5/85 เรื่อง

220 การประชุมวิชาการงานเกษตรนเรศวร ครั ้งที่
01
การคัดแยกแบคทีเรียกรดแลกติกที่มีคุณสมบัติในการเป็
นโปรไบโอติกจากระบบทางเดินอาหาร
ปลาทะเล
Screening for probiotic properties of lactic acid bacteria isolated from digestive tract
of marine fish
ฐิติรัตน์ รัตนวิวัลย์ 1* และ นงนุช เลาหะวิสุทธิ ์ 1
Thitirat Rattanawiwan 1* and Nongnuch Laohavisuti 1
บทคัดย่อ
การคัดแยกแบคทีเรียกรดแลกติก จากระบบทางเดินอาหารของตัวอย่างปลาทะเล ด้วยอาหารเลี ้ยงเชื ้อ
MRS สามารถคัดแยกเชื ้อแบคทีเรียกรดแลกติกได้ 45 ไอโซเลท คัดแยกได้จากปลากดทะเล 17 ไอโซเลท ปลา
ทรายแดง 16 ไอโซเลท ปลาทู 4 ไอโซเลท และปลากระบอก 8 ไอโซเลท น าเชื ้อที่คัดแยกได้
มาทดสอบ
คุณสมบัติการเป็ นโปรไบโอติกได้ 6 ไอโซเลท ได้แก่ Tb11, Ma9, Mu7, Ba9, Ba1 และ Ba16 พบว่าเชื ้อดังกล่าว
มีความสามารถเจริญได้ที ่ ค่าความเป็ นกรด-ด่าง ระหว่าง 2-10 สามารถเจริญได้ในอาหารที ่มีโซเดียมคลอไรด์
ตั ้งแต่ 1-5% และสามารถเจริญได้ในน ้าดีสังเคราะห์ ที่มีความเข้มข้นสูงถึง
0.9% นอกจากนี ้ยังพบว่า ไอโซเลท
Tb11 จากปลาทรายแดง สามารถยับยั ้งแบคทีเรียทดสอบได้ ได้แก่ Lactobacillus sakei subsp. sakei JCM
1157 T , Lactobacillus sakei TISTR 890, Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides JCM 6124 T ,
Leuconostoc mesenteroides TISTR 942, Leuconostoc cremoris, Lactobacillus plantarum TISTR 8104,
Brochotrix camprestris NBRC 11547, Pseudomonas fluorescens JCM 5963 T , Pseudomonas fluorescens
TISTR 358 และความสามารถในการต้านทานต่อยาปฏิชีวนะ พบว่า ไอโซเลท Tb11 สามารถต้านทานต่อ
Gentamycin, Naldixic acid, Neomycin, Norfloxacin, Oxolinic acid และ Sulfamethoxazole/Trimethoprim
ค าส าคัญ: แบคทีเรียกรดแลกติก โปรไบโอติก ระบบทางเดินอาหารปลาทะเล
Abstract
Lactic acid bacteria was isolated from digestive tract of marine fish using selective media MRS. Forty
five isolates were obtained from sea catfish (Arius maculates), ornate threadfin bream (Nemipterus hexodon),
mackerel (Rastrelliger brachysoma) and mullet (Mugil sunviridis). All isolates were screened for probiotic
properties of lactic acid bacteria. The results showed that six isolates probiotic properties of lactic acid
bacteria were Tb11, Ma9, Mu7, Ba9, Ba1 and Ba16.These strains survival in vitro study were performed in
1 สาขาวิชาเทคโนโลยีการผลิตสัตว์และประมง คณะเทคโนโลยีการเกษตร สถาบันเทคโนโลยีพระจอมเกล้าเจ้าคุณทหาร
ลาดกระบัง กรุงเทพฯ 10520
*Corresponding author : E-mail: milky_gm@hotmail.com

การประชุมวิชาการงานเกษตรนเรศวร ครั ้งที่
01 221
pH range 2-10, concentration of NaCl at 1-5% and concentration of bile salts reached 0.9%. In addition,
Isolate Tb11 from ornate threadfin bream inhibit the indicator strains of Lactobacillus sakei subsp. sakei JCM
1157 T , Lactobacillus sakei TISTR 890, Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides JCM 6124 T ,
Leuconostoc mesenteroides TISTR 942, Leuconostoc cremoris, Lactobacillus plantarum TISTR 8104,
Brochotrix camprestris NBRC 11547, Pseudomonas fluorescens JCM 5963 T , Pseudomonas fluorescens
TISTR 358. Moreover, isolate Tb11 was resistant to Gentamycin, Naldixic acid, Neomycin, Norfloxacin,
Oxolinic acid and Sulfamethoxazole/Trimethoprim.
