P. gingivalis 에 대한 피톤치드의 항균효과

하였다. 배양액에 피톤치드를 0.005% 농도로 첨가, 또는 피톤치드 없이 2시간 배양하였다.
배양액을 1 ㎖씩 취하여 얼음에서 냉각시킨 RNase free microcentrifuge tube에 옮긴 다음
Qiagen total RNA isolation Kit (Valencia, CA, U .S. A.)를 사용하여 total RNA를 추출하
였다. 추출한 RNA는 분광광도계로 각 260 ㎚, 280 ㎚에서 흡광도를 측정하여 추출량을 정
량하고 순도를 계산하였다.
2) RT
Qiagen RT-PCR Kit (Valencia, CA, U.S.A.)를 사용하여 RT를 시행하였다. 정량하여 농
도를 동일하게 맞춘 Total RNA (50 ng〜100 ng/㎕) 1〜5 ㎕, RNasin (40 Units/㎕) 0.2 ㎕ ,
2 mM dNTPs 2 ㎕, oligo dT primer (10 pmol) 1 ㎕, MgCl2 (2〜5 mM) 2〜4 ㎕, RNase
inhibitor (40 Units/㎕) 1 ㎕를 혼합하고 증류수로 최종량을 20 ㎕로 조절하였다. 이들 RT
혼합액을
었다.
50℃에서 30분 , 95℃에서 15분간 시행하고 4℃에서 반응을 정지시켜 cDNA를 얻
3) PCR
PCR에 앞서, Nakayama 13-b) 가 보고한 P. gingivalis ATCC 33277의 sod 염기서열 일부
를 포함하는 forward (5´-CCT ATG TGG ACA ACC TCA AT-3´), reverse (5´-GGC
TTC C TT ATG TA T TG G TG -3´ ) pr ime r를 제작하 였 다.
그리고 PCR에 사용되는 template의 동량화를 위한 대조군으로 Nelson 등 13-c) 이 보고한
P. gingivalis의 게놈 전체 염기서열 중에서 housekeeping 유전자인
glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gap A) 일부를 포함하는 forward (5´-AAT
ATC ATC CCC TCT TCC ACC-3´), reverse (5´-GTT GGA GTA TCC GAT TTC
GTT-3´) primer를 제작하였다.
Ta b l e 1 . Primers to be used in RT-PCR
Primers Sequence (5' to 3') Amplicon size (bp)
sod-forward CCT ATG TGG ACA ACC TCA AT
sod-reverse GGC TTC CTT ATG TAT TGG TG
gapA-forward AAT ATC ATC CCC TCT TCC ACC
gapA-reverse GTT GGA GTA TCC GAT TTC GTT
PCR을 위하여 cDNA (10〜50 ng/㎕) 1〜5 ㎕, primer 각각 10 pmol, Taq DNA
polymerase (5 Units/㎕; TaKaRa Korea) 0.25 ㎕, 2 mM dNTP 2〜5 ㎕, 10× buffer 2〜5
㎕, MgCl2 (2〜5 mM) 2〜4 ㎕를 혼합하고 증류수로 최종량을 50 ㎕로 조절하였다. PCR 혼
합액을 95℃에서 5분간 변성시킨 다음, PCR cycle은 94℃에서 30〜60초, 52〜55℃에서 3 0〜
60초, 72℃에서 60〜90초로 25〜30회 반복하고, 72℃에서 10분간 반응한 후 4℃에서 반응을
- 5 -
517
354