ภาพที่ 1
ภาพที่ 1
ภาพที่ 1
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
ปัญหาพิเศษ<br />
เรื่อง<br />
การคัดแยกแบคทีเรียที<br />
่ผลิตเอนไซม์เซลลูเลสจากมูลสุกร<br />
Isolation of Cellulase-Producing Bacteria from Manure.<br />
โดย<br />
นางสาวทิพวรรณ แตงสวน<br />
หลักสูตรสัตวศาสตร์<br />
สาขาวิชาเทคโนโลยีการผลิตสัตว์และประมง<br />
คณะเทคโนโลยีการเกษตร<br />
Curriculum of Animal Science<br />
Division of Animal Production Technology and Fisheries<br />
Faculty of Agricultural Technology<br />
สถาบันเทคโนโลยีพระจอมเกล้า King Mongkut’s Institute of Technology<br />
เจ้าคุณทหารลาดกระบัง Chaokuntaharn Ladkrabang<br />
กรุงเทพฯ 10520 Bangkok 10520 Thailand
ใบรับรองปัญหาพิเศษปริญญาตรี<br />
หลักสูตรสัตวศาสตร์<br />
สาขาวิชาเทคโนโลยีการผลิตสัตว์และประมง<br />
เรื่อง<br />
การคัดแยกแบคทีเรียที่ผลิตเอนไซม์เซลลูเลสจากมูลสุกร<br />
Isolation of Cellulase-Producing Bacteria from Manure.<br />
ได้รับการพิจารณาเห็นชอบโดย<br />
โดย<br />
นางสาวทิพวรรณ แตงสวน<br />
อาจารย์ที่ปรึกษา.........................................................................<br />
(ผศ.ดร. กนกรัตน์ ศรีกิจเกษมวัฒน์)<br />
อาจารย์ที่ปรึกษา<br />
หลักสูตรรับรองแล้ว<br />
....................................................................................<br />
(รศ.ดร. กานต์ สุขสุแพทย์)<br />
ประธานหลักสูตรสัตวศาสตร์<br />
วันที่..........เดือน............................ปี<br />
............
ปัญหาพิเศษ<br />
เรื่อง<br />
การคัดแยกแบคทีเรียที่ผลิตเอนไซม์เซลลูเลสจากมูลสุกร<br />
Isolation of Cellulase-Producing Bacteria from Manure.<br />
โดย<br />
นางสาวทิพวรรณ แตงสวน<br />
เสนอ<br />
หลักสูตรสัตวศาสตร์<br />
สาขาวิชาเทคโนโลยีการผลิตสัตว์และประมง<br />
คณะเทคโนโลยีการเกษตร<br />
สถาบันเทคโนโลยีพระจอมเกล้าเจ้าคุณทหารลาดกระบัง<br />
กรุงเทพมหานคร<br />
พ.ศ.2553
บทคัดย่อปัญหาพิเศษ<br />
เรื่อง<br />
การคัดแยกแบคทีเรียที่ผลิตเอนไซม์เซลลูเลสจากมูลสุกร<br />
Isolation of Cellulase-Producing Bacteria from Manure.<br />
การคัดแยกแบคทีเรียที ่ผลิตเอนไซม์เซลลูเลสจากมูลสุกรได้ท าการศึกษาคัดแยกจากมูล<br />
สุกรสดและจากมูลสุกรที ่ได้บ่อหมัก biogas โดยน ามาวิเคราะห์กิจกรรมเอนไซม์โดยใช้อาหาร<br />
CMC บ่มในสภาพไร้อากาศที ่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็ นเวลา 72 ชั่วโมง<br />
หาอัตราส่วนของ<br />
บริเวณโซนใสต่อขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางโคโลนี (HC) ผลการคัดแยกพบว่า การคัดแยกแบคทีเรียที ่<br />
สามารถสร้างเอนไซม์เซลลูเลสจากมูลสุกรสด พบว่ามีเชื ้อที่แสดงกิจกรรมของเอนไซม์เซลลูเลส<br />
ทั ้งหมด 20 ตัวอย่าง จากบ่อหมัก biogas มีเชื ้อที่แสดงกิจกรรมของเอนไซม์เซลลูเลส<br />
9 ตัวอย่าง<br />
จากการศึกษาลักษณะการเรียงตัวและการติดสีแกรมของเชื ้อแบคทีเรียจากมูลสุกรสด ที่สามารถ<br />
สร้างเอนไซม์เซลลูเลสได้ สามารถจัดกลุ่มแบคทีเรี ยได้ 8 กลุ่มและพบว่าตัวอย่างหมายเลข<br />
SD6R1C79 สามารถผลิตเอนไซม์เซลลูเลสได้ดีที ่สุด โดยมีค่า HC เท่ากับ 3.88 เซนติเมตร ส่วนการ<br />
คัดแยกเชื ้อแบคทีเรียที ่สามารถสร้างเอนไซม์เซลลูเลสจากมูลสุกรที ่ได้บ่อหมัก biogas พบเชื ้อ<br />
แบคทีเรียหมายเลข L(A) โดยมีค่า HC เท่ากับ 3.09 เซนติเมตร ซึ ่งเป็ นที่น่าสนใจที่จะศึกษาถึงการ<br />
จ าแนกชนิดเชื ้อและหาสภาวะที ่เหมาะสมต่อการเจริญและสร้างเอนไซม์ของเชื ้อเพื่อน<br />
าไปใช้<br />
ประโยชน์ในอุตสาหกรรมต่อไป<br />
I
ค านิยม<br />
ปัญหาพิเศษฉบับนี ้ ส าเร็จลุล่วงลงได้ด้วยดีโดยได้รับความกรุณาจาก ผศ.ดร. กนกรัตน์<br />
ศรีกิจเกษมวัฒน์ อาจารย์ที่ปรึกษา<br />
ที่กรุณาให้ค<br />
าแนะน าช่วยเหลือ ให้ความเอื ้อเฟื ้ อวัสดุอุปกรณ์<br />
ต่างๆ และทุนในการวิจัย ตลอดจนแก้ไขข้อบกพร่องต่างๆ ของปัญหาพิเศษฉบับนี ้ จนเสร็จ<br />
เรียบร้อยและสมบูรณ์ยิ่งขึ<br />
้น<br />
ขอขอบพระคุณ โครงการย่อยบัณฑิตศึกษาและวิจัย สาขาเทคโนโลยีชีวภาพทางการเกษตร<br />
ห้องปฏิ บัติ ก ารสรี รวิท ย าและกา ย วิภาคสัตว์ ภาควิช าเทคโนโลยีก ารผลิ ตสัตว์ คณะ<br />
เ ท ค โ น โ ล ยี ก า ร เ ก ษ ต ร แ ล ะ ห้ อ ง ป ฏิ บัติ ก า ร ภ า ค วิ ช า เ ท ค โ น โ ล ยี ก า ร ผ ลิ ต พื ช ค ณ ะ<br />
เทคโนโลยีการเกษตร สถาบันเทคโนโลยีพระจอมเกล้าเจ้าคุณทหารลาดกระบังที ่ให้ความ<br />
อนุเคราะห์ในการใช้ห้องปฏิบัติการ<br />
ขอขอบคุณพี่ๆ<br />
ปริญญาโท โดยเฉพาะ นางสาวปัทมาพร จิตปรีดา และนางสาวมานิตา<br />
บุพตา ที่คอยเป็<br />
นที่ปรึกษาและให้ความช่วยเหลือตลอดจนปัญหาพิเศษฉบับนี<br />
้เสร็จสมบูรณ์<br />
ขอกราบขอบพระคุณบิดา มารดา และพี่น้องทุกคนที่คอยเป็<br />
นก าลังใจให้ตลอดในยามที่มี<br />
ปัญหาและยามที่ขาดก<br />
าลังใจ<br />
ขอขอบคุณเพื่อนๆ<br />
ทุกคนที่คอยถามไถ่อย่างเป็<br />
นห่วงและคอยเป็ นก าลังใจจนท าให้ปัญหา<br />
พิเศษฉบับนี ้ส าเร็จลงได้ด้วยดี<br />
II<br />
ทิพวรรณ แตงสวน<br />
31 มีนาคม 2554
สารบัญ<br />
หน้า<br />
บทคัดย่อ I<br />
ค านิยม II<br />
สารบัญ III<br />
สารบัญตาราง IV<br />
สารบัญภาพ V<br />
ค าน า 1<br />
วัตถุประสงค์ 1<br />
การตรวจเอกสาร 2<br />
อุปกรณ์และวิธีการทดลอง 12<br />
ผลการทดลอง 17<br />
สรุปและวิจารณ์ผลการทดลอง 29<br />
เอกสารอ้างอิง 30<br />
ภาคผนวก 32<br />
III
สารบัญตาราง<br />
่ ตารางที<br />
หน้า<br />
1. จุลินทรีย์ที ่สามารถผลิตเอนไซม์เซลลูเลสได้ 8<br />
2. เชื ้อราที่สามารถสร้างเอนไซม์เซลลูเลส<br />
9<br />
3. ผลศึกษาลักษณะ รูปร่าง ของเชื ้อแบคทีเรีย และการทดสอบความ<br />
สามารถในการสร้างเอนไซม์เซลลูเลสที่คัดเลือกได้จากมูลสุกรสด<br />
4. ผลศึกษาลักษณะ รูปร่าง ของเชื ้อแบคทีเรีย และการทดสอบความ<br />
สามารถในการสร้างเอนไซม์เซลลูเลสที่คัดเลือกได้จากมูลสุกร<br />
18<br />
จากบ่อแก๊ซชีวภาพ 24<br />
IV
สารบัญภาพ<br />
่ ภาพที<br />
หน้า<br />
1. ลักษณะโครงสร้างของเซลลูโลส และหน่วยย่อยบีต้า-ดี-กลูโคไฟราโนส<br />
ที่ต่อด้วยพันธะบีต้า-1,4-ไกลโคซิดิก<br />
ระหว่างคาร์บอนต าแหน่งที่<br />
1<br />
ของหน่วยย่อยบีต้า-ดี-กลูโคไฟราโนส กับคาร์บอนต าแหน่งที่<br />
4<br />
ของหน่วยย่อยถัดไป 3<br />
่<br />
่<br />
่<br />
่<br />
่<br />
่<br />
2. รูปร่างของโครงสร้างเซลลูโลสที ่พบในผนังเซลล์ทั่วไป<br />
3<br />
3. โครงสร้างสามมิติของเอนไซม์เซลลูเลส 5<br />
4. กลไลการท าปฏิกิริยาการย่อยสลายเซลลูโลสขของระบบเอนไซม์เซลลูเลส 6<br />
5. แสดงการท าเจือจางล าดับส่วน 14<br />
6. วิธีการ spread plate 14<br />
7. วิธีการ streak plate 14<br />
8. เทคนิคการย้อมสีแบคทีเรีย 15<br />
9. ลักษณะการเกิดโซนใสรอบโคโลนีของเชื ้อจุลินทรีย์ที ่สร้างเอนไซม์เซลลูเลส<br />
10. แสดงลักษณะแกรม รูปร่าง และการจัดเรียงตัวของเชื ้อจุลินทรีย์ที ่มี<br />
ความสามารถในการสร้างเอนไซม์เซลลูเลสจากมูลสุกรสดกลุ่มที 1<br />
19<br />
เชื ้อติดสีแกรมลบ รูปร่างกลม ลักษณะการเรียงตัวอยู ่เดี่ยวๆ<br />
หรือเป็ นคู่ๆ<br />
11. แสดงลักษณะแกรม รูปร่าง และการจัดเรียงตัวของเชื ้อจุลินทรีย์ที ่มี<br />
ความสามารถในการสร้างเอนไซม์เซลลูเลสจากมูลสุกรสดกลุ่มเชื ้อที 2<br />
19<br />
เชื ้อติดสีแกรมลบ รูปร่างกลมหรือรี มีการเรียงตัวอยู ่เป็ นคู่ 20<br />
12. แสดงลักษณะแกรม รูปร่าง และการจัดเรียงตัวของเชื ้อจุลินทรีย์ที ่มี<br />
ความสามารถในการสร้างเอนไซม์เซลลูเลสจากมูลสุกรสดกลุ่มเชื ้อที 3<br />
เชื ้อติดสีแกรมบวก รูปร่างกลม มีการจัดเรียงตัวอยู ่เดี่ยวๆ<br />
และเป็ นคู่ๆ<br />
13. แสดงลักษณะแกรม รูปร่าง และการจัดเรียงตัวของเชื ้อจุลินทรีย์ที ่มี<br />
ความสามารถในการสร้างเอนไซม์เซลลูเลสจากมูลสุกรสดกลุ่มเชื ้อที 4<br />
20<br />
เชื ้อติดสีแกรมบวก รูปร่างกลมหรือรี เรียงตัวจับกันเป็ นคู่ 21<br />
14. แสดงลักษณะแกรม รูปร่าง และการจัดเรียงตัวของเชื ้อจุลินทรีย์ที ่มี<br />