Keywords: Lactic acid bacteria Probiotic Digestive tract of marine fish
บทน า
แบคทีเรียกรดแลกติก (Lactic acid bacteria) เป็ นแบคทีเรียในกลุ่มที ่ได้รับการพิจารณาว่าเป็ นแบคทีเรีย
ที่มีความปลอดภัยสูงต่อคนและสัตว์
GRAS (Generally recognized as safe organisms) ซึ ่งแบคทีเรียในกลุ่มนี ้
พบทั่วไปตามธรรมชาติ
สามารถสร้างสารที่ยับยั
้งและท าลายการเจริญเติบโตของจุลินทรีย์ที ่ท าให้อาหารเน่าเสีย
รวมทั ้งจุลินทรีย์ที ่ก่อให้เกิดโรค ที่มาจากการปนเปื
้ อนจากอาหาร จากนั ้นจึงได้มีการศึกษาถึงความหลากหลาย
ทางสายพันธุ์ เพื่อที่จะน
ามาใช้ประโยชน์ จากแบคทีเรียกรดแลกติกสายพันธุ์ต่างๆ ส าหรับในวงการ การ
เพาะเลี ้ยงสัตว์น ้านั ้น พบว่าแบคทีเรียกรดแลกติกได้มีการน ามาประยุกต์ใช้เป็ นโปรไบโอติก เพื่อใช้ส
าหรับ
ยับยั ้งและท าลายจุลินทรีย์ที ่ก่อโรค ในระบบทางเดินอาหาร ท าให้โครงสร้างภายในร่างกายของเจ้าบ้านสมบูรณ์
ดี (Host) และยังช่วยควบคุมสิ ่งแวดล้อมที่ชักน
าให้เกิดโรค โดยแบคทีเรียที่พบส่วนมากในระบบทางเดินอาหาร
ของปลา เช่น Lactobacillus, Carnobacerium, Stretococcus และ Leconostoc เป็ นต้น (Ringo & Gatesoupe,
1998) นอกจากนี ้ยังพบว่าแบคทีเรียกรดแลกติกบางสายพันธุ์สามารถสร้างสารยังยั ้งจุลินทรีย์ (Antimicrobial
agent) ซึ ่ งพบว่าสารที่สร้างออกมาส่วนใหญ่นั
้น จะเป็ นสารพวกกรดแลกติกและกรดอะซิติก โดยในปัจจุบัน
แบคทีเรียกรดแลกติกได้รับความสนใจและมีการศึกษากันอย่างกว้างขวาง ในแง่ของวงการการเพาะเลี ้ยงสัตว์น ้า
พบว่า ได้มีการน าแบคทีเรียกรดแลกติก ไปประยุกต์ใช้เป็ นโปรไบโอติกร่วมกับการเพาะเลี ้ยงสัตว์น ้า เช่น การ
น าไปใช้เพื่อยับยั
้งแบคทีเรียที่ก่อให้เกิดโรคในสัตว์น
้า การส่งเสริมการเจริญของสัตว์น ้า อีกทั ้งยังช่วยในการลด
การใช้สารปฏิชีวนะ (Antibiotic) เพื่อเป็
นการลดการตกค้างของสารปฏิชีวนะในสัตว์น ้าและในสิ่งแวดล้อมอีก
ด้วย ดังนั ้นการศึกษาในครั ้งนี ้ จึงได้ท าการคัดแยกแบคทีเรียกรดแลกติก ที่สามารถสร้างสารยับยั
้งการเจริญของ
จุลินทรีย์ จากระบบทางเดินอาหารของปลาทะเล รวมถึงการศึกษาคุณสมบัติของการเป็ นโปรไบโอติก โดย
ศึกษาการทนต่อโซเดียมคลอไรด์ การทนต่อน ้าดีสังเคราะห์ การทนต่อความเป็ นกรด - ด่าง และการต้านทานต่อ
ยาปฏิชีวนะ เพื่อใช้เป็
นอีกแนวทางหนึ ่ง ในการเลือกน าไปประยุกต์ใช้ส าหรับการเพาะเลี ้ยงสัตว์น ้า ทั ้งในด้าน
การส่งเสริมการเจริญและการควบคุมการเกิดโรคอีกด้วย

222 การประชุมวิชาการงานเกษตรนเรศวร ครั ้งที่
01
อุปกรณ์และวิธีการ
1. ก
ารคัดแยกเชื ้อแบคทีเรีย
