coagulants of moringa oleifera lam. seeds purification ... - EPFL

COAGULANTS OF MORINGA OLEIFERA LAM. SEEDS
PURIFICATION & CHARACTERISATION
THÈSE N O 3251 (2005)
PRÉSENTÉE À LA FACULTÉ SCIENCES DE BASE
Institut des sciences et ingénierie chimiques
SECTION DE CHIMIE ET GÉNIE CHIMIQUE
ÉCOLE POLYTECHNIQUE FÉDÉRALE DE LAUSANNE
POUR L'OBTENTION DU GRADE DE DOCTEUR ÈS SCIENCES TECHNIQUES
PAR
Stephan Christos DÖRRIES
Diplom-Biochemiker, Universität Hannover, Allemagne
et de nationalité allemande
acceptée sur proposition du jury:
Dr I. W. Marison, directeur de thèse
Prof. G. Folkard, rapporteur
Dr C. Servis, rapporteur
Prof. U. von Stockar, rapporteur
Prof. C. Wandrey, rapporteur
Lausanne, EPFL
2005

Table of Contents
of Moringa oleifera Lam. Seeds . . . . . . . . . . 1
Coagulants
Water Supply . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
Global
Treatment using Primary Coagulants . . . . . . . . . . . . . . . . . .3
Water
Flocculants . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4
Commercial
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
Aim
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
References
of Flocculating Proteins
Extraction
M.oleifera Seeds . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
from
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
Abstract
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
Introduction
and Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .12
Materials
Extraction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
Seed
Salt Solution: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
Multiple
Extraction Buffer: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
Protein
NaCl: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .13
1M
Water: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
Demineralised
Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .13
Analytical
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
Chromatography
/ Western Blotting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
SDS-PAGE
and Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
Results
Extraction procedures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
Different
of Protein Content during Storage . . . . . . . . . . . . . . . . 19
Evolution
of Thermo-Precipitation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
Effect
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
Conclusions
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
of M.oleifera Seed Proteins
Purification
Sequence Determination . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
for
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
Abstract
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
Introduction
Strategies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
Purification
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
SDS-PAGE
of Proteins upon Extraction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
Modification
and Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .34
Materials
Extraction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
Seed
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
Chromatography
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
Analytics
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
SDS-PAGE
Protein . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
Total
Spectrometry (MS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
Mass
and Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
Results
Reverse Phase HPLC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
Semi-Preparative
iii

iv
Reverse Phase Chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . 40
Preparative
of the Thermo-Precipitation Step . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
Influence
Extraction Buffer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
Protein
of Non-Reduced Main Protein Component Prior
Pooling
Reduction. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
to
Theoretical Plate Number . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
Increased
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
Conclusions
Strategy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
Purification
Characteristics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
Protein
Modification and Non-Proteinaceous Components . . . . . 61
Protein
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
of Non-Proteinaceous Components
Characterisation
in M.oleifera Extracts . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
Present
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
Abstract
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
Introduction
of Secondary Metabolites that Interfere
Presence
Protein Purification from Seeds . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
with
Compounds . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
Phenolic
derivatives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
Glucosinolate
of Phenolics and Isothiocyanates
Influence
the Physicochemical Properties of Proteins . . . . . . . . . . . . . . 68
on
of Secondary Metabolites in M.oleifera seed extracts 71
Determination
and Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
Materials
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
Chemicals
material . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
Plant
and isolation of 4(-α-L-rhamnopyranosyloxy)-
Extraction
(4RBGLS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
benzylglucosinolate
of 4RBGLS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
Re-crystallization
of isolated 4RBGLS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
Characterization
and isolation of 4-(α-L-rhamnopyranosyloxy)-
Preparation
(4RBITC) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
benzylisothiocyanate
Extractions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
Seed
Extraction Procedure for All Different Media . . . . . . . 73
Modified
Protein Extraction Procedures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
Original
methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
HPLC
of secondary metabolites . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
Quantification
and Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
Results
of Standards for Glucosinolates
Preparation
Isothiocyanates present in M.oleifera . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
and
Analysis of Different Extraction Media . . . . . . . . . . 76
Qualitative
of Secondary Metabolites in Extracts
Quantification
M.oleifera seeds . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
of
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
Conclusions
of the Results in Regard to Protein Extraction . . . . . 86
Importance
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
Acknowledgments
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88

