89-91 - Polskie Stowarzyszenie Biomateriałów
89-91 - Polskie Stowarzyszenie Biomateriałów
89-91 - Polskie Stowarzyszenie Biomateriałów
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
przestrzennej, a także stopnia porowatości czy skłonności<br />
do resorpcji. Bardzo ważne znaczenie ma ponadto rodzaj<br />
kontaktowanych z materiałem komórek, ich pochodzenie,<br />
sposób i gęstość posiewu czy pasaż, po którym zostały<br />
użyte do badań [10-13].<br />
Duże zainteresowanie, jakim cieszy się w obszarze nauk<br />
biomedycznych, bioresorbowalny kopolimer glikolidu z laktydem<br />
(PLGA) ma odzwierciedlenie w licznych opracowaniach<br />
naukowych potwierdzających możliwość jego stosowania w<br />
takich specjalnościach medycyny jak inżynieria tkankowa<br />
i genetyczna, farmakologia, chirurgia czy stomatologia<br />
[14-18]. kopolimer ten łączy się często z różnego rodzaju<br />
napełniaczami pochodzenia naturalnego czy syntetycznego,<br />
które wpływają między innymi na charakterystykę<br />
mechaniczną kompozytu, odpowiedź komórkową i proces<br />
jego degradacji [19,20]. Wyjątkowy wpływ na końcowe właściwości<br />
kompozytu mają napełniacze ceramiczne oparte o<br />
fosforany wapnia (hydroksyapatyt, fosforan trójwapniowy)<br />
czy bioszkło [21-23]. Wpływają one bowiem w sposób<br />
istotny na aktywność biologiczną powstałego z ich udziałem<br />
kompozytu co ma odzwierciedlenie w ich lepszej integracji<br />
z żywą tkanką [24,25].<br />
W niniejszej pracy postawiono sobie za cel ocenę stopnia<br />
cytotoksyczności kompozytu złożonego z kopolimeru<br />
glikolidu z laktydem oraz hydroksyapatytu (PLGA+HA)<br />
w kontakcie z ludzkimi komórkami kościotwórczymi linii<br />
hFOB 1.19.<br />
materiał i metody<br />
Materiałem badawczym w pracy był kopolimer glikolidu i<br />
L-laktydu (PLGA: 82% L-laktydu, 18% glikolidu), który został<br />
pozyskany z Centrum Materiałów Polimerowych i Węglowych<br />
PAN w Zabrzu. Syntezę przeprowadzono na drodze<br />
otwarcia pierścienia z użyciem nietoksycznego inicjatora<br />
- acetyloacetonianu cyrkonu [26]. kopolimer charakteryzował<br />
się średnim ciężarem cząsteczkowy Mn=75kDa oraz<br />
współczynnikiem polidyspersji Mn/Mw=2,1. kompozyt<br />
PLGA+HA sporządzono przez dodanie do kopolimeru 15<br />
wt% nanocząsteczek hydroksyapatytu (HA) pochodzenia<br />
naturalnego z kości wołowej [27].<br />
Do badań in vitro użyto krążków o średnicy 16mm i grubości<br />
1mm wyciętych z błonek otrzymanych metodą wylewania<br />
z roztworu CH2Cl2 kompozytu na szalki. W celu poprawy<br />
homogeniczności PLGA+HA przed dodaniem nanocząsteczek<br />
hydroksyapatytu do rozpuszczonego w CH 2Cl 2<br />
kopolimeru zwilżano je wcześniej w tym samym roztworze.<br />
Połączenie obu składników nastąpiło poprzez mieszanie na<br />
mieszadle magnetycznym oraz rozbijanie ultradźwiękami.<br />
Całość prowadzona była w temperaturze pokojowej.<br />
Do badań in vitro oceniających cytotoksyczność badanego<br />
kompozytu użyto ludzkich osteoblastów linii hFOB 1.19<br />
zakupionych w American Type Culture Collection – ATCC<br />
(Manassas, VA, uSA), numer katalogowy CRL-11372.<br />
Badania przeprowadzono zgodnie z zaleceniami normy<br />
PN-EN ISO 10993-5 [3].<br />
Część doświadczalną pracy przeprowadzono w katedrze<br />
i Zakładzie Mikrobiologii i Immunologii Śląskiego uniwersytetu<br />
Medycznego w Zabrzu. Hodowlę komórek prowadzono<br />
w plastikowych butelkach o pojemności 50 ml (Nunc A/S Roskilde,<br />
Dania). Jako medium hodowlane stosowano podłoże<br />
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium oraz podłoże Ham’s<br />
F12 połączone w proporcji 1:1 (bez czerwieni fenolowej i<br />
antybiotyków) z dodatkiem 2,5mM L-glutaminy oraz 0,3mg/<br />
ml G418 Sulphate i 10% płodowej surowicy cielęcej (FBS)<br />
inaktywowanej termicznie. komórki hodowano w sposób<br />
ciągły w temperaturze 34 o C w atmosferze powietrza z 5%<br />