ใช้ตัวอย่างจากปลาทะเล ซึ ่ งประกอบไปด้วย ปลากดทะเล (Arius maculates) ปลาทรายแดง
(Nemipterus hexodon) ปลาทู (Rastrelliger brachysoma) และปลากระบอก (Mugil sunviridis) ชนิดละ 12
ตัวอย่าง โดยน าของเหลวที่อยู่ในกระเพาะอาหาร
น าใส่ในถุงผสมสารละลายโซเดียมคลอไรด์ 0.85% ปริมาตร 9
มิลลิลิตร จะได้สารละลายโซเดียมคลอไรด์ ที่มีความเข้มข้น
1:10 จากนั ้นเจือจางต่อให้ได้ความเข้มข้น 1:100,
1:1000, 1:10000 และ 1:100000 ในแต่ละตัวอย่าง จากนั ้นดูดสารละลายในแต่ละระดับความเจือจาง 100
ไมโครลิตร ถ่ายลงในจานเพาะเชื ้อบนอาหารแข็ง De Man-Rogosa and Sharpe (MRS) ที่เติมแคลเซียม
คาร์บอเนตความเข้มข้น 0.5% ใช้แท่งแก้วสามเหลี่ยมปราศจากเชื
้อเกลี่ยให้ทั่วจานเพาะเชื
้อ น าเข้าบ่มที่อุณหภูมิ
30ºCเป็ นเวลา 48 ชั่วโมง
(แบบไม่ใช้อากาศ) ตรวจนับเชื ้อบนจานเพาะเชื ้อ เลือกนับจานเพาะเชื ้อที่มีโคโลนี
30-
300 โคโลนี จากนั ้นสุ่มเลือกโคโลนีที ่มีบริเวณใส (Clear zone) รอบๆโคโลนี มาเลี ้ ยงในอาหารเหลว MRS
ปริมาตร 5 มิลลิลิตร เพื่อเป็
น Stock culture โดยใส่กลีเซอรอล ความเข้มข้น 30% ปริมาตร 500 ไมโครลิตร รวม
กับเชื ้ อแบคที เรี ยกรดแลกติ ก ปริ มาตร 500 ไมโครลิตร จากนั ้ นจึ งน าไปเก็บที ่อุณหภูมิ
-20 ºC เพื่อใช้ส
าหรับในการศึกษาครั ้งต่อไป
2. การทดสอบคุณสมบัติการเป็ นโปรไบโอติก
การทดสอบความสามารถในการเจริญ เมื่อเลี
้ยงเชื ้อในสภาวะเป็ นกรด-ด่าง น ้าดีสังเคราะห์และโซเดียม
คลอไรด์ ดัดแปลงจากวิธีการ Hyronimus et al. (2000) โดยน าแบคทีเรียกรดแลกติกจาก Stock culture ปริมาตร
100 ไมโครลิตร มาเลี ้ยงในอาหารเหลว MRS ปริมาตร 5 มิลลิลิตร น าไปบ่ม ที่อุณหภูมิ
30ºC เป็ นเวลา 18
ชั่วโมงจากนั
้นถ่ายเชื ้อปริมาตร 100 ไมโครลิตร ลงในอาหารเหลว MRS ปริมาตร 5 มิลลิลิตร ที่มีการปรับค่า
ความเป็ นกรด-ด่างเท่ากับ 2, 3, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9 และ 10 รวมถึงอาหารเหลว MRS ที่มีน
้าดีสังเคราะห์ ความ
เข้มข้น 0, 0.3, 0.6 และ 0.9% (w/v) และอาหารเหลว MRS ที่มีโซเดียมคลอไรด์ความเข้มข้น
0, 1, 2, 3, 4 และ
5% (w/v) บ่มที่อุณหภูมิ
30ºC เป็ นเวลา 18 ชั่วโมง
จากนั ้นตรวจสอบการเจริญของเชื ้อ โดยวัดค่าการดูดกลืน
แสงที่ความยาวคลื่น
600 nm และหาจ านวนเชื ้อโดยการ Spread plate บนอาหารแข็ง MRS
3. ก
ารทดสอบการยับยั ้งเชื ้อแบคทีเรียเป้ าหมายของเชื ้อแบคทีเรียกรดแลกติก
การทดสอบการยับยั ้งเชื ้อแบคทีเรียเป้ าหมาย ใช้วิธีการ Direct method โดยน าเชื ้อแบคทีเรียกรดแลกติก
ที่คัดเลือกได้มาปลูกเชื
