPγS 結合能力或 GTP 水解能力做為指標外,下游訊息傳遞也可以作為參考依<br />
據。然而在 A1 receptor-GFP-Cys251Gly Gαi 融合蛋白質的實驗中,雖然具有 agonist 刺<br />
激下 [ 35 S]GTPγS 結合能力,但卻無法傳遞訊息到 adenylyl cyclase 和 MAP kinase。目<br />
前仍沒有合理的實驗結果可以推測原因。但很有可能與 G protein signaling system 的四<br />
級結構有關。<br />
Gβγ 的影響<br />
Gβγ 的存在可以促進 GPCR 和 Gα 的耦合。Restored Gβγ 的 HEK 細胞表現 A1<br />
receptor-Gαi 融合蛋白質時會對 agonist 具有較高親和力。可是在表現<br />
β2-adrenoceptor-Gαs 之 Sf9 細胞中共表現 Gβγ 對於 agonist 親和力卻沒有顯著影響,而<br />
對於基礎 GTPase 能力有些許改變。所以呼應上述的實驗結果,Gβγ 對於 G protein<br />
signaling system 的四級結構影響仍有待研究。
利用 GPCRs 和 G protein α subunits 融合蛋白質作為 ligand 篩選工具<br />
將融合蛋白質表現於 Sf9 細胞膜上,成功的以 ligand 活化融合蛋白質的有幾個例<br />
子,包括做為模式的 nociceptin receptor- Gαi2 可以反應出組織萃取物中的 ligand,再利<br />
用液相層析鑑定其身分;原本是 orphan GPCR 的 hGPCR48 和 Gαi1 融合後,在化學<br />
小分子、脂質資料庫中篩選出 5-oxo-ETE 為其化學小分子 ligand,而後解釋嗜中性和<br />
嗜酸性球的化學趨性。<br />
結論<br />
本文中所描述的 GPCR -Gα 融合蛋白質是一項利於 ligand 篩選的工具。大約 50%<br />
已知的 GPCR 是與 Gαi 耦合。如果將這個比例推廣到目前的 orphan GPCR 中,將有<br />
半數的 orphan GPCR 可望篩選出 ligand。在後基因體時代裡,deorphaning 將繼續是一<br />
個最令人興奮的研究領域;此外,這個平台在藥物篩選的應用上,亦是未來過半數製藥<br />
產業上的一大福音。然而,不能否認的是,在細胞內真實 GPCR 所交互作用的網路,<br />
遠比科學家想像的更有空間。更謹慎的研究了解 signaling transduction 亦是後基因體時<br />
代不能被忽視的關鍵。<br />
參考文獻<br />
1. Heterotrimeric G protein activation by G-protein-coupled receptors. Nature Reviews<br />
Molecular Cell Biolog. 9(1), 60-71 (2008).<br />
2. G-protein-coupled receptor-focused drug discovery using a target class platform approach.<br />
Drug Discovery Today 14(5-6):231-40 (2009)<br />
3. Cellular assays as portals to seven-transmembrane receptor-based drug discovery. Nature<br />
reviews Drug Discovery 8(8):617-26. (2009)<br />
4. RCSB Protein Data Bank: http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do
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