zawartością CO 2 przy 100% wilgotności względnej. komórki<br />
which they were used for the examination [10-13].<br />
The significant amount of interest in bioresorbable lactide-glycolide<br />
co-polymer (PLGA) in biomedical sciences is<br />
reflected in numerous scientific works which confirm the fact<br />
that the material can be used in such medical specializations<br />
as tissue engineering, genetic engineering, pharmacology,<br />
surgery or stomatology [14-18]. This co-polymer is often<br />
combined with different kinds of fillers of natural or synthetic<br />
origin, which have an influence upon, among others, the mechanical<br />
characteristics of the composite, the cell response<br />
and the process of its degradation [19, 20]. Ceramic fillers<br />
based on calcium phosphate (hydroxyapatite, tricalcium<br />
phosphate) or bio-glass have an exceptional influence on<br />
the properties of the composite [21-23]. They have a vital<br />
effect on the biological activity of the composite created with<br />
their participation, which is reflected by their better integration<br />
with living tissue [24,25].<br />
The aim of this work is to assess the degree of cytotoxicity<br />
of the composite consisting of lactide-glycolide composite<br />
and hydroxyapatite (PLGA+HA) in contact with human<br />
bone-forming cells hFOB 1.19 line.<br />
material and methods<br />
The material examined in the research was L-lactideglycolide<br />
co-polymer (PLGA: 82% of L-lactide and 18% of<br />
glycolide) which was obtained at the Polymer and Carbon<br />
Materials Centre of the Polish Science Institute in Zabrze.<br />
The synthesis was performed by opening the ring using<br />
a non-toxic initiator - zirconium acetylacetonate [26]. The<br />
copolymer had a medium molecular weight Mn=75kDa and<br />
the polydispersion coefficient Mn/Mw=2.1. PLGA+HA composite<br />
was obtained through adding 15wt% of nanoparticles<br />
of hydroxyapatite (HA) of natural origin (from bovine bone)<br />
to the co-polymer [27].<br />
To perform in vitro examinations discs of 16mm diameter<br />
and 1mm thickness were used; they were cut from<br />
membranes obtained by pouring the composite on bowls<br />
from CH 2Cl 2 solution. In order to improve PLGA+HA homogeneity,<br />
before adding hydroxyapatite nanoparticles to the<br />
co-polymer dissolved in CH 2Cl 2, they were moisture in the<br />
same solution. Both ingredients were blended by mixing<br />
them on a magnetic mixer and breaking them with the use<br />
of ultrasound. The whole procedure was performed in room<br />
temperature.<br />
To perform in vitro examinations assessing cytotoxicity<br />
of the examined composite human osteoblasts hFOB 1.19<br />
line were used. They were purchased in American Type<br />
Culture Collection – ATCC (Manassas, VA, uSA), catalogue<br />
number CRL-11372. The examinations were performed in<br />
accordance with the regulations of the PN-EN ISO 10993-5<br />
norm [3].<br />
The experimental part of the research was performed at<br />
the Chair and Department of Microbiology and Immunology<br />
of the Medical university of Silesia in Zabrze. The cells were<br />
cultured in plastic 50ml bottles (Nunc A/S Roskilde). Dulbecco’s<br />
Modified Eagle’s Medium was used together with Ham’s<br />
F12 in proportion 1:1 (without phenol red and antibiotics)<br />
with the addition of 2,5mM L-glutamine, 0,3mg/ml G418<br />
Sulphate and 10% foetal bovine serum (FBS) inactivated<br />
thermally. The cells were cultured in a continuous manner at<br />
a temperature of 34 o C, air containing 5% CO 2, and 100%<br />
relative humidity. The cells used in the research were after<br />
6 passages, which guaranteed their stability and a constant<br />
rate of proliferation.<br />
The assessment of cytotoxicity level of the biomaterial<br />
assessed was done using two method. The first method<br />
used its extract obtained by 8-day incubation of the samples<br />
99