Hayvan Sağlığı Araştırmaları 2009 Yılı Program - Tagem

������������������������������������������������������������������������������������������
������������������������������������������������������������������������������������������
µl homojenat 14 000g’de 10 dak. santrifüj edildi ve elde edilen pellet DNA ekstraksiyonu
���������������������������������
6.4.DNA Ekstraksiyonu ve PZR
Kültürden DNA Ekstraksiyonu:� ������ ������� üreyen P. larvae referans kültüründen
���������������������������������������������������������ppendorf tüpte süspanse edildi. Sonra
��������� ������� ����������� ���� �������� ������������ ������ ����������������� ������ ��������
süspansiyonu 56°�� ��� ��� ������� �������� ��������� �������� ��� �������� ���������
süspansiyona 300 µl TNES-tamponu (20 mM Tris pH 8.0,150 mM NaCl, 10 mM EDTA,
% 0,2 SDS) ve 200������ ����������� �� ������ �������� ����� �������� ����� ����� balmumu ve
������ ������������ ��� ����� �������� ���� µl TNES-tamponu (20 mM Tris pH 8.0,150 mM
NaCl, 10 mM EDTA, % 0,2 SDS) ve 200µg/ml Proteinase K ilave edildi. Daha sonra
süspansiyon 37°����� �� ����� ������� �������� �������������� ������ ��� ������� ���������
��������� ��������� ������������ ������� �������������� ��� �������� ��������� �������������
����� �������� ����� µl) Tris-���� ���� ������� �������� ������ ������ �������� �������iyon elle 5
������� �������� ������ ����������� ��� ������� ������� ��� ������� ���������� �������� ����������
����������� ������ ������������ ���� ����������� ��������� ������ ������������ ���� ���������
�����������������������������������������������������������������������������������������
���� �������� ������ ���� ���������� ����������� ����� ������ �������� ��������������� ���������
süspansiyona 0,1 volüm 3M sodyum asetat ve 2,5 volüm saf etanol ilave edilerek -20°C'de
1-2 saat bekletildi. Daha sonra süspansiyon 13.000 rpm'de 10 dakika santrifüj edildi ve
������������ ���������������� ����� ������� ������ ����� ���� ��� ������������� �������� ��� �����
������ ��� �������� ������� ���� �������� �������� ��� ��������� ��������� ������������ �������
��������������������������������������������������������������� Son olarak elde edilen tortu
���������������������������������������������������������������������������������������
�������������������
Direkt PZR: Bakteriyel pelletler (Kültür, bal, balmumu, larva) 200 µl enzim solüsyonu
içinde ( 20 mg lysozyme, 20 mM Tris-HCL (ph 8.0), 2mM EDTA ve 1.2 % Triton) içinde
37 0 ‘de 1 saat inkube edildi. Ondan sonra 25 µl Proteinaz K ve 200 µl buffer AL (Qiagen)
ilave edildi. Daha sonra ise ilk önce 56 0 C’de 30 dak, 96 0 C’de 5 dak. inkube edildi.
DNA’ya 200 µl elution buffer ilave edilerek -20 0 C de donduruldu. Bu süspansiyondan 5 µl
�������������������������������������������������������������������������������������
�����������������������������������������-HCl, pH 9.0, 500mM KCl, 15mM MgCl2, %1
Triton X-100), deoksinükleotid� ��������������� ���� ��������� ���� ���� ��� ���� ����
polymerase enzimi (Fermentas), 40 pmol her bir primer AF 6f (5’- GCA AGT CGA GCG
GAC CTT GT-3’) ve AF 7r (5’-GCA TCG TCG CCT TGG TAA GC -3’) (Bakonyi, 2003)
��������������������������������������������������������������������������������������
�������� ���� ���� ��������� ��� ���� ������������ ���������� ���������������� ��������
������� ����������� ������������������ ���� ��������������� �������� �� ������� ��� ���������
müteakip 95°C'de 20 saniye denatürasyon, 50°C'de 20 saniye hibridizasyon ve 72°C' de 1
�������������������������������������������������������������������������������������������
������������������ �������������� ������-Elmer Gene Amp PCR sistemi 2400
������������������������������������������������������������������ar bekletildi.
������� ���������� ������� ����� ������� ���� ������������� ��������� ����� ���������
Elektroforez tampon solüsyonu olarak Tris-Borik asit-����������������������������������
���� ������������� ��������� ��� ������� �� ����� �������� ������������� ������� ������������������
������������������������������������������������������������������������������������������
��������� ������������ ������������������� ����������������� ������� � � ���������� �������������
����������������������������������������������������������������erlendirildi (Lauerman;
���������� ������������ ���� �������������� ������������ ���� ��� �������������� ����� P.larvae
237