ความสามารถในการสร้างเอนไซม์เซลลูเลสจากมูลสุกรสดกลุ่มเชื ้อที 5<br />
เชื ้อติดสีแกรมบวก รูปร่างกลม ลักษณะการเรียงตัวเป็ นคู่สอง และคู่สี<br />
21<br />
V
สารบัญภาพ(ต่อ)<br />
่<br />
่<br />
่<br />
่<br />
่<br />
่<br />
่<br />
่<br />
่<br />
่ ่<br />
่<br />
ภาพที<br />
หน้า<br />
15. แสดงลักษณะแกรม รูปร่าง และการจัดเรียงตัวของเชื ้อจุลินทรีย์ที ่มี<br />
ความสามารถในการสร้างเอนไซม์เซลลูเลสจากมูลสุกรสดกลุ่มเชื ้อที 6<br />
เชื ้อติดสีแกรมบวก รูปร่างกลม ลักษณะการเรียงตัวอยู ่เป็ นคู่สี<br />
22<br />
16. แสดงลักษณะแกรม รูปร่าง และการจัดเรียงตัวของเชื ้อจุลินทรีย์ที ่มี<br />
ความสามารถในการสร้างเอนไซม์เซลลูเลสจากมูลสุกรสดกลุ่มเชื ้อที 7<br />
เชื ้อติดสีแกรมบวก รูปร่างท่อนสั ้น มีการเรียงตัวอยู ่เดี่ยวๆ<br />
หรือเป็ นคู่ๆ<br />
17. แสดงลักษณะแกรม รูปร่าง และการจัดเรียงตัวของเชื ้อจุลินทรีย์ที ่มี<br />
ความสามารถในการสร้างเอนไซม์เซลลูเลสจากมูลสุกรสดกลุ่มเชื ้อที 8<br />
22<br />
เชื ้อติดสีแกรมบวก รูปร่างท่อนสั ้น มีการเรียงตัวอยู ่เดี่ยวๆ<br />
หรือเป็ นคู่ๆ<br />
18. แสดงลักษณะแกรม รูปร่าง และการจัดเรียงตัวของเชื ้อจุลินทรีย์ที ่มี<br />
23<br />
ความสามารถในการสร้างเอนไซม์เซลลูเลสจากมูลสุกรจากบ่อแก๊ซชีวภาพ<br />
กลุ่มเชื ้อที 1 เชื ้อติดสีแกรมลบ รูปร่างกลมหรือรี ลักษณะการเรียงตัวอยู ่เดี่ยวๆ<br />
และเป็ นคู่ๆ 24<br />
19. แสดงลักษณะแกรม รูปร่าง และการจัดเรียงตัวของเชื ้อจุลินทรีย์ที ่มี<br />
ความสามารถในการสร้างเอนไซม์เซลลูเลสจากมูลสุกรจากบ่อแก๊ซชีวภาพ<br />
กลุ่มเชื ้อที 2 เชื ้อติดสีแกรมบวก รูปร่างกลม มีการเรียงตัวอยู ่เดี่ยวๆ<br />
และเป็ นคู่ๆ 25<br />
20. แสดงลักษณะแกรม รูปร่าง และการจัดเรียงตัวของเชื ้อจุลินทรีย์ที ่มี<br />
ความสามารถในการสร้างเอนไซม์เซลลูเลสจากมูลสุกรจากบ่อแก๊ซชีวภาพ<br />
กลุ่มเชื ้อที 3 เชื ้อติดสีแกรมบวก รูปร่างกลม การจัดเรียงตัวจับกันเป็ นคู่สอง<br />
และคู่สี<br />
25<br />
21. แสดงลักษณะแกรม รูปร่าง และการจัดเรียงตัวของเชื ้อจุลินทรีย์ที ่มี<br />
ความสามารถในการสร้างเอนไซม์เซลลูเลสจากมูลสุกรจากบ่อแก๊ซชีวภาพ<br />
กลุ่มเชื ้อที 4 เชื ้อติดสีแกรมบวก รูปร่างกลม ลักษณะการเรียงตัวเป็ นคู่สี<br />
22. แสดงลักษณะแกรม รูปร่าง และการจัดเรียงตัวของเชื ้อจุลินทรีย์ที ่มี<br />
26<br />
ความสามารถในการสร้างเอนไซม์เซลลูเลสจากมูลสุกรจากบ่อแก๊ซชีวภาพ<br />
กลุ่มเชื ้อที 5 เชื ้อติดสีแกรมบวก รูปร่างกลม เรียงตัวอยู ่เดี่ยวๆ<br />
เป็ นคู่ และเป็ นสาย 26<br />
VI
สารบัญภาพ(ต่อ)<br />
่<br />
่<br />
่<br />
่<br />
ภาพที<br />
หน้า<br />
23. แสดงลักษณะแกรม รูปร่าง และการจัดเรียงตัวของเชื ้อจุลินทรีย์ที ่มี<br />
ความสามารถในการสร้างเอนไซม์เซลลูเลสจากมูลสุกรจากบ่อแก๊ซชีวภาพ<br />
กลุ่มเชื ้อที 6 เชื ้อติดสีแกรมบวก รูปร่างท่อนสั ้น มีการเรียงตัวอยู ่เดี่ยวๆ<br />
24. แสดงลักษณะแกรม รูปร่าง และการจัดเรียงตัวของเชื ้อจุลินทรีย์ที ่มี<br />
27<br />
ความสามารถในการสร้างเอนไซม์เซลลูเลสจากมูลสุกรจากบ่อแก๊ซชีวภาพ<br />
กลุ่มเชื ้อที 7 เชื ้อติดสีแกรมบวก รูปร่างท่อนสั ้น ลักษณะการเรียงตัวอยู ่เดี่ยวๆ<br />
หรือเป็ นคู่ๆ 27<br />
25. แสดงลักษณะแกรม รูปร่าง และการจัดเรียงตัวของเชื ้อจุลินทรีย์ที ่มี<br />
ความสามารถในการสร้างเอนไซม์เซลลูเลสจากมูลสุกรจากบ่อแก๊ซชีวภาพ<br />
กลุ่มเชื ้อที 8 เชื ้อติดสีแกรมบวก รูปร่างท่อนสั ้น ลักษณะการรียงตัวจับกัน<br />
อยู่เป็<br />
นคู่ 28<br />
VII
การคัดแยกแบคทีเรียที่ผลิตเอนไซม์เซลลูเลสจากมูลสุกร<br />
Isolation of Cellulase-Producing Bacteria from Manure.<br />
ค าน า<br />
ปัจจุบันการเลี ้ ยงสัตว์ภายในประเทศก าลังเจริ ญเติบโตและมีการพัฒนาอย่างรวดเร็ว<br />
โดยเฉพาะฟาร์มสุกร ที่ตอบสนองความต้องการการบริโภคเนื<br />
้อสุกร ซึ ่ งสิ่งที่เราหลีกเลี่ยงไม่ได้<br />
ก็<br />
คือ มูลสุกรและของเสียจากฟาร์มสุกรที ่มีปริมาณมากและก าลังเป็ นปัญหาท าให้เกิดน ้าเสีย และ<br />
สภาพแวดล้อมเสื่อมโทรม<br />
ดังนั ้นจึงมุ่งเน้นที่จะน<br />
ามูลสุกรและของเสียจากฟาร์มสุกรมาหาจุลินทรีย์<br />
ที่มีประสิทธิภาพในการผลิตเอนไซม์<br />
เพื่อใช้เป็<br />
นหัวเชื ้อในการย่อยสารประกอบในน ้าเสียเพื ่อช่วย<br />
ลดระยะเวลาในการบ าบัดให้ทันกับการเกิดน ้าเสียในปัจจุบันทั ้งยังอาจน ามาใช้ผลิตเอนไซม์ใน<br />
อุตสาหกรรมได้อีกทางหนึ ่ งเนื่องจากแหล่งเอนไซม์ที<br />
่ส าคัญและเป็ นที่น่าสนใจอย่างมาก<br />
คือ<br />
จุลินทรีย์ที ่มีความสามารถในการผลิตเอนไซม์เซลลูเลส ซึ ่งเป็ นเอนไซม์ที่มีความสามารถในการ<br />
ย่อยสลายสารประกอบเซลลูโลส ที่เป็<br />
นองค์ประกอบในน ้ าเสี ยและในขยะต่าง ๆ นอกจากนี ้<br />
จุลินทรีย์หลายชนิดที ่สร้างเอนไซม์ เซลลูเลสออกมาย่อยเซลลูโลส เช่น เชื ้อรา แบคทีเรี ย และ<br />
เชื ้อแอคติโนมัยสิท ผลจากการย่อยสลายเซลลูโลสด้วยเอนไซม์เซลลูเลสจะได้ผลิตภัณฑ์สุดท้าย คือ<br />
น ้าตาลกลูโคส ซึ ่งสามารถน าไปใช้ในการผลิตแอลกอฮอล์ โปรตีนเซลล์เดียว วิตามิน กรดอินทรีย์<br />
สารปฏิชีวนะ และเคมีภัณฑ์ต่าง ๆ โดยผ่านกระบวนการหมัก และยังน าเอนไซม์เซลลูเลสไปใช้ใน<br />
อุตสาหกรรมต่างๆ อีก เช่น อุตสาหกรรมการผลิตยาง อาหาร กระดาษ เป็ นต้น<br />
ดังนั ้นการศึกษาครั ้ งนี ้ ได้ท าการศึกษาการแยกจุลินทรีย์ที ่สามารถสร้างเอนไซม์เซลลูเลส<br />
โดยท าการแยกจุลินทรีย์จากมูลสุกรสด และมูลสุกรจากบ่อแก๊สชีวภาพ และน าไปใช้ในการเพิ่ม<br />
คุณค่าของวัตถุดิบที ่เหลือจากฟาร์มสุกร ยังช่วยลดการน าเข้าเอนไซม์ส าเร็จรูปจากต่างประเทศได้<br />
อีกด้วย<br />
วัตถุประสงค์<br />
เพื่อการจัดจ<br />
าแนกเชื ้อจุลินทรีย์ที ่สามารถสร้างกิจกรรมเอนไซม์ Cellulase ที่แยกได้จากมูล<br />
สุกรสด และมูลสุกรจากบ่อก๊าซชีวภาพ<br />
1
การตรวจเอกสาร<br />
1. เซลลูโลส (cellulose)<br />
เซลลูโลส เป็ นโพลีแซคคาไรด์ที ่มีขนาดเล็กมาก ลักษณะเป็ นแท่ง (rod-shaped units) ที่<br />
เรี ยกว่า ไมเซล (micells) บางครั ้ งประกอบเป็ นหน่วยใหญ่จากไมเซล 10 ถึง 20 หน่วย เป็ น<br />
ไมโครไฟบริล (microfibril) ซึ ่งโครงสร้างมีลักษณะส่วนใหญ่เป็ นผลึก (cystalline) จึงถูกย่อยสลาย<br />
ได้ยาก เป็ นส่วนประกอบอินทรีย์ที ่พบมากที่สุดประมาณร้อยละ<br />
45 ของสารอินทรีย์ทั ้งหมดใน<br />
ธรรมชาติ ส่วนใหญ่ถูกผลิตขึ ้นจากกระบวนการสังเคราะห์ด้วยแสงของพืช และสะสมอยู ่ที่ผนัง<br />
เซลล์ เช่น ฝ้ าย มีส่วนประกอบของเซลลูโลสมากกว่าร้อยละ 97-99 จัดว่าเป็ นเซลลูโลสที่บริสุทธิ<br />
์<br />
ประกอบด้วยสายโพลิเมอร์เรียงขนาน และยึดติดกันด้วยแรงกระจายตัว (dispersion forcc) และ<br />
พันธะไฮโดรเจน (hydrogen bond) ภายในโมเลกุลเซลลูโลสจึงยึดติดกันแน่นท าให้เซลลูโลสท า<br />
ปฏิกิริยากับสารต่าง ๆ ได้ช้า เพราะสารไม่สามารถผ่านเข้าไปในเซลลูโลสได้ ยังพบในสาหร่าย และ<br />
ฟังไจหลายชนิด รวมทั ้งในสัตว์ทะเลหลายชนิด และเนื่องจากเซลลูโลสสามารถถูกย่อยสลายได้ใน<br />
สิ่งแวดล้อมโดยจุลินทรีย์จึงเป็<br />
นส่วนประกอบที่มีความส<br />
าคัญต่อวัฏจักรคาร์บอน<br />
ในด้านโครงสร้างสายของเซลลูโลสจะต่อกันด้วยพันธะบีต้า-1,4-ไกลโคซิดิก โดยเรียงต่อ<br />
กันเป็ นสายตรงที่ไม่มีการแตกกิ่งก้านสาขา<br />
จ านวนหน่วยย่อยที่มาต่อขึ<br />
้นอยู่กับชนิด<br />
และอายุของพืช<br />
อาจมี 200-15,000 หน่วย หรือเป็ นล้านหน่วย คอนฟิ กูเลชัน (configulation) ของบีต้า-ดี-กลูโคไฟรา<br />
โนส (β-D-glucogyranose) ส่วนใหญ่จะเป็ นรูปแบบเก้าอี ้ (chair form) (<strong>ภาพที่</strong><br />
1) และโมเลกุลของ<br />
กลูแคนจะมีผิว (surface) เป็ นไฮโดรเจนอะตอม โมเลกุลของสายกลูแคนมีสมบัติไม่ชอบน ้ า<br />
(hydrophobic) การต่อกันด้วยพันธะบีต้า-1,4-ไกลโคซิดิก จึงเกิดแรงที่ท<br />
าให้สายกลูแคนหมุนบิดตัว<br />
ได้ 180 องศา รอบแกน จึงท าให้แต่ละสายมีรูปร่างลักษณะที ่เปรียบเสมือนริบบิ้น (flat ribbon)<br />