of Coagulating Activity of Different Compo-
Measurement
Present in M.oleifera Seed Extracts . . . . . . . . . . 91
nents
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .92
Abstract
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
Introduction
of Coagulation Efficiency . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .92
Testing
of the Particle Concentration on
Influence
Coagulating Activity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .94
the
of colloid material for coagulation experiments . . . . . . . . 95
Choice
of the Coagulation Rate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
Measurement
of Coagulation and Flocculation . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
Definition
and Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .99
Materials
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .99
Chemicals
Seed Extracts . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .99
M.oleifera
Assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .99
Coagulation
and Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
Results
Extraction Procedures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106
Different
of Fractions prepared by Chromatographic separation
Analysis
Extracts . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
of
extract . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
Non-reduced
after Reduction of the Sample . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
Separation
of Suspensions of Glassbeads and Bentonite . . . . . 114
Flocculation
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116
Conclusions
activity of M.oleifera extracts . . . . . . . . . . . . . . . . . 117
Coagulating
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120
References
of M.oleifera Seed Proteins . . . . . . 123
Characterisation
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124
Abstract
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124
Introduction
Proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126
Seed
and Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131
Materials
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131
Chemicals
extraction and quantification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131
Protein
Separation (prep. HPLC + Äkta) . . . . . . . . . . 132
Chromatographic
SDS PAGE / Western Blotting . . . . . . . . . . . . . . . . 132
Tris-Tricine
Protein Staining and Immuno Staining . . . . . . . . . 132
Non-Specific
Staining of Glycosylated Proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . 132
Specific
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
MALDI/TOF-MS
Mapping / Mass Mapping . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
Peptide
and Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134
Results
Sequences of Selected Protein Fractions . . . . . . . . . . . . . . . 134
Tag
molecular weight proteins present in oil body fractions . . . 135
Low
Separated by Reverse Phase Chromatography
Proteins
Sample Reduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137
after
digest . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139
Tryptic
Digest . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142
Chymotryptic
Immuno Detection of Proteins with Anti-Flo Antibodies . . . . . . 144
v

vi
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146
Conclusions
of Purification of M.oleifera seed proteins . . . . . . . 146
Difficulties
of Isolated Fragments to Mo2.1 . . . . . . . . . . . . . . . . 146
Homology
Homologies of Mo2.1 with seed proteins . . . . . . . . . 147
Sequence
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149
of the Extraction Procedure . . . . . . . . . . . . . 151
Scale-up
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152
Abstract
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152
Introduction
from Laboratory to Pilot Scale . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154
Transfer
and Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156
Materials
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156
Chemicals
Cake Extraction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156
Press
Extraction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156
Batch
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156
Percolation
and Diafiltration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156
Ultrafiltration
Scale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156
Laboratory
Scale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157
Pilot
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157
Diafiltration
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158
Analytics
SDS-PAGE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158
Tris-Tricine
Determination (BCA & Bradford) . . . . . . . . . . . . . . . . . 158
Protein
and Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 159
Results
Separation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 159
Solid-Liquid
Concentration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161
Product
Extraction by Percolation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 164
Protein
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169
Conclusions
Separation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169
Solid-Liquid
Concentration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169
Product
Extraction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172
Solid-Liquid
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174
of Moringa oleifera Lam. Seeds . . . . . . . . 175
Coagulants
Conclusions and Future Perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . 176
General
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181
Figures and Tables . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 183
Additional
3 - Characterisation of Non-Proteinaceous
Chapter
Present in M.oleifera Extracts . . . . . . . . . . . . . . . . . . 184
Components
Calculation of Secondary Metabolite Concentration from Signal
Direct
Areas Observed in Standard Protein HPLC Chromatograms 190
Peak
4 - Measurement of Coagulating Activity of Different Components
Chapter
in M.oleifera Seed Extracts . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191
Present
change during coagulation
Absorption
a glass powder suspension . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 195
of
5 - Characterisation of M.oleifera Seed Proteins . . . . . . . 198
Chapter

