89-91 - Polskie Stowarzyszenie Biomateriałów

Wykorzystane do eksperymentu komórki po 24- lub 48godzinnej
inkubacji z badaną próbką ekstraktu PLGA+HA
odpłukiwano, a następnie dodawano do nich roztwór MTT
uzyskując końcowe stężenie 1,1mM. Hodowlę kontynuowano
przez 4 godziny w identycznych warunkach jak
poprzednio. Po tym czasie komórki odwirowywano, supernatant
zlewano, a do zaadherowanych komórek dodawano
DMSO w celu ekstrakcji formazanu MTT z komórek.
Supernatant pobierano po 20 minutach i oznaczano jego
absorbancję przy długości fali 550nm stosując automatyczny
czytnik płytek. Procent cytotoksyczności CT [%] obliczano
posługując się wzorem (3), do którego wstawiano wartości
poszczególnych absorbancji po uprzednim odjęciu wartości
ADMSO (absorbancja DMSO):
gdzie A b–absorbancja próbki badanej, A k–absorbancja
próbki kontrolnej
wyniki
uzyskane w trakcie obu metod wyniki badań mikrobiologicznych,
określających procentową wartość poziomu cytotoksyczności
(CT) kompozytu PLGA+HA względem ludzkich
osteoblastów linii hFOB 1.19, zawarto w TABELI 1. Wynika z
niej, iż zarówno w I jak i II metodzie we wszystkich okresach
pomiarów wartość cytotoksyczności badanego materiału
kształtowała się w granicach dopuszczalnych norm [3].
Wyższe wartości CT uzyskane w trakcie bezpośredniego
kontaktu komórek z kompozytem były prawdopodobnie
efektem obecności w materiale aktywnych biologicznie nanocząsteczek
hydroksyapatytu. Pobudzały one w większym
stopniu stykające się z nimi komórki i tym samym intensywniejsza
była ich odpowiedź komórkowa. Zetknięcie komórek
z ekstraktem (I metoda) było jedynie pośrednim kontaktem
komórek z materiałem, a dokładnie z ewentualnie wydzielonymi
przez niego do medium hodowlanego substancjami
szkodliwymi czy produktami jego rozkładu.
Zastosowanie dwóch metod oceny stopnia cytotoksyczności
badanego materiału względem ludzkich komórek
kościotwórczych spowodowało uzyskanie jednocześnie
dwóch różnych jego procentowych wartości w tym samym
okresie pomiaru. Jest to potwierdzeniem wysuwanych
przez autorów prac o podobnej tematyce wniosków, iż na
końcową odpowiedź komórkową w kontakcie z zawierającym
polimerową osnowę biomateriałem ma wpływ wiele
czynników natury chemicznej, fizycznej, technologicznej
czy biologicznej [6,7,9,10,13,22]. Szczególne znaczenie
final concentration of 1,1mM. The culturing was continued
for 4 hours in the same conditions as before. After that time
the cells were centrifuged, the supernatant was decanted,
and DMSO was added to the adhered cells with a view to
extract MTT formazane from the cells. The supernatant
was collected after 20 minutes and its absorbance was
determined at a wavelength of 550nm implementing an
automatic plate reader. The cytotoxicity percentage CT [%]
was calculated according to formula (3), where the values
of particular absorbances had previously been diminished
by subtracting ADMSO (DMSO absorbance):
where A s–absorbance of the examined sample, A c–absorbance
of the control sample.
results
The results of microbiological examination obtained from
both methods, which determined the percentage value of
cytotoxicity level (CT) of PLGA+HA composite to human
osteoblasts hFOB 1.19 line are presented in Table 1. It can
be concluded that both in the first and the second method,
the value of cytotoxicity of the examined materials was
within the allowed norms in all examination periods [3].
Higher CT values obtained during the cells’ direct contact
with the composite were probably caused by the presence
of biologically active nanoparticles of hydroxyapatite in the
material. They aroused in a higher degree the cells adjoining
them and, what followed, their cell response was more
intensive. Contacting the cells with the extract (the first
method) brought about only an indirect contact between
the cells and the material, and more precisely, with harmful
substances produced by the material and emitted to the
cultivation medium or the products of its decomposition.
using two methods to assess the degree of cytotoxicity of
the examined material to human bone-forming cells enabled
to obtain its two different percentage values simultaneously,
in the same examination period. This confirms the
assumptions put forward by the authors of works on similar
subjects that there are many factors (of chemical, physical,
technological or biological nature) which may influence the
final response of cells in contact with a biomaterial having
a polymer warp [6, 7, 9, 10, 13, 22]. However, the kind and
origin of the cells used for the examination, as well as the
method of contacting them with the samples of the examined
material are of special significance [4, 5, 8, 12, 14, 20].
CT [%] – I metoda
CT [%] - 1st CT [%] – II metoda
method
CT [%] – 2nd method
Test LDH
Test MTT
Test LDH
LDH Test
MTT Test
LDH Test
Czas:
Time: 24 h 48 h p 24h 48 h p 24 h 48 h 72 h p24-48 p48-72 PLGA+HA 0 0 - 0 1,5±1,3 NS 10,4±1,6 7,0±2,4 0,6±1,0