สายกลูแคนแต่ละสายจะมาเรียงต่อกันเป็ นไมโครไฟบริล ซึ ่งอาจจะม้วนหรือพับไปมาตามแกนของ<br />
เส้นใยเซลลูโลส หรือม้วนทับกันเป็ นเกลียวรอบแกนของเส้นใย จากการเรียงตัวของโมเลกุลของ<br />
เซลลูโลสดังกล่าวท าให้สามารถแบ่งรูปร่างของเซลลูโลสในผนังเซลล์พืชได้ 3 แบบ ที่แตกต่างกัน<br />
ดังแสดงใน<strong>ภาพที่</strong><br />
2 (Norkrans, 1967) จากการศึกษาโดยใช้เอกซเรย์ดิฟแฟคชัน (x-ray diffraction)<br />
พบว่าไมโครไฟบริลบางส่วนจัดตัวอย่างมีระเบียบ (crystalline) แต่บางส่วนจัดตัวไม่เป็ นระเบียบ<br />
(amorphous) ซึ ่งในธรรมชาติจะมีส่วนจัดตัวเป็ นระเบียบร้อยละ 85 แต่ส่วนที่ไม่เป็<br />
นระเบียบร้อยละ<br />
15 ผนังเซลล์ของพืชจะมีเซลลูโลสจับตัวอยู ่เป็ นแถบ ๆ ไม่ติดต่อกันโดยตลอด แยกโดยช่องว่าง เมื่อ<br />
เซลล์แก่เต็มที่ภายในช่องว่างจะเต็มไปด้วยลิกนิน<br />
ซึ ่งมีผลท าให้เซลลูโลสถูกห่อหุ้มด้วยลิกนิน<br />
2
<strong>ภาพที่</strong><br />
1 ลักษณะโครงสร้างของเซลลูโลส และหน่วยย่อยบีต้า-ดี-กลูโคไฟราโนส ที่ต่อด้วยพันธะ<br />
บีต้า-1,4-ไกลโคซิดิก ระหว่างคาร์บอนต าแหน่งที่<br />
1 ของหน่วยย่อยบีต้า-ดี-กลูโคไฟราโนส<br />
กับคาร์บอนต าแหน่งที่<br />
4 ของหน่วยย่อยถัดไป (พิจิตรา, 2548)<br />
<strong>ภาพที่</strong><br />
2 รูปร่างของโครงสร้างเซลลูโลสที ่พบในผนังเซลล์ทั่วไป<br />
Norkrans (1967) อ้างโดย<br />
อมรรัตน์ (2547)<br />
ก. ฟริงเกิลไมเซล (fingle micells) ประกอบด้วยส่วนที่เป็<br />
นระเบียบ และที่ไม่เป็<br />
นระเบียบ<br />
ข. โครงสร้างขของเซลลูโลสที่ม้วน<br />
หรือพับไปมาตามแกนของเส้นใย<br />
ค. โครงสร้างที่มีลักษณะเป็<br />
นริบบิ้นหนาเกิดจากการม้วนไปมาโดยตั ้งฉากกับแกนริบบิ้น<br />
และแถบของริบบิ้นจะม้วนเป็ นเกลียว<br />
3
2. ระบบเอนไซม์เซลลูเลส<br />
2.1 การย่อยสลายสารประกอบเซลลูโลส (พรเทพ, 2538)<br />
ในธรรมชาติการย่อยสลายสารประกอบเซลลูโลส เกิดโดยอาศัยการย่อยสลายจุลินทรีย์<br />
หลายชนิดรวมกันในสภาพที ่มีออกซิเจน ผลที่ได้จากการย่อยสลาย<br />
จะได้ก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์<br />
อิวมัส ความร้อน และจุลินทรีย์เพิ ่มขึ ้น โดยที่ปริมาณการเพิ<br />
่มขึ ้นของจุลินทรีย์จะได้มาจากการย่อย<br />
สลายสารประกอบเซลลูโลสในสภาพที ่เหมาะสม มีการระบายอากาศ และอุณหภูมิที่เหมาะสม<br />
มี<br />
แหล่งอาหารเพียงพอกับการน าไปสร้างพลังงานเพื ่อใช้ในระบบเมตาบอลิซึม และการเพิ่มจ<br />
านวน<br />
เซลล์ ในส<strong>ภาพที่</strong>ไม่มีออกซิเจน<br />
การย่อยสลายเซลลูโลส จะได้ก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์ ไฮโดเจน<br />
เอทธานอล กรดฟอร์มิก กรดซัคซินิก กรดบิวทีริก และกรดแลกติก เป็ นต้น นอกจากนี ้การย่อยสลาย<br />
สารประกอบเซลลูโลส ยังสามารถท าได้โดยวิธีทางเคมี ซึ ่งมีการย่อยสลายด้วยสารเคมี อาทิเช่น การ<br />
ใช้กรด การย่อยสลายวิธีนี ้ ปฏิกิริยาที ่เกิดขึ ้นจะไม่เฉพาะเจาะจง ดังนั ้นน ้าตาลกลูโลสบางส่วนที ่<br />
เกิดขึ ้นจะท าปฏิกิริยากับกรดต่อไป ท าให้ได้ผลิตภัณฑ์ข้างเคียงชนิดอื ่น และกรดยังท าปฏิกิริยากับ<br />
สารชนิดอื่นที่ติดมากับเซลลูโลส<br />
ท าให้ผลิตภัณฑ์ที่ไม่ต้องการ<br />
นอกจากนี ้โครงสร้างในส่วนที ่เป็ น<br />
คริสตัลลีน ก็จ าเป็ นต้องใช้กรดที ่ความเข้มข้น และอุณหภูมิสูงในการย่อยสลายจึงจะได้น ้ าตาล<br />
กลูโคส ปฏิกิริยาย่อยจึงเกิดแบบรุนแรง ภาชนะที่ใช้ต้องทนทานต่อการกัดกร่อน<br />
ต้นทุนจึงสูง และ<br />
กรดที่ถูกทิ้งออกมายังก่อให้เกิดมลพิษต่อสิ่งแวดล้อมอีกด้วย<br />
แต่วิธีนี ้ฏิกิริยาการย่อยสลายจะเกิดขึ ้น<br />
อย่างรวดเร็วภายใน 15-20 นาที หรือโดยวิธีทางชีวภาพ อาทิเช่น การย่อยสลายด้วยเอนไซม์<br />
เซลลูเลส วิธีนี ้เป็ นวิธีที่เฉพาะเจาะจงระหว่างเอนไซม์เซลลูเลสกับสารประกอบเซลลูโลส<br />
โดยจะไม่<br />
ท าปฏิกิริยากับสารอื ่นที่ปนมา<br />
จึงท าให้ได้น ้าตาลกลูโคสซึ ่ งค่อนข้างบริสุทธิ ์ ลักษณะการย่อยจะ<br />
เกิดขึ ้นช้าๆ ปฏิกิริยาเกิดขึ ้นในที่มีอุณหูมิซึ<br />
่งสิ่งมีชีวิตสามารถเจริญเติบโตได้<br />
และปฏิกิริยาที ่เกิดขึ ้น<br />
ก็ไม่รุนแรง นอกจากนี ้ก็อาจไม่จ าเป็ นต้องใช้ภาชนะที่ทนทานต่อการกัดกร่อน<br />
ต้นทุนจึงต ่ากว่า และ<br />
ยังไม่ก่อให้เกิดมลพิษต่อสิ่งแวดล้อม<br />
หากแต่วิธีนี ้น ้าตาลกลูโคสที่ได้อยู่ในรูปสารละลายเจือจาง<br />
2.2 การท างานของเอนไซม์เซลลูเลส (พิจิตรา, 2548)<br />
การย่อยสลายเซลลูโลสด้วยเอนไซม์ เป็ นกระบวนการย่อยสลายที่มีความจ<br />
าเพาะเจาะจงสูง<br />
เอนไซม์จะไม่ท าปฏิกิริยากับสารอื ่น ๆ ที่ปนเปื<br />
้ อนมา ท าให้ได้ผลิตภัณฑ์ที่มีความบริสุทธิ<br />
์ สูง และ<br />
ปฏิกิริยาไม่รุนแรงซึ ่งเอนไซม์ที่ถูกย่อยสลายเซลลูโลสได้เรียกรวมว่าเป็<br />
นเอนไซม์ในกลุ่มเซลลูเลส<br />
เอนไซม์เซลลูเลสเป็ นกลุ่มเอนไซม์ที่ท<br />
าหน้าที่เร่งปฏิกิริยาการย่อยสลายพันธะบีต้า-1,4-ไกลโคซิดิก<br />
ภายในโครงสร้างโมเลกุลของเซลลูโลสหน่วยเล็กที ่สุดหากการย่อยสลายสมบูรณ์จะได้น ้าตาล<br />
กลูโคส<br />
4
<strong>ภาพที่</strong><br />
3 โครงสร้างสามมิติของเอนไซม์เซลลูเลส (พิจิตรา, 2548)<br />
จาการศึกษาระบบเอนไซม์เซลลูเลส ( cellulose system) โดยการแยกเอนไซม์<br />
เซลลูเลสแต่ละชนิ ดให้บริ สุ ทธิ ์ นั ้ น ท าให้สรุ ปการจัดระบบของเอนไซม์เซลลูเลสได้ว่า<br />
ประกอบด้วยเอนไซม์ 3 กลุ่ม ตามระบบการจัดจ าแนกเอนไซม์ (Enzyme Classification (E.C)) ดังนี ้<br />
1. เอนโดกลูคาเนส หรือเอนโด-บีต้า-1,4-กลูคาเนส (E.C.3.2.1.4) (พิจิตรา, 2548)<br />
ท าหน้าที่ย่อยโมเลกุลของเซลลูเลสในส่วนที่ไม่เป็<br />
นระเบียบ (amorphous) หรือย่อยอนุพันธ์<br />
ของเซลลูโลส เช่น คาร์บอกซีเมทิลเซลลูโลส (carboxymethyl cellulose) เซลลูโลสที่ผ่านการท<br />
า<br />
ปฏิกิริ ยากับกรดฟอสฟอริ ก (phosphoric swollen cellulose) ไฮดรอกซีเอทิลเซลลูโลส<br />
(hydroxyethyl cellulose) และเซลโลโอลิโกเมอร์ (cello-oligomers) โดยตัดย่อยเซลล์ที ่ต าแหน่ง<br />
พันธะบีต้า-1,4-ไกลโคซิดิกแบบสุ่ม (random) ท าให้ผลิตภัณฑ์ผสมหลายชนิด คือ เซลโลโอลิโก<br />
แซคคาไรด์ ( cellooligo-saccharides) เซ ล โล เพ นธ าโอส (cellopentaose) เซลโลไตรโอ ส<br />
(cellotriose) เซลโลไบโอส (cellobiose) และกลูโคส โดยจะได้ผลิตภัณฑ์หลักใดขึ ้นอยู่กับสมบัติ<br />
ของแต่ละเอนไซม์<br />
2. เอกโซกลูคาเนส หรือเอกโซ-1,4-กลูคาเนส หรือเอกโซบีต้า-1,4-กลูแคนกลูโคไฮโดร<br />
เนส หรือเอกโซบีต้า-1,4-เซลโลไบโอไฮโดรเนส (E.C.3.2.1.91) พบว่ามักท าหน้าร่วมกับเอนไซม์<br />
เอนโดกลูคาเนสในการย่อยโมเลกุลของเซลลูโลส โดยการย่อยสลายเซลลูโลสจากปลายด้านที ่ไม่มี<br />
น ้าตาลรีดิวซ์ (non-reducing) ของเซลลูโลส ผลิตภัณฑ์ที่ได้จากการย่อยสลายส่วนใหญ่<br />
คือ น ้าตาล<br />
เซลโลไบโอส นอกจากนี ้ ยังพบว่าสามารถย่อยสลายเซลลูโลสที ่จัดตัวอย่างเป็ นระเบียบ<br />
(microcrystalline cellulose) ได้โดยอาศัยการท างานร่วมกับเอนโดกลูคาเนส<br />
5
3. เอนไซม์บีต้า-1,4-กลูโคไซเนส (E.C.3.2.1.21)<br />
เป็ นเอนไซม์ที่ท<br />
าหน้าที่<br />
ย่อยโมเลกุลของเซลโลไบโอส เซลโลโอลิโกแซคคาไรด์ ที่ละลาย<br />
น ้าได้ให้เป็ นน ้าตาลกลูโคส แต่ไม่สามารถย่อยสลายโมเลกุลซับซ้อนขนาดใหญ่ของเซลลูโลสได้<br />
โดยตรง<br />
กลไกลการย่อยสลายโมเลกุลของเซลลูโลสทั ้งในส่วนที ่เป็ นระเบียบ (crystalline) และไม่<br />
เป็ นระเบียบ (amorphous) ให้เป็ นน ้าตาลกลูโคส โดยเอนไซม์ทั ้ง 3 ชนิดร่วมกันแสดงเป็ นแผนภูมิ<br />
ได้ดัง<strong>ภาพที่</strong><br />
4<br />
<strong>ภาพที่</strong><br />
4 กลไลการท าปฏิกิริยาการย่อยสลายเซลลูโลสขของระบบเอนไซม์เซลลูเลส ( Fan and Lee,<br />
1983 อ้างโดย อมรรัตน์ , 2547)<br />
ในธรรมชาติมีสิ ่งมีชีวิตหลายชนิดสามารถสร้างเอนไซม์ย่อยสลายเซลลูโลสได้ เช่น สัตว์<br />
ทะเลในกลุ่มเพรียงหัวหอม (tunicate) หอยทากยักษ์ (Achatinafulica) และจุลินทรีย์หลายชนิดทั ้งที่<br />
เป็ นโปรโตซัว แบคทีเรี ย แอคติโนมัยสิ ท และเชื ้ อรา จุลินทรี ย์แต่ละชนิดที ่สร้างเอนไซม์<br />