HPLC of Extract prepared
Preparative
Multiple Salt Solution from M.oleifera press cake. . . . . . 198
with
of Fractions for Sequence Analysis
Preparation
Reverse Phase HPLC of an Extract prepared
by
Multiple Salts Solution from M.oleifera Press Cake . . . . . 202
with
6 - Scale-up of the Extraction Procedure . . . . . . . . . . . . . . 205
Chapter
of the Diafiltration Device . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 205
Setup
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 205
Reference
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 207
Nomenclature
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 208
Abbreviations
Acids (Single Letter Code) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209
Amino
Vitae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211
Curriculum
Publications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212
vii

SUMMARY
Water has been declared a human right by the United Nations, thus urging countries who have
ratified the International Covenant on Economic, Social and Cultural Rights to ensure supply
with drinking water for their populations 1 .
However, supply of drinking water in developing countries underlies different constraints than
those met in industrialized countries. An example is the dependency on treatment chemicals that
may pose problems in these countries regarding importation and distribution 2 . In pioneering
work in the Darfur region (Sudan) S.A.A. Jahn has instructed rural people how to use local nat-
ural coagulants, that had been used traditionally by parts of the population, for the preparation
of water for household use with special emphasis on the seeds of the Moringa oleifera tree 3 . The
implementation of water supply for the population on the other hand demands centralized water
treatment for villages and cities and thus traditional techniques will reach their limitations.
The present work tries to identify and characterise the coagulating principle present in the seeds
and press-cake of M.oleifera, in order to produce quantities of a standardized coagulant that
could be used in small treatment works. Therefore, different extraction methods, reported in the
literature, are compared regarding extraction efficiency and composition. All extracts contained
a large proteinaceous moiety, which differed from proteins described before as Mo 2.1 (floccu-
lating proteins 4 ) in the way that two proteins were detected under reducing conditions, both not
co-migrating with a synthetic protein having the amino acid sequence of Mo 2.1. Moreover a
different group of proteins with higher molecular weight was only present during the first two
days of storage of the liquid extract. An optimized extraction procedure is presented, resulting
in a total protein yield of 40g/L.
Separation of proteinaceous components present in the seed and press-cake extracts lead to the
determination of relative molecular masses of two protein components present (4 and 8 kDa)
which form a 12 kDa heterodimer under non-reducing conditions, such as those found in the
raw extracts. Further evidence is presented that the number of different proteins present in the
UN, Substantive issues arising in the implementation of the international covenant on economic, social
1.
cultural rights. 2002, United Nations, Economic and Social Council, Committee on Economic,
and
and Cultural Rights.
Social
Folkard, G. and J. Sutherland, Development of a naturally derived coagulant for water and wastewater
2.
Water Science and Technology: Water Supply, 2002. 2(5-6): p. 89-94.
treatment.
Jahn, S.A.A., Proper use of African natural coagulants for rural water supplies research in the Sudan
3.
a guide for new projects. 1986, Eschborn: Deutsche Gesellschaft für Technische Zusammenarbeit.
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S. 541
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4.
Lam. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects, 1995. 1243(3): p. 477-481.
Oleifera
ix