้อ แบบจุด (Spot inoculate) บนอาหารแข็ง น าไปบ่มที่อุณหภูมิ
30ºC เป็ นเวลา 18 ชั่วโมง
จากนั ้นถ่ายเชื ้อทดสอบที่เลี
้ยงในอาหารเหลวปริมาตร 10 ไมโครลิตร ลงในอาหารเลี ้ยงเชื ้อที่มีวุ้น
1% ปริมาตร

การประชุมวิชาการงานเกษตรนเรศวร ครั ้งที่
01 223
5 มิลลิลิตร ซึ ่งหลอมตัวและมีอุณหภูมิประมาณ 45 ºC ผสมให้เข้ากันแล้วเททับลงบนจานเพาะเชื ้อเป้ าหมายที่
เตรียมไว้ ปล่อยทิ้งไว้ประมาณ 30 นาที เพื่อให้อาหารแข็งตัว
แล้วน าไปบ่มในอุณหภูมิที่เหมาะสมส
าหรับการ
เจริญของแบคทีเรียทดสอบแต่ละชนิด เป็ นเวลา 24 ชั่วโมง
ตรวจดูบริเวณใส (Clear zone) ซึ ่งเกิดจากการที ่
แบคทีเรียกรดแลกติก สร้างสารยับยั ้งการเจริญของแบคทีเรียทดสอบ พร้อมวัดขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง
4. กา
รทดสอบความสามารถในการต้านทานต่อยาปฏิชีวนะ
การทดสอบการต้านทานยาปฏิชีวนะใช้วิธีการของ Quinn et al. (1994) ถ่ายเชื ้อแบคทีเรียกรดแลกติกที ่
คัดเลือกได้จากการทดลองที ่ 3 ปริมาตร 100 ไมโครลิตร ลงในอาหารเหลว MRS ปริมาตร 5 มิลลิลิตร จากนั ้น
เจือจางเชื ้อด้วยน ้าเกลือ 0.85% ให้มีความขุ ่นเท่ากับ 0.5 McFarland มาตรฐาน ท าการ Swab เชื ้อด้วยไม้ที ่ส่วน
ปลายพันด้วยส าลีปลอดเชื ้อลงบนอาหารแข็ง MRS ให้ทั่วจานเพาะเชื
้อ ทิ้งไว้ให้แห้ง จากนั ้นน าแผ่นยา
ปฏิชีวนะวางไว้ด้านบนอาหารแข็ง น าไปบ่มที ่อุณหภูมิ 30ºC ในสภาวะที ่ไม่มีออกซิเจนเป็ นเวลา
18 ชั่วโมง
ตรวจผลโดยสังเกตบริเวณใส วัดขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางของบริเวณใสแล้วเปรียบเทียบกับค่า
มาตรฐานแสดงผลเป็ น Susceptible(S), Intermediate(I) หรือ Resistant(R)
ผลและวิจารณ์ผลการทดลอง
1. กา
รคัดแยกแบคทีเรียกรดแลกติกจากระบบทางเดินอาหารปลาทะเล
จากการน าตัวอย่างระบบทางเดินอาหารปลาทะเล ได้แก่ ปลากดทะเล (Arius maculates) ปลาทรายแดง
(Nemipterus hexodon) ปลาทู (Rastrelliger brachysoma) และ ปลากระบอก (Mugil sunviridis) จ านวน
ทั ้งหมด 48 ตัวอย่าง มาคัดแยกแบคทีเรียกรดแลกติก ซึ ่งเจริญบนอาหารแข็ง MRS ที่ผสมแคลเซียมคาร์บอเนต
0.5% ผลการทดลองพบว่า สามารถคัดแยกเชื ้อแบคทีเรียกรดแลกติกได้ 45 ไอโซเลท โดยคัดแยกได้จากปลากด
ทะเล 17 ไอโซเลท ปลาทรายแดง 16 ไอโซเลท ปลาทู 4 ไอโซเลท และ ปลากระบอก 8 ไอโซเลท
2. ก
ารทดสอบความสามารถในการเจริญเมื่อเลี
้ยงเชื ้อในสภาวะเป็ นกรด-ด่าง
จากการน าเชื ้อที่คัดแยกได้ทั
้งหมด จ านวน 45 ไอโซเลท มาเลี ้ ยงในสภาวะที ่เป็ นกรด-ด่างพบว่ามี
6 ไอโซเลท ได้แก่ Tb11, Ma9, Mu7, Ba9, Ba1 และ Ba16 สามารถเจริญเติบโตได้ในสภาวะที ่มีความเป็ นกรด-