เซลลูเลสที่มีความสามารถในการย่อยลสายแตกต่างกันขึ<br />
้นกับสภาวะแวดล้อมที ่จุลินทรีย์เหล่านั ้น<br />
เจริญอยู ่ พบว่าเชื ้อรา (celllulolytic fungi) เป็ นจุลินทรีย์ที ่สามารถสร้างเอนไซม์เซลลูเลสได้ใน<br />
ปริมาณที ่มากกว่าจุลินทรีย์ชนิดอื ่น ๆ เอนไซม์เซลลูเลสส่วนใหญ่เป็ นเอกซ์ตร้าเซลลูลาร์เอนไซม์<br />
(extracellular enzyme) คือ เซลล์ปล่อยเอนไซม์ออกมานอกเซลล์ ท าให้สะดวกต่อการแยกและ<br />
คัดเลือกสายพันธุ์ที ่มีประสิทธิภาพดีในการย่อยสลายเซลลูโลส และสะดวกต่อการน ามาผลิต<br />
เอนไซม์เซลลูเลสเพื่อใช้ในการศึกษา<br />
หรือใช้ในอุตสาหกรรม (พิจิตรา, 2548)<br />
6
2.3 การยับยั ้บการสร้างและการท างานของเอนไซม์เซลลูเลส<br />
ในการย่อยสลายเซลลูโลสให้เป็ นน ้ าตาลกลูโคส จะมีการยับยั ้งการท างานของระบบ<br />
เอนไซม์เซลลูเลส 2 แบบ คือ การยับยั ้งแบบไม่แข่งขัน (non-completitive) และการยับยั ้งแบบ<br />
แข่งขัน (completitive) สารที่ท<br />
าให้เกิดการยับยั ้งแบบไม่แข่งขันได้ ได้แก่ เซลโลไบโอส และ<br />
กลูโคส สารที่ท<br />
าให้เกิดการยับยั ้งแบบแข่งขัน โดยจะยับยั ้งการสร้างเอนไซม์บีต้า-1,4-กลูโคซิเดส<br />
ได้แก่ กลูโคส ทั ้งนี ้ พบการยับยั ้งได้แม้แต่ในอาหารที ่มีการเติมตัวเหนี ่ยวน า (Fan and Lee, 1983<br />
อ้างโดย อมรรัตน์ , 2547; Moo-Yong et al. 1983)<br />
Duff et al. (1996) สรุปว่าเอนไซม์เซลลูเลสแต่ละตัวจะถูกยับยั ้งโดยผลิตภัณฑ์สุดท้ายที ่เกิด<br />
จากการย่อยสลาย กล่าวคือ กิจกรรมของเอนไซม์เอกโซกลูคาเนสจะถูกยับยั ้งโดยเซลโลไบโอส<br />
เช่นเดียวกับกิจกรรมของเอนไซม์บีต้า-กลูโคซิเดสที ่ถูกยับยั ้งโดยกลูโคสซึ ่งเป็ นสารที่มีฤทธิ<br />
์ ยับยั ้ง<br />
ไม่รุนแรง ส่วนลักษณะการยับยั ้งจะเป็ นการยับยั ้งแบบแข่งขัน (completitive inhibition)<br />
นอกจากนี ้ ยังพบว่าสารประกอบพอลลาเดียม (palladium) ก็เป็ นสารที่มีฤทธิ<br />
์ ยับยั ้งปฏิกิริยาของ<br />
เอนไซม์อย่างรุนแรง โดยมีรายงานว่าสารพอลลาเดียมนี ้ยับยั ้งกิจกรรมของเอนไซม์เอกโซกลูคาเนส<br />
และเอนโดกลูคาเนสที ่ผลิตจากเชื ้อรา Trichoderma reesei และลักษณะการยับบั ้งจะเป็ นแบบที่<br />
เรียกว่า irreversible inhibition อย่างไรก็ตามสามารถป้ องกันการยับยั ้งปฏิกิริยาของเอนไซม์วิธีนี ้ได้<br />
โดยการเติมกรดอะมิโนชนิดฮิสทิดีน ซิสเทอีน หรือซิสทีนลงไปในสารละลายผสมได้ (reaction<br />
mixture) (พิจิตรา, 2548)<br />
2.4 สมบัติของเอนไซม์เซลลูเลส (พรเทพ, 2538)<br />
จากการศึกษาถึงโครงสร้างของเอนไซม์เซลลูเลสพบว่า เซลลูเลสเป็ น glycoprotein<br />
ประกอบด้วยโปรตีน และคาร์โบไฮเครตในอัตราส่วน 1 ต่อ 1 มีน ้าหนักโมเลกุลประมาณ 30,000<br />
ถึง 60,000 ดาลตัน มีสมบัติละลายน ้าได้ดี ไม่ต้องการ co-factor หรือโลหะอื ่นๆในการท าปฏิกิริยา<br />
โดยทั่วไปเอนไซม์เซลลูเลสที่ได้จากจุลินทรีย์<br />
จะมีอุณหภูมิที่เหมาะสมในการท<br />
างานประมาณ 50<br />
องศาเซลเซียส ยกเว้นจุลินทรีย์ทนร้อนบางชนิด นอกจากนี ้ เอนไซม์เซลลูเลสยังมีความทนต่อ<br />
อุณหภูมิสูง ทนต่อความเป็ นกรดเป็ นด่าง (pH) ในช่วงกว้างประมาณ 4.8 ถึง 8.0 และคงทนต่อ<br />
สารเคมีได้ดี สามารถเก็บที่อุณหภูมิที่ต<br />
่ากว่า 0 และ 4.0 องศาเซลเซียส ได้เป็ นเวลาหลายปี หรือเก็บ<br />
โดยวิธี freeze dry หรือตกตะกอน ด้วยอะซิโตน หรือเอทธานอล โดยไม่สูญเสียคุณสมบัติ อย่างไรก็<br />
ตามเอนไซม์ที่ได้จากจุลินทรีย์ต่างชนิดกัน<br />
ย่อมมีสมบัตแตกต่างกัน<br />
7
3. การผลิตเอนไซม์เซลลูเลส<br />
3.1 จุลินทรีย์ที่สร้างเอนไซม์เซลลูเลส<br />
เนื่องจากเซลลูโลสมีลักษณะโครงสร้างทางเคมีสายยาว<br />
จุลินทรีย์ไม่สามารถเข้าสู ่เซลล์ได้<br />
โดยตรง ดังนั ้นจุลินทรีย์ต้องสร้าง extracellular enzyme ออกมาย่อยเซลลูโลสให้เป็ นสารประกอบ<br />
อินทรีย์ที ่ละลายน ้าได้ และสามารถผ่านเข้าไปในเซลล์ได้ เอนไซม์ที่ย่อยสลายเซลลูโลสได้เรียกว่า<br />
เอนไซม์เซลลูเลส มีสิ่งมีชีวิตหลายชนิดสร้างเอนไซม์นี<br />
้ได้ (พรเทพ, 2528)<br />
จุลินทรีย์นับว่ามีความส าคัญในการย่อยสลายเซลลูโลสมาก จุลินทรีย์หลายชนิดที ่สร้าง<br />
เอนไซม์เซลลูเลสเพื ่อย่อยสลายเซลลูโลสมักอยู ่ในกลุ่มเชื ้อรา แบคทีเรีย และแอคติโนมัยสิท ดัง<br />
ตารางที่<br />
1 (พรเทพ, 2538)<br />
่ ตารางที 1 จุลินทรีย์ที ่สามารถผลิตเอนไซม์เซลลูเลสได้<br />
เชื ้อรา เชื ้อแบคทีเรีย เชื ้อแอคติโนมัยสิท<br />
Alternaria sp.<br />
Bacillus sp.<br />
Micrormonospora sp.<br />
Aspergillus sp.<br />
Cellulomonas sp.<br />
Nocardia sp.<br />
Chaetomium sp.<br />
Clostridium sp.<br />
Streptomyces sp.<br />
Corprinus sp.<br />
Corynebacterium sp.<br />
Streotosporangium sp.<br />
Foames sp.<br />
Cytophaga sp.<br />
Fusarium sp.<br />
Polyangium sp.<br />
Myrothecium sp.<br />
Pseudomonas sp.<br />
Penicillium sp.<br />
Sporocytophaga sp.<br />
Polyporus sp.<br />
Rhizoctonia sp.<br />
Sporotrichum sp.<br />
Thielavia sp.<br />
Trametes sp.<br />
Trichothecium sp.<br />
Trichoderma sp.<br />
Verticillium sp.<br />
Zygorhynchus sp.<br />
Vibrio sp.<br />
ที่มา<br />
: พรเทพ (2538)<br />
8
ในการผลิตเอนไซม์เซลลูเลสจากเชื ้อจุลินทรีย์ ปัจจัยส าคัญที่ควบคุมการผลิตเอนไซม์<br />
นอกจากจะขึ ้นอยู่กับสายพันธุ์ของจุลินทรีย์แล้ว<br />
ยังขึ ้นอยู่กับปัจจัยอื<br />
่นๆ อีก เช่น ชนิดความเข้มข้น<br />
ของแหล่งคาร์บอน แหล่งไนโตรเจน ธาตุอาหารหลัก และธาตุอาหารรอง รวมไปถึงสภาพแวดล้อม<br />
การผลิต ซึ ่ งได้แก่ อายุและปริมาณของเชื ้อเริ่มต้น<br />
ความเป็ นกรดเป็ นด่าง (pH) อุณหถูมิ การให้<br />
อากาศ และอัตราการเขย่า (พรเทพ, 2538)<br />
3.2 การผลิตเอนซม์เซลลูเลสโดยเชื้อรา<br />
เอนไซม์เซลลูเลสที่ผลิตเพื่อการค้ามักเป็<br />
นเอนไซม์เซลลูเลสผสมที่สกัดได้จากเชื<br />
้อราชนิดที่<br />
แตกต่างกันไป และให้ปริมาณเอนไซม์ที ่แตกต่างกันขึ ้นอยู่กับสายพันธุ์ของเชื<br />
้อราที่ใช้องค์ประกอบ<br />
ของอาหาร และสภาวะที่ใช้ในการผลิต<br />
การเลี ้ยงจุลินทรีย์เพื ่อผลิตเอนไซม์เซลลูเลสกระท าได้ทั ้งใน<br />
อาหารเหลวและอาหารแข็ง ขึ ้นอยู่กับความเหมะสม<br />
การที่จะให้ผลผลิตเอนไซม์สูงและให้คุณภาพ<br />
ดีนั ้นจะต้องมีการควบคุมสภาวะต่าง ๆ ให้เหมาะสม เช่น อุณหภูมิ ชนิดอาหารที่ใช้ต้องเหมาะสม<br />
พีเอช การปนปื ้ อน รวมทั ้งค านึงถึงราคาต้นทุนในการผลิตด้วย นอกจากนี ้การใส่สารเร่งการเจริญ<br />
แหล่งไนโตรเจน และแร่ธาตุที่จ<br />
าเป็ นต่อการเจริญของเซลล์ สารเหนี่ยวน<br />
าให้เชื ้อผลิตเอนไซม์ก็เป็ น<br />
สิ่งที่ต้องค<br />
านึงถึงด้วย สารเหนี่ยวน<br />
าการผลิตเอนไซม์เซลลูเลส ได้แก่ สารประกอบเซลลูโลส<br />
อนุพันธ์ของเซลลูโลส และสารที่พันธะบีต้า-1,4-ไกลโคซิดิก<br />
เช่น cellobiose, sepharose และ<br />
lactose เป็ นต้น (Tsao and Chaing, 1983)<br />
่ ตารางที 2 เชื ้อราที่สามารถสร้างเอนไซม์เซลลูเลส<br />
เชื ้อรา เอกสารอ้างอิง<br />
Agaricus bisporus Manning and Wood (1983)<br />
Ascobolus furfuraceus<br />
Wicklow et al. (1980)<br />
Aspergillus aculeatus<br />
Kanamoto et al. (1979)<br />
A. Fumigates Roger et al. (1972) and Jain et al. (1979)<br />
A. Niger<br />
Ikeda et al. (1973)<br />
A. phoenicis<br />
Stemberg et al. (1977)<br />
A. Terreu<br />
Sinha et al. (1981) and Garg and Neelakantan<br />
(1982)<br />
A. wentii Keilich et al. (1970)<br />
Btryodiplodia theobromac Umezurike (1979, 1981)<br />
Chaetomium globosum Keilich et al. (1970)<br />
9
่ ตารางที 2 (ต่อ)<br />
เชื ้อรา เอกสารอ้างอิง<br />
Chrysosporium lignorum Eriksson and Rzedowski (1969)<br />
Cladosporium Cladosporioides Lynch et al. (1981)<br />
Coriolus versicolor Highley (1975)<br />
Dichomistus sqalens Ouau and Poglietti (1985)<br />
Eupenicillium javanicum Tanaka et al. (1981)<br />
Fusarium moniliforme Matsumoto et al. (1974)<br />
