P. gingivalis 에 대한 피톤치드의 항균효과
P. gingivalis 에 대한 피톤치드의 항균효과
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하였다. 배양액<strong>에</strong> 피톤치드를 0.005% 농도로 첨가, 또는 피톤치드 없이 2시간 배양하였다.<br />
배양액을 1 ㎖씩 취하여 얼음<strong>에</strong>서 냉각시킨 RNase free microcentrifuge tube<strong>에</strong> 옮긴 다음<br />
Qiagen total RNA isolation Kit (Valencia, CA, U .S. A.)를 사용하여 total RNA를 추출하<br />
였다. 추출한 RNA는 분광광도계로 각 260 ㎚, 280 ㎚<strong>에</strong>서 흡광도를 측정하여 추출량을 정<br />
량하고 순도를 계산하였다.<br />
2) RT<br />
Qiagen RT-PCR Kit (Valencia, CA, U.S.A.)를 사용하여 RT를 시행하였다. 정량하여 농<br />
도를 동일하게 맞춘 Total RNA (50 ng〜100 ng/㎕) 1〜5 ㎕, RNasin (40 Units/㎕) 0.2 ㎕ ,<br />
2 mM dNTPs 2 ㎕, oligo dT primer (10 pmol) 1 ㎕, MgCl2 (2〜5 mM) 2〜4 ㎕, RNase<br />
inhibitor (40 Units/㎕) 1 ㎕를 혼합하고 증류수로 최종량을 20 ㎕로 조절하였다. 이들 RT<br />
혼합액을<br />
었다.<br />
50℃<strong>에</strong>서 30분 , 95℃<strong>에</strong>서 15분간 시행하고 4℃<strong>에</strong>서 반응을 정지시켜 cDNA를 얻<br />
3) PCR<br />
PCR<strong>에</strong> 앞서, Nakayama 13-b) 가 보고한 P. <strong>gingivalis</strong> ATCC 33277의 sod 염기서열 일부<br />
를 포함하는 forward (5´-CCT ATG TGG ACA ACC TCA AT-3´), reverse (5´-GGC<br />
TTC C TT ATG TA T TG G TG -3´ ) pr ime r를 제작하 였 다.<br />
그리고 PCR<strong>에</strong> 사용되는 template의 동량화를 위한 대조군으로 Nelson 등 13-c) 이 보고한<br />
P. <strong>gingivalis</strong>의 게놈 전체 염기서열 중<strong>에</strong>서 housekeeping 유전자인<br />
glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gap A) 일부를 포함하는 forward (5´-AAT<br />
ATC ATC CCC TCT TCC ACC-3´), reverse (5´-GTT GGA GTA TCC GAT TTC<br />
GTT-3´) primer를 제작하였다.<br />
Ta b l e 1 . Primers to be used in RT-PCR<br />
Primers Sequence (5' to 3') Amplicon size (bp)<br />
sod-forward CCT ATG TGG ACA ACC TCA AT<br />
sod-reverse GGC TTC CTT ATG TAT TGG TG<br />
gapA-forward AAT ATC ATC CCC TCT TCC ACC<br />
gapA-reverse GTT GGA GTA TCC GAT TTC GTT<br />
PCR을 위하여 cDNA (10〜50 ng/㎕) 1〜5 ㎕, primer 각각 10 pmol, Taq DNA<br />
polymerase (5 Units/㎕; TaKaRa Korea) 0.25 ㎕, 2 mM dNTP 2〜5 ㎕, 10× buffer 2〜5<br />
㎕, MgCl2 (2〜5 mM) 2〜4 ㎕를 혼합하고 증류수로 최종량을 50 ㎕로 조절하였다. PCR 혼<br />
합액을 95℃<strong>에</strong>서 5분간 변성시킨 다음, PCR cycle은 94℃<strong>에</strong>서 30〜60초, 52〜55℃<strong>에</strong>서 3 0〜<br />
60초, 72℃<strong>에</strong>서 60〜90초로 25〜30회 반복하고, 72℃<strong>에</strong>서 10분간 반응한 후 4℃<strong>에</strong>서 반응을<br />
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