Hayvan Sağlığı Araştırmaları 2009 Yılı Program - Tagem

3.2. Metot
3.2.1. Örneklerin Homojenizasyonu
�������������������������������������������������������������������������������������������
��������������������������������������������������������������������������������������������
���������������������������������������� ����������������������������������������������������
PBS içinde +4 0 C’de dok�� �������������� ����������� ����������� ������ ����� �������� ���
������� ���������� ������� ������������������ ������������ ���������� ����� ��� ������ ���������
���������� ����������� ���������� �������� ����� ��������� �������� ������ ����������� ��� ��-PCR
���������������������k üzere -80 0 ���������������������������������������������������
�����������������������
����� ������������� �������� ������������� �����-1/100) 100 µl hacimde RTG-2 hücreleri
���������� ��� ������ ��������������� �������� �������� ��� 0 C’de %5 CO 2’ li ortamda her gün
CPE yönünden 7 gün boyunca doku kültürü mikroskobunda kontrol edildi (Resim 3,4,5).
Dondur-���� �������������������������������������������������������������������������������
Tüm materyaller RTG-������������������������������������������������������-PCR ve Ag-
ELISA ile test edildi.
Resim 3. 24 gözlü makropleytlerdeki RTG-2 hücrelerine ekstrakt inokulayonu
Resim 4. RTG-2 hücresi
Resim 5. RTG-2 hücresinde VHSV’nin CPE’si
3.2.3. Antijen ELISA
������������������������������������������������������������������� temin edilen Ag-ELISA
kiti (TEST-LINE, Czech Republic) ile test edildi. Test üretici firma test prosedürüne göre
�����������������������������-ELISA testi
3.2.4. RNA Ekstraksiyonu ve RT-PCR
�����������������������������������������������������������-PCR y���������������������
������������ ��� ������� ������� ����������� ����������� ����-guanidium-phenol-chloroform-
������������������������������������������������������������������������������������������������
��������������������������������������������������������������������������������������
�������� ���������� ������ ��� 0 ����� �� ������� ��� ������� ��������� ����� �������� ����� ����-
HCl, 25 mMKCl, 4 mM MgCl2, 10mM DTT, 50 ng random heksamer primer, 200 U
Moloney murine leukemia virus reverse transkriptase (MMLV-RT) (MBI, Fermentas,
����������������������������������������������������������������������������������������
������������������������������������������������������������������������
������������������������������������������������������������������������������������'-
GGG-GAC-CCC-AGA-CTG-T-3' (forvard primer) ve 5'-TCT-CTG-TCA-CCT-TGA-
TCC-��������������������������������������������������������������������������������������
���������������������������������-CCAGCTCAACTCAGGTGTCC-3’) ve VGanti (5’-
GTCACYGTGCATGCCATTGT-3’) (36), VHS3, CGGCCAGCTCAACTCAGGTGTCC;
������ ���������������������������� ����� ������ ���������� ������������
Amplifikasyon, 3 µl cDNA, 75 mM Tris-HCl (pH8,8), 20 mM NH4(SO4)2, 1,5 mM MgCl2,
10 pmol’ar primerler, 0,2 mM dNTP, ve 0,5 U Taq DNA polimeraz (MBI, Fermentas,
����������������������������������������������������������������� 0 �������������������������
94 0 C’de 30 saniye, 52 0 C’de 30 saniye, 68 0 C’de 1 dakika süren program 35 defa
���������������� ������ ��� 0 C’de 7 dakika süren programda (2-oie), G bölgesinden seçilen
587 bp’lik primer VGense ve VGanti primer için, 72 0 C’de 10 dakika ve 94 0 C’de 2
��������� ��������� ��� 0 C’de 40 saniye, 64 0 C’de 40 saniye, 72 0 C’de 40 saniye süren
�������� ��� ����� ���������������� ������ ��� 0 C’de 5 dakika süren programda (37), G
bölgesinden seçilen 625 bp’lik primer VHS3 ve VHS4 primer için, 94 0 ����������������
takiben, 94 0 C’de 30 saniye, 60 0 C’de 30 saniye, 72 0 C’de 90 saniye süren program 40 defa
������������������������� 0 C’de 10 dakika süren programda (52) thermal cyclerde (Thermo
�������������������������������������������������������������������������� -1 ethidium
337