Fusarium sp. Trivcdi and Rao (1980,1981)<br />
F. solani Wood and MC Crae (1971)<br />
Thraustotheca clavata Berner and Chapman (1977)<br />
Torula thermophile Fergus (1969) and Jain et al. (1979)<br />
Volvariella volvacea Chang and Steinkraus (1982)<br />
Verticillium albo-atrum Gupta and Heale (1971)<br />
ที่มา<br />
: ดัดแปลงมาจาก Eriksson et al. (1990)<br />
4. ประโยชน์และการประยุกต์ใช้เอนไซม์เซลลูเลส และจุลินทรีย์ย่อยสลายเซลลูโลส (พิจิตรา, 2548)<br />
ปัจจุบันมีการใช้เอนไซม์เซลลูเลส หรื อจุลินทรี ย์ที่สามารถสร้างเอนไซม์ย่อยสลาย<br />
เซลลูโลสได้ในอุตสาหกรรม และเกษตรกรรม เช่น การใช้ในการสลายพืชผัก และกากเหลือจาก<br />
เกษตรกรรม การย่อยขยะเป็ นปุ ๋ ยหมัก เป็ นต้น ตัวอย่างการใช้ประโยชน์ได้แก่<br />
1. อุตสาหกรรมกระดาษ พบว่าเอนไซม์เซลลูเลสบางชนิดที ่เหมาะสมมีส่วนช่วยลดเวลาใน<br />
การตี (beating time) และช่วยต้านไข (grease resistancc) ท าให้กระดาษมีคุณภาพดี<br />
2. ในกระบวนการน ้าผักกระป๋ อง<br />
3. ใช้ในการสกัดน ้าผลไม้เปรี ้ ยว และท าให้ใส (extraction and clarification of juice) แล้ว<br />
ยังท าให้น ้าผลไม้ที่ได้เป็<br />
นเนื ้อเดียวกัน<br />
4. เอนไซม์เซลลูเลสน ามาใช้เป็ นส่วนประกอบในส้วมถังเกรอะ (septic tank)<br />
5. เอนไซม์เซลลูเลสจาก Trichoderma reesei ช่วยสลายผนังเซลล์พืช ท าให้มีการเชื่อม<br />
โปรโตพลาสต์ (protoplast) ของเซลล์พืชสองชนิดซึ ่ งนับว่าเป็ นประโยชน์ที่มีค่าต่อวงการเกษตร<br />
แผนใหม่<br />
6. ใช้ในอุตสาหกรรมอาหาร เช่น อุตสาหกรรมเครื่องดื่ม<br />
7. ช่วยเพิ่มอัตราการย่อยในอุตสาหกรรมอาหารสัตว์<br />
8. ใช้ในกระบวนการผลิตแอลกอฮอล์จากเมล็ดธัญพืช<br />
10
9. ใช้จุลินทรีย์ที ่สร้างเอนไซม์เซลลูเลสในอุตสาหกรรมการผลิตปุ ๋ ยหมัก<br />
10. นอกจากนี ้ ยังมีการน าเอนไซม์เซลลูเลสมาผลิตเป็ นยาอีกด้วย โดยใช้เอนไซม์<br />
เซลลูเลสร่ วมกับเอนไซม์ชนิดอื ่นช่วยเป็ นยาขับลมในกระเพาะ และช่วยลดอาการแน่นท้อง<br />
เนื่องจากเอนไซม์เซลลูเลสไปย่อยเส้นใยได้<br />
5. งานวิจัยที่เกี่ยวข้อง<br />
เอนไซม์ที่เกี่ยวข้องกับการย่อยสลายสารประกอบในขยะและน<br />
้าเสียต่างๆ ได้แก่ เซลลูเลส<br />
จัดเป็ น extracellular, hydrolytic enzyme พบได้ในเชื ้อราหลายชนิด เช่น Aspergilus spp.,<br />
Chaetomium spp., Penicillium spp., Fusarium spp. ในแบคทีเรียหลายชนิด เช่น Cellulomonas<br />
spp., Bacillus spp., Pseudomonas spp. และ ในแอคติโนมัยสิท เช่น Streptomyces spp.,<br />
Thermonospora spp. (Bellamy, 1977) เอนไซม์ดังกล่าวประกอบด้วย endo 1,4-β-glucanases, exo<br />
1,4-β-glucanases และ 1,4-β-glucosidase ซึ ่ งเอนไซม์ทั ้ง 3 ชนิดนี ้ จะรวมกันย่อยเซลลูโลสได้<br />
กลูโคส (Bhat, S. 1997 ; Eriksson et al. 1990)<br />
Asha, and Prema (2007) ได้ศึกษาลักษณะของเอนไซม์เซลลูเลสที ่ผลิตขึ ้นโดยแบคทีเรีย<br />
สายพันธุ์ Bacillus pumilis โดยท าการทดลองเลื ้ยงในอาหารเลี ้ยงเชื ้อแบบแข็งโดยท าการศึกษา<br />
ความสามารถในการผลิตเอนไซม์เซลลูเลส โดยเลี ้ยงในอาหารเลี ้ยงเชื ้อที่มีสารประกอบจากแหล่ง<br />
วัตถุดิบเหลือทิ้งทางการเกษตรชนิดต่างๆ ดังนี ้ เปลือกข้าว, ฟางข้าว, ขี ้เลื่อย,<br />
ชานอ้อย, กากมะพร้าว<br />
และร าข้าวสาลี จากการศึกษาพบว่า ร าข้าวสาลี เป็ นแหล่งอาหารที่ท<br />
าให้แบคทีเรียมีความสามารถใน<br />
การผลิตเอนไซม์เซลลูเลสมากที ่สุด ทั ้งนี ้ เพราะในร าข้าวสาลีประกอบด้วยน ้าตาลที่ละลายน<br />
้าได้<br />
เช่น glucose 42.5 เปอร์เซนต์ของน ้าหนักแห้ง, xylose 15.4 เปอร์เซนต์ของน ้าหนักแห้ง. Arabinose<br />
3.1 เปอร์เซนต์ของน ้าหนักแห้ง และ galactose 2.7 เปอร์เซนต์ของน ้าหนักแห้ง ซึ ่งเป็ นสารอาหารที่<br />
จ าเป็ นส าหรับการเจริญของจุลินทรีย์ นอกจากนั ้นยังได้ท าการศึกษาผลของความชื ้น และ pH ที่<br />
เหมาะสมต่อการผลิตเอนไซม์เซลลูเลสด้วย พบว่ามีความชื ้นมากกว่า 75 เปอร์เซนต์ เป็ นความชื ้นที่<br />
เหมาะสมมากที่สุด<br />
ส าหรับ pH 8-9 เป็ นสภาวะที่เหมาะสมที่สุดส<br />
าหรับการเจริญของจุลินทรีย์<br />
Juhasz et al. (2005) ได้ท าการสึกษาลักษณะของเอนไซม์เซลลูเลสที ่ผลิตได้จากเชื ้อ<br />
Trichoderma reesei RUT C30 โดยท าการหาแหล่งชนิดของคาร์บอน (carbon source) ที่เหมาะสม<br />
ที่สุดที่ท<br />
าให้เชื ้อ Trichoderma reesei RUT C30 มีความสามารถในการผลิตเอนไซม์เซลลูเลสมาก<br />
ที่สุด<br />
โดยแหล่งคาร์บอนที ่ใช้ได้แก่ ต้นสนใบสั ้น, ต้นหลิว, ซังข้าวโพด และ Solka Floc ซึ ่งเกิดน า<br />
วัตถุดิบเหล่านั ้นมาใช้เป็ นสับสเตรทนั ้นต้องน ามาผ่านการแปรรูปทางเคมีที ่เหมาะสมก่อน จาก<br />
การศึกษาพบว่า ซังข้าวโพดเป็ นแหล่งคาร์บอนที่เหมาะสมท่สุดที<br />
่ท าให้ Trichoderma reesei RUT<br />
C30 มีความสามารถในการผลิตเอนไซม์เซลลูเลสมากที่สุด<br />
ส่วน Solka Floc, ต้นหลิว และต้นสนใบ<br />
สั ้นให้กิจกรรมเอนไซม์รองลงมาตามล าดับ<br />
11
อุปกรณ์และวิธีการทดลอง<br />
1. อุปกรณ์และเครื่องมือที่ใช้ในการทดลอง<br />
1.1 ตู้ปลอดเชื ้อ<br />
1.2 เครื่องวัดค่าการดูดกลืนแสง<br />
(Spectrometer)<br />
1.3 เครื่องหมุนเหวี่ยง<br />
(Centrifuge)<br />
1.4 เครื่องชั่งน<br />
้าหนักละเอียด<br />
1.5 กล้องจุลทรรรศน์ (Microscope)<br />
1.6 เครื่องนึ<br />
่งฆ่าเชื ้อ (Autoclave)<br />
1.7 ตู้อบ<br />
1.8 ไมโครเวฟ<br />
1.9 ตู้บ่มเชื ้อ<br />
1.10 Vortex mixer<br />
1.11 ขวดวัดปริมาตร<br />
1.12 ปิ เปต<br />
1.13 ตะแกรงวางหลอดทดลอง<br />
1.14 หลอดทดลองขนาด 10 มิลลิลิตร<br />
1.15 บีกเกอร์<br />
1.16 กระบอกตวง<br />
1.17 ลูปเขี่ยเชื<br />
้อ<br />
1.18 แท่งแก้ว<br />
1.19 ช้อนตักสาร<br />
1.20 ตะเกียงแอลกอฮอล์<br />
1.21 กระดาษทิชชู<br />
1.22 ส าลี<br />
1.23 ถุงพลาสติก<br />
2. สารเคมี<br />
2.1 อาหารเลี ้ยงเชื ้อ<br />
2.1.1 อาหารเพาะเลี ้ยงเชื ้อ Nutrient agar (NA)<br />
2.1.2 อาหารเพาะเลี ้ยงเชื ้อ Nutrient broth (NB)<br />
2.1.3 อาหารเพาะเลี ้ยงเชื ้อ CMC (ภาคผนวก ก)<br />
12
2.2 สารเคมี<br />
2.2.1 Peptone<br />
2.2.2 Congo red<br />
2.2.3 Sodium chloride<br />
2.2.4 Crystal violet<br />
2.2.5 Safranin<br />
2.2.6 Alcohol<br />
2.2.7 Iodine<br />
2.2.8 น ้ากลั่น<br />
3. วิธีการทดลอง<br />
3.1 วิธีการแยกและการจ าแนกเชื ้อจุลินทรีย์จากมูลสุกรสด และบ่อแก๊ซชีวภาพ<br />
โดยน ามูลสุกรสด และมูลสุกรจากบ่อแก๊ซชีวภาพ เก็บในภาชนะที ่รักษาอุณหภูมิของ<br />
ตัวอย่างไม่ให้มีการเปลี ่ยนแปลงมาท าการเจือจางตัวอย่างให้ได้ความเข้มข้น 10 -1 -10 -7 (<strong>ภาพที่</strong><br />
5)<br />
จากนั ้นน าตัวอย่างที่เจือจางมาเลี<br />
้ยงบนอาหาร Nutrient agar (NA) โดยใช้เทคนิค Spread plate (ภาพ<br />
ที่<br />
6) น าไปบ่มที่อุณหภูมิ<br />
37 องศาเซลเซียส เป็ นเวลา 48 ชั่วโมง<br />
candle jar (กล่องสุญญากาศที ่มีการ<br />
จุดเทียนไล่ออกซิเจน) ชั่วโมง<br />
เพื่อตรวจนับจ<br />
านวนโคโลนีที่เจริญบนผิวหน้าอาหาร<br />
แล้วท าการ<br />
คัดเลือกความเข้มข้นที่มีจ<br />
านวนโคโลนี 30-300 โคโลนี เพื่อท<br />
าการศึกษาต่อไป<br />
3.2 ขั ้นตอนการคัดเลือกเชื ้อและท าเชื ้อให้บริสุทธิ ์<br />
น าสารละลายที่มีความเข้มข้นที<br />
่เก็บได้จากข้อ 3.1 มาท าให้บริสุทธิ ์ โดยน าลูปเขี่ยเชื<br />
้อที่ท<br />
า<br />
การฆ่าเชื ้อแล้วจุ่มลงในสารละลาย น ามาท าการ Cross streak (<strong>ภาพที่</strong><br />
7) ลงบนอาหาร NA บ่มที่<br />
อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็ นเวลา 48 ชั่วโมง<br />
เมื่อได้โคโลนีเดี<br />
่ยว ๆ น าไปย้อมแกรม (<strong>ภาพที่</strong><br />
8)<br />
เพื่อแยกแบคทีเรี<br />
ยแกรมลบ หรื อแกรมบวก และศึกษาลักษณะรู ปร่ างของเชื ้ อ ภายใต้กล้อง<br />
จุลทรรศน์ เพื่อจัดจ<br />
าแนกกลุ่มเชื ้อแบคทีเรีย จากนั ้นน าเชื ้อที่ได้<br />
streak ลงบนหลอดอาหารเอียง NA<br />
และบ่มที่อุณหภูมิ<br />