ด่างที่
2-10 โดยพบว่าไอโซเลท Tb11 จากปลาทรายแดงสามารถเจริญเติบโตได้สูงที ่สุดที่ค่าความเป็
นกรด-ด่าง
เท่ากับ 7 ซึ ่งมีจ านวนเซลล์ เท่ากับ 8.152 log CFU/ml (OD 600nm เท่ากับ 1.413) และเมื่อค่าความเป็
นกรด-ด่าง
สูงขึ ้น (8.0-10) ผลปรากฏว่า ความสามารถในการเจริญลดลงตามระดับค่าความเป็ นกรด-ด่างที่สูงขึ
้น แสดงใน
ภาพที่
1 แบคทีเรียกรดแลกติกเมื ่อเลี ้ยงในสภาวะที ่มีค่าความเป็ นกรด พบว่าปริมาณของแบคทีเรียจะลดลง

224 การประชุมวิชาการงานเกษตรนเรศวร ครั ้งที่
01
เนื่องจากเซลล์ชะลอหรือเจริญเติบโตได้ไม่ดี
อย่างไรก็ตามพบว่าความทนต่อกรดขึ ้นอยู่กับระดับความเป็
นกรด
ของอาหารที่ใช้เลี
้ยง ซึ ่ งค่าความเป็ นกรดและด่างภายนอกเซลล์ จะมีผลต่อความทนต่อกรด โดยจะส่งผลต่อ
ความเป็ นกรดและด่างของไซโตพลาสซึมในเซลล์ ซึ ่งความสามารถในการทนต่อกรด เป็ นสมบัติที่ส
าคัญของ
แบคทีเรียที่มีคุณสมบัติเป็
นโปรไบโอติก (Vinderola & Reinheimer, 2003)
3. ก
ารทดสอบความสามารถในการเจริญเมื ่อเลี ้ยงเชื ้อในสภาวะที่มีน
้าดีสังเคราะห์
เมื่อน
าไอโซเลท Tb11 มาทดสอบความสามารถในการเจริญในน ้าดีสังเคราะห์ที ่ระดับความเข้มข้น
ต่างๆ พบว่า ไอโซเลท Tb11 สามารถเจริญได้ในสภาวะที่มีน
้าดีสังเคราะห์ความเข้มข้นได้สูงถึง 0.9% (w/v) ซึ ่ง
มีจ านวนเซลล์เท่ากับ 3.029 log CFU/ml (OD 600nm เท่ากับ 0.128) และลดการเจริญลงเมื ่ออยู่ในสภาวะที่มีน
้าดี
สังเคราะห์สูงขึ ้น อย่างไรก็ตาม คมแข และคณะ (2553) ได้ทดสอบการเจริญของไอโซเลท Sb2 ที่คัดแยกได้จาก
ระบบทางเดินอาหารปลากระพง พบว่าเชื ้อสามารถเจริญได้ในน ้าดีสังเคราะห์ที่ความเข้มข้น
0.3% ส่วนในความ
เข้มข้นที่
0.6% และ 0.9% ไม่พบการเจริญ Begley et al. (2005) ได้รายงานว่า โดยทั่วไปแล้วในกระเพาะและ
ล าไส้ของสัตว์ของสัตว์จะมี bile salts ซึ ่ง bile salts มีความเข้มข้นสูงท าให้สามารถละลายไขมันในเยื ่อหุ้มเซลล์
ส่งผลให้ส่วนประกอบต่างๆที่อยู่ภายในเซลล์เกิดการรั่วไหลออกมาและท
าให้เซลล์ตายในที่สุด
ทั ้งนี ้สายพันธุ์ก็
เป็ นอีกปัจจัยหนึ ่งต่อความสามารถในการทน bile salts อีกด้วย
4. ก
ารทดสอบความสามารถในการเจริญเมื ่อเลี ้ยงเชื ้อในสภาวะที่มีโซเดียมคลอไรด์
เมื่อน
าไอโซเลท Tb11 มาทดสอบความสามารถ ในการเจริญในสภาวะที ่มีโซเดียมคลอไรด์ในระดับ
ความเข้มข้น 1-5% โดยพบว่าความเข้มข้นของโซเดียมคลอไรด์ที ่ 1% มีการเจริญสูงที ่สุด ซึ ่งมีจ านวนเซลล์
เท่ากับ 8.071 log CFU/ml (OD 600nm เท่ากับ 1.019) และมีค่าลดลงตามล าดับ ส่วนการเลี ้ยงในสภาวะที่ไม่มี