x
Summary
extracts using the reported techniques may be an artifact due to sample degradation, oxidation
and reaction with non-proteinaceous substances present in the extracts.
The presence of glucosinolates and of their derivatives that belong to the reactive group of iso-
thiocyanates was show in the extracts of M.oleifera seeds and press-cake, thus increasing the
risk of protein stability problems during storage of the potential product. Furthermore, a method
for protein isolation which reduces interference of isothiocyanates has been developed for ex-
traction from M.oleifera.
In order to compare the coagulating activities of different components present in fractions after
separation of the seed extracts a miniaturized assay has been developed. Highest coagulating
activities were found for the 8 kDa protein chain. Partial sequencing of different preparations of
the 8 kDa chain indicated the presence of several forms of the protein having slight sequence
differences. The protein chain is very similar to the published Mo 2.1 protein, but appears to
contain 70 amino acid residues instead of the 60 residues reported for Mo 2.1. These results
clearly indicate that the original protein Mo 2.1 is only a fragment of the proteins present in ex-
tracts from M.oleifera seeds.
Experiments for pilot scale production were conducted involving extraction of the coagulant
from M.oleifera press cake. Different possible technologies for the preparation of coagulant
from M.oleifera press-cake are compared. Difficulties were encountered in solid-liquid separa-
tion after initial extraction, due to high solid loads and very slow settling, and during concen-
tration of extracts by ultrafiltration. Alternatively tests for percolation of press-cake were
carried out, which resulted in high extraction efficiencies. Finally an extraction process using
sequential percolation with two different solvents, in order to separate glucosinolates and pro-
teins is proposed, followed by a precipitating concentration step of the product.