37 องศาเซลเซียส เป็ นเวลา 48 ชั่วโมง<br />
หลังจากนั ้นน ามาเก็บไว้ที่อุณหภูมิ<br />
4 องศา<br />
เซลเซียส ใช้การศึกษาขั ้นต่อไป<br />
13
<strong>ภาพที่</strong><br />
5 แสดงการท าเจือจางล าดับส่วน (กนกวรรณ และคณะ, 2547)<br />
<strong>ภาพที่</strong><br />
6 วิธีการ spread plate (กนกวรรณ และคณะ, 2547)<br />
<strong>ภาพที่</strong>7<br />
วิธีการ streak plate (กนกวรรณ และคณะ, 2547)<br />
14
<strong>ภาพที่</strong><br />
8 เทคนิคการย้อมสีแบคทีเรีย (กนกวรรณ และคณะ, 2547)<br />
15
3.3 การคัดเลือกเชื ้อจุลินทรีย์ที ่สามารถสร้างเอนไซม์เซลลูเลส<br />
การศึกษาความสามารถในการสร้างเอนไซม์เซลลูเลส โดยน าตัวอย่างที่เก็บได้จากข้อ<br />
3.2<br />
มาเพาะเลี ้ยงเชื ้อในอาหารเหลว Nutrient broth (NB) บ่มที่อุณหภูมิ<br />
33 องศาเซลเซียส เป็ นเวลา 24<br />
ชั่วโมง<br />
แล้วน าไปวัดค่าการดูดกลืนแสงที ่ความยาวคลื่น<br />
600 นาโนเมตร เจือจางเชื ้อให้ได้ปริมาณ<br />
เชื ้อเริ่มต้นเท่ากัน<br />
จากนั ้นปิ เปตสารละลายที่เจือจางแล้วปริมาตร<br />
10 ไมโครลิตร โดยใช้วิธี agar spot<br />
(พิรุฬห์พร, 2552) จ านวน 4 จุด ลงบนอาหาร CMC บ่มในสภาพไร้อากาศที ่อุณหภูมิ 37 องศา<br />
เซลเซียส เป็ นเวลา 72 ชั่วโมง<br />
โดยวัดขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางของโคโลนี วัดขนาดของโซนใส<br />
(Clear zone) ด้วยการย้อมสี Congo red 0.1 % (Hendricks and Doyle, 1995) 15 นาที จากนั ้นจึงเท<br />
ออกและเทสารละลาย Sodium chloride ความเข้มขข้น 1 N จนท้วมจานอาหาร ทิ้งไว้ 15 นาที เท<br />
ออกและสังเกตบริเวณโซนใส หาอัตราส่วนของบริเวณโซนใสต่อขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางโคโลนี<br />
(HC) (Lu, 2005) คัดเลือกเชื ้อที่เกิดโซนใสมาวิเคราะห์กิจกรรมของเอนไซม์เซลลูเลส<br />
แล้วน าเชื ้อที่<br />
เกิดโซนใสมาเก็บ stock โดย Streak เชื ้อลงบนอาหาร NA น าไปบ่มที่อุณหภูมิ<br />
37 องศาเซลเซียส<br />
เป็ นเวลา 48 ชั่วโมง<br />
แล้วเลี ้ยงเชื ้อลงในอาหาร NB จนเชื ้อขุ ่น เติม glycerol 30 % ต่อเชื ้อ 1 มิลลิลิตร<br />
น ามา vortex ให้เข้ากันหลังจากนั ้นน ามาเก็บไว้ที่อุณหภูมิ<br />
-20 องศาเซลเซียส เพื่อศึกษาขั<br />
้นต่อไป<br />
ค่า HC (Lu, 2005) = เส้นผ่านศูนย์กลางโซนใสรอบโคโลนี (cm)<br />
เส้นผ่านศูนย์กลางโคโลนี (cm)<br />
16
ผลการทดลอง<br />
ผลการจัดจ าแนกกลุ ่มเชื้อจุลินทรีย์ และคัดเลือกเชื้อจุลินทรีย์ที ่มีประสิธิภาพสูงในการสร้างเอนไซม์<br />
เซลลูเลสของแต่ละกลุ ่ม<br />
จากการเลี ้ยงเชื ้อแบคทีเรียที ่ผลิตเอนไซม์เซลลูเลสบนอาหารเลี ้ยงเชื ้อ CMC น าไปบ่มที่<br />
อุณหภูมิห้อง เป็ นเวลา 72 ชั่วโมง<br />
จากนั ้นวัดขนานเส้นผ่านศูนย์กลางของบริเวณโซนใสรอบ<br />
โคโลนี และขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางของโคโลนี แล้วน ามาหาอัตราส่วนของบริ เวณโซนใสต่อ<br />
ขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางโคโลนี และท าการเลี ้ยงเชี ้อแบคทีที่ผลิตเอนไซม์เซลลูเลส<br />
บนอาหารเลี ้ยง<br />
เชื ้อ NA น าไปบ่มที่อุณหภูมิห้อง<br />
เป็ นเวลา 48 ชั่วโมง<br />
ได้โคโลนีเดี ่ยวๆ จากนั ้นย้อมแกรมศึกษา<br />
ลักษณะ รูปร่าง ของเชื ้อแบคทีเรีย เพื่อจัดจ<br />
าแนกกลุ่มเชื ้อแบคทีเรีย พบว่ามีเชื ้อที่แสดงกิจกรรมของ<br />
เอนไซม์เซลลูเลส จากมูลสุกรสดทั ้งหมด 20 ตัวอย่าง จากการศึกษาลักษณะการเรียงตัวและการติด<br />
สีแกรมของเชื ้อแบคทีเรี ยจากมูลสุกรสด ที่สามารถสร้างเอนไซม์เซลลูเลสได้<br />
สามารถจัดกลุ่ม<br />
แบคทีเรียได้ 8 กลุ่ม ดังนี ้ กลุ่มเชื ้อที่<br />
1 พบว่า เชื ้อแบคทีเรี ยหมายเลข SD6R1C1, SD6R1C8,<br />
SD6R1C44, SD6R1C77, SD7R1C1, SD7R1C4 และ SD7R1C8 เป็ นเชื ้อติดสีแกรมลบ รูปร่างกลม<br />
ลักษณะการเรียงตัวอยู ่เดี่ยวๆ<br />
หรือเป็ นคู่ๆ (ตารางที่<br />
3, <strong>ภาพที่</strong><br />
10) กลุ่มเชื ้อที่<br />
2 พบว่า เชื ้อแบคทีเรีย<br />
หมายเลข SD6R1C75 และ SD7R1C7 เชื ้อติดสีแกรมลบ รูปร่างกลมหรือรี มีการเรียงตัวอยู ่เป็ นคู่<br />
(ตารางที่<br />
3, <strong>ภาพที่</strong><br />
11) กลุ่มเชื ้อที่<br />
3 พบว่า เชื ้อแบคทีเรียหมายเลข SD6R1C29, SD6R1C79,<br />
SD7R1C16 และ SD7R1C18 เป็ นเชื ้อติดสีแกรมบวก รูปร่างกลม มักมีการจัดเรียงตัวอยู ่เดี่ยวๆ<br />
และ<br />
เป็ นคู่ๆ (ตารางที่<br />
3, <strong>ภาพที่</strong><br />
12) กลุ่มเชื ้อที่<br />
4 พบว่า เชื ้อแบคทีเรียหมายเลข SD6R1C53 เชื ้อติดสี<br />
แกรมบวก รูปร่างกลมหรือรี เรียงตัวจับกันเป็ นคู่ (ตารางที่<br />
3, <strong>ภาพที่</strong><br />
13) กลุ่มเชื ้อที่<br />
5 พบว่า เชื ้อ<br />
แบคทีเรียหมายเลข SD6R1C19 เชื ้อติดสีแกรมบวก รูปร่างกลม ลักษณะการเรียงตัวเป็ นคู่สอง และ<br />
คู่สี่<br />
ตารางที่<br />
3, <strong>ภาพที่</strong><br />
14) กลุ่มเชื ้อที่<br />
6 พบว่า เชื ้อแบคทีเรียหมายเลข SD6R1C59 และ SD6R1C69<br />
เชื ้อติดสีแกรมบวก รูปร่างกลม ลักษณะการเรียงตัวอยู ่เป็ นคู่สี่<br />
(ตารางที่<br />
3, <strong>ภาพที่</strong><br />
15) กลุ่มเชื ้อที่<br />
7<br />
พบว่า เชื ้อแบคทีเรียหมายเลข SD6R1C30 เป็ นเชื ้อติดสีแกรมบวก รูปร่างท่อนสั ้น มีการเรียงตัวอยู ่<br />
เดี่ยวๆ<br />
หรือเป็ นคู่ๆ (ตารางที่<br />
3, <strong>ภาพที่</strong><br />
16) กลุ่มเชื ้อที่<br />
8 พบว่า เชื ้อแบคทีเรียหมายเลข SD6R1C12<br />
เป็ นเชื ้อติดสีแกรมบวก รูปร่างท่อนสั ้น มีการเรียงตัวอยู ่เดี่ยวๆ<br />
หรือเป็ นคู่ๆ (ตารางที่<br />
3, <strong>ภาพที่</strong><br />
17)<br />
จากการทดสอบความสามารถในการสร้างเอนไซม์เซลลูเลสของเชื ้อแบคทีเรียกลุ่มเชื ้อแต่<br />
ละกลุ่ม ดังแสดงในตารางที ่ 3 พบว่าเชื ้อ SD7R1C1, SD6R1C75, SD6R1C79, SD6R1C53,<br />
SD6R1C19, SD6R1C69, SD6R1C30 และ SD6R1C12 ตามล าดับ สามารถสร้างเอนไซม์เซลูเลสได้<br />
เป็ นอย่างดี เมื่อเปรียบเทียบกับเชื<br />
้อแบคทีเรียตัวอย่างอื ่น โดยดูจากผลของอัตราส่วนระหว่างบริเวณ<br />
โซนใสของโคโลนีกับขนาดของโคโลนีแสดงค่า HC เท่ากับ 3.43, 2.09, 3.88, 1.36, 1.64, 2.10, 1.50<br />
และ 2.45 เซนติเมตร ตามล าดับ<br />
17
่<br />
่<br />
่<br />
่<br />
่<br />
่ ่<br />
่ ่<br />
่<br />
่<br />
่<br />
ตารางที 3 ผลการจัดกลุ่มจากการศึกษาลักษณะ รูปร่าง ของเชื ้อแบคทีเรีย และการทดสอบ<br />
ความสามารถในการสร้างเอนไซม์เซลลูเลสที่คัดเลือกได้จากมูลสุกรสด<br />
กลุ่มเชื<br />
้อ โคโลนี ลักษณะสัญฐานวิทยา HC หมายเหตุ<br />
แกรม รูปร่าง การจัดเรียงตัว<br />
1 SD6R1C1 ลบ กลม เดี่ยว,<br />
คู่ 2.47 ภาพที 10<br />
SD6R1C8 ลบ กลม เดี่ยว,<br />
คู่ 2.44<br />
SD6R1C44 ลบ กลม เดี่ยว,<br />
คู่ 2.19<br />
SD6R1C77 ลบ กลม เดี่ยว,<br />
คู่ 1.78<br />
SD7R1C1 ลบ กลม เดี่ยว,<br />
คู่ 3.43<br />
SD7R1C4 ลบ กลม เดี่ยว,<br />
คู่ 2.45<br />
SD7R1C8 ลบ กลม เดี่ยว,<br />
คู่ 2.57<br />
2 SD6R1C75 ลบ กลม (รี) เดี่ยว,<br />
คู่ 2.09 ภาพที 11<br />
SD7R1C7 ลบ กลม (รี) เดี่ยว,<br />
คู่ 1.97<br />
3 SD6R1C29 บวก กลม เดี่ยว,<br />
คู่ 2.82 ภาพที 12<br />
SD6R1C79 บวก กลม เดี่ยว,<br />
คู่ 3.88<br />
SD7R1C16 บวก กลม เดี่ยว,<br />
คู่ 1.89<br />
SD7R1C18 บวก กลม เดี่ยว,<br />
คู่ 1.22<br />
4 SD6R1C53 บวก กลม (รี) คู่ 1.36 ภาพที 13<br />
5 SD6R1C19 บวก กลม คู่, สี<br />
1.64 ภาพที 14<br />
6 SD6R1C59 บวก กลม สี<br />
2.08 ภาพที 15<br />
SD6R1C69 บวก กลม สี<br />
2.10<br />
7 SD6R1C30 บวก ท่อนสั ้น เดี่ยว,<br />
คู่ 1.50 ภาพที 16<br />
8 SD6R1C12 บวก ท่อนสั ้น คู่ 2.45 ภาพที 17<br />
18
ก ข<br />
<strong>ภาพที่</strong><br />
9 ลักษณะการเกิดโซนใสรอบโคโลนีของเชื ้อจุลินทรีย์ที ่สร้างเอนไซม์เซลลูเลส<br />
ก. มูลสุกรสด<br />
ข. มูลสุกรจากบ่อแก๊ซชีวภาพ<br />
<strong>ภาพที่</strong><br />
10 แสดงลักษณะแกรม รูปร่าง และการจัดเรียงตัวของเชื ้อจุลินทรีย์ที ่มีความสามารถในการ<br />
