P. gingivalis 에 대한 피톤치드의 항균효과

정지하여 PCR 산물을 얻었다. PCR 산물은 1% agarose gel에 전기영동한 후 ethidium
bromide (0.5㎍/㎕)로 염색한 다음 UV 광선 하에서 나타난 띠의 크기와 상대적인 양을 확
인하고, 확인한 결과는 사진촬영으로 기록하였다.
S D S - P A G E
실험균주를 액체배지에 접종하여 37℃ 혐기성 상태에서 24시간 배양한 다음 배양액 100
㎕를 새 액체배지 10 ㎖에 접종하고 피톤치드를 0.005% 첨가, 또는 피톤치드 없이 24시간
혐 기적 으로 배양하였 다 . 배양액을 10,000 × g로 30분간 4℃에서 원침시킨 후 균체를 PBS로
세정한 균 부유액을 초음파파쇄기로 1분간 파쇄 시킨 후 원심 분리하여 상층액의 단백질을
Bradford 방법으로 정량하여 각 시료의 단백질 총량을 동일하게 조정하였다. 농도가 조정된
상층액에 5× sample buffer (β-mercaptoethanol 포함) 4 ㎕를 첨가하여 100℃에서 10분간
처리한 후 SDS-10% polyacrylamide gel에 적하한 후 Tall Mighty Small gel apparatus
(SE280; Hoefer Scientific Instruments, U. S. A.) 상에서 SDS-polyacrylamide gel
electrophoresis (SDS-PAGE)를 시행하였다. 전기영동이 끝난 polyacrylamide gel은
Coomassie blue로 염색한 다음 염색된 단백질 띠를 관찰하였다.
Im m u n o b l o t
위와 같은 방법으로 전기영동이 끝난 또 다른 set의 P. gingivalis 시료의 gel은
Semi-Dry Blotting unit (Fisher Scientific, U. S. A.)를 이용하여 1시간 동안 2.5 ㎃/㎤ gel
의 출력으로 nitrocellulose막(Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, U. S. A.)에 전이시켰
다. 단백질이 전이되지 않은 부위의 PVDF 막(Roche Diagnostic, Mannheim, Germany)은
1% BSA-TBS (20 mM Tris-HCl [pH 7.5], 0.5M NaCl)로 1시간 차단한 다음 1%
BSA-TBS에 1:500로 희석한 anti-fimbrillin 항혈청, anti-whole cell 항혈청을 각각 첨가 한
후 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 다음 PVDF 막을 Tris-Tween 20 완충용액(10 mM
Tris-HCl [pH 8.0], 0.05% Tween 20 [v/v], 0.01% NaN3)으로 매 5분씩 3회 세정한 다음
1% BSA-TBS에 1:1,000로 희석한 goat anti-rabbit IgG(H+L)-alkaline phosphatase
conjugate (Sigma, St. Louis, MO, U. S. A.)로 상온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후
Tris-Tween 20 완충용액으로 nitrocellulose막을 매 10분씩 5회 세척한 다음 substrate
BCIP/NPT
다.
(Sigma, St. Louis, MO, U. S. A.)로 처리하여 발색되는 단백질 띠를 관찰하였
- 6 -