ZUSAMMENFASSUNG
Wasser ist von den Vereinten Nationen zu einem Menschenrecht erklärt worden, in der Absicht
Staaten, die den Internationalen Pakt über wirtschaftliche, soziale und kulturelle Rechte
ratifiziert haben, dazu zu bewegen, die Versorgung der Bevölkerung mit Trinkwasser zu
gewährleisten 1 .
Bei der Umsetzung dieses Ziels ist jedoch zu bedenken, dass die Trinkwasserversorgung in den
armen Ländern anderen Beschränkungen unterliegt, als die für industrialisierte Nationen gilt.
Die Abhängigkeit von Chemikalien zur Wasseraufbereitung beispielsweise, welche aus
anderen Ländern importiert werden müssen, birgt die Gefahr von Unregelmässigkeiten bei der
Lieferung 2 . S.A.A. Jahn versuchte, die Verwendung von natürlichen Flockungsmitteln
(besonders der Samen des M.oleifera Baumes) zur Aufbereitung von Trinkwasser in der
Landbevölkerung in der Region um Darfur (Sudan) mit einfachen Mitteln zu systematisieren 3 .
Dem gegenüber verlangt die Umsetzung der Wasserversorgung der Bevölkerung eine
zentralisierte Wasseraufbereitung zur Versorgung ganzer Dörfer und Städte, sodaß traditionelle
Methoden nicht mehr ausreichen.
Die vorliegende Arbeit versucht, das die Koagulation verursachende Prinzip in den Samen und
dem bei der Ölgewinnung anfallenden Filterkuchen von M.oleifera zu identifizieren und zu
charakterisieren, um größere Mengen eines standardisierten Koagulationsmittels herstellen zu
können, welches in kleinen bis mittleren Wasseraufbereitungsanlagen verwendet werden kann.
Zu diesem Zweck wurden verschiedene, in der Literatur angegebene Extraktionsverfahren
getestet und bezüglich der Extraktionsleistung sowie der Zusammensetzung des resultierenden
Extraktes verglichen. Alle Extrakte zeigten einen hohen Proteingehalt, der jedoch
charakteristische Unterschiede zu dem zuvor beschriebenen Protein Mo 2.1 (Flockungsaktives
Protein 4 ) aufwies. Dies äußerte sich durch das Vorhandensein zweier Proteine, die beide in
ihrem elektrophoretischen Migrationsverhalten von einer synthetisch hergestellten Probe des
Mo 2.1 Proteins abwichen. Darüberhinaus konnte eine weitere Gruppe höhermolekularer
UN, Substantive issues arising in the implementation of the international covenant on economic, social
1.
cultural rights. 2002, United Nations, Economic and Social Council, Committee on Economic,
and
and Cultural Rights.
Social
Folkard, G. and J. Sutherland, Development of a naturally derived coagulant for water and wastewater
2.
Water Science and Technology: Water Supply, 2002. 2(5-6): p. 89-94.
treatment.
Jahn, S.A.A., Proper use of African natural coagulants for rural water supplies research in the Sudan
3.
a guide for new projects. 1986, Eschborn: Deutsche Gesellschaft für Technische Zusammenarbeit.
and
S. 541
Gassenschmidt, U., et al., Isolation and Characterization of a Flocculating Protein from Moringa-
4.
Lam. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects, 1995. 1243(3): p. 477-481.
Oleifera
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xii
Zusammenfassung
Proteine ausschlieslich während der ersten zwei Tage der Lagerung beobachtet werden. Eine
maximale Protein Konzentration von 40 g/L wurde durch die Verwendung einer Lösung
verschiedener Salze erhalten.
Die Trennung verschiedener in den Extrakten von Samen und Filterkuchen vorhandener
Proteine ermöglichte die Bestimmung der relativen Molmasse von zwei unterschiedlichen
Komponenten (4 und 8 kDa), die unter nicht reduzierenden Bedingungen, wie sie in den
Extrakten vorliegen, ein 12 kDa Heterodimer bilden. Weiterhin wurden Anhaltspunkte
gefunden, daß die große Anzahl von Proteinen, die in den Extrakten gefunden wurden
möglicherweise auf Artefakte, wie Zersetzung, Oxidation oder Reaktion mit nicht-proteinösen
Substanzen, zurückzuführen ist.
Das Vorhandensein von Glukosinolaten, und deren Derivaten, welche zur Gruppe der reaktiven
Isothiocyanate gehören, erhöht die Gefahr der Instabilität für die Proteine in M.oleifera Samen-
und Filterkuchenextrakten. Aus diesem Grunde wurde eine weitere Methode zur
Proteinisolation entwickelt, die den Einfluß von Isothiocyanaten minimiert.
Zum Vergleich der koagulierenden Eigenschaften von verschiedenen Komponenten nach
Fraktionierung der Extrakte wurde ein miniaturisierter Test erstellt. Die stärksten
koagulierenden Effekte wurden für die 8 kDa Kette des 12 kDa Proteins gefunden. Teilweise
Sequenzierung verschiedener Präparationen der 8 kDa Kette ergab geringe Unterschiede in den
Proteinsequenzen. Insgesamt ist die 8 kDa Kette dem Mo 2.1 Protein sehr ähnlich, jedoch
besteht sie aus 70 Aminosäureresten, anstelle von 60, wie es für Mo 2.1 berichtet wurde. Diese
Ergebnisse zeigen deutlich, daß es sich bei dem Mo 2.1 um ein Fragment eines Proteines
handelt, das in Extrakten von M.oleifera Samen gefunden wird.
Versuche zur Produktion eines Koagulationsmittels aus M.oleifera Filterkuchen im
Technikumsmaßstab wurden durchgeführt. Dabei wurden verschiedene Verfahren zur
Herstellung des Koagulierungsmittels verglichen. Auf Schwierigkeiten stießen Versuche bei
Fest-Flüssig Trennverfahren nach erfolgter Extraktion aufgrund hoher Feststoffgehalte und sehr
schlechtem Sedimentationsverhalten. Weiterhin ließen sich Versuche zur Aufkonzentrierung
der Lösungen mittels Ultrafiltration nur sehr schlecht reproduzieren. Alternativ wurden
Versuche zur Perkolation des gemahlenen Filterkuchens durchgeführt, die zu hohen
Extraktionsausbeuten führten. Abschließend wird ein Extraktionsprozeß mittels sequentieller
Perkolation unter Verwendung zweier verschiedener Lösungsmittel, um eine Trennung von
Glukosinolaten und Proteinen zu erreichen, gefolgt von einer Fällung der aktiven Proteine zur
Produktkonzentrierung vorgeschlagen.