สร้างเอนไซม์เซลลูเลสจากมูลสุกรสดกลุ่มที่<br />
1 เชื ้อติดสีแกรมลบ รูปร่างกลม ลักษณะการ<br />
เรียงตัวอยู ่เดี่ยวๆ<br />
หรือเป็ นคู่ๆ<br />
19
<strong>ภาพที่</strong><br />
11 แสดงลักษณะแกรม รูปร่าง และการจัดเรียงตัวของเชื ้อจุลินทรีย์ที ่มีความสามารถในการ<br />
สร้างเอนไซม์เซลลูเลสจากมูลสุกรสดกลุ่มเชื ้อที่<br />
2 เชื ้อติดสีแกรมลบ รูปร่างกลมหรือรี มี<br />
การเรียงตัวอยู ่เป็ นคู่<br />
<strong>ภาพที่</strong><br />
12 แสดงลักษณะแกรม รูปร่าง และการจัดเรียงตัวของเชื ้อจุลินทรีย์ที ่มีความสามารถในการ<br />
สร้างเอนไซม์เซลลูเลสจากมูลสุกรสดกลุ่มเชื ้อที่<br />
3 เชื ้อติดสีแกรมบวก รูปร่างกลม มีการ<br />
จัดเรียงตัวอยู ่เดี่ยวๆ<br />
และเป็ นคู่ๆ<br />
20
<strong>ภาพที่</strong><br />
13 แสดงลักษณะแกรม รูปร่าง และการจัดเรียงตัวของเชื ้อจุลินทรีย์ที ่มีความสามารถในการ<br />
สร้างเอนไซม์เซลลูเลสจากมูลสุกรสดกลุ่มเชื ้อที่<br />
4 เชื ้อติดสีแกรมบวก รูปร่างกลมหรือรี<br />
เรียงตัวจับกันเป็ นคู่<br />
<strong>ภาพที่</strong><br />
14 แสดงลักษณะแกรม รูปร่าง และการจัดเรียงตัวของเชื ้อจุลินทรีย์ที ่มีความสามารถในการ<br />
สร้างเอนไซม์เซลลูเลสจากมูลสุกรสดกลุ่มเชื ้อที่<br />
5 เชื ้อติดสีแกรมบวก รูปร่างกลม<br />
ลักษณะการเรียงตัวเป็ นคู่สอง และคู่สี่<br />
21
<strong>ภาพที่</strong><br />
15 แสดงลักษณะแกรม รูปร่าง และการจัดเรียงตัวของเชื ้อจุลินทรีย์ที ่มีความสามารถในการ<br />
สร้างเอนไซม์เซลลูเลสจากมูลสุกรสดกลุ่มเชื ้อที่<br />
6 เชื ้อติดสีแกรมบวก รูปร่างกลม<br />
ลักษณะการเรียงตัวอยู ่เป็ นคู่สี่<br />
<strong>ภาพที่</strong><br />
16 แสดงลักษณะแกรม รูปร่าง และการจัดเรียงตัวของเชื ้อจุลินทรีย์ที ่มีความสามารถในการ<br />
สร้างเอนไซม์เซลลูเลสจากมูลสุกรสดกลุ่มเชื ้อที่<br />
7 เชื ้อติดสีแกรมบวก รูปร่างท่อนสั ้น มี<br />
การเรียงตัวอยู ่เดี่ยวๆ<br />
หรือเป็ นคู่ๆ<br />
22
<strong>ภาพที่</strong><br />
17 แสดงลักษณะแกรม รูปร่าง และการจัดเรียงตัวของเชื ้อจุลินทรีย์ที ่มีความสามารถในการ<br />
สร้างเอนไซม์เซลลูเลสจากมูลสุกรสดกลุ่มเชื ้อที่<br />
8 เชื ้อติดสีแกรมบวก รูปร่างท่อนสั ้น มี<br />
การเรียงตัวอยู ่เดี่ยวๆ<br />
หรือเป็ นคู่ๆ<br />
จากการศึกษาสักษณะรูปร่างของเชื ้อแบคทีเรียจากมูลสุกรจากบ่อแก๊ซชีวภาพ ที่สามารถ<br />
สร้างเอนไซม์เซลลูเลสได้พบว่ามีเชื ้อที่แสดงกิจกรรมของเอนไซม์เซลลูเลส<br />
ทั ้งหมด 9 ตัวอย่าง ดัง<br />
แสดงในตารางที่<br />
4 สามารถจัดกลุ่มแบคทีเรียได้ 8 กลุ่ม ดังนี ้ กลุ่มเชื ้อที่<br />
1 พบว่า เป็ นเชื ้อแบคทีเรีย<br />
หมายเลข LD3R1C13 เป็ นเชื ้อติดสีแกรมลบ รูปร่างกลมหรือรี ลักษณะการเรียงตัวอยู ่เดี่ยวๆ<br />
และ<br />
เป็ นคู่ๆ (ตารางที่<br />
4, <strong>ภาพที่</strong><br />
18) กลุ่มเชื ้อที่<br />
2 พบว่า เชื ้อแบคทีเรียหมายเลข LD3R1C31 เชื ้อติดสีแก<br />
รมบวก รูปร่างกลม มักมีการเรียงตัวอยู ่เดี่ยวๆ<br />
และเป็ นคู่ๆ (ตารางที่<br />
4, <strong>ภาพที่</strong><br />
19) กลุ่มเชื ้อที่<br />
3<br />
พบว่า เชื ้อแบคทีเรียหมายเลข L(A) เชื ้อติดสีแกรมบวก รูปร่างกลม การจัดเรียงตัวจับกันเป็ นคู่สอง<br />
และคู่สี่<br />
(ตารางที่<br />
4, <strong>ภาพที่</strong><br />
20) กลุ่มเชื ้อที่<br />
4 พบว่า เชื ้อแบคทีเรียหมายเลข LD5R1C1 เชื ้อติดสีแกรม<br />
บวก รูปร่างกลม ลักษณะการเรียงตัวเป็ นคู่สี่<br />
(ตารางที่<br />
4, <strong>ภาพที่</strong><br />
21) กลุ่มเชื ้อที่<br />
5 พบว่า เชื ้อ<br />
แบคทีเรียหมายเลข LD3R1C97 เชื ้อติดสีแกรมบวก รูปร่างกลม เรียงตัวอยู ่เดี่ยวๆ<br />
เป็ นคู่ และเป็ น<br />
สาย (ตารางที่<br />
4, <strong>ภาพที่</strong><br />
22) กลุ่มเชื ้อที่<br />
6 พบว่า เชื ้อแบคทีเรียหมายเลข LD3R1C10 เชื ้อติดสีแกรม<br />
บวก รูปร่างท่อนสั ้ น มีการเรียงตัวอยู ่เดี่ยวๆ<br />
(ตารางที่<br />
4, <strong>ภาพที่</strong><br />
23) กลุ่มเชื ้อที่<br />
7 พบว่า เชื ้อ<br />
แบคทีเรียหมายเลข L3R1C17/1 เป็ นเชื ้อติดสีแกรมบวก รูปร่างท่อนสั ้ น ลักษณะการเรียงตัวอยู ่<br />
เดี่ยวๆ<br />
หรือเป็ นคู่ๆ (ตารางที่<br />
4, <strong>ภาพที่</strong><br />
24) กลุ่มเชื ้อที่<br />
8 พบว่า เชื ้อแบคทีเรียหมายเลข LD3R1C16<br />
และ LD5R1C5 เป็ นเชื ้อติดสีแกรมบวก รูปร่างท่อนสั ้น ลักษณะการรียงตัวจับกันอยู ่เป็ นคู่ (ตารางที่<br />
4, <strong>ภาพที่</strong><br />
25)<br />
จากการทดสอบความสามารถในการสร้างเอนไซม์เซลลูเลสของเชื ้อแบคทีเรียกลุ่มเชื ้อที่<br />
1-<br />
8 ดังแสดงในตารางที ่ 4 พบว่าเชื ้อ LD3R1C13, LD3R1C31, L(A), LD5R1C1, LD3R1C97,<br />
LD3R1C10, LD3R1C17/1 และ LD3R1C16 ตามล าดับ สามารถสร้างเอนไซม์เซลูเลสได้เป็ นอย่างดี<br />
23
เมื่อเปรียบเทียบกับเชื<br />
้อแบคทีเรียตัวอย่างอื ่น โดยดูจากผลของอัตราส่วนระหว่างบริเวณโซนใสของ<br />
โคโลนีกับขนาดของโคโลนีแสดงค่า HC เท่ากับ 1.51, 1.54, 3.09, 1.19, 2.82, 1.85, 2.46 และ 2.91<br />
เซนติเมตร ตามล าดับ<br />
่<br />
่<br />
่<br />
่ ่<br />
่ ่<br />
่<br />
่<br />
่<br />
่<br />
ตารางที 4 ผลการจัดกลุ่มจากการศึกษาลักษณะ รูปร่าง ของเชื ้อแบคทีเรีย และการทดสอบ<br />
ความสามารถในการสร้างเอนไซม์เซลลูเลสที่คัดเลือกได้จากมูลสุกรจากบ่อแก๊ซชีวภาพ<br />
กลุ่มเชื<br />
้อ โคโลนี ลักษณะสัญฐานวิทยา HC หมายเหตุ<br />
แกรม รูปร่าง การจัดเรียงตัว<br />
1 LD3R1C13 ลบ กลม (รี) เดี่ยว,<br />
คู่ 1.51 ภาพที 18<br />
2 LD3R1C31 บวก กลม เดี่ยว,<br />
คู่ 1.54 ภาพที 19<br />
3 L(A) บวก กลม คู่, สี<br />
3.09 ภาพที 20<br />
4 LD5R1C1 บวก กลม สี<br />
1.19 ภาพที 21<br />
5 LD3R1C97 บวก กลม เดี่ยว,<br />
คู่, สาย 2.82 ภาพที 22<br />
6 LD3R1C10 บวก ท่อนสั ้น เดี่ยว<br />
1.85 ภาพที 23<br />
7 LD3R1C17/1 บวก ท่อนสั ้น เดี่ยว,<br />
คู่ 2.46 ภาพที 24<br />
8 LD3R1C16 บวก ท่อนสั ้น คู่ 2.91 ภาพที 25<br />
LD5R1C5 บวก ท่อนสั ้น คู่ 2.58<br />
<strong>ภาพที่</strong><br />
18 แสดงลักษณะแกรม รูปร่าง และการจัดเรียงตัวของเชื ้อจุลินทรีย์ที ่มีความสามารถในการ<br />
สร้างเอนไซม์เซลลูเลสจากมูลสุกรจากบ่อแก๊ซชีวภาพกลุ่มเชื ้อที่<br />
1 เชื ้อติดสีแกรมลบ<br />
รูปร่างกลมหรือรี ลักษณะการเรียงตัวอยู ่เดี่ยวๆ<br />
และเป็ นคู่ๆ<br />
24
<strong>ภาพที่</strong><br />
19 แสดงลักษณะแกรม รูปร่าง และการจัดเรียงตัวของเชื ้อจุลินทรีย์ที ่มีความสามารถในการ<br />
สร้างเอนไซม์เซลลูเลสจากมูลสุกรจากบ่อแก๊ซชีวภาพกลุ่มเชื ้อที่<br />
2 เชื ้อติดสีแกรมบวก<br />
รูปร่างกลม มีการเรียงตัวอยู ่เดี่ยวๆ<br />
และเป็ นคู่ๆ<br />
<strong>ภาพที่</strong><br />
20 แสดงลักษณะแกรม รูปร่าง และการจัดเรียงตัวของเชื ้อจุลินทรีย์ที ่มีความสามารถในการ<br />
สร้างเอนไซม์เซลลูเลสจากมูลสุกรจากบ่อแก๊ซชีวภาพกลุ่มเชื ้อที่<br />
3 เชื ้อติดสีแกรมบวก<br />
รูปร่างกลม การจัดเรียงตัวจับกันเป็ นคู่สอง และคู่สี่<br />
25
<strong>ภาพที่</strong><br />
21 แสดงลักษณะแกรม รูปร่าง และการจัดเรียงตัวของเชื ้อจุลินทรีย์ที ่มีความสามารถในการ<br />
สร้างเอนไซม์เซลลูเลสจากมูลสุกรจากบ่อแก๊ซชีวภาพกลุ่มเชื ้อที่<br />
4 เชื ้อติดสีแกรมบวก<br />
รูปร่างกลม ลักษณะการเรียงตัวเป็ นคู่สี่<br />
<strong>ภาพที่</strong><br />
22 แสดงลักษณะแกรม รูปร่าง และการจัดเรียงตัวของเชื ้อจุลินทรีย์ที ่มีความสามารถในการ<br />
สร้างเอนไซม์เซลลูเลสจากมูลสุกรจากบ่อแก๊ซชีวภาพกลุ่มเชื ้อที่<br />
5 เชื ้อติดสีแกรมบวก<br />
รูปร่างกลม เรียงตัวอยู ่เดี่ยวๆ<br />
เป็ นคู่ และเป็ นสาย<br />
26
<strong>ภาพที่</strong><br />
23 แสดงลักษณะแกรม รูปร่าง และการจัดเรียงตัวของเชื ้อจุลินทรีย์ที ่มีความสามารถในการ<br />
สร้างเอนไซม์เซลลูเลสจากมูลสุกรจากบ่อแก๊ซชีวภาพกลุ่มเชื ้อที่<br />
6 เชื ้อติดสีแกรมบวก<br />
รูปร่างท่อนสั ้น มีการเรียงตัวอยู ่เดี่ยวๆ<br />
