View - JUWEL - Forschungszentrum Jülich

4.3 Zellkopplung an Gold-Nanopillars 59
mit Fibronektin (Sigma) beschichtet. Hierfür wurde 1ml Fibronektin in 200 ml 0, 02 %
Gelatine verdünnt und in dieser Konzentration auf die Substratoberfläche aufgebracht.
Nach einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Lösung wieder abgesaugt,
und die Zellen konnten direkt ausgesät werden. Die HL1-Zelllinie stammte vom Louisiana
State University Health Science Center (New Orleans, LA, USA).
HEK-Zellen:
HEK 293 - Zellen sind eine häufig verwendete Zelllinie, die aus humanen Nierenepithelzellen
gewonnen wird. Die HEK-Zellen, die in der vorliegenden Arbeit verwendet wurden,
verfügen über Natriumkanäle vom Typ NaV 1.4. Die pLL-Beschichtung für die Kultivierung
von HEK-Zellen folgte dem gleichen Protokoll wie für RCN (s. oben). Vergleichsweise
wurden auf einem Teil der Substrate HEK-Zellen ohne vorherige Beschichtung ausgesät.
In diesem Fall wurden die Proben vorher lediglich sterilisiert.
Weitere Details zur Kultivierung von HL1- und HEK-Zellen und von kortikalen Rattenneuronen
sowie zu den dabei verwendeten Nährmedien und Lösungen können nachgelesen
werden bei [98].
4.3.2 Live-Dead-Staining mittels Fluoreszenzmikroskopie
Zur statistischen Auswertung des Verhältnisses zwischen lebenden und toten Zellen wurde
die Fluoreszenzmikroskopie verwendet. Hierfür kam ein Axio Imager Z.1 Apotome
(Carl Zeiss GmbH, Oberkochen) zum Einsatz. Alle Messungen wurden mit einem 20x-
Immersionsobjektiv durchgeführt.
Als Farbstoff für lebende Zellen wurde Calcein (Sigma) verwendet, tote Zellen auf den Substraten
wurden mit Ethidiumhomodimer-1 (EthD-1, Invitrogen) gefärbt. Die Färbelösung
bestand aus PBS mit 1mM Calcein und 2mM EthD-1. Vor dem Färben wurden die Zellen
zwei Mal mit vorgewärmter PBS-Lösung (1x) gewaschen und dann in der Färbelösung
inkubiert. Die Fluoreszenzbilder wurden in der Regel im Zeitraum zwischen 5 und 15 Min
mit dem 38HEGFP-Kanal (λ = 488 nm) und dem 43HEDsRed-Kanal (λ = 546 nm) des
Apotomes aufgenommen. Anschließend wurden die Bilder statistisch mit der frei verfügbaren
Software ImageJ ausgewertet.
Für die fluoreszenzmikroskopische Untersuchung der Aktinfilamente wurden die Neuronen
15 min lang mit 3, 7% Formaldehyd in PBS bei 4 ℃ fixiert. Anschließend wurde die Fi-