โซเดียมคลอไรด์ พบว่าไอโซเลท Tb11 มีค่าการเจริญที ่สูงกว่าในสภาวะที ่มีโซเดียมคลอไรด์ โดยมีค่าการเจริญ
เท่ากับ 8.082 log CFU/ml (OD 600nm เท่ากับ 1.085) Vinderola & Reinheimer (2003) รายงานว่าเมื่อมีการเพิ่ม
ความเข้มข้นของโซเดียมคลอไรด์ลงไป โซเดียมคลอไรด์จะเข้าไปรบกวนการเจริญเติบโตของแบคทีเรีย ทั ้งนี ้
เนื่องจากว่า
กระบวนการเมตาบอลิซึมของแบคทีเรียมีความ Sensitive ต่อไออออนของโซเดียมคลอไรด์และน ้า
5. ก
ารทดสอบความสามารถในการยับยั ้งแบคทีเรียเป้ าหมายของแบคทีเรียกรดแลกติก
จากการศึกษาความสามารถ ในการยับยั ้งเชื ้อแบคทีเรียเป้ าหมาย ของแบคทีเรียกรดแลกติกโดยน าเชื ้อที่
คัด เ ลื อ ก ไ ด้จ า ก ก า ร ท น ต่ อ ส ภ า ว ะ ค ว า ม เ ป็ น ก รด -ด่ า ง ท น ต่ อ เ ก ลื อน ้ า ดี สั ง เค ร า ะ ห์ แ ล ะ ท น ต่ อ

การประชุมวิชาการงานเกษตรนเรศวร ครั ้งที่
01 225
โซเดียมคลอไรด์ ทั ้งหมด 6 ไอโซเลท มาทดสอบการยับยั ้งเชื ้อแบคทีเรียเป้ าหมาย โดยการสังเกตบริเวณใส
(Clear zone) ที่เกิดจากการสร้างกรดอินทรีย์ของแบคทีเรียกรดแลกติก
ในการยับยั ้งเชื ้อเป้ าหมาย ซึ ่งมีทั ้งเชื ้อก่อ
โรค และเชื ้อที่ท
าให้อาหารเน่าเสีย ผลการทดลองพบว่า ไอโซเลท Tb11 สามารถยับยั ้งเชื ้อ Lactobacillus sakei
subsp. sakei JCM 1157 T , Lactobacillus sakei TISTR 890, Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides
JCM 6124 T , Leuconostoc mesenteroides TISTR 942, Leuconostoc cremoris, Lactobacillus plantarum TISTR
8104, Brochotrix camprestris NBRC 11547, Pseudomonas fluorescens JCM 5963 T , Pseudomonas
fluorescens TISTR 358 ผลการทดลองแสดงในตารางที ่ 1 จากการศึกษาที ่ผ่านมา พบว่ากิจกรรมการยับยั ้ง
แบคทีเรียเป้ าหมายของแบคทีเรียกรดแลกติก อาจเป็ นผลมาจากการเกิดกรดอินทรีย์ที ่แบคทีเรียกรดแลกติกผลิต
ออกมา ซึ ่งสารประกอบต่างๆเหล่านี ้ที่แบคทีเรียกรดแลกติกผลิตออกมา
จะมีผลต่อแบคทีเรียได้ 2 ลักษณะ คือ
มีฤทธิ ์ ในการยับยั ้งการเจริญ และมีฤทธิ ์ ในการฆ่า (หทัยรัตน์, 2551)
Figure1 Effects of pH on growth of Tb11
Figure2 Effects of bile salts on growth of Tb11

226 การประชุมวิชาการงานเกษตรนเรศวร ครั ้งที่
01
Figure3 Effects of NaCl on growth of Tb11
Table1 List of indicator strains, growth condition and zone diameter of Tb11 against the strains
Indicator strains Media Temperature (ºC) Zone diameter
(mm)
Lactic acid bacteria group
Lactobacillus sakei TISTR 890
Lactobacillus sakei subsp. sakei JCM 1157
Leuconostoc mesenteroides subsp.