<strong>ภาพที่</strong><br />
24 แสดงลักษณะแกรม รูปร่าง และการจัดเรียงตัวของเชื ้อจุลินทรีย์ที ่มีความสามารถในการ<br />
สร้างเอนไซม์เซลลูเลสจากมูลสุกรจากบ่อแก๊ซชีวภาพกลุ่มเชื ้อที่<br />
7 เชื ้อติดสีแกรมบวก<br />
รูปร่างท่อนสั ้น ลักษณะการเรียงตัวอยู ่เดี่ยวๆ<br />
หรือเป็ นคู่ๆ<br />
27
<strong>ภาพที่</strong><br />
25 แสดงลักษณะแกรม รูปร่าง และการจัดเรียงตัวของเชื ้อจุลินทรีย์ที ่มีความสามารถในการ<br />
สร้างเอนไซม์เซลลูเลสจากมูลสุกรจากบ่อแก๊ซชีวภาพ กลุ่มเชื ้อที่<br />
8 เชื ้อติดสีแกรมบวก<br />
รูปร่างท่อนสั ้น ลักษณะการรียงตัวจับกันอยู ่เป็ นคู่<br />
28
สรุปและวิจารณ์ผลการทดลอง<br />
ในการคัดแยกเชื ้อแบคทีเรียที ่สามารถสร้างเอนไซม์เซลลูเลสจากมูลสุกรสดทั ้งหมด 20<br />
ตัวอย่าง เมื่อน<br />
ามาวิเคราะห์กิจกรรมเอนไซม์โดยใช้อาหาร CMC พบว่า เชื ้อแบคทีเรียหมายเลข<br />
SD6R1C79 สามารถผลิตเอนไซม์เซลลูเลสได้ดีที่สุด<br />
โดยมีค่า HC เท่ากับ 3.88 เซนติเมตร รองลงมา<br />
คือ เชื ้อแบคทีเรียหมายเลข SD7R1C11, SD6R1C29, SD7C1R8 และ SD7R1C4 โดยมีค่า HC<br />
เท่ากับ 3.44, 2.82, 2.57 และ 2.45 เซนติเมตร ตามล าดับ ซึ ่งเชื ้อแบคทีเรียหมายเลข SD6R1C79 และ<br />
SD6R1C29 เป็ นเชื ้อกลุ่มที่<br />
3 เชื ้อติดสีแกรมบวก รูปร่างกลม มีลักษณะการเรียงตัวอยู ่เดี่ยวๆ<br />
และ<br />
เป็ นคู่ๆ ส่วนเชื ้อแบคทีเรียหมายเลข SD7R1C11 SD7C1R8 และ SD7R1C4 เป็ นเชื ้อกลุ่มที่<br />
1 เชื ้อติด<br />
สีแกรมลบ รูปร่างกลม มีการเรียงตัวอยู ่เดี่ยวๆ<br />
หรือเป็ นคู่ๆ<br />
การคัดแยกเชื ้อแบคทีเรียที ่สามารถสร้างเอนไซม์เซลลูเลสจากมูลสุกรจากบ่อแก๊ซชีวภาพ<br />
พบ 9 ตัวอย่าง เมื่อน<br />
ามาวิเคราะห์กิจกรรมเอนไซม์โดยใช้อาหาร CMC พบว่า เชื ้อแบคทีเรีย<br />
หมายเลข L(A) สามารถผลิตเอนไซม์เซลลูเลสได้ดีที ่สุด โดยมีค่า HC เท่ากับ 3.09 เซนติเมตร<br />
รองลงมาคือ เชื ้อแบคทีเรียหมายเลข LD3R1C16, LD3R1C97, LD3R1C17/1 และ LD5R1C5 โดยมี<br />
ค่า HC เท่ากับ 2.91, 2.82, 2.46 และ 2.54 เซนติเมตร ตามล าดับ ซึ ่งเชื ้อแบคทีเรียหมายเลข L(A)<br />
เป็ นเชื ้อกลุ่มที ่ 3 เชื ้อติดสีแกรมบวก รูปร่างกลม มีการเรียงตัวเป็ นคู่สอง และคู่สี่<br />
เชื ้อแบคทีเรีย<br />
หมายเลข LD3R1C16 และ LD5R1C5 เป็ นเชื ้อกลุ่มที่<br />
8 เชื ้อติดสีแกรมบวก รูปร่างท่อนสั ้ น มีการ<br />
เรียงตัวจับกันอยู ่เป็ นคู่ เชื ้อแบคทีเรียหมายเลข LD3R1C97 เป็ นเชื ้อกลุ่มที ่ 5 เชื ้อติดสีแกรมบวก<br />
รูปร่างกลม จัดเรียงตัวอยู ่เดี่ยวๆ<br />
เป็ นคู่ และเป็ นสาย และเชื ้อแบคทีเรียหมายเลข LD3R1C17/1 เป็ น<br />
เชื ้อกลุ่มที่<br />
7 เชื ้อติดสีแกรมบวก รูปร่างท่อนสั ้น ลักษณะการจัดเรียงตัวอยู ่เดี่ยวๆ<br />
หรือเป็ นคู่<br />
จากการศึกษาในครั ้ งนี ้ สามารถคัดเลือกเชื ้อแบคทีเรี ยพบเชื ้อที่สามารถสร้างเอนไซม์<br />
เซลลูเลสได้ในจ านวนค่อนข้างมาก อาจเป็ นไปได้ว่าเพราะในมูลสุกรมีองค์ประกอบทางโภชนะที ่มี<br />
เยื่อใยค่อนข้างสูงคือประมาณ<br />
13.15-15.25 % วัตถุแห้ง (กองอาหารสัตว์, 2551) ซึ ่งเป็ นที่<br />
น่าสนใจในการศึกษาถึงชนิดของเชื ้อและสภาวะที ่เหมาะสมในการเจริญของเชื ้อ เพื่อน<br />
าไปใช้<br />
ประโยชน์จริงในอุตสาหกรรมต่างๆ รวมถึงการบ าบัดน ้าเสีย และการก าจัดขยะต่อไป<br />
29
เอกสารอ้างอิง<br />
กนกวรรณ ปวงก า จิณภัทร, ใจค า กิตติพร เปล่งเสริมทรัพย์, หัทยา อรุโณทยานันท์, และศรวิษณ์<br />
อินทพันธุ์ 2547. จุลชี ววิทยาทางอาหารทั ่วไป. ภาควิชาเทคโนโลยีชี วภาพ คณะ<br />
อุตสาหกรรมเกษตร มหาวิทยาลัยเชียงใหม่<br />
พรเทพ ถนนแก้ว. 2538. ภาวะเหมาะสมของการผลิตเซลลูเลสจากเชื ้อราที่คัดแยกจากบริเวณปลูก<br />
ป่ าศรนารายณ์. วิทยานิพนธ์จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย<br />
พิรุฬห์พร ศรีมงคล. 2552. การคัดเลือกจุลินทรีย์ในการผลิตเซลลูเลสและไซแลนเนส. วิทยานิพนธ์<br />
วิทยาศาสตร์มหาบัณฑิต. กรุงเทพมหานคร : สถาบันเทคโนโลยีพระจอมเกล้าเจ้าคุณทหาร<br />
ลาดกระบัง<br />
พิจิตรา ตั ้งเขื่อนขันธ์,<br />
รสรินทร์ รุจนานนท์ และอัญชลี อ านาทสมบูรณ์. 2548. การคัดเลือกเชื ้อรา<br />
เพื่อผลิตเอนไซม์เซลลูเลสจากวุ้นมะพร้าวที<br />
่เป็ นเศษเหลือทิ้งจากโรงงาน. วิทยานิพนธ์<br />
วิทยาศาสตร์มหาบัณฑิต. กรุงเทพมหานคร : สถาบันเทคโนโลยีพระจอมเกล้าเจ้าคุณทหาร<br />
ลาดกระบัง<br />
อมรรัตน์ บุญมาศิริ. 2547. การท าเอนไซม์เอนโดกลูคาเนสจากเชื ้อรา Pseudeurotium sp. HT 14/1<br />
ให้บริสุทธิ ์ และสมบัติของเอนไซม์บริสุทธิ ์ , มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์. กรุงเทพมหานคร.<br />
น. 6-14.<br />
กองอาหารสัตว์. 2551. การน าขี ้ หมูกับมาใช้ในอาหารสุกร. [Online] Available :<br />
http://www.rakbankerd.com/agriculture/print.php?id=685&s=tblanimal. 12/12/2551.<br />
Asha, C. and Prema, P. 2007. Production of cellulose-free endoxylanase from novel alkalophikic<br />
thermotolerent Bacillus pumilus by solid-state fermentation and its application in<br />
wastepaper recycling Bioresource Technology (485-490)<br />
Bhat, S. 1997. Cellulase degrading enzymes and their potential industrial application.<br />
Biotechol.Adv.15 : 538-620<br />
Duff, S. J. B. and Murray, W. D. 1996. Bioconvertion of forest products industry waste<br />
cellulosics to fuel ethanol : a review. Bioresour. Technol. 55, 1-33.<br />
Eriksson,K-E.L., Blanchette,R.A. and Ander,P. 1990. Microbial and enzymatic degradation of<br />
wood and wood components. Springer-Verlag Berlin heiberg, Newyork.<br />
Fan, L. T. and Lee, Y. H. 1983. Kinetc studies of enzymatic hydrolysis of insoluble cellulose :<br />
derivation of mechanistic uinetic model Biotech. Bioeng. 25 : 2707-2033<br />
30
Juhasz, T., Szengyel, Z., Reczey, K., Suka-Aho, M. and Viikari, L. 2005. Characterizayion of<br />
Cellulose and hemicellulases produced by Trichoderma reesei oon various carbon<br />
sources. Process Biochemistry (3519-3525)<br />
Lu , W.J., Hong-Tao, W., Shi-Jian, Y., Zhi-Chao, W. and Yong-Feng, N. 2005. “Isolation and<br />
characterization of mesophilic cellulose-degrading bacteria from flower stalks-vegetable<br />
waste co-composting system.” J. Gen. Appl. Microbiol. 5: 353-360.<br />
Moo-Young, M., Moreira, A.R. and Tenger. R. P. 1983. Priciples of solid substrate fermentation,<br />
pp. 117-144. In Smith, J. E., D. R. Berry and Kristiansen, B. (eds). The filamentous<br />
Fungi. Fungal Technology. New York : John wiley & Sons Inc.<br />
Norkrans, B. 1967. Cellulose and cellulolysis. Adv. Appl. Icrobail. 9 : 91-215<br />
Takasima, S., Nakamura, A., Masaki, H. and uosumi, T. 1996. Purification and characterization<br />
of cellulose from Humicola grisea. Biosci. Biotech. Biochem. 60(1) : 77-82<br />
Tsao, G. T. and Chiang, L. 1983. Cellulose and hemicellulos technology, pp. 296-326. In Smith,<br />
J. E., D. R. berry and Kristiansen, (eds). The filamentous Fungi : Fungal Technology.<br />
New York : John Wiley & Sons Ins<br />
31
ภาคผนวก<br />
32
ภาคผนวก<br />
อาหารเลื้ยงเชื้อที่ใช้ในการทดลอง<br />
1. CMC Agar<br />
(NH4)SO2 1 กรัม<br />
CMC (carboxymethy Cellulose) 5 กรัม<br />
Yeast extract 1 กรัม<br />
Agar 10 กรัม<br />
น ้ากลั่น<br />
2. Nutrent bort (NB)<br />
1 ลิตร<br />
Beef extract 3 กรัม<br />
Peptone 5 กรัม<br />
Sodium Chloride 8 กรัม<br />
น ้ากลั่น<br />
3. Nutrent Agar (NA)<br />
1 ลิตร<br />
Beef extract 3 กรัม<br />
Peptone 5 กรัม<br />
Potato starch (soluble starch) 10 กรัม<br />
Agar 15 กรัม<br />
น ้ากลั่น<br />
1 ลิตร<br />
33