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60 Kapitel 4: Methoden und Materialien
xierung durch eine einstündige Inkubation in 5%igem fötalem Kälberserum (kurz: FBS,
Invitrogen) gestoppt. Die Zellmembran der Neuronen wurde dann 15 min lang in PBS
mit 5% FBS und 0, 1% Triton X-100 (Sigma) bei Raumtemperatur durchlässig gemacht.
Als Fluoreszenzfarbstoff kam TRITC-Phalloidin (Sigma) zum Einsatz, das mit 20 μg
ml in
der Permeabilisierungslösung gelöst wurde. Hierin wurden die Proben für 1h bei 37 ℃
inkubiert und anschließend mit PBS und Wasser abgespült.
4.3.3 Fixierung und Kritisch-Punkt-Trocknung
Im Anschluss an die Untersuchung mittels Fluoreszenzmikroskopie wurden die Proben,
auf denen erfolgreich Zellen kultiviert werden konnten, für REM-Aufnahmen fixiert. Zunächst
wurde Glutaraldehyd (25 % EM Grade, Agar Scientific Ltd., Essex) in 20 mM des
Puffers 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure (kurz: HEPES, Carl Roth
GmbH & Co KG, Karlsruhe) gelöst. Der pH-Wert dieser Lösung wurde mit 1M NaOH
auf 7,4 eingestellt. Wichtig war bei der anschließenden Steril-Filtration, dass die Fixierlösung
flusenfrei blieb, um Kontaminationen der Zellkultur zu vermeiden. Je nach Zelltyp
wurden Fixierungsprotokolle mit unterschiedlichen Konzentrationen Glutaraldehyd in
HEPES verwendet. Vorher wurden die Zellen zwei Mal in 1x PBS gereinigt, um Großteile
der Färbelösung auszuwaschen.
Protokoll A: 1, 25 % Glutaraldehyd
Rattenneuronen wurden zunächst für 2h in 1, 25 % Glutaraldehyd fixiert. Anschließend
wurde diese Lösung gegen eine 2, 5 %ige Glutaraldehydlösung ausgetauscht, in der die
Proben ca. 20 h inkubiert blieben. Am nächsten Tag folgte die Ethanol-Austauschreihe,
die in Protokoll B beschrieben ist und eine weitere Nacht beinhaltete. Dieses Protokoll war
zwar sehr zeitintensiv, gewährleistete aber, dass die Haftung der Zellen am Substrat nach
der Fixierung optimal war. Gleichzeitig wurden Schrumpfungseffekte der Zellen durch den
Ethanolaustausch minimiert.
Dieses Protokoll ließ sich auch abkürzen durch Weglassen der Vorfixierung in 1, 25 %
Glutaraldehyd. In der kurzen Variante von Protokoll A wurden die Proben direkt für 4h
in 2, 5% Glutaraldehyd inkubiert, so dass die ersten beiden Schritte der Ethanol-Reihe
noch am selben Tag durchgeführt werden konnten.
Protokoll B: 3, 5% Glutaraldehyd
Für HL1- und HEK-Zellen war die Fixierung weniger kritisch als bei Rattenneuronen. Aus