mesenteroides JCM 6124 T
Leuconostoc mesenteroides TISTR 942
Leuconostoc cremoris
Lactobacillus plantarum TISTR 8104
Enterococcus faecalis TISTR 888
Enterococcus faecalis JCM 5803 T
Other gram positive bacteria
Bacillus coagulans TISTR 1447
Brochotrix campeatris NBRC 11547 T
Staphylococcus aureus TISTR 118
Other gram negative bacteria
Salmonella Typhimurium
Streptococcus sp. TISTR 1030
Escherichia coli JCM 109
Pseudomonas fluorescens JCM 5693 T
Pseudomonas fluorescens TISTR 358
Aeromonas hydrophila TISTR 1321
MRS
MRS
MRS
MRS
MRS
MRS
MRS
MRS
TSB-YE
TSB-YE
TSB-YE
TSB-YE
TSB-YE
TSB-YE
TSB-YE
TSB-YE
NB
37
30
30
30
30
30
37
37
37
26
37
37
37
37
26
26
30
5(+)
18(+)
3(+)
8(+)
9(+)
4(+)
-
-
-
2(+)
-
-
-
-
9(+)
6(+)
-

การประชุมวิชาการงานเกษตรนเรศวร ครั ้งที่
01 227
JCM = Japanese culture of Microroganism, Wako, Japan
NRBC = National Institute of Technology and Evaluation (NITE) Biological Resource Center
TISTR = Thailand Institute of Scientific and Technological Research
TSB-YE = Tryptic soy broth (Himedia, India) + 0.5% Yeast extract (Merck, Germany)
NB = Nutrient broth MRS= De Man Rogosa and Sharpe (Merck, Germany)
+ = Inhibition zone - = No inhibition zone
6. ก
ารทดสอบความสามารถในการต้านทานต่อยาปฏิชีวนะ
จากการทดสอบความสามารถในการต้านทานต่อยาปฏิชีวนะ จ านวน 15 ชนิด ของไอโซเลท Tb11 ผล
การทดลองพบว่าไอโซเลท Tb11 สามารถต้านทานต่อยาปฏิชีวนะ Gentamycin, Naldixic acid, Neomycin,
Norfloxacin, Oxolinic acid และ Sulfamethoxazole/Trimethoprim แสดงในตาราง ที่
2 มีรายงานว่า การ
ต้านทานต่อยาปฏิชีวนะของแบคทีเรีย มีพื ้นฐานมาจาก 2 ปัจจัยด้วยกัน คือ การมียีนที่ต้านทานต่อยาปฏิชีวนะ
และการปรับตัวในสภาวะที่มียาปฏิชีวนะ
การทดสอบคุณสมบัติการต้านทานต่อยาปฏิชีวนะ (Mathur & Singh,
2005) เป็ นคุณสมบัติข้อหนึ ่งในการคัดเลือกเชื ้อแบคทีเรี ยกรดแลกติกที ่มีคุณสมบัติในการเป็ นโปรไบโอติ
กเนื่องจากในการเพาะเลี
้ ยงสัตว์น ้ ามักมีการใช้ยาปฏิชีวนะเข้ามาเกี่ยวข้อง
สาเหตุเนื ่องมาจาก การติดเชื ้อ
แบคที เรี ย จากสิ ่ งแวดล้อม จึงจ าเป็ นอย่า งยิ่ง
ที่
ต้อง มี การศึกษาความส ามารถในการต้านท านต่ อ
ยาปฏิชีวนะ
Table2 Antibiotics resistance of isolate Tb11
Antibiotic agents
Ampicillins
Chloramphenicol
Cephalothin
Erythomycin
Gentamycin
Kanamycin
Disk
content
(ug)
10
30
30
15
10
30
R
11
≤ 12
≤ 14
≤ 13
≤ 12
≤ 13
Zone diameter
I
12-13
13-17
15-17
14-22
13-14
14-17
S
≥14
≥18
≥18
≥23
≥15
≥18
Zone
diameter
(mm)
30
30
30
35
9
14
Tb11
Acceptable
inhibitory
S
S
S
S
R
I

228 การประชุมวิชาการงานเกษตรนเรศวร ครั ้งที่
01
Naldixic acid
30 ≤ 3
Neomycin
30 ≤ 12
Nitrofurantion
300 ≤ 14
Norfloxacin
10 ≤ 17
Novabicin
30 ≤ 12
Oxolinic acid
2 ≤ 10
Tetracyclin
30 ≤ 14
Sulfamethoxazole/Trimethoprim 25 ≤ 10
Oxytetracyclin
30 ≤ 14
S = Susceptible I = Intermediate R = Resistant
สรุปผลการทดลอง
การคัดแยกแบคทีเรี ยกรดแลกติก ที่มีคุณสมบัติในการเป็
นโปรไบโอติก พบว่า ไอโซเลท Tb11
สามารถเจริญและทนต่อกรดได้ที ่ pH 2-3 สามารถเจริญได้ในน ้าดีสังเคราะห์ที ่มีความเข้มข้น 0.9% เจริญได้ใน
อาหารที่มีโซเดียมคลอไรด์ที
่มีความเข้มข้น 1-5% และมีคุณสมบัติในการยับยั ้งแบคทีเรียเป้ าหมายได้ทั ้ง
แบคทีเรียแกรมบวกและแบคทีเรียแกรมลบ นอกจากนี ้ ยังมีความสามารถในการต้านทานต่อ Gentamycin,
Naldixic acid, Neomycin, Norfloxacin, Oxolinic acid และ Sulfamethoxazole/Trimethoprim จึงสามารถกล่าว
ได้ว่าไอโซเลท Tb11 มีคุณสมบัติเบื ้องต้นในการเป็ นโปรไบโอติก
เอกสารอ้างอิง
14-18
13-16
15-16
18-21
13-16
-
15-18
11-15
15-18
คมแข พิลาสมบัติ, จุฑารัตน์ เศรษฐกุล และ อดิศร เสวตวิวัฒน์. (2553). สมบัติการเป็ นโปรไบโอติกของ
แบคทีเรียกรดแลกติกที ่ผลิตแบคเทอริโอซินซึ ่ งคัดแยกได้จากระบบทางเดินอาหารของปลากะพง.
วารสารเกษตรพระจอมเกล้าลาดกระบัง, 28-3, 1-8.
หทัยรัตน์ มุสิกสังข์. (2551). การคัดเลือกแบคทีเรียกรดแลกติกที ่เป็ นโปรไบโอติกในไก่และการเพิ่มการรอด
ชีวิตของเชื ้อโดยการห่อหุ้ม. วิทยานิพนธ์ ปริญญาโท. มหาวิทยาลัยสงขลานครินทร์, สงขลา
Begley, M., Cormac, G.M.G., & Hill, C. (2005). The interaction between bacteria and bile. FEMS
Microbiol, 29, 625-651.
Gomez-Gil, B., Roque, A., & Turnbull, J.F. (2000). The use and selection of probiotic bacteria for
use in the culture of larval aquatic organisms. Aquaculture, 191, 259-270.
≥19
≥17
≥17
≥22
≥17
≥11
≥19
≥16
≥19
0
11
27
13
18
0
41
0
40
R
R
S
R
S
R
S
R
S

การประชุมวิชาการงานเกษตรนเรศวร ครั ้งที่
01 229
Hyronimus, B., Marrec, C.L., Sassi, A.H., & Deschamps, A. (2000). Acid and bile tolerance of
spore- forming lactic acid bacteria. Int. J. Food Microbiol, 61, 193-197.
Mathur, S., & Singh, R. (2005). Antibiotic resistance in food lactic acid bacteria :a review. Int. J. Food
Micribiol, 105, 281-295.
Ringo, E., & Gatesoupe, F.J. (1997). Lactic acid bacteria in fish: a review. Aquaculture, 160, 177-203.
Quinn, P.J., Carter, M.E., Markey, B.K., & Carter, G.R. (1994). Clinical Veterinary Microbiology.
London WC1W9LB, England.
Vinderola, G., Chaia, C.G., & Reinheimer, J.A. (2003). Lactic acid starter and probiotic bacteria: a
comparative “in vitro” study of probiotic characteristics and biological barrier resistance. Food Res.
Int., 36, 895-904.